UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE INSTITUTO DE QUÍMICA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Elton Marlon de Araújo Lima
Caracterização da inibição de Xilanases GH11 por acoplamento proteína-proteína: uma investigação por dinâmica molecular
NATAL, RN 2016
Caracterização da inibição de Xilanases GH11 por acoplamento proteína-proteína: uma investigação por dinâmica molecular
NATAL, RN 2016
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Química do Petróleo da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos da Graduação.
Orientador: Prof. Dr. Davi Serradella Vieira Coorientador: Me. Sérgio Ruschi Bergamachi Silva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto de Química - IQ
Lima, Elton Marlon de Araujo.
Caracterização da inibição de Xilanases GH11 por acoplamento proteína-proteína: uma investigação por dinâmica molecular / Elton Marlon de Araujo Lima. - Natal, 2016.
58f.: il.
Trabalho de conclusão de curso (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Instituto de Química, Natal, 2016.
Orientador: Prof. Dr. Davi Serradella Vieira. Coorientador: Me. Sérgio Ruschi Bergamachi Silva.
1. Catálise enzimática - Monografia. 2. Xilanases - Inibição - Monografia. 3. Proteínas - Monografia. 4. Enzimas - Monografia. 5. Dinâmica molecular - Monografia. 6. Química - Monografia. I. Vieira, Davi Serradella. II. Título.
Caracterização da inibição de Xilanases GH11 por acoplamento proteína-proteína: uma investigação por dinâmica molecular
Aprovado em: ____/____/____
______________________________________________________________________ Prof. Dr. Davi Serradella Vieira
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Orientador
______________________________________________________________________ Prof. Drª. Fernanda Marur Mazzé
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Membro da Banca
______________________________________________________________________ Prof. Dr. Tiago Pinheiro Braga
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Membro da Banca
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Química do Petróleo, como um dos requisitos para obtenção do grau de Graduado em Química do Petróleo pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
“If I have seen further it is by standing upon the shoulders of giants”. (Isaac Newton)
Em primeiro lugar, a Deus, por me agraciar com fé e força nos momentos de fraqueza, e por ter me guiado no caminho que decidi seguir.
Aos meus pais, José Vicente de Lima Filho e Rosa Amélia de Araújo Lima, por terem feito do meu sonho, o sonho deles. Por ter acreditado mais em mim, do que eu mesmo. Pelo carinho, amor, dedicação e cuidado que me foram dados desde meu nascimento. Por me encherem de orgulho.
A minha irmã, Erika Nataly, pelo incentivo e amor incondicional.
Ao meu sobrinho, Heitor, que iluminou minha vida e da minha família. Está com ele me faz um ser humano melhor e cheio de esperança.
Ao meu avô, José Vicente (Seu Zé), que mesmo dormindo, está presente em minha vida como exemplo de caráter e perseverança.
A minha amiga, Layse Lins, a quem devo experiências maravilhosas e fundamentais para meu crescimento pessoal e profissional. Obrigado por me suportar!
A Luiza Diógenes, Luiz Júlio e Raimunda Carvalho, por todo suporte que me foi dado durante a graduação. Por ter me acolhido em seu seio familiar quando precisei. Pelos conselhos, lágrimas e risadas.
A toda minha família, pelo encorajamento e torcida. Em especial aos meus primos: Lívia Juliana, Aline Nascimento, Pierre Franklin, Hanley Lucena, Rayne Fernandes, Francis Casado, Daiane Laise, Flávio Luiz e Hellen Lima.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Davi Serradella Vieira, por ter partilhado toda sua experiência e conhecimento, pela compreensão e pelo apoio, sem os quais jamais seria possível a realização deste trabalho. E por despertar, em mim, a vontade de fazer ciência.
Aos companheiros do Laboratório de Modelagem Molecular e Simulação Aplicada – LAMMSA, pelos momentos compartilhados durante esses anos: Norberto Monteiro, Sérgio Ruschi, Taytyanne Libório e Amison Silva.
Aos amigos, que fiz durante a graduação, e que levarei para vida: Isabelle Mariane, Raphaella Cabral, Rayssa Cabral, Felipe da Hora, Rebecca Barros, Vanessa Bezerra, Nadja Coelho, Gregory Vinicius, Andrey Halley e Heloise Medeiros.
de cidadãos conscientes e profissionais éticos. Em especial, ao Prof. Dr. Jones de Andrade, por fazer seus alunos irem além dos seus limites, e assim os tornar mais seguros e mais capazes de enfrentar situações que os tirem da zona de conforto.
Ao REUNI, PROPESQ e CNPq, pelo apoio financeiro e concessão da bolsa.
Xilanases são enzimas produzidas por vários organismos como bactérias e fungos e são capazes de hidrolisar as ligações 1,4-beta da cadeia principal da xilana (principal componente da hemicelulose). As xilanases apresentam grande aplicabilidade na indústria biotecnológica, com destaque para os processos de geração do etanol de segunda geração. O objetivo do estudo é investigar o processo molecular fundamental da inibição de xilanases GH11, assim como uma caracterização estrutural/energética do sítio ativo dessas enzimas. Foram estudadas, por simulação de dinâmica molecular, duas xilanases da mesma família, com diferentes sensibilidades com relação à inibição por acoplamento com a proteína XIP-1, a xilanase XYNC, produzida pelo fungo Penicillium funicolosum, que sofre inibição, e a xilanase NpXyn, produzida pelo fungo Neocallimastix patriciarum, que é a única enzima xilanase fúngica a não sofrer inibição pela XIP-1. A energia de interação média dos acoplamentos NpXyn+XIP-I e XYNC+XIP-I são -1.63 kcal/mol e -9.27 kcal/mol, respectivamente. As análises por RMSF (raiz da flutuação quadrática média) por resíduo mostram claramente diferentes padrões de flexibilidades na interface proteica das duas xilanases. A região que forma o sítio catalítico é mais estabilizada (baixa flutuação) na NpXyn em comparação com a XYNC. A análise pontual do sítio catalítico das xilanases, frente o resíduo mais importante da XIP-1 (Arg149), mostrou que os resíduos catalíticos da XYNC estão mais próximos da Arg149 e que não há formação de uma interface, na região dos dedos, que impeça a inibição. Na NpXyn a presença de resíduos “hotspot” na região do dedos da xilanase forma uma interface estável com a proteína inibidora, impedido o acesso da a Arg149 ao resíduos catalíticos, o que impede a inibição.
