UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DANILO ANTONINI ALVES
ABORDAGEM BIOFARMACÊUTICA DE
PARTÍCULAS POLIMÉRICAS EM BACTÉRIAS
CAUSADORAS DE INFECÇÃO NO TRATO URINÁRIO
CAMPINAS 2016
Abordagem biofarmacêutica de partículas poliméricas
em bactérias causadoras de infecção no trato urinário
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos para obtenção do Título de Doutor em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientador: PROF. DR. MARCELO LANCELLOTTI
CAMPINAS 2016
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR DANILO ANTONINI ALVES E ORIENTADA POR PROFESSOR DOUTOR MARCELO LANCELLOTTI.
COMISSÃO ORGANIZADORA
Prof. Dr. Marcelo Lancellotti
Prof. Dr. Rodrigo Catharino
Prof. Dr. André Lisboa Rennó
Prof. Dr. Daniel Fábio Kawano
Prof. Dr. Luciano Moura Martins
Os membros da Comissão Organizadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Este trabalho é dedicado aos meus pais Audaci e Umbelino.
Pelo amor e apoio incondicional e por não ter me deixado desistir.
Aos meus irmãos Thiago e Diego, meus verdadeiros e eternos amigos.
“O caminho é esse tem pedra, tem sol tem bandido, mocinho tem você amando tem você sozinho é só escolher ou vai, ou fica.
FUI… ”
companheirismo e pelos ensinamentos acadêmicos e não acadêmicos. Saiba que sou
muito grato e honrado em fazer parte da sua história acadêmica e por você fazer parte da
minha. Como alguém que conhecemos sempre fala: Você mora no meu pâncreas!
Aos meus familiares, minhas cunhadas Yara e Isabela, meus avós, meus tios e primos.
Muito obrigado pelo incondicional apoio.
À Universidade Estadual de Campinas, por me acolher em suas instalações e fazer com
que o diferente fosse absolutamente normal.
Aos meus queridos companheiros do laboratório de Biotecnologia Farmacêutica da
UNICAMP.
À Profa. Dra. Luciana Maria de Hollanda, minha grande confidente e incentivadora.
Foram inúmeras conversas acadêmicas e filosóficas, conselhos e principalmente por
sempre tentar me mostrar o melhor lado vida. Nunca me esquecerei das suas
gargalhadas e toda ajuda depositada. Eu amo você!
À Dra. Daisy Machado. Não tenho palavras para agradecer o que você fez por mim.
Muito obrigado por ter me ajudado na hora que eu mais precisei. Seu incentivo,
colaboração e amizade foram essenciais para que chegasse até aqui.
À minha grande amiga Verônica Muniz Couto, obrigado por toda ajuda e por não ter me
deixado desistir. O maior presente que eu ganhei no meu Doutorado foi sua amizade.
Aos meus queridos amigos Renan Kosseki e Rafaella Fabiana C. Pereira, pessoas que
permaneceram desde os meus primeiros dias em Campinas até a conclusão deste
trabalho.
Renan, você é personificação das palavras amizade, lealdade e nobreza. Obrigado por
sua amizade, companheirismo e por todos os outros momentos compartilhados.
Estaremos sempre juntos.
Rafaella, foi um privilégio ter convivido com você durante todos estes anos. Muito
obrigado por sua amizade, companheirismo, incalculáveis ajudas no laboratório, por sua
meus agradecimentos a toda sua família, principalmente à sua avó Eva, sua irmã
Marcela e seu cunhado Augusto.
À Thais Holtz e Adriana de Melo, minha eterna gratidão à amizade e contribuição
durante toda a minha jornada.
Aos companheiros que me deram o privilégio de suas respectivas convivências antes de
seguirem suas próprias jornadas pelo mundo.
À Cibele Esteves Zanardi, minha grande e verdadeira amiga. Mesmo com nossa
similaridade em relação à teimosia e nossas inúmeras diferenças, sempre estivemos
perto um do outro. Obrigado por nunca ter desistido de mim e por sempre estar do meu
lado nos momentos que eu mais precisei. É imensurável a importância que você tem em
minha vida. Conte sempre comigo, principalmente para coisas que seriam facilmente
julgadas pela tradicional família brasileira.
À Ana Carolina Afonso, minha grande amiga, o maior presente que a UNICAMP me
deu. Você é sensacional, sou privilegiado em poder tê-la por perto e aprender a cada dia
com você. Eu me espelho na sua inteligência, sabedoria, elegância e da forma que você
leva a vida. Agradeço tudo que você e sua família fizeram por mim. Eu amo você!
À Maria Cecília K. Amstalden, minha grande amiga que também atende por “Cília” ou
“Lelinha”. Amizade, companheirismo e confusões são certamente os adjetivos que
sobressaem comparados aos outros que circundam nossa relação. Com quem eu
conversaria as coisas mais diversas da vida nos horários mais alternativos possíveis
(com fusos inclusos)? Você é irmã que eu nunca tive. Obrigado por sua hospedagem nas
“Alemanhas” e por tudo que você já fez por mim. Eu amo você!
À Ives Bernardelli de Mattos, meu grande amigo irmão. Amigo de inúmeras conversas,
detentor de um companheirismo imensurável e amizade sem igual. Apesar de todas as
reviravoltas que ocorreram em nossas vidas, estivemos sempre próximos e que assim
seja sempre. Você é muito especial para mim! Obrigado por toda atenção e confiança
depositada. Te amo jovem!
(lê-se: uma pessoa que some rs...), você está sempre no meu coração com uma
importância impar.
À Júlia Varela, amizade, intensidade e um pouco insanidade facilmente descrevem
nossa relação. Você é a prova que duas pessoas ligadas nos 220 v podem conviver
harmoniosamente. Serei eternamente grato por tudo que você e sua família fizeram por
mim.
Agradeço a todos os outros alunos e colaboradores que contribuíram com minha
formação e com o desenvolvimento do laboratório de Biotecnologia durante estes 8
anos: Gisele Gentil, Daniel Ferreira Lima, Alice Reis, Fernanda Buscariollo, Kléber
Almeida, Aline Kurl, Rodolfo Boer, David di Santi, Natali Carleti, Washington da
Silva, Felipe Ribeiro, Tobias Garcez, Paula Martins, Fernando Bergamini e Begõna
Gimenez-Cassina.
À Profa. Dra. Daniele Ribeiro de Araújo e seus alunos Deise e Alisson, pela
colaboração científica disponibilizada neste trabalho.
À Profa. Dra. Patrícia Severino, muito obrigado pela amizade, conselhos e ajuda
proporcionada para concretização deste trabalho. Sou seu fã.
Aos meus amigos e professores de graduação, especialmente à Rodolfo Francisquini,
Rafaela Conselvan, Amanda Pietra e Professora Elen. Foram anos muito difíceis, muito
estudo, pouco tempo e dinheiro, mas, tínhamos uns aos outros, e assim, tudo se tornou
mais fácil.
Aos meus amigos que compartilharam um lar durante estes 12 anos de jornada
acadêmica, André, Wilson, Murilo, Ronny, Marco Aurélio, Kiko, Lucas, Douglas,
Rodolfo, Hugo, Danilo, Thiago, Ives, Larissa, Júlia, Carolina, Christiano, Rhelvis,
André e Vitor. Vocês tornaram tudo mais fácil.
estes 7 anos de amizade se juntem aos próximos 50 que virão.
