SELEÇÃO DE PRIMERS ISSR PARA ESTUDOS DE DIVERSIDADE GENÉTICA EM MINIJARDIM CLONAL DE Dalbergia nigra (Vell.) Allem. Ex Benth

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XXII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVIII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VIII Encontro de Iniciação à Docência - Universidade do Vale do Paraíba. 1

SELEÇÃO DE PRIMERS ISSR PARA ESTUDOS DE DIVERSIDADE GENÉTICA

EM MINIJARDIM CLONAL DE Dalbergia nigra (Vell.) Allem. Ex Benth

Aline Ramalho Dos Santos

1

_{, Elbya Leão Gibson}

1

_{, Adelson Lemes da Silva}

Júnior

2

_{, Lucimara Cruz de Souza}

2

_{, Elzimar de Oliveira Gonçalves}

1

_{, Fábio}

Demolinari de Miranda

3

_.

1_{Universidade Federal do Espírito Santo, Departamento de Ciências Florestais e da Madeira, Av.Gov.} Lindemberg, 316 – Centro, Jerônimo Monteiro - ES, Brasil,alineramalho12@hotmail.com,

elbyagibson@hotmail.com, elzimarog@yahoo.com.br.

2_{Universidade Federal do Espírito Santo – Centro de Ciências Agrárias e Engenharias/ Laboratório de} Bioquímica e Biologia Molecular/ Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, Alto

universitário, s/n – Guararema, Alegre – ES, Brasil, adelsonlemes@yahoo.com.br, lucimaracruz@yahoo.com.

3Universidade Federal do Espírito Santo – Centro de Ciências Exatas e Naturais e da saúde / Departamento de Biologia, Alto Universitário, s/n – Guararema, Alegre – ES, Brasil,

tcarrijo@gmail.com, fademolinari@yahoo.com.br.

Resumo - O objetivo deste trabalho foi selecionar primers ISSR para serem utilizados em futuras

análises de diversidade genética em Dalbergia nigra. Para isto, foram utilizadas folhas coletadas em 4 indivíduos da espécie, para a realização da extração e purificação do DNA genômico. Posteriormente, as amostras de DNA foram submetidas a ensaios de PCR utilizando 24 primers, seguida por eletroforese em gel de agarose, de modo a permitir a avaliação e seleção dos primers com maior qualidade de amplificação. Foram selecionados 11 primers por possuírem número considerável de locos polimórficos, além de serem nítidos e bem definidos, os quais geraram 180 fragmentos, demonstrando que a quantidade de marcadores moleculares ISSR utilizados neste estudo são suficientes para quantificar a diversidade genética em futuros trabalhos com populações da espécie.

Palavras-chave:

jacarandá-da-bahia, variabilidade genética, polimorfismo, marcador molecular.

Área do Conhecimento: Engenharia agronômica Introdução

Dalbergia nigra (Vell.) Allemão ex Benth, popularmente conhecida como jacarandá-da-bahia, é

uma espécie arbórea endêmica da Floresta Atlântica Brasileira, com distribuição natural nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo (CARVALHO, 2003).

A espécie tem valor econômico extremamente alto, considerada a melhor madeira do Brasil para construção civil, fabricação de móveis finos, instrumentos musicais e decorativos. A árvore é ainda muito ornamental, principalmente pela inflorescência de reconhecida beleza cênica e agradável aroma, folhagem delicada e forma aberta de sua copa, tendo grande potencial para uso no paisagismo em áreas amplas (CARVALHO, 2003).

A exploração desordenada dessa espécie, em virtude de a madeira ser de ótima qualidade, além da devastação de seu ambiente natural, ocasionou sua inclusão na lista de espécies da flora brasileira ameaçadas de extinção, na categoria vulnerável (MMA, 2014). Além disso, estudos conduzidos mostram que a fragmentação das subpopulações e do hábitat está diminuindo a diversidade genética da espécie. Populações pequenas e isoladas sofrem endogamia, acelera a perda da diversidade genética, o que leva a depressão endogâmica e menor habilidade de evoluírem em resposta as mudanças ambientais (FRANKHAM et al., 2008).

O uso de marcadores moleculares dominantes ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) são amplamente utilizados nos estudos de diversidade genética, devido ao seu alto caráter informativo na detecção de polimorfismos, baixo custo, abundantes no genoma e reprodutíveis entre laboratórios (SANTANA et al., 2011). Esse tipo de marcador permite a identificação de ampla variabilidade intra e

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XXII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVIII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VIII Encontro de Iniciação à Docência - Universidade do Vale do Paraíba. 2 interespecíficas e, com isso, fundamentam-se como uma ferramenta bastante útil em programas de melhoramento e estudos de diversidade (LORENZONI et al., 2014).

