ANDRÉ VICTOR CORDEIRO
O PAPEL DO EXERCÍCIO FÍSICO NO DESEQUILÍBRIO
MITONUCLEAR E UPRMT NA MUSCULATURA
ESQUELÉTICA DE CAMUNDONGOS IDOSOS
LIMEIRA 2019
ANDRÉ VICTOR CORDEIRO
O PAPEL DO EXERCÍCIO FÍSICO NO DESEQUILÍBRIO
MITONUCLEAR E UPRMT NA MUSCULATURA
ESQUELÉTICA DE CAMUNDONGOS IDOSOS
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Rochete Ropelle.
LIMEIRA 2019
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo na área de Ciências do Esporte
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ANDRÉ VICTOR CORDEIRO E ORIENTADA PELO PROF. DR. EDUARDO ROCHETE ROPELLE.
Biblioteca da Faculdade de Ciências Aplicadas Renata Eleuterio da Silva - CRB 8/9281
Cordeiro, André Victor,
C811p CorO papel do exercício físico no desequilíbrio mitonuclear e UPRmt na musculatura esquelética de camundongos idosos / André Victor Cordeiro. – Limeira, SP : [s.n.], 2019.
CorOrientador: Eduardo Rochete Ropelle.
CorDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas.
Cor1. Músculo esquelético. 2. Envelhecimento. 3. Exercícios físicos. I. Ropelle, Eduardo Rochete, 1976-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Aplicadas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: The role of physical exercise on mitonuclear imbalance and
UPRmt in skeletal muscle of aged mice
Palavras-chave em inglês:
Skeletal muscle Aging
Physical exercises
Área de concentração: Metabolismo e Biologia Molecular
Titulação: Mestre em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo Banca examinadora:
Eduardo Rochete Ropelle [Orientador] Fabiana Braga Benatti
Adaliene Versiane Matos Ferreira Júlio César Baptista Ferreira Marcio Alberto Torsoni
Data de defesa: 30-08-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-4202-429X - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/8363604320529351
Autor: André Victor Cordeiro
Título: O Papel do Exercício Físico no Desequilíbrio Mitonuclear e UPRmt na
Musculatura Esquelética de Camundongos Idosos.
Natureza: Dissertação
Área de Concentração: AA – Ciências do Esporte
Instituição: Faculdade de Ciências Aplicadas – FCA/Unicamp Data da Defesa: Limeira-SP, 30 de Agosto de 2019.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Eduardo Rochete Ropelle (orientador) Faculdade de Ciências Aplicadas - FCA/Unicamp
Profa. Dra. Fabiana Braga Benatti (membro). Faculdade de Ciências Aplicadas - FCA/Unicamp
Prof. Dr. Adaliene Versiane Matos Ferreira (membro externo) Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
DEDICATÓRIA
Ao meu pai. A saudade que eu sinto do
senhor é imensa, mas jamais será tão
grande quanto o amor e a gratidão que
eu tenho por você. Obrigado por me
servir como o melhor exemplo de
homem, pai e amigo. Que o senhor
continue me protegendo e abençoando,
de onde estiver.
AGRADECIMENTOS
Gostaria primeiramente de agradecer a Deus por ter me dado toda a proteção, benção, força e sabedoria necessárias, ao longo de todo esse processo. O senhor sempre esteve e estará ao meu lado, por isso toda vitória é sua, em primeiro lugar.
‘In memoriam’ ao meu pai, Waldomiro Cordeiro. Mais de 5 anos se passaram desde a sua partida, e não há um único dia que eu deixe de pensar em você. Sei que o senhor está olhando por mim aí de cima, torcendo e comemorando a cada vitória, como fizemos a vida inteira. Jamais se esqueça do quanto eu te amo e sou grato ao senhor por ter me ensinado tudo que sei, e me preparado para vida desde cedo.
A minha querida mãe, Nair Mafalda Gaia. A senhora é a base da minha formação, meu porto seguro e fonte inesgotável de força, superação e sabedoria. Minha querida mamãe, que a senhora jamais se esqueça que eu não seria absolutamente nada, sem a senhora. E que conquista nenhuma valeria, se eu não pudesse compartilhar com você. Eu te amo mais do que tudo nessa vida!