Aos meus amigos Carolina Haro, Valéria Figueiredo e Lucas Martinez. Como não
associar vocês a inúmeros momentos especiais? Impossível. Aprendi e aprendo muito
com vocês. Vocês são maravilhosos! Muito obrigado por tudo.
Daniele Yahn e família. Pessoas maravilhosas que tive a honra de poder compartilhar
inúmeras situações. Sou eternamente grato.
À grande família Paulínia Mavericks. Depois de anos, pude sentir o verdadeiro espirito
que só um esporte coletivo pode proporcionar. Tantas histórias e aventuras
(principalmente em terras mexicanas). Obrigado Cássia, Cibele, Égritti, Thuane, Carlos,
JP, Bia, Gú, Camila, Guilherme, Lucas Luz, Lê, Élcio, Grécia e todas as outras pessoas
importantíssimas em minha vida. Em breve estarei com vocês novamente.
Ao Professor Msc. João Castilho pela confiança e por todas as oportunidades que você
me proporcionou. Nunca esquecerei!
Aos meus amigos Isabela Tesoto, Dag Mendoça, Estela Estrela, Letícia Caramori,
Henrique “Ninis” Gripp e Ana Sanseverino pela amizade compartilhada.
Aos meus amigos de Dracena, Guilherme, Douglas, Christiano, Luciano, Bruno, Rafael,
Gustavo, Bruna, Karen e tantos outros, além dos meus amigos de infância Hélio
Piovesan e Michele Pedroso. Não seria nada sem vocês!
A todos que um dia foram meus alunos, meu muito obrigado por me deixarem fazer
parte da vida de vocês!
Aos meus amigos da Liga Madden Legends por anos de amizade e entretenimento.
Aos membros da banca Professores Doutores Rodrigo Catharino, André Lisboa Rennó,
Daniel Fábio Kawano, Luciano Moura Martins, Thaís Franchini Tornatore de Araújo,
Valéria Nasser Figueiredo e Elen Landgraf Guiguer por aceitarem fazer parte desta
avaliação.
nos momentos de dificuldade.
À FAPESP pelo apoio financeiro e confiança proporcionada através do processo
2011/21882-3.
presença de microrganismos no sistema urinário. Tais patologias são responsáveis por grande
parte dos processos infecciosos adquiridos na comunidade e nos ambientes hospitalares.
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosas e Klebsiella pneumoniae são descritas na literatura
como as principais responsáveis pelas causas de ITU. O uso indiscriminado dos antibióticos ao
longo do tempo, fizeram com que os microorganismos patogênicos criassem mecanismos
adaptativos de resistência à varias drogas existentes, tornando-se alvo de preocupação dos
órgãos públicos de saúde, principalmente no que se diz respeito à ambientes hospitalares. Este
trabalho terá como objetivo propor novas alternativas de tratamento para pacientes com ITU
baseados em partículas poliméricas associadas a agentes antimicrobianos da classe das
quinolonas. Tais partículas foram caracterizadas através das técnicas de Dinamic Light
Scattering (Espalhamento Dinâmico de Luz), Nanoparticle Tracking Analysis (Análise de
Rastreamento de Nanopartículas) e por Potencial Zeta. O perfil de dissolução e liberação dos
sistemas obtidos foi avaliado pela técnica de difusão vertical in vitro em células de Franz. A
avaliação biológica dos compostos foi avaliada através da técnica de Mínima Concentração
Inibitória, utilizando bactérias isoladas de pacientes com ITU e por avaliação da citotoxicidade
microorganisms in the urinary system. These diseases are responsible for much of the infectious
processes acquired in the community and in hospital settings. Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa and Klebsiella pneumoniae are described in the literature as the main responsible for
the causes of UTI. Indiscriminate use of antibiotics over time, caused pathogenic
microorganisms would create adaptive mechanisms of resistance to several existing drugs,
becoming the subject of concern of public health agencies, especially as it relates to hospital
settings. This work will aim to propose new treatment alternatives for patients with UTI based
on polymer particles associated with antimicrobial agents of the quinolone class. These particles
were characterized by the techniques of Dynamic Light Scattering , Nanoparticle Tracking
Analysis and Zeta potential. The dissolution profile and release of systems obtained was
evaluated by vertical diffusion technique in vitro Franz cell. The biological evaluation of the
compounds was evaluated by the Minimum Inhibitory Concentration technique using bacteria
isolated from patients with urinary tract infection and evaluation of cytotoxicity by cell viability
DLS - Dynamic Light Scattering
ITU - Infecção no Trato Urinário
MCG - Micrograma
MH - Meio de cultura Mueller-Hinton
MIC - Minimum Inhibitory Concentration
NTA - Nanoparticle Tracking Analysis
OE - óxido de etileno
OP - óxido de propileno
PEG - polietilenoglicol
PPG - propilenoglicol
Figura 2 - Esquema representando a micelização e a gelificação do Poloxamer a partir dos monômeros de PO e EO em função do aumento da temperatura em água. (Adaptado de Dumortier, 2006)
Figura 3 - Estrutura 4-quinolona, molécula base para as quinolonas.
Figura 4 - Estrutura química do Ácido Nalidíxico (1ª geração), Ciprofloxacino, Norfloxacino (2ª geração) e Levofloxacino (3ª geração), quinolonas utilizadas no presente trabalho.
Figura 5 – Processo de obtenção das formulações poliméricas (a) e incorporação dos fármacos as formulações previamente estabelecidas (b).
Figura 6 - Representação esquemática de uma partícula com carga elétrica positiva, camada de Stern com íons negativos e camada difusa, ambas circundando a partícula. Decaimento
exponencial do potencial zeta com a distância entre a região medida e a superfície da partícula.
Figura 7 - Curva de calibração da Ciprofloxacino leitura realizada em espectrofotômetro UV-VIS em triplicata.
Figura 8 - Curva de calibração da Levofloxacino leitura realizada em espectrofotômetro UV-VIS em triplicata.
Figura 9 - Curva de calibração da Norfloxacino leitura realizada em espectrofotômetro UV-VIS em triplicata.
Figura 10 - Fotografia do equipamento automatizado das Células de Difusão Vertical de Franz utilizado no trabalho.
Figura 11 - Forma de leitura das partículas em suspensão, sem fluxo contínuo (DLS) e com fluxo contínuo (NTA).
Formulação 1 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N1) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37 °C (d) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA)
Figura 13 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 2 (PL-407 8% e PL 213 2%) isolada (F2) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b), Formulação 2 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L2) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37 °C (d) e Formulação 2 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N2) nas temperaturas de 25 °C (e) e 37 °C (f) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA).
Figura 14 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 3 (PL-108 8% e PL-403 2%) isolada (F3) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b) e Formulação 3 associada à 1 mg/mL de Ciprofloxacino (C3) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37
°C (d) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA).
Figura 15 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 4 (PL-108 8% e PL 213% 2%) isolada (F4) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b) e Formulação 4 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L4) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37 °C (d) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA).
Figura 16 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 5 (PL-407 8%) isolada (F5) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b), Formulação 5 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L5) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37 °C (d) e Formulação 5 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (L5) nas temperaturas de 25 °C (e) e 37 °C (f) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA).
Figura 17 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 6 (PL-108 8%) isolada (F6) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b) e Formulação 6
Figura 18 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 7 (PL-213 2%) isolada (F7) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b) e Formulação 7 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N7) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37 °C (d) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA).