Figura 1 - Formação de uma ligação peptídica por condensação. ... 15
Figura 2 - Fórmulas estruturais dos 20 aminoácidos primários de proteína. ... 16
Figura 3 - Níveis de estruturas de proteínas ... 17
Figura 4 - Ligação de um substrato (vermelho) a uma enzima (cinza) no sítio ativo. ... 19
Figura 5 - Energia livre em função das coordenadas de reação comparando a energia livre, G, para reações catalisadas (∆Gcat) e não-catalisadas (∆Gnãocat) ... 20
Figura 6 - δigações β-1,4 da cadeia principal da xilana ... 21
Figura 7 - Estruturas tridimensionais das xilanases: (a) GH10 – PBD:1B3Z; (b) GH11 – PDB: 2C1F ... 22
Figura 8 - Representação da analogia da mão direita com regiões/domínios das xilanases GH11. ... 22
Figura 9 - Estrutura tridimensional de GH11 com xilopentaose ligada ao sítio ativo ... 23
Figura 10 - Sobreposição das estruturas da NpXyn (vermelho) e XYNC (azul). Códigos PDB: NpXyn (2C1F) e XYNC (1UKR). ... 23
Figura 11 - Estrutura tridimensional do XIP-1 obtida no Banco de Dados de Proteínas código: 1OMO. ... 24
Figura 12 - Representação tridimensional dos complexos estudados: (a) NpXyn+XIP-1, com resíduos catalíticos representados em esferas, Glu113 (em verde) e Glu201 (em azul); (b) XYNC+XIP-1, Glu86 (em vermelho) e Glu177 (em amarelo). ... 25
Figura 13 - Resíduo Gly154 da NpXyn (esferas verde) confrontando o Ala144 (esferas azul) do XIP-1. ... 35
Figura 14 - Região dos dedos (roxo) confronta estericamente o inibidor. ... 36
Figura 15 - Arg149 (esferas vermelhas) é um resíduo muito importante para interação com sito ativo da XYNC. ... 36
Figura 16 - RMSD(t) para as xilanases NpXyn e XYNC... 37
Figura 17 - RMSD(t) para as para os inibidores XIP-1+NpXyn e XIP-1+XYNC ... 38
Figura 18 - Valores de RMSF da NpXyn por resíduo. ... 39
Figura 19 - Valores de RMSF da XYNC por resíduo ... 40
Figura 20 - Os valores de entre a razão do RMSF XIP (NpXyn) pelo RMSF XIP (XYNC), por resíduo. ... 42
Figura 24 - δocalização dos “hot-spots” da NpXyn (esferas cinza) e da XIP-1 (esferas verdes) (A); da XYNC (esferas amarelas) e da XIP-1 (esferas roxas). ... 50
DNA Ácido desoxirribonucléico RNA Ácido Ribonucléico
GH 10 Família F de enzimas xilanases GH11 Família G de enzimas xilanases PBD Banco de Dados de Proteínas GLU Aminoácido: Acido Glutâmico GLY Aminoácido: Glicina
LEU Aminoácido: Leucina ASN Aminoácido: Asparagina ARG Aminoácido: Arginina DM Dinâmica Molecular
GROMOS96(43A1) Campo de força utilizado para simulações RMSD Raiz do desvio quadrático médio
EPI Energia Potencial de interação RMSF Raiz quadrática média da flutuação GROMACS Programa de simulação molecular
LINCS Algoritmo usado para restringir a distância de ligação com átomos de hidrogênio
SETTLE Algoritmo usado para restrição da geometria da molécula de água
1. INTRODUÇÃO ... 12
2. OBJETIVOS ... 14
2.1 OBJETIVO GERAL ... 14
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 14
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 15
3.1 ESTRUTURA E FUNÇÃO DE PROTEÍNAS ... 15
3.2 ENZIMAS ... 19
3.3 XILANASES ... 21
3.4 INIBIDOR XIP-1 ... 24
3.5 SIMULAÇÃO MOLECULAR ... 26
3.5.1 MÉTODO: DINÂMICA MOLECULAR ... 26
3.5.2 MODELOS - CAMPOS DE FORÇAS ... 28
3.5.3 MÉTODOS DE ANÁLISE ... 30
4. METODOLOGIA ... 33
4.1 CONDIÇÕES DE SIMULAÇÃO ... 33
4.2 ESTRUTURAS DAS ENZIMAS E COMPLEXOS SIMULADOS ... 33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35
5.1 ESTABILIDADE ESTRUTURAL ... 35
5.2 FLEXIBILIDADE E RIGIDEZ ... 39
5.3 ENERGIA POTENCIAL DE INTERAÇÃO (EPI) ... 43
5.4 ALANINE SCANNING ... 44
5.5 DISTÂNICAS DOS RESÍDUOS CATALÍTICOS COM A ARG149 DO INIBIDOR . 51 6. CONCLUSÕES ... 53
1. INTRODUÇÃO
Devido às suas aplicações biotecnológicas, enzimas tem sido o foco dos esforços de investigações científicas. Este interesse tem sido impulsionado por um crescente mercado de enzimas para diversas aplicações, tais como a substituição de compostos organoclorados em alguns processos industriais como o biobranqueamento do papel, suplementos alimentares para os seres humanos e animais, produção de biocombustíveis, vacinas, medicamentos, etc (Aehle, W., 2004).
O aparecimento das técnicas de biologia molecular permitiu a produção de enzimas recombinantes. O isolamento de micróbios de fontes termais, utilizados como fonte de isolamento de enzimas nativas, também foi estimulado. Nesse contexto, a produção de enzimas recombinantes através de evolução dirigida e sitio-dirigida facilitou o uso das enzimas de biocatálise industrial e biorefinarias.
Lignocelulose é o maior componente estrutural das células vegetais, representando a maior fonte de material orgânico renovável. A lignocelulose é formada por lignina, hemicelulose e celulose. As propriedades químicas de componentes de lignocelulose fazem deles um substrato de grande valor biotecnológico (Malherbe et al., 2003). Esforços têm sido concentrados no desenvolvimento de tecnologias para conversão desses tipos de biomassa em bicombustíveis, químicos, fontes de energias mais baratas para fermentação e ração animais.
Hemiceluloses são polímeros heterogêneos formados por pentoses (D-xylose, D-arabiose), hexoses (D-manose, D-glucose, D-galactose) e açucarem ácidos (Saha et al., 2000). As hemiceluloses de madeiras duras contêm principalmente xilanas, enquanto em madeiras moles glucomananas são as mais comuns.
Há varias enzimas responsáveis pela degradação da hemicelulose, no caso a xilana, são: a endo-1,4-β-xilanase (EC 3.2.1.8), a β-xilosidase (EC 3.2.1.37), a α-glucuronidase ( EC 3.2.1.139), a α-L-arabionofuranosidase (EC 3.2.1.55) e a acetilxilanaesterase (EC 3.2.1.72) sendo que todas atuam em heteropolímeros na natureza (Turner et al., 2007)
A hidrólise da cadeia da xilana é feita principalmente pela ação de complexos enzimáticos na qual as endo-1,4-β-xilanase, ou simplesmente xilanases, possuem um papel crucial durante a despolimerização dessas cadeias (Wouters et al., 2001). As xilanases podem ser classificadas em duas famílias, a GH10 e GH11, ambas são produzidas pelos mais diferentes tipos de organismos, das bactérias e fungos aos artrópodes.
No processo de conversão da biomassa em etanol, a xilanase é a primeira enzima a ser adicionada, ela tem a função de facilitar o acesso da enzima celulase até a celulose e nesse contexto é defina como enzima acessória. No caso do branqueamento da polpa de celulose, as xilanases facilitam o acesso de produtos químicos (clorados) ou da enzima lacase para eliminação da lignina.
As plantas contêm ampla variedade de enzimas que hidrolisam polissacarídeos complexos. Essas enzimas endógenas são frequentemente reguladas por inibidores protéicos que também podem desempenhar um papel importante na defesa dessa hidrólise enzimática através de microorganismos e predadores. Os primeiros relatos indicando que sementes de cereais contendo inibidores de atividade de xilanases foram publicados no final da década de 1990 (Debyser et al., 1997; Debyser et al., 1998; Rouau et al., 1998).
Na natureza, plantas adaptaram o mecanismo de inibição de xilanases particularmente a partir de organismo fitopatogênicos. Um exemplo de inibidor é a proteína de trigo XIP-I, que atua em xilanases GH11 fúngicas, mas não nas bacterianas (Payan et al., 2004).
A inibição é um processo molecular que nos ajuda a compreender o mecanismo de reconhecimento molecular e caracterização de sítios catalíticos. Muitas vezes a inibição atua por padrões de interação diferentes daqueles exibidos para atividade biológica. O presente estudo visa conhecer a bioquímica fundamental da família GH11 de xilanases, para a partir desse entendimento, poder compreender como o processo inibitório é governado microscopicamente. Esse estudo se encaixa na denominada engenharia de proteínas ou desenho reacional de proteínas. A engenharia de proteínas tem comprovado seu potencial no desenvolvimento de novas aplicações biológicas para estas macromoléculas (Arnold et al., 1996). Em teoria, todas as propriedades de uma enzima podem ser alteradas, mas na pratica a estratégia de desenho reacional é impedida pela complexidade da relação entre a estrutura e função proteica, dificultando a identificação de possíveis alvos para posterior mutagênese sitio dirigida. Dentro desse contexto as técnicas computacionais surgem como ferramentas úteis para contribuir de maneira a poupar gastos e esforços para o desenho de novas enzimas mais eficientes e funcionais.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem como objetivo investigar, por simulações de dinâmica molecular, o processo molecular da inibição de xilanases GH11 pelo XIP-1, para contribuir na elucidação das bases estruturais do processo inibitório desta família de enzimas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudar, por simulação de dinâmica molecular, duas xilanases da família GH11 com diferentes sensibilidades com relação à inibição por acoplamento com a proteína XIP-1;
Caracterizar, por análises computacionais, cada complexo enzima-inibidor através dos efeitos na estabilidade e flexibilidade estrutural e energia de interação;
Compreender diferentes padrões de interações para os processos de inibição e atividade de diferentes xilanases;
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 ESTRUTURA E FUNÇÃO DE PROTEÍNAS
Proteínas são polímeros de aminoácidos resultantes da desidratação dos mesmos formando uma ligação covalente específica entre eles, chamada ligação peptídica (Lehninger et al., 2014), como mostra a Figura 1.
