Efeito do ph, umidade e indutores sobre a produção de celulases por Trichoderma reesei em fermentação em estado sólido

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Anais do III Encontro Paranaense de Engenharia e Ciência – 28 a 30 de Outubro de 2013 – Toledo–PR

Efeito do pH, umidade e indutores sobre a produção de celulases por Trichoderma reesei em fermentação em estado sólido

Isabela F. Marra^1,*, Thiago B. Silva¹, Fabiano B. Scheufele¹, Dahianne G. C. Gebert¹, Carina Langaro¹, Mônica L. Fiorese, Salah D. M. Hasan¹

(1) NBQ – Núcleo de Biotecnologia e Desenvolvimento de Processos Químicos. Universidade Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE, Campus Toledo-PR. ifmarra@gmail.com

Resumo: A conversão de biomassa lignocelulósica a glicose por hidrólise enzimática tem se tornado um processo viável devido à utilização de matéria residual. Com o objetivo de obter maiores conversões, foram avaliados nesse trabalho diferentes pHs, umidade e indutores na produção de celulases por fermentação em estado sólido (FES), utilizando o microrganismo Trichoderma sp e o substrato bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente, foram avaliados os efeitos do pH e da umidade através da metodologia de superfícies de resposta. Constatou-se que o meio de cultura que fornece a melhor atividade enzimática (AE), atingindo o valor de 0,157 U.mL^-1, deve ser preparado em pH 7 e razão sólido-líquido 1:9. A partir do meio de cultura selecionado, foram avaliados os efeitos da presença dos indutores carboximetilcelulose (CMC) e lactose, individualmente, em diferentes concentrações. Para ambos os indutores os níveis de atividade enzimática elevaram-se consideravelmente. A lactose apresentou a maior AE com a concentração de 2 g/L (1,321 U.mL^-1) e o CMC com concentração de 5 g/L (1,045 U.mL^-1).

Palavras – Chave: Biomassa Lignocelulósica; Fermentação em estado sólido; Carboximetilcelulose; Lactose.

INTRODUÇÃO

As biomassas vegetais contêm grandes quantidades de celulose, além de outros polissacarídeos hidrolisáveis a glicose para fermentação a etanol combustível ou para a produção de produtos químicos de interesse.

A possibilidade de produzir combustíveis derivados da maior fonte de carbono existente, a lignocelulose, incentivou grandes investimentos na indústria de biocombustíveis (BANSAL et al., 2009). O bioetanol, proveniente de biomassas lignocelulósicas, apresenta-se como uma tecnologia promissora, considerando-se que a matéria-prima é extremamente abundante e ainda pode contribuir majoritariamente na redução dos gases do efeito estufa (SINGHANIA et al., 2010).

Na natureza a biodegradação de biomassa vegetal é lenta, pois a lignina e a cristalinidade dos substratos restringem o acesso das enzimas hidrolíticas aos componentes dos polissacarídeos.

Entretanto, a biomassa pode ser pré-tratada e fracionada, liberando os materiais lignocelulósicos em condições mais

acessíveis ao ataque das enzimas (PALONEN et al., 2004).

O grande potencial de mercado e o papel importante que as celulases agregam sobre as indústrias de bioenergia e produtos de origem biológica causam grande motivação no desenvolvimento de enzimas celulolíticas aprimoradas que se apliquem na hidrólise da celulose das paredes celulares vegetais (ZHANG et al., 2006).

O processo de fermentação em estado sólido (FES) apresenta grande capacidade de produção de enzimas, tornando-se interessante pela possibilidade de utilizar-se o sólido fermentado bruto como fonte direta para a obtenção dessas enzimas (PARIS, 2008). Esse processo necessita de uma seleção cuidadosa da matéria-prima ou substrato, escolha de um microrganismo específico, controle dos parâmetros da fermentação propriamente dita, além da separação, em alguns casos, e purificação dos produtos (GUTIERREZ ROJAS, 1998).

A maioria das celulases comerciais é produzida pelos fungos filamentosos Trichoderma reesei ou Aspergillus niger. O

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desempenho da produção dessas enzimas é intensamente influenciado por diversos parâmetros incluindo a natureza do substrato celulósico, o pH do meio, a disponibilidade de nutrientes, a suplementação com indutores, a temperatura de fermentação, entre outros (SINGHANIA et al., 2010).

A produção industrial das celulases requerem o entendimento e controle dos parâmetros envolvidos no crescimento do microrganismo e de sua capacidade produtiva da enzima. Dentre os diversos parâmetros que influenciam a eficiência do processo FES, a água apresenta papel de destaque, em virtude do seu elevado grau de interação com as substâncias que compõem a fase sólida (GERVAIS e MOLIN,2003).