Figura 19 - Tamanhos das partículas (nm) em razão da concentração (partículas/mL) da Formulação 8 (PL-403 2%) isolada (F8) na temperatura de 25 °C (a) e 37° (b) e Formulação 8 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N8) nas temperaturas de 25 °C (c) e 37 °C (d) utilizando a técnica de Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA).
Figura 20 - Perfis de liberação “in vitro” obtidos da Ciprofloxacino (CPF) e da Formulação 3 associada com Ciprofloxacino (F3) em célula vertical de Franz. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação)
Figura 21 - Comparativo dos perfis de liberação da Ciprofloxacino (CPF) com Formulação 3 associada à Ciprofloxacino (F3) utilizando o modelo de cinética de liberação de Ordem Zero. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
Figura 22 - Comparativo dos perfis de liberação da Ciprofloxacino (CPF) com Formulação 3 associada à Ciprofloxacino (F3) utilizando a cinética de liberação do modelo de Higuchi. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
Figura 23 - Perfis de liberação “in vitro” obtidos da Levofloxacino (LVF) , da Formulação 2 associada à Levofloxacino (F2), da Formulação 4 associada à Levofloxacino (F4), da Formulação 5 associada à Levofloxacino (F5) e da Formulação 6 associada à Levofloxacino (F6)em célula vertical de Franz. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
Formulação 5 associada à Levofloxacino (L5) e da Formulação 6 associada à Levofloxacino (L6) utilizando o modelo de cinética de liberação de Ordem Zero. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
Figura 25 - Comparativo dos perfis de liberação da Levofloxacino (LVF) com a Formulação 2 associada à Levofloxacino (L2), da Formulação 4 associada à Levofloxacino (L4), da Formulação 5 associada à Levofloxacino (L5) e da Formulação 6 associada à Levofloxacino (L6) utilizando a cinética de liberação do modelo de Higuchi. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
Figura 26 - Perfis de liberação “in vitro” obtidos da Norfloxacino (Norf) , da Formulação 1 associada à Norfloxacino (N1), da Formulação 2 associada à Norfloxacino (N2), da Formulação 5 associada à Norfloxacino (N5) , da Formulação 7 associada à Norfloxacino (N7) e da Formulação 8 associada à Norfloxacino (N8) em célula vertical de Franz. Dados apresentados
como médias ± d.p. (n=3/formulação)
Figura 27 - Comparativo dos perfis de liberação da Norfloxacino (Norf) com a Formulação 1 associada à Norfloxacino (N1), da Formulação 2 associada à Norfloxacino (N2), da Formulação 5 associada à Norfloxacino (N5) , da Formulação 7 associada à Norfloxacino (N7) e da Formulação 8 associada à Norfloxacino (N8) utilizando o modelo de cinética de liberação de Ordem Zero. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
Figura 28 - Comparativo dos perfis de liberação da Norfloxacino (Norf) com a Formulação 1 associada à Norfloxacino (N1), da Formulação 2 associada à Norfloxacino (N2), da Formulação 5 associada à Norfloxacino (N5) , da Formulação 7 associada à Norfloxacino (N7) e da Formulação 8 associada à Norfloxacino (N8) utilizando a cinética de liberação do modelo de Higuchi. Dados apresentados como médias ± d.p. (n=3/formulação).
triplicata nas concentrações de 0,15, 0,32, 0,625, 1,25, 2,5, 5 e 10 µg/mL por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle. Dados expressos como médias ± d.p.
Figura 30 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 1 (PL-407 8% e PL-403 2%) isolada e a Formulação 1 associada à Norfloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250, 2.500, 5.000 e 10.000 µg/mL para o polímero isolado e nas concentrações respectivas, polímero e fármaco, de 100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para à associação de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 31 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 2 (PL-407 8% e PL 213 2%) isolada e a Formulação 2 associada à Levofloxacino e à Norfloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250, 2.500, 5.000 e 10.000 µg/mL para o polímero isolado e nas concentrações respectivas, polímero e fármaco, de 100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para as associações de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 32 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 3 (PL-108 8% e PL-403 2%) isolada e a Formulação 3 associada à Ciprofloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250,
para à associação de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 33 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 4 (PL-108 8% e PL 213%) isolada e a Formulação 4 associada à Levofloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250, 2.500, 5.000 e 10.000 µg/mL para o polímero isolado e nas concentrações respectivas, polímero e fármaco, de 100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para à associação de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 34 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 5 (PL-407 8%) isolada e a Formulação 5 associada à Levofloxacino e à Norfloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250, 2.500, 5.000 e 10.000 µg/mL para o polímero isolado e nas concentrações respectivas, polímero e fármaco, de 100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para as associações de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 35 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 6 (PL-108 8%) isolada e a Formulação 6 associada à Levofloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As
100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para à associação de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 36 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 7 (PL 213 2%) isolada e a Formulação 7 associada à Norfloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250, 2.500, 5.000 e 10.000 µg/mL para o polímero isolado e nas concentrações respectivas, polímero e fármaco, de 100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para à associação de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Figura 37 - Avaliação da citotoxicidade da Formulação 8 (PL-403 2%) isolada e a Formulação 8 associada à Norfloxacino em células NHI/3T3 (a), HaCaT (b), HUVEC (c) e NG97 (d). As células foram tratadas em triplicata nas concentrações de 100, 300, 625, 1.250, 2.500, 5.000 e 10.000 µg/mL para o polímero isolado e nas concentrações respectivas, polímero e fármaco, de 100/0,15, 300/0,32, 625/0,625, 1.250/1,25, 2.500/2,5, 5.000/5 e 10.000/10 µg/mL para à associação de polímero-fármaco por um período de 24 horas. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram expostas aos fármacos testados. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços e os resultados representam as médias e desvios padrão (ANOVA).
Tabela 2 - Classificação de principais quinolonas de acordo com as suas respectivas gerações.
Tabela 3 - Linhagens bacterianas utilizadas no trabalho
Tabela 4 - Sistemas Poloxamer obtidos no trabalho
Tabela 5 - Marca e concentrações presentes em cada disco de antibiótico utilizado
Tabela 6 - Teste de Sensibilidade das linhagens selecionadas às quinolonas e à outros antimicrobianos de diferentes classes. Os dados estão demonstrados pelo tamanho dos halos de inibição mesurados em milímetros (mm).
Tabela 7 - Valores da média das análises do Potencial Zeta (mV) da Ciprofloxacino, Levofloxacino e Norfloxacino na concentração de 100 µg/mL diluída 1:10 em água deionizada
nas temperaturas de 25 °C e 37 °C.
Tabela 8 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (Tamanho dos diâmetros em nanômetros), Porcentagem da Distribuição do tamanho da partícula dentro da amostra (% Distribuição), Polidispersão (PDI) e Análise do Potencial Zeta (mV) da Formulação 1 (PL-407 8% e PL-403 2%) isolada e a Formulação 1 associada à Norfloxacino em temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e desvio padrão (n = 3).
Tabela 9 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 1 (PL-407 8% e PL-403 2%) isolada (F1) e Formulação 1 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N1) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 10 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (em nanômetros) e distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) da Formulação 2 (PL-407 8% e PL 213 2%) isolada e a Formulação 2 associada à Levofloxacino e à Norfloxacino em temperaturas de 25 °C
Tabela 11 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 2 (PL-407 8% e PL-213 2%) isolada (F2), Formulação 2 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L2) e Formulação 2 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N2) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 12 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (tamanho de partícula), distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) e análise do Potencial Zeta (mV) da Formulação 3 (PL-108 8% e PL-403 2%) isolada e a Formulação 3 associada à Ciprofloxacino em temperaturas de 25° C e 37° C. Os dados do estão expressos em média e desvio padrão (n =
3).