Figura 1 - Formação de uma ligação peptídica por condensação.
Fonte: Lehninger., 2014.
Uma boa compreensão das propriedades químicas dos aminoácidos primários é fundamental para o entendimento da bioquímica estrutural. Este tópico pode ser simplificado pelo agrupamento dos aminoácidos em cinco classes principais, tendo como base as propriedades dos seus grupo R, em particular a sua polaridade, ou tendência para interagir com a água em pH biológico (próximo a 7). Os aminoácidos apresentam propriedades físicas e químicas definidas pelas suas cadeias laterais. Diferentes cadeias laterais conferem diferentes propriedades aos aminoácidos, influenciando na localização do mesmo na proteína e consequentemente na função biológica. As cadeias laterais podem apresentar uma característica não-polar (hidrofóbico), polar ou carregada. As estruturas dos 20 aminoácidos essenciais são mostradas na Figura 2. Em cada classe, existe uma graduação de tamanho, polaridade e forma do grupo R (Lehninger et al., 2014).
Figura 2 - Fórmulas estruturais dos 20 aminoácidos primários de proteína.
Fonte: Lehninger., 2014.
A atividade biológica de uma proteína está intimamente relacionada à sua estrutura tridimensional. As estruturas tridimensionais de uma proteína são descritas em quatro níveis hierárquicos denominados: estruturas primária, secundária, terciária e quaternária, como mostrado na Figura 3. As ligações peptídicas ligam covalentemente os aminoácidos em cadeia, formando a seqüência dos aminoácidos, o que corresponde à estrutura primária. A estrutura secundária refere-se à conformação espacial local adotada pela cadeia principal da proteína. Elas podem ser classificadas em α-hélice, β-folhas e dobras. A estrutura terciária é a estrutura tridimensional de toda a proteína, considerando todas as cadeias laterais. Proteínas que atuam como dímero, trímeros, tetrâmeros e etc, atuam na presença de duas ou mais cadeias polipeptídicas que podem ser idênticas ou não, assim esse arranjo de subunidades protéicas em complexos tridimensionais constitui a estrutura quaternária (Lehninger et al., 2014).
Figura 3 - Níveis de estruturas de proteínas
Fonte: Lehninger., 2014.
Diferentes classes de interações intramoleculares são apontadas como fatores estabilizantes das biomoléculas, como as ligações de hidrogênio, interações iônicas, as interações hidrofóbicas e as interações de van der Waals. Estas interações, principalmente as de curto alcance, como as interações hidrofóbicas e de van der Waals são individualmente mais fracas que as demais citadas, porém coletivamente têm uma influência muito significativa na estabilização das proteínas e demais biomoléculas como os ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios de membranas (Lehninger et al., 2014).
Muitas biomoléculas são anfipáticas: proteínas, algumas vitaminas, esteróides e fosfolipídios de membranas têm regiões superficiais polares e apolares. As estruturas que compõem essas moléculas são estabilizadas por interações hidrofóbicas ao longo das regiões não-polares. As interações hidrofóbicas entre lipídios e entre lipídios e proteínas são os determinantes da estrutura das membranas biológicas. As interações hidrofóbicas entre aminoácidos não-polares também estabilizam o enovelamento tridimensional das proteínas. Macromoléculas tais com o as proteínas, o DNA e o RNA apresentam tantos locais potencialmente favoráveis para a ocorrência de ligações de hidrogênio ou interações iônicas, van der Waals e hidrofóbicas, que o efeito cumulativo dessas forças ao longo de toda a biomolécula constitui um dos principais fatores de estabilização de uma bio(macro)molécula. No caso das proteínas, a estrutura mais estável (nativa) é usualmente aquela que maximiza a formação das interações intramoleculares. Esse princípio determina, também, o enovelamento de uma simples cadeia polipeptídica ou polinucleotídica em sua estrutura tridimensional (Lehninger et al., 2014).
O outro fator que determina juntamente com as interações intramoleculares a estabilidade de uma biomolécula é a sua relação com o solvente, no caso, a água. As biomoléculas polares dissolvem-se facilmente em água porque podem substituir as interações água-água por interações água-soluto, mais favoráveis energeticamente, formando camadas de solvatação que são de suma importância para a estabilidade e atividade biológica das biomoléculas. Portanto, estamos falando das interações intermoleculares, dentre as quais, as principais, quando o solvente é a água, são as ligações de hidrogênio intermoleculares formadas entre as moléculas de água e os grupos polares da biomolécula. Grupos polares do soluto são energeticamente favorecidos pela solvatação e, portanto provocam uma organização local das moléculas da água, diferentemente do que acontece com os grupos não polares, que não conseguem promover o mesmo nível de organização de moléculas de água ao redor. Normalmente, as proteínas se enovelam de forma a compactar da melhor forma possível os resíduos hidrofóbicos no seu interior, gerando um aumento da entropia das moléculas de água, efeito conhecido como entrópico. Em resumo, a estabilidade de uma biomolécula pode ser medida pela variação de energia livre, , a uma dada temperatura T, calculada usando dois termos importantes, o energético (contabilizado pela variação de entalpia do processo, e o entrópico (contabilizado pela variação de entropia do processo, ,) de acordo com a equação abaixo (Lehninger et al., 2014):
As estruturas proteicas evoluíram para atuar em determinados ambientes celulares. Condições diferentes daquelas da célula podem resultar em mudanças estruturais na proteína. A perda estrutural de uma proteína causa perda de sua função, processo conhecido como desnaturação. Isso ocorre devido a vários fatores como, por exemplo, a temperatura, pH e adição de alguns solventes orgânicos miscíveis em água. Cada um desses fatores afeta as interações presentes na proteína, e que são responsável direta pela manutenção da sua estrutura nativa, podendo resultar em ruptura estrutural local da proteína, mudança conformacional ou perda total de estrutura (Lehninger et al., 2014; Voet et al., 1995)
3.2 ENZIMAS
Nos sistemas biológicos os catalisadores são proteínas denominadas enzimas. A catálise tem importância fundamental para a sustentação da vida nos organismos, pois um grande número de reações biológicas requer enzimas para acelerarem tais processos. Nos organismos as enzimas agem em sequências organizadas, catalisando reações sucessivas a partir das quais as moléculas nutrientes são degradadas e a energia liberada é disponível para utilização. Enzimas são proteínas que apresentam funções catalíticas, portanto, possuem uma região denominada sítio catalítico ou sítio ativo, onde ocorrem as reações catalisadas. A catálise em sistemas biológicos não é tarefa exclusiva das enzimas, uns pequenos grupos de moléculas de RNA também apresentam tais funções (ribozimas) (Lehninger et al., 2014).
Como toda proteína, a atividade (catalítica) das enzimas está intimamente associada a sua conformação espacial, ou seja, a sua estrutura tridimensional. A ação biológica exibida por uma enzima depende da integridade da sua estrutura, principalmente do seu sítio catalítico. Então, se uma enzima é desnaturada ou dissociada, sua atividade catalítica é destruída. Assim, desde sua estrutura proteica primária até a quaternária das enzimas são primordiais para atividade catalítica. A propriedade característica das reações catalisadas por enzimas é que a reação ocorre confinada em um bolsão da enzima, denominado sítio ativo, como mostrada na figura 4. A molécula que liga no sítio ativo e sobre a qual a enzima age é denominada substrato. O contorno da superfície do sítio ativo é delimitado por resíduos de aminoácidos com grupos nas cadeias laterais que ligam o substrato e que catalisam a sua transformação química (Lehninger et al., 2014).
Figura 4 - Ligação de um substrato (vermelho) a uma enzima (cinza) no sítio ativo.
A composição em aminoácidos do sítio catalítico aliada à disposição espacial das suas cadeias laterais confere ao sítio ativo o alto grau de especificidade para um determinado substrato (Develin, 1997). Assim como todo catalisador, a enzima promove uma redução da energia de ativação da reação pela estabilização do estado de transição ou complexo ativado, como mostrado na figura 5.
Figura 5 - Energia livre em função das coordenadas de reação comparando a energia livre, G, para reações catalisadas (∆Gcat) e não-catalisadas (∆Gnãocat)
Fonte: http://images.slideplayer.com.br/27/9114010/slides/slide_22.jpg, acesso em 08/08/2016.