Outro fator relevante para a otimização dos processos em estado sólido é o pH, porém seu controle e monitoramento durante as FES’s não é fácil de ser realizado (PANDEY, 2003). Sendo assim, a determinação exata do pH, em substratos sólidos é feita, com precisão, somente no início e no final do processo fermentativo (PALMA, 2003). E como tentativa de amenizar o efeito de uma variação brusca do pH, utilizam-se substratos com boa capacidade tamponante ou a adição de soluções-tampão durante a etapa de umidificação do substrato (DEL BIANCHI et al., 2001).

Apesar do fenômeno de indução de celulases nos fungos ainda não ser totalmente conhecido, há evidências da participação de dissacarídeos, tais como a celobiose, a sacarose, a lactose e a soforose (ILMÉN et al. 1997).

A resposta das células fúngicas aos diferentes meios varia com a concentração e o tipo de indutor, o que requer o estudo das exigências nutricionais do microrganismo para estimular uma efetiva biossíntese enzimática e atingir expressivas produtividades de celulases (VRIES &

VISSER, 2001).

Nesse contexto, o presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do pH, da umidade e do uso de diferentes indutores durante a

produção de celulases a partir do fungo Trichoderma reesei.

MATERIAIS E MÉTODOS Microrganismo

Utilizou-se o fungo Trichoderma sp.

1382, cedido pelo Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA.

Pré-tratamento do bagaço de cana

Retirou-se o conteúdo solúvel, inserindo os resíduos lignocelulósicos (bagaço de cana-de-açúcar), cedidos pela Usina Santa Terezinha Ltda. - USAÇÚCAR da unidade de Ivaté-PR, em água destilada por 12 h.

Lavou-se com água corrente e, então, os resíduos foram secos em estufa (Quimis) em recipientes metálicos a temperatura de 50°C por 7 dias. Após, os resíduos passaram por um tratamento alcalino oxidativo, utilizando peróxido de hidrogênio 1 % na proporção de 50 mL da solução por grama de resíduo. O pH da solução com hidróxido de sódio foi ajustado a 11,5. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente por 16 h em mesa agitadora orbital (Marconi - MA140CFT) a 150 rpm. O conteúdo insolúvel foi filtrado e lavado repetidamente até que o filtrado se tornasse neutro. Em seguida, os resíduos tratados e filtrados foram secos em estufa à temperatura de 50°C durante 2 dias.

Fermentação em estado sólido (FES) Pesou-se os resíduos pré-tratados inserindo-os em frascos erlenmeyer de 250 mL. Os frascos, a solução nutriente, vidrarias e ponteiras da pipeta foram autoclavados (Phoenix AV75) por 20 min a 121°C. Os ensaios fermentativos foram realizados adicionando a solução de esporos e em seguida a solução nutriente nos frascos erlenmeyer. Os frascos foram levados à estufa bacteriológica a 30°C por 5 dias, sendo retirado um frasco a cada dia, armazenando-os em freezer. Após o tempo decorrido da fermentação, realizou-se a extração das enzimas.

Na primeira etapa experimental as fermentações foram conduzidas testando

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diferentes meios de cultura. Na segunda etapa, foram utilizados os indutores carboximetilcelulose (CMC) e lactose pA, os quais foram dissolvidos na solução nutriente em diferentes concentrações, e adicionados ao substrato.

Extração das enzimas

Adicionou-se ao fermentado sólido a solução-tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0, na proporção 1:17 (g de sólido/mL de solução-tampão). Os frascos fermentados contendo o sólido e a solução-tampão foram inseridos em incubadora shaker (Hydrosan) por 2h, a 35°C com velocidade de agitação de 150 rpm. O sólido foi removido por processo de filtração a vácuo com papel filtro, sendo posteriormente centrifugado (centrífuga Parsec CT-0603) por 20 min em rotação de 3000 rpm, para remoção de sólidos particulados. O filtrado de cada uma das amostras foi armazenado em freezer em frascos de polietileno de alta densidade (PEAD) até a posterior realização das análises.

A atividade enzimática total (FPAse) foi determinada conforme o método do papel filtro (GHOSE, 1987). Os açúcares redutores foram medidos pelo método proposto por MILLER (1959). A FPAse foi expressa em U.mL^-1 ou U.g^-1 de substrato, cuja unidade (U) de atividade enzimática (AE) libera 1 μmol de açúcar redutor por mililitro de caldo por minuto.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Avaliação do pH e umidade para a FES Utilizou-se um planejamento fatorial do tipo 2² completo, com uma quadruplicata no ponto central para avaliar a influência do pH inicial do meio e a umidade a partir da proporção sólido-líquido sobre a produção de celulases durante o processo fermentativo FES. A Tabela 1 apresenta os níveis das variáveis avaliadas no planejamento.