Tabela 13 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 3 (PL-108 8% e PL-403 2%) isolada (F3) e Formulação 1 associada à 1 mg/mL de Ciprofloxacino (C3) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e desvio padrão (n = 3).
Tabela 14 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (em nanômetros) e distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) da Formulação 4 (PL-108 8% e PL-213% 2%) isolada e a Formulação 4 associada à Levofloxacino em temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do tamanho de partículas estão expressos em média e desvio padrão. Para a polidispersão o valor é expresso pela média. Ambas as análise apresentaram um n=3.
Tabela 15 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 4 (PL-108 8% e PL 213% 2%) isolada (F4) e Formulação 4 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L4) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 16 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (tamanho de partícula), distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) e análise do Potencial Zeta (mV) da Formulação 5 (PL-407 8%) isolada e a Formulação 5 associada à Levofloxacino e à
Tabela 17 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 5 (PL-407 8%) isolada (F5), Formulação 5 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L5) e Formulação 5 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N5) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 18 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (em nanômetros) e distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) da Formulação 6 (PL-108 8%) isolada e a Formulação 6 associada à Levofloxacino em temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do tamanho de partículas estão expressos em média e desvio padrão. Para a polidispersão o valor é
expresso pela média. Ambas as análise apresentaram um n=3.
Tabela 19 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 6 (PL-108 8%) isolada (F6) e Formulação 6 associada à 1 mg/mL de Levofloxacino (L6) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 20 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (em nanômetros) e distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) da Formulação 7 (PL 213 2%) isolada e a Formulação 7 associada à Norfloxacino em temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do tamanho de partículas estão expressos em média e desvio padrão. Para a polidispersão o valor é expresso pela média. Ambas as análise apresentaram um n=3.
Tabela 21 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 7 (PL-213 2%) isolada (F7) e Formulação 7 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N7) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 22 - Medidas dos diâmetros hidrodinâmicos (em nanômetros) e distribuição dos tamanhos das micelas poliméricas (polidispersão) da Formulação 8 (PL-403 2%) isolada e a Formulação 8 associada à Norfloxacino em temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do
Tabela 23 - Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) da Formulação 8 (PL-403 2%) isolada (F8) e Formulação 8 associada à 1 mg/mL de Norfloxacino (N8) nas temperaturas de 25 °C e 37 °C. Os dados do estão expressos em média e erro padrão (n = 3).
Tabela 24 - Parâmetros de liberação para Ciprofloxacino (CPF) e Formulação 3 associada com Ciprofloxacino (F3) através de difusão em membranas artificiais em células de Franz utilizando o modelo de Ordem Zero e o modelo de Higuchi.
Tabela 25 - Parâmetros de liberação para da Levofloxacino (LVF), da Formulação 2 associada com Levofloxacino (F2), da Formulação 4 associada com Levofloxacino (F4), da Formulação 5 associada com Levofloxacino (F5) e da Formulação 6 associada com Levofloxacino (F6) através de difusão em membranas artificiais em células de Franz utilizando o modelo de Ordem Zero e o modelo de Higuchi.
Tabela 26 - Parâmetros de liberação para da Norfloxacino (Norf) , da Formulação 1 associada à Norfloxacino (N1), da Formulação 2 associada à Norfloxacino (N2), da Formulação 5 associada à Norfloxacino (N5) , da Formulação 7 associada à Norfloxacino (N7) e da Formulação 8 associada à Norfloxacino (N8) através de difusão em membranas artificiais em células de Franz utilizando o modelo de Ordem Zero e o modelo de Higuchi.
Tabela 27 - Padrões interpretativos dos diâmetros dos halos de inibição para considerar uma cepa sensível, intermediária ou resistente à um fármaco.
Tabela 28 - Concentração Mínima Inibitória dos sistemas poliméricos isolados.
Tabela 29 - Concentração Mínima Inibitória da Ciprofloxacino e Ciprofloxacino associado a Formulação 3.
Tabela 31 - Concentração Mínima Inibitória da Levofloxacino e Levofloxacino associado as Formulação 2, 4, 5 e 6.
1.1 - Infecção no Trato Urinário ... 29
1.2 - Hidrogéis e Sistemas micelares: estrutura, auto-organização e aplicações farmacêuticas dos poloxamers ... 31 1.3 – Quinolonas ... 35 1.3.1 – Mecanismos de ação ... 38 2 - OBJETIVOS ... 40 3 - MATERIAIS E MÉTODOS ... 41 3.1 - Amostras bacterianas ... 41 3.1.1 - Meio de cultura ... 41
3.1.2 - Obtenção das amostras bacterianas ... 41
3.2 - Desenvolvimentos de sistemas carreadores micelares para os estudos de liberação controlada ... 42
3.3 - Análises das estruturas micelares ... 44
3.3.1 - Medidas de diâmetro hidrodinâmico e valores de polidispersão ... 44
3.3.2 – Potencial Zeta ... 45
3.3.3 - Análise de rastreamento de nanopartículas ... 47
3.4 - Quantificações por absorção espectrofotométrica dos Fármacos ... 48
3.5 - Ensaios de dissolução e liberação in vitro em células de difusão vertical de Franz ... 50
3.6 - Obtenções de amostras de pacientes com Infecção no Trato Urinário (ITU) ... 51
3.6.1 - Solicitação de pesquisa ao Hospital Estadual de Sumaré ... 51
3.6.2 - Triagem e seleção dos voluntários do estudo ... 52
3.8.1 - Ensaio de Viabilidade Celular Através da Redução do MTT (3-brometo de (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio). ... 53
3.9 - Análise do padrão de suceptibilidade/resistência de Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus frente aos antimicrobianos e
determinação da Mínima Concentração Inibitória (MIC) ... 54
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 56
4.1 Caracterizações das estruturas micelares pelas técnicas de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e Potencial Zeta. ... 56
4.2 - Ensaios de dissolução e liberação in vitro em células de difusão vertical de Franz ... 82
4.2.1 – Modelos de análise dos dados ... 82
4.2.2 – Membrana difusora e permeação do fármaco ... 83
4.3 – Permeação e liberação dos fármacos em célula de Franz ... 84
4.3.1 – Ciprofloxacino ... 84
4.3.2 - Levofloxacino ... 87
4.3.3 - Norfloxacino ... 91
4.4- Avaliação da atividade antibacteriana dos polímeros isolados, fármacos isolados e associação polímero-fármaco frente à de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae e Sthapylococcus aureus. ... 95
4.5 - Avaliação da Citotoxicidade dos polímeros, copolímeros e associação polímero antibióticos pela redução do MTT (3-brometo de (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio) ... 100
5- CONCLUSÕES ... 117
6 - BIBLIOGRAFIA ... 118
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - Infecção no Trato Urinário
A infecção no trato urinário (ITU) é uma patologia extremamente freqüente, que ocorre em todas as idades e em ambos os sexos. Em um período que se estende do nascimento até a puberdade a maior incidência ocorre no sexo feminino, em uma taxa de 20 vezes maior em relação ao sexo masculino (Kline & Lewis, 2016). Na vida adulta, a incidência de ITU se eleva e o predomínio no sexo feminino se mantém, com picos de maior acometimento no início ou relacionado à atividade sexual, durante a gestação ou na menopausa. Aproximadamente 50 a 70% das mulheres apresentam pelo menos um episódio de ITU em suas vidas, sendo que, 20 a 30% destas apresentam episódios recorrentes (Hooton, 2000; MACLEAN, 2001; Masson, 2009). Na mulher, a susceptibilidade à ITU se deve à uretra mais curta e a maior proximidade do ânus com o vestíbulo vaginal e uretra. No homem, o maior comprimento uretral, maior fluxo urinário e o fator antibacteriano prostático são protetores. A partir da 5ª a 6ª década, a presença do prostatismo torna o homem mais suscetível à ITU (Graves et al., 2007; Masson, 2009).