As enzimas são classificadas de acordo com as reações que elas catalisam, com base num acordo internacional que permite descrever as propriedades das enzimas, considerando sua classe, subclasse e outras características. Por exemplo, as endo-1,4-β-xilanases, ou simplesmente xilanases, são designadas por E.C.3.2.1.8, grupo das glicosilhidrolases, onde 3 é classe das hidrolases, 2 a sub-classe das glicosilases, 1 se refere as enzimas glicosidases que hidrolisam compostos O- e S-glicosílicos e 8 é a designação para endo-1,4-β-xilanases (Vieira, Davi Serradella., 2007).
3.3 XILANASES
O polissacarídeo hemicelulósico mais abundante na maioria das paredes celulares das plantas terrestres é a xilana (Brett et al., 1996), e sua cadeia principal é formada por resíduos de β-D-xilopiranose unidos por ligações β-1,4- (Aspinall., 1985; Biely., 1993), como mostado na Figura 6. Ezimas hemicelulolíticas são necessárias para hidrolisar completamente a xilana. As enzimas que atuam na cadeia principal das xilanas são as exo-1,4-β-xilosidases e as endo-1,4-β-xilanases ou simplesmente xilanases. Xilanases são produzidas por vários organismos como bactérias, fungos, algas, protozoários e artrópodes e são capazes de hidrolisar as ligações 1,4-β da cadeia principal da xilana, produzindo vários xilo-oligômeros de comprimentos variados (Kulkarni et al., 1999; Kirk et al., 1996).
Figura 6 - δigações β-1,4 da cadeia principal da xilana
Fonte: Vieira, Davi Serradella (2007).
As xilanases podem ser classificadas em duas principais famílias de glicosilhidrolases: a família GH10 e a GH11. A família GH10 é composta por endo-1,4-β-xilanases e endo-1,3-β-xilanases (EC 3.2.1.32) (Coutinho & Henrissat., 1999). Os membros desta família são também capazes de hidrolisar os grupos arilo β-glicósidos de xilobiose e xilotriose na ligação aglicônica. Além disso, estas enzimas são altamente ativas em xilo-oligossacáridos curtos, o que indica que possuem assim pequenos sítios de ligação ao substrato. Análise da estrutura cristalina e análises cinéticas de xilo-oligossacárideos de vários tamanhos e produtos finais indicaram que as xilanases da família 10 têm normalmente de quatro a cinco sítios de ligação com o substrato (Biely et al., 1999). As xilanases da família GH11 são menores, mais consistentes estruturalmente, e mais específicas para a xilana (Kulkarni et al., 1999; Kirk et al., 1996). Essas características apresentadas pelas xilanase GH11 são responsáveis pela ampla aplicabilidade biotecnológica destas enzimas, motivo pelo grande interesse mostrado
nos últimos anos em estuda-lás (Kirk et al., 1996; Du Manoir et al., 1991). A figura 7 apresenta as estruturas tridimensionais características das xilanases GH11 e GH10.
Figura 7 - Estruturas tridimensionais das xilanases: (a) GH10 – PBD:1B3Z; (b) GH11 – PDB: 2C1F
Fonte: Autor, 2016.
Tradicionalmente, classificam-se as diferentes regiões das xilanases GH11 de acordo com uma analogia coma mão direita (dedos, polegar e palma), como mostra a Figura 8. O sitio ativo das xilanases da família GH11 está localizado numa região chamada “cleft”, região formada pela superfície dos domínios palmas e dedos.
Figura 8 - Representação da analogia da mão direita com regiões/domínios das xilanases GH11.
Fonte: Vieira, Davi Serradella (2007).
O sítio catalítico das xilanases GH11 é formado por um cluster de resíduos polares/anfipáticos e carregados, dois deles, os resíduos catalíticos, localizados na palma, são
resíduos de ácidos glutâmicos conservados nessa família de xilanases, a numeração desses resíduos é particular de cada xilanase (Vardakou et al., 2008; Payan et al., 2004). O sitio catalítico de xilanases GH11 interagindo com uma xilopentaose é mostrado na figura 9. A sobreposição estrutural, mostrada na figura 10, evidencia a semelhança entre as estruturas das duas xilanases.
Figura 9 - Estrutura tridimensional de GH11 com xilopentaose ligada ao sítio ativo
Fonte: Autor, 2016.
Figura 10 - Sobreposição das estruturas da NpXyn (vermelho) e XYNC (azul). Códigos PDB: NpXyn (2C1F) e XYNC (1UKR).
No presente trabalho foram estudadas duas xilanases GH11 produzidas pelos fungos Penicillium funicolosum e Neocallimastix patriciarum, denominadas de XYNC e NpXyn, respectivamente. Nessas xilanases, os resíduos catalíticos são: Glu113 e Glu201 na NpXyn, Glu86 e Glu177 na XYNC (Vardakou et al., 2008; Payan et al., 2004). A Figura 10 apresenta as estruturas tridimensionais da XYNC e NpXyn sobrepostas.
3.4 INIBIDOR XIP-1
A proteina inibidora XIP-I (Triticum aestivum), obtida apartir da protéina do trigo, atua inibindo xilanases GH11 de origem fúngica, mas não inibie as de oriem bacteriana. Axilanase NpXyn, obtida a partir deum fungo anaeróbio, é a única insensível à inibição da XIP-I (Vardakou et al., 2008). A estrutura tridimensional da proteina inibidora XIP-1 é mostrada na figura 11.
Figura 11 - Estrutura tridimensional do XIP-1 obtida no Banco de Dados de Proteínas código: 1OMO.
Fonte: Autor, 2016
A inibição das xilanases GH11 pela proteína XIP-1 se dá por interação/acoplamente proteína-proteína. Os complexos NpXyn+XIP-1 e XYNC+XIP-1 estão mostrados na figura 12. A construção desses modelos está discutida na seção 4 - Metodologia.
Figura 12 - Representação tridimensional dos complexos estudados: (a) NpXyn+XIP-1, com resíduos catalíticos representados em esferas, Glu113 (em verde) e Glu201 (em azul); (b) XYNC+XIP-1, Glu86 (em vermelho) e
Glu177 (em amarelo).
3.5 SIMULAÇÃO MOLECULAR
3.5.1 MÉTODO: DINÂMICA MOLECULAR
Em termos simplificados, a dinâmica molécula é uma técnica computacional que determina a movimentação das partículas de um sistema molecular do qual se conhece os potenciais de interação entre as partículas (Allen et al., 1987; Frenkel et al., 1996). A dinâmica molecular permite estudar a evolução temporal das configurações dos constituintes do sistema e, a partir das sequências de posições geradas, determinar as propriedades macroscópicas do sistema, conforme os princípios fundamentais da Mecânica Estatística. Neste método, partículas interagentes, inicialmente dispostas em determinada configuração, movimentam-se sob a influência de potenciais intermoleculares. Conhecendo posições e velocidades de todas as partículas em um dado instante t, pode-se computar as forçar resultantes em cada partícula, devido às interações com as demais e então determinar as posições e velocidades em um instante posterior t + δt, através das equações de movimento Newtonianas. Este procedimento é realizado recursivamente gerando trajetórias atômicas para todo o sistema (Morgon et al., 2014).
Propriedades macroscópicas são sempre médias sobre o ensemble estatístico representativo (equilíbrio ou não-equilíbrio) de sistemas moleculares. Para a geração de um ensemble representativo de equilíbrio dois métodos estão disponíveis: Monte Carlo e dinâmica molecular (DM). Para geração de ensemble de não-equilíbrio e analises de eventos dinâmicos apenas a DM é apropriada. As equações de movimento a serem resolvidas para um sistema de N átomos interagindo são:
⃗
⃗
⃗ ⃗
onde mi é a massa do átomo i, ⃗ são coordenadas de posições do átomo i, ⃗ é a energia potencial total e ⃗⃗ é a força atuante no átomo i.
Para determinar as trajetórias atômicas ao longo do tempo emprega-se um algoritmo para integrar as equações de movimento de Newton, por exemplo, os algoritmos leap-frog (Allen et al., 1987; Frenkel et al., 1996) e Verlet (Verlet., 1967). O algoritmo de leap-frog usa as posições ⃗ no tempo t e as velocidades ⃗⃗ no tempo , onde t é o tempo de integração.
⃗ ⃗ ( ) ⃗
⃗ ⃗ ⃗ O algoritmo de Verlet é dado por:
⃗ ⃗ ⃗ ⃗
Os algoritmos leap-frog e Verlet são equivalentes. Tais algoritmos possibilitam a obtenção de propriedades estruturais, temporais e termodinâmicas.