No entanto, para determinar estratégias de conservação, são necessários bons resultados com estudos genéticos, logo, a seleção de primers funcionais se torna um pré-requisito antes da análise amostral completa, a fim de garantir o uso de iniciadores que apresentem o melhor perfil de amplificação (SILVA et al., 2015). Considerando o exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética em minijardim clonal de Dalbergia nigra, e fornecer subsídios para a conservação e multiplicação de genótipos superiores.

Metodologia

Amostras foliares de aspecto saudável de D. nigra foram coletadas aleatoriamente em minicepas obtidas por propagação sexuada. As plantas matrizes que compõem o jardim miniclonal são originadas de duas procedências de sementes de D. nigra, sendo uma coletada no município de Viçosa, Minas Gerais e a outra no município de Linhares, Espírito Santo, adquiridas via comercialização realizada por empresa registrada no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). As minicepas foram alocadas em vasos com capacidade volumétrica de 3,8 L, previamente adubadas com 4,0 e 8,0 g dm-3_{, do fertilizante de liberação controlada Basacote® Mini} 6M, com tempo de liberação de 5 a 6 meses, visando manter o status nutricional adequado para produção de material vegetativo (miniestacas). O manejo do jardim miniclonal foi realizado com irrigações diárias para a manutenção da turgescência, podas seletivas na coleta e manutenção das miniestacas necessárias a experimentação (GATTI et al., 2011).

O minijardim clonal está localizado na área experimental do Departamento de Ciências Florestais e da Madeira, do Centro de Ciências Agrárias e Engenharias, pertencente à Universidade Federal do Espírito Santo (DCFM-UFES), localizado no município de Jerônimo Monteiro – ES, apresentando latitude de 20º 47’S e longitude de 41º 24’W e altitude de 120 m.

Figura 1. Minijardim clonal de Dalbergia nigra conduzido em vasos. Jerônimo Monteiro, ES.

Fonte: o autor

Para os procedimentos dos testes de amplificação, utilizou-se amostras de DNA de quatro indivíduos, sendo dois de cada procedência. A extração do DNA genômico foi realizada segundo o protocolo de extração proposto por Doyle e Doyle (1990), considerando as modificações propostas

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XXII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVIII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VIII Encontro de Iniciação à Docência - Universidade do Vale do Paraíba. 3 pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), adequado para espécies vegetais com altas concentrações de polissacarídeos.

Nas reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) foram utilizados 24 primers ISSR da University of British Columbia (Tabela 1). Em cada reação utilizou-se um mix com volume final de 20 μL, contendo: tampão 1X (10 mM de Tris-HCl pH 8,5 e 50 mM de KCl), 2,5 mM de MgCl2, 0,25 mM de cada dNTP, 0,2 μM de primer, 1 unidade de Taq DNA polimerase e cerca de 50ng de DNA genômico. Tabela 1. Primers ISSR produzidos pela University of British Columbia e suas respectivas sequências testados em amostras de DNA de quatro indivíduos da espécie Dalbergia nigra.

Primers Sequências (5'-3')

UBC 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT

UBC 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC

UBC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG

UBC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT

UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC

UBC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA

UBC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT

UBC 814 CTC TCT CTC TCT CTC TA

UBC 815 CTC TCT CTC TCT CTC TG

UBC 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT

UBC 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG

UBC 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA

UBC 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT

UBC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG

UBC 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT

UBC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA

UBC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT

UBC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG

UBC 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT

UBC 864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG

UBC 866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC

UBC 868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA

UBC 876 GAT AGA TAG ACA GAC A

UBC 891 HVH TGT GTG TGT GTG TG

* A = Adenina; T = Timina; C = Citosina; G = Guanina; H = (A, T ou C); R = (A ou G); V = (A, C ou G) e Y = (C ou T).

As amplificações foram realizadas com auxílio de um termociclador Applied Biosystems, com etapa inicial de desnaturação a 94°C por 5 minutos. Em seguida, foram programados 35 ciclos constituídos de três etapas: 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 52°C e 90 segundos a 72°C. Ao final desses ciclos seguiram-se por uma extensão final de 72°C por 7 minutos.

Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese utilizando-se gel de agarose a 2%, por aproximadamente 5 horas a 100 Volts. Após separação dos fragmentos, os géis foram submergidos em solução de brometo de etídio (0,50 μg/mL) durante 40 min, em seguida foram fotografados sob luz UV em fotodocumentador, permitindo a distinção entre presença e ausência de bandas, além do tamanho dos fragmentos com auxílio do marcador de peso molecular Ladder 100bp. Os produtos amplificados foram avaliados como presença (1) ou ausência (0) de bandas, utilizada para a elaboração da matriz binária. A partir dessa matriz, foi realizada uma análise descritiva dos dados obtendo se o número total de bandas (NTB), número de bandas polimórficas (NBP) e a porcentagem de bandas polimórficas (PBP), por meio desta, foi possível identificar quais primers apresentaram melhor perfil de amplificação.

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Resultados

Dentre os 24 primers testados, 11 foram selecionados, por possuir número considerável de fragmentos, bom padrão de amplificação, bandas nítidas e bem definidas (Figura 2), proporcionando um total de 180 bandas (Tabela 2).

Figura 2. Padrão de bandas demonstrado em gel de agarose produzidos pelos primers UBC 813, UBC 814 e UBC 815 em quatro indivíduos de D. nigra. M – Marcador (Ladder 100 pb).

Fonte: o autor

A quantidade de bandas por primer variou de 7 (UBC 868) a 19 bandas (UBC 810), com média de 11,63. Dentre o total de 180 bandas obtidas, 128 foram polimórficas, resultando em 70,76% de polimorfismo.

Tabela 2. Primers ISSR selecionados para Dalbergia nigra, incluindo a faixa de variação de tamanho dos locos em pares de bases (TPB), número total de bandas (NTB), número de bandas polimórficas (NBP), porcentagem de bandas polimórficas (PBP) por primer.

Primer TPB (min- máx) NTB NBP PBP UBC 807 300 - 2000 20 14 70% UBC 809 500 - 1800 20 17 85% UBC 810 300 - 2080 22 19 86, 36% UBC 811 450 - 2080 17 11 64, 70% UBC 812 400 - 2080 19 11 57, 89% UBC 813 500 - 1500 12 9 75% UBC 814 500 - 1800 12 11 91, 66% UBC 818 500 - 1550 13 9 69, 23% UBC 834 400 - 1800 13 8 61, 53% UBC 840 230 - 2000 19 12 63, 15% UBC 868 600 - 2000 13 7 53, 84% Total - 180 128 70,76%

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O primer UBC 810 foi o que apresentou maior número de amplificação, com 22 fragmentos, seguido pelos UBC 809 e UBC 807 com 20 fragmentos. Entretanto, o primer UBC 814 foi quem apresentou a maior taxa de fragmentos polimórficos (91,66%). Já a menor taxa de polimorfismo por

primer é observada no UBC 868 com 53, 84 % de polimorfismo.

Discussão

A quantidade de locos gerados pelos primers ISSR mostraram-se eficientes para quantificar diversidade genética em indivíduos de D. nigra, indicando que a utilização de 11 primers (70,76% de polimorfismo) são suficientes para futuros estudos, assim como observado por outros autores com espécies arbóreas utilizando a mesma metodologia de seleção (TIAGO et al., 2015).

Resultados semelhantes foram encontrados por Silva Júnior et al. (2016), onde selecionaram 11

primers ISSR para Schizolobium parahyba var. Amazonicum, gerando 129 fragmentos amplificados,

dos quais 53 foram polimórficos, resultando em 41,08% de polimorfismo. Em estudos com Pilocarpus

pennatifolius, 11 primers ISSR foram testados, sendo selecionados somente 5 por apresentarem

melhor padrão de amplificação (BANDEIRA; DEIMLING; GEORG-KRAEMER, 2010). E em análises com a espécie Erythrina velutina, também selecionaram 11 primers, os quais geraram 149 locos (GONÇALVES et al., 2014).

A seleção prévia de primers funcionais são essenciais para estudos de diversidade genética de uma espécie. Ao selecionar um número específico de iniciadores é possível impedir que primers que tenham baixo nível de polimorfismo e poucos fragmentos sejam utilizados (SILVA et al., 2015).

Conclusão

Os onze primers selecionados geraram produtos de amplificação satisfatórios para quantificar a diversidade genética existente em indivíduos de D.nigra.

Agradecimentos

À Universidade Federal do Espírito Santo e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais. À CAPES, FAPES e SEAG, pelo financiamento desta pesquisa.

Referências

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