Os principais fatores predisponentes do hospedeiro a aquisição de ITU são: obstrução do trato urinário, refluxo vésico-ureteral, cateterização urinária, gravidez, diabetes mellitus, relação sexual e géis espermicidas, prostatismo, menopausa, idosos, má condições de higiene e transplante renal (CATTEL, 1996; FORMAN, 2002; Santos et al., 2002; Graves et al., 2007).
A ITU é caracterizada pela presença de microorganismos no sistema urinário, sendo as infecções de etiologia bacteriana o maior responsável pelos casos de ITU existentes (LEE & NEILD; THOME, 2007). ITU é classificada quanto à localização anatômica no trato urinário, em pielonefrite (rins), uretrite (uretra), cistite (bexiga); à presença de sintomas, em assintomática ou sintomática; às recorrências (recaída ou reinfecção) ou esporádica e a quadro clínico como complicada e não complicada (MACLEAN, 2001). Em relação às recorrências de ITU, podem ser definidas como recaída ou reincidência e reinfecção. A primeira é definida pela presença do mesmo microrganismo, que não foi efetivamente eliminado, ocorrendo em um
período de até duas semanas após o término do tratamento. Estes casos estão relacionados há antibioticoterapia inadequada, descumprimento da posologia correta pelo paciente e pela resistência bacteriana. A reinfecção é definida por um novo caso de ITU após duas semanas do termino do tratamento inicial, pode ser causada pelo mesmo isolado bacteriano ou diferente da anterior. Fatores genéticos, comportamentais, ambientais e alterações anatômicas são os principais fatores que associados aos casos de ITU recorrentes por reinfecção. (CAI et al., 2012; EPP et al., 2010; MACLEAN, 2001).
Classifica-se ITU também segundo a etiologia da doença, se a infecção foi oriunda da comunidade ou foi adquirida posterior ao um procedimento hospitalar (NNIS, 2004). A ITU é a segunda infecção mais comum no ser humano, em ambiente hospitalares é primeira infecção mais freqüente relatada (Kiffer et al., 2007).
Os agentes etiológicos mais freqüentemente envolvidos com ITU adquirida na comunidade são, em ordem de frequência: a Escherichia coli, o Staphylococcus saprophyticus, espécies de Proteus e de Klebsiella e o Enterococcus faecalis. A E. coli, sozinha, responsabiliza-se por 70% a 85% das infecções do trato urinário adquiridas na comunidade e por 50% a 60% em pacientes idosos admitidos em instituições (Ahmad et al., 2015; MULLER
et al., 2008).
Quando a ITU é adquirida no ambiente hospitalar, em paciente internado, os agentes etiológicos são bastante diversificados, predominando as enterobactérias, com redução na frequência de E. coli (embora ainda permaneça habitualmente como a primeira causa), e um crescimento de Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus sp, Enterobacter sp.,
Enterococcus faecalis e de fungos, com destaque para Candida sp (Ahmad et al., 2015;KOCH
et al., 2008).
Estudos mostram que perfil de resistência aos antimicrobianos de bactérias causadoras de ITU tem aumentado a cada dia. O uso incorreto e indiscriminado dos agentes
antimicrobianos ao longo do tempo proporcionou o aparecimento de mecanismos de aquisição de resistência bacteriana à diversos fármacos (Pascual et al., 2016; Baron et al., 2016; SILVEIRA et al., 2006; DIENSTMANN et al., 2010).
A procura pela terapêutica individualizada e com o menor risco de efeitos adversos para paciente é uma constante para os cientistas e profissionais da área da saúde. Para isso têm sido pesquisadas novas formas e formulações farmacêuticas procurando aumentar a eficácia e reduzir a toxicidade dos medicamentos (NEBERT et al., 2008). Fundamentado nesta filosofia, as novas formulações farmacêuticas objetivadas para o tratamento das doenças infecciosas, visam diminuir a concentração da droga efetiva para o microrganismo a ser combatido que auxiliaria na diminuição da aquisição de resistência bacteriana frente aos antimicrobianos, bem como possibilitar o tratamento de pacientes acometidos por microrganismo resistentes aos fármacos (Rudramurthy et al., 2016; Hoffman et al., 2016).
1.2 - Hidrogéis e Sistemas micelares: estrutura, auto-organização e aplicações farmacêuticas dos poloxamers
Hidrogéis são formados por redes poliméricas tridimensionais capazes de absorver grande quantidade de água ou fluídos biológicos. Esta rede é composta de homopolímeros ou copolímeros, que se assemelham muito com os tecidos biológicos, devido a sua grande quantidade de água e sua consistência (Hamidi et al., 2008; Bhattarai et al., 2010). Existem inúmeras aplicações para estes hidrogéis em particular nos setores médicos e farmacêuticos. São encontrados em lentes de contato, membranas para biosensores, revestimento para coração artificial, materiais para peles artificiais e como sistema carreador de fármacos (Peppas et al., 2000).
Dentre as diversas substâncias utilizadas para formação de hidrogéis temos os Poloxamers (Lutrol®, Pluronic®, Synperonic®, Tetronic®) que são classificados como hidrogéis termorreversíveis formados por moléculas de constituídos por unidades de óxido de etileno
(OE) e óxido de propileno (OP) organizados em uma estrutura básica do tipo A-B-A, ou seja, OEx – OPy – OEx (ou polietilenoglicol-propilenoglicol-polietilenoglicol, PEG – PPG – PEG). Estes copolímeros têm propriedades anfifílicas caracterizadas pelos seus valores de Balanço Hidrofílico-Lipofílico (HLB, relação entre o número de unidades hidrofílicas e hidrofóbicas de um surfactante), diretamente dependente do número de x e y (figura 1). A variação do número de unidades de OE e OP permite os ajustes da lipofilicidade, hidrofilicidade e o tamanho das partículas micelares (Dumortier et al., 2006).