O número de partículas que compõem o sistema a ser simulado depende da natureza do próprio sistema, das propriedades que se deseja estudar e da capacidade computacional disponível. As propriedades de equilíbrio do sistema em estudo são determinadas a partir de médias temporais sobre um intervalo de tempo suficientemente grande na escala atômica (aproximadamente entre 10-11 a 10-8 segundos de tempo real). O tempo total de simulação depende dos processos dinâmicos que se deseja investigar e da convergência estatística das propriedades de interesse. Algumas propriedades (e.g., energia de interação e distribuição radial de pares) convergem rapidamente, enquanto outras (e.g., pressão, tensão superficial e coeficiente de transporte) requerem longas trajetórias para convergir (Morgon et al., 2014).
Uma característica marcante do método DM é o estabelecimento de forte sinergia com estudos experimentais. Os resultados das investigações experimentais geralmente motivam e guiam os estudos de DM. Os resultados obtidos pela dinâmica, por sua vez, fornecem explicações detalhadas a nível microscópico dos fenômenos observados experimentalmente. Outra característica importante é a diversidade de sistemas tratáveis por essa metodologia. Podem ser estudados por DM desde sistemas homogêneos como gases, fluidos supercríticos, líquidos, soluções e misturas, a sistemas pouco (ou nada) homogêneos como interfaces, filmes de Langmuir-Blodgett, biomembranas, polímeros orgânicos e inorgânicos, polissacarídeos, lipídios, proteínas, ácidos nucléicos e seus complexos, passando por sistemas como zeólitas, argilas, sólidos cristalinos e vítreos, e nanomateriais, dente outros (Morgon et al., 2014).
3.5.2 MODELOS - CAMPOS DE FORÇAS
Em simulação molecular, as proteínas são descritas por modelos que consideram a existência de vários graus de liberdade internos, assim como as interações intra e intermoleculares. Isto resulta em energias, numa classificação simples, de vibração (estiramento, vibração angular e torção), de atração-repulsão e interação puramente eletrostáticas. O campo de força GROMOS96(43A1) (van Gunsteren et al., 1996) é um exemplo de campo de força disponível. Este é adequado para simulação de biomoléculas em solução aquosa, pois foi parametrizado exatamente para essa finalidade (Stocker et al., 2000). O potencial efetivo de interação é desmembrado de acordo com os vários graus de liberdade generalizados. Isso resulta nos seguintes componentes de interação:
1. Estiramento de ligação
Onde rij é a distância entre os átomos i e j; Kvib é uma constante ajustada para descrever a vibração especifica que tem r0 como distância de equilíbrio.
2. Vibração Angular
Onde kθ é uma constante a ser ajustada para descrever a vibração angular especifica que tem θ˚ como ângulo de equilíbrio.
3. Vibração diedral imprópria
Onde Kξ é uma constante a ser ajustada para descrever a vibração diedral imprópria específica que tem ξ0
como ângulo de equilíbrio. Se esta ocorrer átomos1-2-3-4, tem-se que:
⃗⃗ ⃗ ⃗ e
logo:
⃗⃗⃗ ⃗⃗⃗ ⃗⃗⃗ ⃗⃗⃗ Onde sign (ξn) = sign ⃗ ⃗⃗⃗α ) é o sinal de ⃗ ⃗⃗⃗α . 4. Vibração diedral
Onde Kφ e são constantes que devem ser ajustadas para descrever a vibração diedral especifica. Se a vibração diedral ocorrer entre os átomos 1-2-3-4, temos:
⃗⃗ ⃗ ( ⃗ ⃗ ) ⃗
⃗⃗ ⃗⃗ ⃗⃗ ⃗⃗ onde φ é o ângulo de equilíbrio.
5. Interação de van der Waals ou de curto alcance
( )
Onde C12(ij) e C6(ij) são os coeficientes dos termos de repulsão e de atração, respectivamente, que dependem dos tipos de átomos i e j que interagem e que se pertencerem à mesma molécula não podem ser primeiros, segundos ou terceiros vizinhos.
6. Interações de longo alcance: interações coulombianas
A interação entre duas cargas q1 e q2 separadas por uma distância rij é dada pela lei de Coulomb:
( ) onde 0 é a permissividade do vácuo.
As interações coulombianas são interações de longo alcance por serem funções inversamente proporcionais à distância entre as cargas. Em simulação molecular, o tamanho finito e pequeno dos sistemas em estudo não permite considerar as interações coulombianas até distâncias que poderiam ser consideradas suficientes para desprezar os componentes
remanescentes destas interações. De uma maneira geral, as interações são consideradas explicitamente até uma distância, o raio de corte, tal que os cálculos possam ser realizados em tempos factíveis. Portanto, correções devem ser introduzidas para se complementar as energias de interação com as contribuições das cargas presentes além do raio de corte até a maior distância possível. Os métodos citados abaixo têm como função corrigir as interações de longo alcance das falhas provocadas pelo truncamento das interações no raio de corte. Dois métodos que podem ser usados para trabalhar com as forças de longo alcance são geralmente usados, eles são baseados na soma de Ewald (Darden et al., 1993; Essmann et al., 1995) e no campo de reação (Tironi et al., 1995). Na soma de Ewald, as interações entre as cargas, incluindo as imagens, são calculadas. Este método tira vantagens de periodicidade do sistema simulado. O método do campo de reação assume que as interações entre as moléculas presentes além da distância de corte podem ser tratadas pela contribuição média devida às cargas presentes além da distância de corte.
3.5.3 MÉTODOS DE ANÁLISE 1. RMSD
A estabilidade é avaliada pelo desvio quadrático médio, RMSD, que é definido como:
√∑ | ⃗⃗⃗⃗ ⃗ |
onde é o número de átomos usados no cálculo (usa-se os átomos de carbono e nitrogênio da cadeia principal), ⃗⃗⃗ é a posição do átomo i mo tempo t e ⃗⃗⃗⃗ é a posição do átomo i na estrutura de referência. A definição é aplicada após a sobreposição das estruturas. As estruturas de referência usadas são aquelas determinadas por difração de raio-X, obtidas do banco de dados (RCSB Protein Data Bank). O RMSD foi calculado levando em consideração os carbonos α, levando em consideração a média durante o tempo de simulação.
2. Energia potencial de interação
As energias de interação foram calculadas como se segue:
∑ ∑
onde N é o número de átomos da proteína, i e j são átomos da proteína e é a energia de interação entre os átomos i e j.
3.RMSF
A RMSF (Root Mean Square Fluctuation) ou raiz quadrática média da flutuação, calcula a flexibilidade estrutural, utilizando como base os carbonos alfas (Cα) das estruturas. É o desvio padrão da posição de um átomo que é calculado da estrutura média.
√ ∑
onde T é o tempo da trajetória sobre qual a RMSF é calculada, é o tempo de referência, é a posição do resíduo, é a posição dos átomos do resíduo i após a superposição na referência.
4. Alanine Scanning
Alanine Scannnig ou Varredura por Alanina é um método poderoso para analisar interações importantes em interfaces proteína-proteína. A varredura por alanina mede o efeito da eliminação de uma cadeia lateral de um aminoácido na interface protéica através da mutação por alanina. Essas mutações nos possibilitam identificar as principais interações intramoleculares em uma interface protéica (Kortemme et Baker., 2002). Esses resíduos energeticamente importantes presentes na interface protéica são denominados de “hot spots” (Clackson & Wells., 1995). Estudos posteriores sugeriram que a presença de “hotspots” é uma propriedade geral da maioria dos complexos proteína-proteína (Bogan et al., 1998). Resíduos “hot-spots” podem ser definidos, operacionalmente, como aqueles para os quais as mutações de alanina têm efeitos desestabilizadores sobre a energia livre, em mais de 1kcal/mol (Kortemme & Baker., 2002). Valores positivos de energia livre tem efeito desestabilizadores sendo os maiores de 1 kcal/mol os mais importantes, e valores neativos tem efeitos estabilizadores.