Assim, avaliou-se a proporção sólido- líquido (X1) e o pH inicial (X2) sobre a AE da celulase (Y), cujo comportamento ajustou-se segundo o modelo de regressão linear apresentado na Equação (1).

Y= a+b1.X1+b2.X2+b12.X1.X2 (1)

Sendo:

Y a resposta predita da AE (U.mL^-1);

a o intercepto da reta;

b₁ e b₂ os coeficientes lineares das variáveis X1 e X2, respectivamente;

b12 o coeficiente de interação entre as duas variáveis.

Tabela 1. Níveis das variáveis avaliadas no planejamento completo 2² da FES com

Trichoderma sp.

Variáveis Níveis

(-1) (0) (+1)

Proporção sólido-líquido

(U)

1:5 1:7 1:9

pHinicial 3 5 7

Na Tabela 2, apresenta-se a matriz do planejamento com as variáveis nas suas formas reais e codificadas, e os resultados obtidos de atividade enzimática da celulase (AE) após o processo fermentativo (144 h).

Tabela 2. Matriz do planejamento 2² completo da FES com Trichoderma sp. no bagaço de cana

pré-tratado Ensaio

Variáveis AEmédia

U (X1)

pH

(X2) (U.mL^-1) (U.g^-1) 1 1:5 (-1) 3 (-1) 0,052 0,908 2 1:9 (+1) 3 (-1) 0,088 1,517 3 1:5 (-1) 7 (+1) 0,058 1,002 4 1:9 (+1) 7 (+1) 0,157 2,695 5 1:7 (0) 5 (0) 0,063 1,098 6 1:7 (0) 5 (0) 0,057 0,994 7 1:7 (0) 5 (0) 0,058 1,003 8 1:7 (0) 5 (0) 0,056 0,971

Observa-se, a partir da Tabela 2, que o melhor resultado obtido ocorreu no ensaio 4, o qual corresponde a uma proporção sólido- líquido de 1:9 e pH 7,0, cuja AE média alcançou 0,157 U.mL^-1 (2,695 U.g^-1). Foi utilizado o programa computacional STATISTICA^TM (v. 8.0) para a análise dos resultados. A estimativa dos efeitos principais e de interação entre as variáveis são apresentadas na Tabela 3, juntamente

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com os valores obtidos para o p-valor, valores dos coeficientes das variáveis no modelo (Eq.1) e erro padrão. O coeficiente de determinação do modelo R² com um nível de significância α=0,05 foi de 0,790.

Tabela 3. Estimativa dos efeitos para AE para o planejamento 2² completo da FES com

Trichoderma sp.

p-valor coeficiente erro Intercepto 0,000 0,074 0,001

U 0,000 0,033 0,002

pH 0,001 0,019 0,002

U x pH 0,002 0,016 0,002

Observando-se a estimativa dos efeitos, conforme a Tabela 3, para este planejamento verifica-se que dentre as variáveis estudadas todas se mostraram significativas para o intervalo de confiança de 95% (p-valor <

0,05). A proporção sólido-líquido (U), o pH inicial da solução nutriente, bem como a interação entre as duas variáveis possuem influência positiva na produção de celulases pelo microrganismo Trichoderma sp., dentro do intervalo de confiança de 95%. Apesar da não validação do modelo e do seu baixo coeficiente de determinação (R² = 0,790), é possível avaliar, a partir da superfície de resposta apresentada pela Figura 1, a influência do pHinicial e da proporção sólido- líquido sobre a AE das celulases, sugerindo- se uma direção a ser tomada numa possível etapa posterior para fins de otimização do processo.

Na Figura 1 é apresentada a superfície de resposta para o processo FES por Trichoderma sp. com bagaço de cana pré- tratado obtido para a AE da celulase em função da proporção sólido-líquido e do pHinicial.

Figura 1. Superfície de resposta da AE da celulase em função de P e pHinicial para a FES do bagaço de cana pré-tratado com Trichoderma sp.

Verifica-se pela superfície de resposta que para valores mais altos de U e de pH obtêm- se valores de AE mais elevados. Portanto, sugere-se que o processo FES utilizando-se Trichoderma sp. possa ser conduzido em pH em torno de 7,0 e teores elevados de umidade para que uma alta produção de celulases seja alcançada. Neste estudo, a AE máxima obtida no ensaio 4 foi de 0,157 U.mL^-1, demonstrando que a cepa nativa amazônica possui potencial de produção de celulases.