Figura 1: Estrutura química dos Poloxamers
Devido a possibilidade da inserção de diferentes comprimentos moleculares dos blocos de polimeros, existem disponíveis no mercado uma grande variedade, isso ocasionou a criação de um sistema de nomenclatura. Os poloxamers são nomeados com a letra P (Poloxamer) seguindo de três digitos, os dois primeiros digitos multiplicados por 100 determinam aproximadamente a massa molecular de propilenoglicol e o último dígito multiplicado por 10 determina a porcentagem de polietilenoglicol contido no sistema de copolímero. Por exemplo, o P407 comercializado o nome comercial de Lutrol® F127 ou Pluronic® F127 (Basf Chem. Corp.) é um poloxamer composto de por uma massa molecular de 4,000 g/mol de propilenoglicol e 70% de polietilenoglicol. Para a denominação do nome comercial os polímeros recebem uma codificação baseada na forma física dos polímeros em temperatura ambiente sendo L para apresentação em forma líquida (do inglês Liquid), P para apresentação semi-sólida (do inglês Paste) e F para formas sólidas (do inglês Flake) seguidos de dois ou três números, sendo o primeiro número (ou os dois primeiros números em caso de nomeclaturas utilizando três números) multiplicado por 300 determinam aproximadamente o peso da massa
molecular hidrofóbica e o último dígito multiplicado por 10 determina a porcentagem de polietilenoglicol contido, por exemplo o 213 indica uma massa molecular de 2,100 g/mol e 10% de polietilenoglicol (BASF, 2008).
Podemos destacar quatro tipos que são o PL-407, PL-403, PL-108 e PL-241. Suas respectivas caracteristicas físico-químicas estão apresentadas na tabela 1.
Tabela 1: Características físico-químicas dos polímeros utilizados neste trabalho
Polímero Massa molar
Unidades de óxido de etileno (PEG) Unidades de óxido de propileno (PPG) Balanço hidrofílico-lipofílico (HLB) Relação de unidades PEG: PPG Poloxamer 407 (Pluronic® F127) 12600 200,5 65,2 22 3:1 Poloxamer 403 (Pluronic® P123) 5760 39,2 69,4 8 1: 1,75 Poloxamer 108 (Pluronic® F38) 4700 92 16 24 1: 5,75 Poloxamer 213 (Pluronic® L81) 2750 6,3 42,8 4 1: 6,8
Adapatado de: Chiapetta e Sosnik, 2007
A propriedade de gelificação induzida termicamente é perfeitamente reversível e é dependente de temperatura e/ou da concentração para a transição sol – gel (Figura 2). Abaixo da temperatura de transição a amostra é líquida e acima desta temperatura a amostra se apresenta no estado semi-sólido. O aumento da temperatura promove a agregação das moléculas de copolímeros em micelas (micelização) que ocorre devido à desidratação dos blocos OP, hidrofóbicos, que é o primeiro estágio no processo de gelificação. A gelificação induzida pela temperatura se segue após o processo de micelização quando há também uma quantidade suficiente de copolímeros. (Dumortier et al., 2006)
Figura 2 - Esquema representando a micelização e a gelificação do Poloxamer a partir dos monômeros de OP e OE em função do aumento da temperatura em água. (Adaptado de Dumortier, 2006)
Estas estruturas micelares produzem alta viscosidade, rigidez parcial e lenta dissolução dos géis e também possibilitam a incorporação tanto de drogas hidrofílicas quanto de drogas hidrofóbicas.
Sobre o comportamento de transição de fases dos copolímeros de triblocos, é importante notar que, antes do início da transição de fase, a interação entre o bloco OE dos copolímeros triblocos com a água é muito forte e à medida que a temperatura aumenta esta interação diminui. Em uma determinada temperatura mínima, estas interações OE-H2O resultam em transição de fases. (Nandni, Vohra et al., 2009)
Uma das principais motivações para a ampla utilização dos PL reside em sua alta biocompatibilidade, sendo aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) para uso clínico (Kabanov, Batrakova e Alakhov, 2002; Singh-Joy e Mclain, 2008). Apesar de alguns relatos indicarem que o PL 407 induz alterações no metabolismo lipídico e na capacidade de filtração renal, é necessário ressaltar que tais complicações ocorreram apenas quando do uso de doses relativamente elevadas (0,5 a 1 g/kg, por via intraperitoneal) (Li, Palmer e Johnston, 1996; Blonder et al., 1999; Johnston et al., 2000; Dumortier et al., 2006). Adicionalmente, há descrições de algumas propriedades farmacológicas atribuídas ao uso de PL 407 como imunomodulação (reduzindo a ativação de neutrófilos e impedindo o reconhecimento de
nanopartículas pelo sistema retículo-endotelial) (Jackson et al., 2000), a indução de crescimento de fibroblastos e a cicatrização após procedimentos cirúrgicos odontológicos (Hokett et al., 2000).
Formulações farmacêuticas contendo Poloxamers com quinolonas são descritas na literatura, um estudo associando o F 127 com fluoroquinolonas para o tratamento de otites médias mostrou uma melhora na permeação do fármaco com a membrana timpânica otimizando as concentrações terapêuticas locais (KHOO et al., 2013), associação de F 127 e F 68 com moxifloxacina como sistemas de drug delivery do sistema ocular (SHASTR et al., 2010).
O presente trabalho usa sistemas binários de PL, fato pouco explorado na literatura, tal associação abre uma gama de novas estratégias para modular o perfil biofarmacêutico (propriedades estruturais das micelas, propriedades reológicas do gel formado, estabilidade da formulação, solubilidade e razão de liberação do fármaco incorporado) de alternativas de formulações farmacêuticas nas mais diferentes formas de administração (Ricardo et al., 2005;
Harrison et al., 2005; Chaibundit et al., 2007; Newby et al., 2009).
1.3 – Quinolonas
As quinolonas são uma classe de moléculas com propriedades antimicrobianas que foram sintetizadas a partir de modificações da estrutura 4-quinolona (figura 3), a molécula foi obtida acidentalmente oriunda de uma rota secundária da síntese do antimalárico cloroquina (LESCHER et al., 1962; VAN BAMBEKE et al., 2005). A primeira molécula da classe sintetizada e comprovadamente eficaz frente a microrganismos patogênicos (um pequeno espectro de bactérias Gram negativas) foi o Ácido Nalidíxico (AN) em 1962, no mesmo ano, o AN foi introduzido na clínica médica predominantemente sendo utilizado no tratamento de infecções no trato urinário (BALL, 2000).
Figura 3 - Estrutura 4-quinolona, molécula base para as quinolonas.
O AN apresentou uma modesta amplitude de espectro de ação limitando sua abrangência de utilização. Visando ampliar a abrangência do espectro de ação, varias modificações estruturais na molécula foram sendo realizadas ao decorrer das décadas, obtendo assim, diversas novas moléculas para a classe (BOLON, 2011). Com o aumento do número de
moléculas, as quinolonas foram classificadas nas chamadas gerações, estas são baseadas no número de anéis fundidos em sua estrutura básica. Esta classificação é demonstrada na tabela 2, baseadas nos artigos de LEE & KANATANI (1999) e BOLON (2011).
1ª Geração 2ª Geração 3ª Geração 4ª Geração
Ácido Nalidíxico Ciprofloxacino Levofloxacino Moxifloxacino Ácido Pipemídico Norfloxacino Esparfloxacino Trovafloxacino Ofloxacino Grepafloxacino Gemifloxacino
Lomefloxacino Gatifloxacino
Tabela 2 - Classificação de principais quinolonas de acordo com as suas respectivas gerações.