O alanine scaning calcula os efeitos de mutações por alanina na energia livre de ligação de um complexo proteína-proteína, e a função é constituída por vários parâmetros, são eles:
∑
onde:
Parte atrativa de um potencial Lennard-Jones Um termo linear repulsivo dependente da distância
Potencial de uma ligação de hidrogênio cadeia lateral-backbone dependente daorientação
Potencial dependente da orientação de ligação de hidrogênio das cadeias laterais
Modelo de solvatação implícita
W Pesos relativos dos diferentes termos de energia
Tipo de aminoácidos (aa) dependente do ângulo de torção da cadeia
Tipo de aminoácido dependente da energia de referência , que se aproxima da interacções feitas no estado desdobrado, o conjunto (Kuhlman & Baker., 2000) (naa é o número de aminoácidos de um determinado tipo).
Os complexos estudados tiveram o valor de energia livre, ,calculados usando o programa Robetta,disponível em http://robetta.bakerlab.org/alaninescan.
5. Distâncias entre os resíduos catalíticos
As distancias entre os resíduos catalíticos e o XIP-I, em função do tempo, foram calculadas segundo a equação:
⃗⃗⃗⃗ ⃗
Onde ⃗⃗⃗⃗ é a posição de referência, no caso do resíduo Arg149, e ⃗ é a posição do resíduos catalíticos das xilanases.
4. METODOLOGIA
4.1 CONDIÇÕES DE SIMULAÇÃO
Os sistemas foram simulados usando o programa de dinâmica molecular GROMACS 4.5.5 (Lindahl et al., 2001) e modelados pelo campo de força GROMOS96 (43A1) (van Gunsteren et al., 1996), sendo que o modelo SPC (Berendsen et al., 1981) foi usado para descrever as moléculas de água. A temperatura foi controlada usando o algoritmo de Berendsen (Berendsen et al., 1984). O algoritmo LINCS (Hess et al., 1997) foi usado para restringir a distância de ligação com átomos de hidrogênio, e o SETTLE (Miyamoto & Kollman., 1992) para restrição da geometria da molécula de água. O algoritmo leap-frog (Allen et al., 1987; Frenkel et al., 1996) foi aplicado para integrar a equação de movimento com tempo de integração de 2.0fs. Inicialmente o sistema foi inicializado com velocidades atômicas derivadas da distribuição de Maxwell em 298 K. As interações de longo alcance foram tratadas usando particle-mesh Ewald sum (PME), considerando um cutoff de 1,2 nm e tabelas de vizinhos atualizadas a cada 10 fs. A proteína, por ser globular, foi imersa em uma caixa dodecaédrica de lados 9,0 nm. Íons também foram incluídos para neutralizar o sistema, e o utilizamos um pH 7,0.
4.2 ESTRUTURAS DAS ENZIMAS E COMPLEXOS SIMULADOS
As estruturas iniciais das simulações foram determinadas por difração de raios-X e obtidas no banco de dados de proteínas (www.rcsb/pdb). As xilanases simuladas, NpXyn e XYNC, foram produzidas pelos fungos Neocallimastix patriciarum e Penicillium funicolosum, respectivamente, ambas da família GH11. Estão registradas com os seguintes códigos PDB: NpXyn (2C1F) e XYNC (1UKR). A XYNC contém 190 resíduos de aminoácidos, e a NpXyn contém 219 resíduos de aminoácidos e isso confere as diferenças na estrutura e no tamanho das xilanases. A XIP-1 contém 274 resíduos de aminoácidos.
O complexo XYNC+XIP-1 foi obtido do banco de dados de proteínas sob o código 1TE1 (Payan et al., 2004). O sistema NpXyn+XIP-1 foi construído baseado na estrutura do complexo XYNC+XIP-1. Realizou-se uma sobreposição da NpXyn com a XYNC no complexo com a XIP-1, e na sequência deletou-se as coordenadas referentes aos átomos da XYNC, restando no arquivo apenas a NpXyn e a XIP-1. Após a construção do complexo NpXyn+XIP-1, o mesmo foi submetido à etapas de minimização de energia (steepest decent e
dinâmica de restrição) para relaxar as cadeias laterais dos resíduos e eliminar possíveis excessos de energias repulsivas.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ESTABILIDADE ESTRUTURAL
Da análise das estruturas estáticas (raios-X) podem-se fazer algumas análises importantes e prévias às análises dos resultados de simulação. A região do polegar da NpXyn é mais extensa do que da XYNC devido a presença da Gly154. O NH e Cα desse aminoácido se aproximam do grupo carbonila da Ala144 do XIP-1, como mostrado na figura 13. A presença da Gly154 parece oferecer um impedimento estérico para que a alça da XIP-1 (resíduos 148-153) não interaja com a fenda catalítica (cleft) da NpXyn. Estes resultados revelam que o reconhecimento molecular xilanases GH11+XIP-1 depende de determinantes estruturais nas regiões (polegar e palma).
Figura 13 - Resíduo Gly154 da NpXyn (esferas verde) confrontando o Ala144 (esferas azul) do XIP-1.
Fonte: Autor, 2016.
Na NpXyn, a região entre a Leu25-Asn31 também contribui estericamente para a inibição. Especificamente a Asn27, Thr28 e Gly29 (Vardakou et al., 2008). A região é mostrada na figura 14.
Figura 14 - Região dos dedos (roxo) confronta estericamente o inibidor.
Fonte: Autor, 2016.
Outro resíduo da XIP-1 importante para a inibição das xilanases GH11 fúngicas, reportado pela literatura (Payan et al., 2004), é o Arg149, figura 15.
Figura 15 - Arg149 (esferas vermelhas) é um resíduo muito importante para interação com sito ativo da XYNC.
As análises das trajetórias obtidas das simulações de DM começam pela avaliação da estabilidade das estruturas geradas pelas simulações, através da raiz do desvio quadrático médio (RMSD). O RMSD foi calculado usando como referência a estrutura inicial da simulação (t=0.0ps) tomando os átomos de carbono alfa (Cα) para realizar os cálculos após a sobreposição das estruturas tridimensionais. Foram computados os RεSD’s separadamente para cada complexo xilanase GH11/XIP-1 para avaliar a conservação/modificação da estrutura tridimensional de cada proteína. As figuras 16 e 17 apresentam o RMSD, em função do tempo, para as xilanases NpXyn e XYNC, e para a proteína inibidora XIP-1 complexada com NpXyn e XYNC, respectivamente. No início das simulações, normalmente, o RMSD apresenta valores crescentes, como se pode observar nas figuras 16 e 17, que acontece devido à relaxação da estrutura tridimensional pelo solvente e efeito térmico. As etapas anteriores de minimização não são suficientes para completar o processo de relaxamento da estrutura proteica, que é alcançado no começo da simulação num período chamado de Equilibração ou Termalização. O tempo de equilibração de cada proteína depende do campo de força usado, da temperatura, modelo de água, concentração de íons e restrições usadas.
Figura 16 - RMSD(t) para as xilanases NpXyn e XYNC.
Fonte: Autor, 2016. 0 20000 40000 60000 80000 100000 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 R a iz d o d e sv io q u a d rá tic o m é d io ( n m ) Tempo (ps) XYNC NpXyn
Figura 17 - RMSD(t) para as para os inibidores XIP-1+NpXyn e XIP-1+XYNC
Fonte: Autor, 2016.
A tabela 1 apresenta os tempos de equilibração para cada proteína estudada nesse trabalho, de acordo com as condições de simulação, e os respectivos valores temporais médios do RMSD para cada uma. As transições observadas nos perfis do RMSD para as xilanases são características da movimentação abre-fecha realizada pelo polegar e pela movimentação das voltas-β da região dos dedos, rica em resíduos de Gly. Essas transições dependem de vários fatores, como temperatura e extensão da região do polegar, por isso cada xilanase tende a exibir essas transições em diferentes intervalos de tempo.
Tabela 1: Tempos de equilibração das proteínas e valores médios de RMSD. Proteína Tempo de equilibração (ps) Valores médios de RMSD e
desvio padrão NpXyn 27000 0,2195±0,0206 XIP-1 (NpXyn) 55000 0,3109±0,0620 XYNC 70000 0,2227±0,0288 XIP-1 (XYNC) 32000 0,2620±0,0362 Fonte: Autor, 2016. 0 20000 40000 60000 80000 100000 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 R a iz d o d e sv io q u a d rá tic o m é d io ( n m ) Tempo (ps) XIP-1 (XYNC) XIP-1 (NpXyn)
É interessante observar a figura 17, na qual pode-se ver dois distintos comportamentos da XIP-1 em diferentes complexos. A XIP-1 quando complexada com a XYNC exibe uma dinâmica mais restrita, com valores de RMSD cerca de 0.5nm menores do que quando complexada com a NpXyn. Isso se deve ao encaixe da xilanase com a XIP-1 que é mais efetivo no complexo XYNC-XIP-1 do que no complexo NpXyn+XIP-1. No caso do complexo NpXyn+XIP-1 a XIP-1 se mantém mais flexível devido ao acoplamento/encaixe ineficaz.