Avaliação da FES com uso de indutores Com o intuito de atingir maiores níveis de atividade enzimática da celulase, foram utilizados indutores nos ensaios fermentativos, dentre os quais o carboximetilcelulose (CMC) e a lactose pA, em diferentes concentrações. As Tabelas 4 e 5 apresentam os resultados da atividade enzimática para as diferentes concentrações de CMC e lactose, respectivamente, em função do tempo de fermentação.

Tabela 4. Atividade enzimática das celulases produzidas por Trichoderma sp. utilizando

diferentes concentrações de CMC.

Tempo (h)

CMC AE (U.mL^-1)

C=1g/L C=3g/L C=5g/L

0 24

0 0,918

0 0,784

0 0,954

48 0,842 0,776 1,045

(5)

72 0,624 0,780 0,620

96 0,424 0,584 0,573

120 0,264 0,275 0,268

Constatou-se que a utilização do CMC como indutor para a produção de celulase na concentração de 5 g/L ofereceu a maior atividade enzimática, cujo valor foi de 1,045 U.mL^-1, com um pico em 48 h. As demais concentrações de indutor CMC (1 e 3 g/L) forneceram resultados semelhantes entre si, sendo a atividade enzimática relativamente alta observada em torno de 40 h.

Por outro lado, o uso da lactose como indutor na produção de celulases forneceu a maior atividade enzimática na concentração de 2 g/L, com um valor de 1,321 U.mL^-1 em 24 h. Comparando-se os indutores, observou-se que a lactose obteve a maior AE.

Tabela 5. Atividade enzimática das celulases produzidas por Trichoderma sp. utilizando

diferentes concentrações de Lactose.

Tempo (h)

Lactose AE (U.mL^-1)

C=0,5g/L C=1g/L C=2g/L C=3g/L

0 0 0 0 0

24 0,573 1,005 1,321 0,947

48 0,529 0,871 0,653 0,922

72 0,642 0,508 0,649 0,562

96 0,606 0,497 0,515 0,493

120 0,311 0,300 0,162 0,359

Ambos os perfis da atividade enzimática alcançados pelas diferentes concentrações de indutores CMC e lactose durante o processo FES são apresentados na Figura 2.

A utilização de indutores durante a produção de celulases pela fermentação FES com o Trichoderma reesei forneceu resultados satisfatórios, os quais se mostram significativamente maiores que a atividade enzimática obtida sem a sua utilização (ver Tabela 2).

No geral, o comportamento da curva de crescimento em função do tempo mostrou-se similar para as diferentes concentrações de ambos os indutores, obtendo valores de AE máximos em intervalos de tempo próximos uns aos outros. Observou-se que os picos de AE das celulases ocorreram entre 24 e 48 h, sendo que esse período foi menor comparando-se ao processo FES sem a presença de indutor, cujo ponto máximo de produção ocorreu entre 96 e 120 h.

Portanto, a utilização de indutores mostra- se fundamental na produção de enzimas de interesse industrial já que aumentando-se a atividade enzimática durante o processo fermentativo reduz-se o tempo necessário de produção, implicando diminuição de custos em sua operação vinculado à maior produtividade.

(a) (b)

Figura 2. AE x Tempo para diferentes concentrações de: (a) CMC; (b) Lactose.

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CONCLUSÕES

A produção de celulase com o fungo Trichoderma reesei a partir da biomassa lignocelulósica se mostrou um processo favorável, uma vez que foram atingidos valores de AE condizentes com a literatura, resultando em uma alta conversão de glicose. Os ensaios fermentativos realizados sem a presença de indutor constataram que o meio de cultura que propicia o maior crescimento celular deve ser preparado com pH 7 e proporção de sólidos para líquidos de 1:9. Nessas condições, a utilização de indutores (CMC e lactose) resultou em um aumento significativo da atividade celular, bem como na redução do tempo de máxima produção da enzima celulase. A lactose obteve uma pequena vantagem durante a produção de celulase em relação ao uso de CMC, o que se mostra favorável, devido a sua maior acessibilidade e ao seu menor valor econômico. A redução do pico de produção enzimática observado neste estudo aponta um fator importante na produção da celulase, uma vez que, assim, pode-se aumentar a produtividade dos processos fermentativos em estado sólido e reduzir custos operacionais em escala industrial.

Agradecimentos

À UNIOESTE pelo apoio financeiro e ao INPA (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) pelo fornecimento do microrganismo.

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