O marco funcional para classe foi estabelecido em 1980, com a adição combinada de um átomo de flúor (posição 6) e um grupo piperazinil (posição 7) da estrutura base, estabelecendo as quinolonas de segunda geração, proporcionando uma nova denominação
fluoroquinolonas, devido a adição da átomo de flúor na sua estrutura. Esta combinação levou a um maior espectro de ação (passou a incluir Pseudomonas spp), a um aumento da capacidade das quinolonas penetrarem na parede bacteriana levando, consequentemente, a uma melhor atividade contra bactérias Gram negativas, passando a abranger, também, algumas espécies Gram positivas e, atingiu um perfil farmacocinético melhor, chegando a ter uma atividade antibacteriana 1000 vezes superior à observada pelo AN (Andriole, 2000; Van Bambeke et al., 2005). A adição de um segundo e terceiro átomo de flúor na molécula proporcionaram, respectivamente, a criação da terceira e quarta geração das quinolonas, estas tiveram a ampliação do espectro de ação tanto para bactérias Gram positivas e negativas aumentadas, bem como o melhoramento das atividades farmacocinéticas em relação as moléculas das gerações anteriores (FUKUDA et al., 2001).
Figura 4 – Estrutura química do Ácido Nalidíxico (1ª geração), Ciprofloxacino, Norfloxacino (2ª geração) e Levofloxacino (3ª geração), quinolonas utilizadas no presente trabalho.
Ácido Nalidíxico
Ciprofloxacino Norfloxacino Levofloxacino
2ª Geração 3ª Geração
1.3.1 – Mecanismos de ação
As células bacterianas possuem um cromossomo composto por uma molécula de DNA dupla fita. Este DNA geralmente encontra-se superenovelado dentro da célula, tanto para ocupar pouco espaço quanto para tornar funcionais as atividades da bactéria (HAWKEY, 2003). Durante a replicação do DNA bacteriano, ocorre a chamada forquilha de replicação, a separação e abertura de um trecho da dupla fita (formando uma “bolha”) para replicação do mesmo, e
consequentemente maior pressão sobre as torções existentes antes e depois desta forquilha. A enzima responsável por aliviar esta pressão, diminuindo o número de torções através de quebras do segmento e selando novamente ao remover um giro no DNA, é a DNA-girase ou topoisomerase II (PALUMBO et al., 1993; HAWKEY, 2003).
A DNA-girase é um tetrâmero, formado por duas subunidades A e duas subunidades B, codificadas pelos genes gyrA e gyrB respectivamente, pertencente ao grupo de enzimas chamadas topoisomerases. Esta enzima além de ser responsável por diminuir o número de torções durante a replicação do DNA, também tem a função de enovelar e superelicoidizar o DNA, portanto é essencial para controle e manutenção da célula bacteriana viva (PALUMBO et al., 1993; HAWKEY, 2003). Além desta enzima as bactérias contam com outra topoisomerase, conhecida como topoisomerase IV, um tetrâmero formado por duas subunidades C e duas subunidades E, codificadas respectivamente pelos genes parC e parE. Esta enzima tem a função de separar a nova cópia de DNA do antigo cromossomo, para permitir a formação de uma célula-filha (DRLICA et al., 2009; FALCONER et al., 2011).
O mecanismo de ação das quinolonas consiste em se ligar às enzimas alvo, formando um complexo (quinolona – enzima – DNA), e impedir o desempenho da função das mesmas. Ao inibirem estas enzimas, não permitem que o processo de replicação continue e promovem rupturas nas cadeias de nucleotídeos, gerando pontas livres, e consequentemente a degradação da molécula de DNA. A captura destas enzimas ocorre quando o complexo enzima – DNA já
está formado, e impede a reparação da cadeia de DNA, desencadeando a morte celular (DRLICA et al., 2008; DRLICA et al., 2009; KOHANSKI et al., 2010).
2 - OBJETIVOS
Obtenção e caracterização de novos sistemas de liberação modificada baseado em estruturas poliméricas a base de poloxamer associadas aos antibióticos da classe das quinolonas Ciprofloxacino, Levofloxacino e Norfloxacino visando novas alternativas para pacientes com ITU.
Elucidação do perfil de liberação dos fármacos através do ensaio de liberação “in vitro” isoladamente e associados aos diferentes sistemas poliméricos em células de difusão vertical de Franz.
Avaliação do perfil de sensibilidade dos fármacos associadas as respectivas formulações poliméricas comparado com a mesma concentração do fármaco isoladamente frente a bactérias causadoras de Infecção no Trato Urinário visando novas alternativas de tratamentos.
Avaliação da atividade citotóxica em células NHI/3T3, HaCaT, HUVEC e NG97, células padrões para tipo de procedimento.
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Amostras bacterianas
3.1.1 - Meio de cultura
Meio Infusão de cérebro-coração (BHI) e BHI Ágar
Foi utilizada a forma comercializada na concentração de 37 g/L pela Acumedia (Lansing, Mchigan, USA).O material foi esterilizado em autoclave a 120 °C por 20 minutos. Para o preparo do BHI Ágar, adicionou-se 1,5 % de ágar ao meio de cultura líquido antes da esterilização pelo calor úmido (autoclave).
Meio Infusão de Mueller-Hinton (MH) e MH Ágar
Foi utilizada a forma comercializada na concentração de 38 g/L pela Acumedia (Lansing, Mchigan, USA).O material foi esterilizado em autoclave a 120 °C por 20 minutos. Para o preparo do MH Ágar, adicionou-se 1,5 % de ágar ao meio de cultura líquido antes da esterilização pelo calor úmido (autoclave).
3.1.2 - Obtenção das amostras bacterianas
Para avaliarmos as formulações poliméricas de liberação controlada, obtivemos algumas amostras de bactérias oriundas de infecção no trato urinário da coleção do LEBEM - Laboratório Especial de Bacteriologia e Epidemiologia Molecular do Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de USP- Ribeirão Preto/SP, sob coordenação da Profª. Dra. Ana Lúcia da Costa Darini, cepas isoladas de pacientes do Laboratório de Microbiologia do Hospital Estadual de Sumaré/UNICAMP, além das cepas padrões ATCC (American Type Culture Collection). As bactérias estão descritas na tabela 3.
O crescimento das bactérias foi realizado através do inóculo das mesmas em meio BHI ágar.
Tabela 3. Linhagens bacterianas utilizadas no trabalho
Linhagens Características Origem
E.c. HES 1 Escherichia coli HES 1 HES - UNICAMP
E.c. HES 2 Escherichia coli HES 2 HES - UNICAMP
E.c. HES 3 Escherichia coli HES 3 HES - UNICAMP
E.c. ATCC 25992 Escherichia coli ATCC 25992 ATCC
K.p. HES 1 Klebsiella pneumoniae HES 1 HES - UNICAMP
K.p. HES 2 Klebsiella pneumoniae HES 2 HES - UNICAMP
K.p. HES 3 Klebsiella pneumoniae HES 3 HES - UNICAMP
K. p. ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 ATCC
P.a. HES 1 Pseudomonas aeruginosa HES 1 HES - UNICAMP
P.a. 76 JF Pseudomonas aeruginosa 76 JF LEBEM
P.a. 37 JF Pseudomonas aeruginosa 37 JF LEBEM
P.a. 24 JF Pseudomonas aeruginosa 24 JF LEBEM
P. a. ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ATCC
S.a. ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25922 ATCC
S.a. BEC Staphylococcus aureus Brazilian Epidemic Clone LBMB
HES – UNICAMP - Laboratório de Microbiologia do Hospital Estadual de Sumaré/UNICAMP ATCC - American Type Culture Collection
LBMB - Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana – IB – UNICAMP
LEBEM - Laboratório Especial de Bacteriologia e Epidemiologia Molecular - Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de USP- Ribeirão Preto/SP (Profª. Dra. Ana Lúcia da Costa Darini.)