5.2 FLEXIBILIDADE E RIGIDEZ
Flexibilidade/rigidez local pode ser analisada através do RMSF por resíduo. Os cálculos são feitos para os átomos de Cα de cada resíduo, e então um valor médio é computado considerando todas as configurações da trajetória gerada pela simulação duranto todo o tempo. O RMSF pode ser interpretado como um parâmetro para quantificar a flexibilidade da proteína, local ou total, pois apresenta boa correlação com o Fator B de temperatura obtida por difração de raios-X (Kuzmanic & Zagrovic., 2010). Altos valores de RMSF indicam alta flexibilidade, enquanto baixos valores indicam rigidez ou menor flexibilidade. O RMSF por resíduo para as xilanases NpXyn e XYNC estão apresentados nas figuras 18 e 19, respectivamente.
Figura 18 - Valores de RMSF da NpXyn por resíduo.
0 50 100 150 200 250 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Domínio do polegar Domínio dos dedos
R a iz q a u d rá tic a m é d ia d a flu tu a çã o ( n m ) Resíduo
Fonte: Autor, 2016.
Figura 19 - Valores de RMSF da XYNC por resíduo
Fonte: Autor, 2016.
As figuras 18 e 19 mostram destacadamente as regiões de interesse para o problema da inibição, as regiões dos dedos e polegar. Essas regiões apresentaram grandes diferenças de flexibilidade, em cada complexo. Como já foi discutido, as estruturas tridimensionais das xilanases GH11 podem ser divididas em regiões classificadas de acordo com a analogia com a mão direita, o que nos possibilita identificar o comportamento destas regiões. A região dos dedos apresenta alguns pontos de alta flexibilidade alternando com resíduos de alta rigidez, tais resíduos flexíveis são resíduos de glicina que constituem, essencialmente, as voltas-β presentes nessa região. Outra região de grande importância catalítica é a região do polegar. Essa região é de grande importância no presente estudo devido a sua funcionalidade na dinâmica da proteína. A região do polegar apresenta caracteristicamente uma grande flexibilidade devida sua movimentação do tipo “abre-fecha” que controla a entrada e saída do substrato (xilana). Essa movimentação é bem definida e caracterizada na literatura (Vieira et al., 2009). 0 50 100 150 200 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 Domínio do polegar
Domínio dos dedos
R a iz q u a d rá tic a m é d ia d a flu tu a çã o ( n m ) Resíduo
Com isso, é possível observar pela figura 19, que a XYNC tem maior flexibilidade das regiões dos dedos e do polegar, o que proporciona melhores condições de acessibilidade ao seu sítio catalítico. Na figura 18, temos as mesmas regiões destacadas, e é possível observar que tanto a região dos dedos quanto a do polegar estão muito mais rígidas, comparadas com as da XYNC. Isso mostra que a NpXyn realiza um movimento “abre-fecha” ineficiente para a XIP-1 acessar o sítio catalítico, que resulta na insensibilidade à inibição. Foi possível explicar microscopicamente, através do RMSF, o que resultava na insensibilidade da NpXyn ao XIP-1, já que a literatura só justificava o processo macroscopicamente. Em outras palavras, a dinâmica molecular elucidou o entendimento sobre o processo de inibição de dessas xilanases.
A análise de flexibilidade da XIP-1 também foi realizada usando o RMSF como medida, porém como temos o mesmo inibidor em ambos complexos, podemos fazer um único gráfico contendo a comparação da flexibilidade exibida nos diferentes complexos. A figura 20 mostra a razão entre os RεSF’s calculados para a XIP-1 nos complexos com a Npxyn e a Xync, ) ( ) ( Xync RMSF Npxyn RMSF XIP XIP . Os valores de ) ( ) ( Xync RMSF Npxyn RMSF XIP
XIP próximos a 1,0 identificam os
resíduos da XIP-1 que apresentaram flexibilidades semelhantes quando complexados com
ambas xilanases, valores 1,0
) ( ) ( Xync RMSF Npxyn RMSF XIP
XIP identificam os resíduos da XIP-1 que
apresentaram maior flexibilidade no complexo com a NpXyn, já os valores 1,0 denotam os resíduos da XIP-1 de maior flexibilidade na XYNC.
Figura 20 - Os valores de entre a razão do RMSF XIP (NpXyn) pelo RMSF XIP (XYNC), por resíduo.
Fonte: Autor, 2016.
Assim, pode-se observar que há uma maior densidade de pontos na região abaixo de 1.0, indicando que no geral a XIP-1 mostra-se mais flexível complexada com a XYNC do que com a NpXyn. Notamos uma alta flutuação na região entre os resíduos 200 e 225, que está distante da “cabeça inibitória” da XIP-1, tal fato se deve a essa região ser rica em resíduos de Gly e Ala que apresentam cadeias laterais pouco volumosas, resultando numa flutuação local elevada.
Avaliando comparativamente os RMSF para o resíduo Arg149 observa-se que o mesmo se apresenta mais flexível na presença da xilanase XYNC indicando que a sua importância destacada pela literatura (Payan et al., 2004), aparentemente, não pode ser correlacionada com a flexibilidade e sim com o encaixe proteína-proteína, como será discutido a frente pela distância entre esses resíduos e a XIP-1.
0 50 100 150 200 250 300 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 R a iz q u a d rá tic a m é d ia d a flu tu a çã o ( n m ) Resíduo
5.3 ENERGIA POTENCIAL DE INTERAÇÃO (EPI)
A energia potencial de interação (EPI) é um dos principais parâmetros para quantificar a afinidade de um determinado encaixe ou reconhecimento molecular. A EPI foi calculada para ambos os complexos e estão apresentadas na figura 21. Como os resíduos catalíticos já eram conhecidos (Glu113 e Glu201 na NpXyn, Glu86 e Glu177 na XYNC), a EPI foi calculada utilizando apenas os resíduos catalíticos das xilanases com os resíduos mais próximos da XIP-1. Os resultados mostram que o complexo NpXyn+XIP-1 apresentou valores concentrados de EPI com grande densidade de pontos entre 0 e -5 kcal/mol, enquanto que no complexo XYNC+XIP-1 as interações atingiram energias com valores cerca de 6 a 7 vezes mais atrativas. Já era esperado que a XYNC, que sofre inibição, apresentasse EPI mais atrativa (valores negativos) do que a NpXyn, pois já que sofria inibição estava interagindo mais fortemente com a XIP-1. A tabela 2 apresenta os valores de energia potencial média para cada complexo analisado. Os resultados da EPI indicam a quantificação do processo de inibição, já que a XYNC tem um valor de EPI cerca de oito vezes mais atrativa, comparada com a NpXyn, ambas frente ao inibidor. Os perfis de EPI apresentados na figura 21 mostram quantitativamente as diferenças no acoplamento proteína-proteína desses complexos.
Figura 21 - Energia potencial de interação dos complexos.
Fonte: Autor, 2016. 0 20000 40000 60000 80000 100000 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 EP I ( kc a l/m o l) Tempo (ps) XYNC NpXyn
Tabela 2 - Valores de energia potencial de interação média dos complexos.
Complexo EPI média(kcal/mol)
NpXyn-XIP-I -1.63 kcal/mol
XYNC-XIP-I -9.27 kcal/mol
Fonte: Autor, 2016.
5.4 ALANINE SCANNING
A varredura das interfaces por Alanine Scanning é, geralmente, importante para identificar os resíduos de aminoácidos importantes para a estabilização de uma interface proteína-proteína bem como quantificar a contribuição de cada um deles. Após a varredura dos resíduos contidos nas superfícies detectam-se os resíduos de interface proteína-proteína por critério de distância e cada resíduo de interface detectado e substituído por Alanina computando-se, em seguida, o G. Valores de G1.0kcal/molcaracterizam um efeito desestabilizante proveniente da substituição do resíduo em questão por Alanina, sendo assim, considera-se que o resíduo substituído é um "hot-spot".