3.2 - Desenvolvimentos de sistemas carreadores micelares para os estudos de liberação controlada
As formulações usadas no trabalho foram preparadas em colaboração com a Profª. Drª. Daniele Ribeiro de Araújo no Laboratório de Prospecção e Caracterização de Bioativos do Centro de Ciências Naturais e Humanas – área de Farmacologia da Universidade Federal do ABC (UFABC) e tiveram sua caracterização obtida na Central Experimental Multiusuário da UFABC e no Laboratório de Biomembranas do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas.
Foram preparadas 8 diferentes sistemas copolímero a base de poloxamer, onde 4 sistemas são compostos de polímeros isolados e 4 são compostos de sistemas binários (associação de dois polaxamers). Os polímeros utilizados foram PL 407 (Pluronic® F127 ou
Lutrol® F127, BASF), PL 403 (Pluronic® P123, Sigma Aldrich Chem. Co.), PL 108
(Pluronic® F38, Sigma Aldrich Chem. Co.) e PL 213(Pluronic® L81, Sigma Aldrich Chem.
Co.). As diluições dos polímeros para obtenção dos sistemas isolados e binários foram feitas em
utilizando água Milli-Q®, onde permaneceram mantidas a 4°C, sob agitação (300 rpm) por 6 horas, como demonstrado na figura 5 (Schmolka, 1972). Na tabela 4 são demostrados as descrições dos 8 sistemas obtidos, bem como sua concentração.
Tabela 4. Sistemas Poloxamer obtidos no trabalho.
Formulações
Polímero
Concentração
Polímero Concentração
F1
PL 407
8%
PL 403
2%
F2
PL 407
8%
PL 213
2%
F3
PL 108
8%
PL 403
2%
F4
PL 108
8%
PL 213
2%
F5
PL 407
8%
-
-
F6
PL 108
8%
-
-
F7
PL 213
2%
-
-
F8
PL 403
2%
-
-
Para formação dos sistemas poloxamer-antibacterianos (PL-ATB), utilizamos três fármacos da classe das Fluoroquinolonas, sendo eles Ciprofloxacino (Sigma-Aldrich®), Norfloxacino (Sigma-Aldrich®) e Levofloxacino (Sigma-Aldrich®), foi incorporado 1 mg/mL de cada um dos fármacos individualmente em cada sistema polimérico. A incorporação foi realizada sob agitação (300 rpm) mantida a 4°C por 6 horas, como demonstrado na figura 5 (Schmolka, 1972). Após a preparação, as amostras foram armazenadas a 4°C até sua utilização.
Figura 5 – Processo de obtenção das formulações poliméricas (a) e incorporação dos fármacos as formulações previamente estabelecidas (b).
As concentrações utilizadas foram baseadas em estudos prévios realizados pelo grupo de pesquisa Profª. Drª. Daniele Ribeiro de Araújo, tais estudos foram base para publicações do grupo de pesquisa da pesquisadora (Akkari et al., 2016; Dos Santos et al., 2015; Oshiro et al., 2014). Das 32 formulações inicialmente preparadas foram selecionadas 18 formulações, o critério avaliado foi à solubilidade do fármaco aos polímeros.
3.3 - Análises das estruturas micelares
3.3.1 - Medidas de diâmetro hidrodinâmico e valores de polidispersão
A espectroscopia de correlação de fotóns (do inglês Photon Correlation Spectroscopy, PCS), foi utilizada para determinar o diâmetro hidrodinâmico e a distribuição de tamanho (PDI) das nanopartículas, utilizando-se o equipamento NanoSeries ZS90 (Malvern® Instruments) a um ângulo de 173º (CHAIBUNDIT et al., 2007).
O movimento Browniano, próprio de suspensões coloidais, é detectado pelo feixe de luz (laser He-Ne, 633 nm) que o equipamento emite sobre a amostra. Para tanto, parte do feixe de luz é disperso e o remanescente é transmitido através da amostra. A luz dispersa, derivada de um campo elétrico e associada à luz incidente, varia (devido ao movimento Browniano) conforme o tamanho das partículas. Através da determinação do coeficiente de difusão, também relacionado ao movimento Browniano das partículas no meio, consegue-se calcular o diâmetro
médio equivalente ao de uma esfera utilizando a equação de Stokes–Einstein (Equação 1) (Tscharnuter, 2006).
onde: κ = constante de Boltzmann, T = temperatura absoluta, R = raio das vesículas e η= viscosidade da solução dispersante.
Equação 1: Equação de Stokes–Einstein
As amostras foram preparadas com antecedência de 24 horas para favorecer o equilíbrio entre os monômeros e micelas, previamente filtradas através de uma membrana de policarbonato (poro de 0,22μm) e, posteriormente, avaliadas em duas diferentes temperaturas de 25 °C e 37 °C. As suspensões contendo as nanopartículas foram diluídas em água pura (sistema milli-Q) (1:100, amostra: água, v/v), minutos antes de cada medida. Os resultados das medidas foram obtidos a partir de dez varreduras com dez segundos de intervalo. Três medidas foram realizadas para cada amostra, e os resultados foram expressos como um valor médio (com desvio padrão) de diâmetro hidrodinâmico. O software utilizado para coletar e analisar os dados foi o DTS, versão 6.01 Malvern®.
Os experimentos de tamanho diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta foram desenvolvidos na Central Experimental Multiusuário da UFABC.
3.3.2 – Potencial Zeta
A carga superficial das partículas é um dos fatores que determina a estabilidade física das mesmas. Quanto maior a repulsão eletrostática entre as partículas, maior é estabilidade física da formulação. A quantificação da carga superficial das partículas, também denominada potencial zeta, é medida comumente através da mobilidade eletroforética das partículas em um campo elétrico (Mishra et al., 2009).
A Equação 2 relaciona os parâmetros utilizados para o cálculo do potencial zeta (Remington, 2006).
onde UE = mobilidade eletroforética, ε= é constante dielétrica, z= o potencial zeta, f(κa = a função de Henry e
η=representa a viscosidade do meio.
Equação 2: Equação de Henry
A Figura 6 mostra uma representação esquemática da medida do potencial zeta das partículas. Como pode ser observado, há duas regiões distintas em torno da partícula, uma região interna chamada de camada de Stern, onde os íons são fortemente ligados à partícula, e outra mais externa (ou também chamada difusa), na qual os íons são menos firmemente associados. A medida do potencial zeta é dada pela carga existente na superfície de cisalhamento hidrodinâmico (ou no plano de splinning). A magnitude do potencial zeta dá uma indicação da potencial estabilidade do sistema coloidal. Partículas com potenciais zeta mais próximos de + 30 mV ou - 30 mV são normalmente consideradas estáveis (Remington, 2006; Mishra et al., 2009). No entanto cada sistema deve ser individualmente avaliado.
As medidas de potencial zeta foram realizadas diluindo-se 1:100(v/v) a dispersão de nanopartículas com uma solução de NaCl (0,1 mmol.L-1) para propiciar um meio eletrolítico e garantir a formação de uma dupla camada elétrica compacta. As análises foram feitas em equipamento NanoSeries ZS90 (Malvern® Instruments), à temperatura de 25 °C e 37 °C, em cubetas de poliestireno (10 mm de caminho óptico) (Marcato et al., 2008). As medidas foram feitas em triplicata e os dados foram expressos como a média ± desvio padrão.