Os “hot-spots” detectados para os complexo NpXyn e XYNC são mostrados na figura 22 e na tabela 3. Foram detectados 4 “hot-spots” na região/domínio dos dedos e 1 “hot-spots” na região/domínio do polegar, na NpXyn. Sendo o de maior desestabilização o ASN27, com ∆∆G = 3.78 kcal/mol, que está na faixa dos resíduos, da região dos dedos, que confrontam estericamente o inibidor, segundo Vardakou et al., 2008. Para a XYNC, foi detectado apenas 1“hot-spots” na região/domínio dos dedos da XYNC, mostrado na figura 22 e tabela 3. Este resíduo localiza-se na região dos dedos e apresenta 1
. 74 . 3 G kcalmol .
Na XIP-1+Npxyn foram detectados 5 “hot-spots”, como mostrados na figura 23 e tabela 4, dos quais três estão próximo a chamada “cabeça inibitória”, que corresponde a alça (resíduos 148-153), que é uma região que acessaria diretamente a fenda (região da palma) da NpXyn onde estão os resíduos catalíticos não fosse a presença da Gly154 na NpXyn, que confrontam o grupo a Ala144 do XIP-1. Já para a XIP-1+XYNC também foram detectados 5 “hot-spots”, mostrados na figura 23 e tabela 4, dentre os quais está a ARG149, que trata-se do resíduo mais importante para a inibição da XYNC. Os “hot-spots” dos complexos
XIP-1+NpXyn e XYNC+XIP-1 estão representados na estrutura tridimensional do complexo, na figura 24.
A identificação de “hot-spots” unicamente não é indicativo do processo inibitório, pois a presença do mesmo indica apenas a existência de uma interface proteica que pode estar acontecendo nas mais diversas regiões de contato entre as proteínas. Porém, quando identificados na região de interesse podem ser considerados como importantes opções para estudos de mutações sítio-dirigida com o intuito de maximizar ou minimizar tal interface.
Figura 22 - Resíduos “hot-spots” da xilanase NpXyn (A) e XYNC (B). Fonte: Autor, 2016. 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 1 2 3 4 En e rg ia L iv re ( Kc a l/m o l) Resíduos Δ Δ G (kc a l/m o l) 20 40 60 80 100 120 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 En e rg ia L iv re ( Kc a l/ m o l) Resíduos Δ Δ G (kc al/m ol)
A
B
Tabela 3 - Resíduos “hot-spots” localizados na NpXyn e XYNC em diferentes regiões e os seus valores de G após a mutação. NpXyn XYNC Resíduo “Hot-spot” Região ( / ) mol kcal G Resíduo “Hot-spot” Região ( / ) mol kcal G GLN11 Dedos 2.49 THR19 Dedos 3.74 GLU22 Dedos 3.54 TRP24 Dedos 1.19 ASN27 Dedos 3.78 SER155 Polegar 2.67 TYR194 - 1.48 Fonte: Autor, 2016.
Figura 23 - Resíduos “hot-spots” da XIP-1 complexada com Npxyn (A) e com a XYNC (B) Fonte: Autor, 2016.
A
B
80 100 120 140 160 180 0 1 2 3 4 5 6 En e rg ia L iv re ( Kc a l/m o l) Resíduos Δ Δ G (kcal/m o l) 80 100 120 140 160 180 200 220 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 En e rg ia L iv re ( Kc a l/ m o l) Resíduos Δ Δ G (kcal/m o l)Tabela 4 - Resíduos “hot-spots” da XIP-1 complexada com Npxyn e com a XYNC, e seus valores de
G
após a mutação.
XIP-1+NpXyn XIP-1+XYNC
Resíduo “Hot-spot” G(kcal/mol) Resíduo “Hot-spot” G(kcal/mol)
GLN67 5.73 GLN67 1.74 ASP121 3.41 ILE148 1.20 ASN147 3,41 ARG149 1.13 ILE148 1.40 LYS154 2.04 LYS154 1.37 GLU182 1.68 Fonte: Autor, 2016.
Figura 24 - Localização dos “hot-spots” da NpXyn (esferas cinza) e da XIP-1 (esferas verdes) (A); da XYNC (esferas amarelas) e da XIP-1 (esferas roxas).
Fonte: Autor, 2016.
A
5.5 DISTÂNICAS DOS RESÍDUOS CATALÍTICOS COM A ARG149 DO INIBIDOR
A média das distâncias entre os resíduos catalíticos das xilanases e do resíduo Arg149 do inibidor XIP-I foi feita para obter parâmetros sobre a proximidade dos ácidos glutâmicos catalíticos que interagem com o inibidor, através do resíduo Arg149, como mostrado na figura 25. Quanto maior a proximidade espacial entre os resíduos, maior será a probabilidade de interação e menor será a energia potencial de interação.
Figura 25 - Distância dos entre os resíduos catalíticos das xilanases e o resíduo Arg149 do inibidor (XIP-1).
Fonte: Autor, 2016.
A figura 25 apresenta as distâncias médias entre os resíduos catalíticos e a Arg149 do inibidor. Em média, tem-se que o resíduo Arg149 do inibidor encontra-se 0.35nm mais próximo dos resíduos catalíticos da XYNC comparado à xilanase NpXyn. Desse modo, o resíduo Arg149 atua bloqueando o sítio catalítico da XYNC, algo que não acontece na mesma intensidade na xilanase NpXyn. Este fenômeno pode ser explicado pela presença dos resíduos “hot-spots” na região dos dedos da NpXyn, capaz de formar uma interface estável com a proteína inibidora antes mesmo do resíduo Arg149 (inibidor), bloqueando a interação com os resíduos catalíticos. No caso da XYNC, a ausência de resíduos “hot-spots”, na região dos dedos, suficientes para formar essa interface protéica permite que o resíduo Arg149 se
0 20000 40000 60000 80000 100000 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 D is tâ n ci a m é d ia ( n m ) Tempo (ns)
NpXyn (Glu113 e Glu201) XYNC (Glu86 e Glu177)
aproxime dos resíduos catalíticos da xilanase bloqueando-os, e provavelmente causando a inibição da mesma. Distâncias menores (Arg149-resíduos catalíticos) geram energias de interação mais atrativas. A análise local dos resíduos catalíticos foi fundamental para a identificação e explicação dos possíveis fatores responsáveis pelas diferentes sensibilidades à inibição exibida por essas xilanases.
6. CONCLUSÕES
O cálculo do RMSD ao longo da DM nos mostrou o quanto os complexos se estabilizaram estruturalmente ao longo do tempo de simulação. Verificaram-se tempos de equilibração distintos para cada proteína dos complexos simulados, devido às diferentes movimentações abre-fecha característicos das xilanases GH11.
As diferenças na movimentação da região/domínios dos dedos e polegar são decisivas para o processo de inibição, pois podem permitir ou não o acesso da XIP-1 ao sítio ativo das xilanases. Foi evidenciado pelos resultados que a NpXyn (não inibida) tinha as regiões/domínios mais travadas em relação a XYNC (inibida), e isso possibilitava à primeira alcançar uma conformação mais fechada, causando impedimento estérico. Os diferentes perfis de flexibilidade apresentados por essas xilanases em contato com o mesmo inibidor é um potencial indicativo que o processo de inibição está sendo governado, essencialmente, pela dinâmica do acoplamento proteína-proteína.
A quantificação do processo de inibição dessas xilanase pela proteína XIP-1 pode ser obtida a partir da energia potencial de interação entre os resíduos catalíticos (conhecidos previamente) e os resíduos mais próximos da XIP-1. A diferença energética de aproximadamente -8 kcal/mol entre a XYNC+XIP-1 e NpXyn+XIP-1 é suficiente para justificar o reconhecimento molecular que ocorre no complexo XYNC+XIP-1.
Alguns resíduos presentes na região/domínio dos dedos da NpXyn, tem o papel de impedir o acesso do inibidor à região catalítica através da formação de uma interface estável com a XIP-1, caracterizada pela identificação de 5 hot-spots. Os “hot-spots” identificados são os primeiros alvos de estudos de mutação sítio dirigida para desestabilizar uma interface proteica.
Uma proximidade maior entre os resíduos catalíticos da XYNC com o resíduo ARG149 do inibidor evidencia que há uma maior interação entre eles. Portanto, quanto menor a distância entre esses 3 resíduos, mais atrativa será a energia potencial de interação e consequentemente maior será a interação.
Com esse estudo foi possível correlacionar todo o aporte que já era conhecido, de bases experimentais, com a aplicação da dinâmica molecular para compreender melhor a nível microscópico, o processo molecular da inibição de xilanases GH11.