Aos meus familiares. Minhas queridas tias, Amantina e Nadir. Sem vocês duas eu não teria o mínimo de condições de terminar essa etapa da minha vida. Aos meus primos, ao meu irmão, e todos os familiares que compartilham ao meu lado, toda essa trajetória. E por falar em família, o meu agradecimento mais especial à minha eterna namorada, Maria Rita. Você é a personificação do que eu aprendi sobre o amor. Obrigado por ficar ao meu lado durante esse processo, me incentivando, dando forças e compartilhando comigo todos dos melhores e piores momentos. Como se isso tudo não fosse o suficiente, você trouxe luz, cores e felicidade em minha vida. O meu maior pedido a Deus, é que esse seja apenas o início de uma vida inteira ao seu lado.
Em especial, o meu muito obrigado ao meu orientador, professor Eduardo Ropelle, por ser a pessoa que eu sabia que poderia contar em todos os momentos dessa trajetória. Obrigado por confiar no meu trabalho e por me ensinar o que é ciência, na forma mais pura da palavra. A minha eterna gratidão ao senhor, por ter me dado a oportunidade e todas as condições necessárias para que eu me desenvolvesse como aluno, pesquisador e ser humano.
Ao meu laboratório, LaBMEx, e a todos os colaboradores. Em especial, professores Eduardo, Leandro, Dennys e Rodrigo. Obrigado pelas cobranças e por se importarem com o meu trabalho e minha formação pessoal. Cada reunião, críticas, sugestões e “puxões de orelha” (que não foram poucos!) Eu escutei, absorvi e tentei me esforcei ao máximo para crescer. Obrigado por serem sempre solícitos e dispostos a ajudar, em todos os momentos que eu precisei. E a toda a família LaBMEx/LabGeN: o mais sincero obrigado. Vitor, Rafael, Marcella, Thais, Lucas, Barbara, Camila, Kellen, Susana, Gabriel, Fernanda, Rodrigo, Luciele, Leonardo, Raphael, Peruca e Diego, obrigado por compartilharmos todos esses dias de muito trabalho, mas muitas brincadeiras, desabafos, risos e felicidade.
E por fim, aos “Ropellers” (X-Men). Tenham certeza, que não há outro lugar no mundo onde eu gostaria de estar trabalhando. Durante anos, todos os dias, compartilhamos conversas, experimentos, desabafos, alegrias, etc. Em especial, aos meus queridos ICs Renata e Rafael, pois sem vocês, esse trabalho não teria sido feito. E por último, aos mestres (ou melhor, doutores!) Vagner, Carlos e Luciene. Obrigado por serem colegas de trabalho, amigos pessoais e acima de tudo, por serem inspiração do que um dia eu gostaria de me tornar.
A todos, eu deixo a minha eterna gratidão.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
EPÍGRAFE
“Sempre tentei.
Sempre fracassei.
Não importa.
Tento de novo.
Fracasso de novo.
Fracasso melhor”.
Samuel Beckett.
RESUMO
Introdução: Entende-se o fenômeno mitocondrial de resposta a proteínas malformadas (UPRmt), como um sistema de controle e qualidade de proteínas que asseguram a integridade e funcionalidade das mitocôndrias frente a danos proteotóxicos. A UPRmt é induzida por um desequilíbrio estequiométrico entre proteínas codificadas pelo DNA mitocondrial (mtDNA), e proteínas oriundas do DNA nuclear (nDNA), ativando chaperonas e proteases que remodelam e asseguram a funcionalidade das proteínas mitocondriais, melhorando o metabolismo e suas funções. No entanto, durante o envelhecimento, a disfunção mitocondrial é, ao menos em parte, relacionada à redução da capacidade de ativação da UPRmt. Contudo, sabe-se que o exercício promove respostas fisiológicas benéficas frente a condições que provocam o declínio fisiológico, como a senescência celular. Dessa forma, é plausível ponderar que exercício pode induzir o desequilíbrio mitonuclear e a UPRmt, contrabalanceando a disfunção mitocondrial no envelhecimento. Materiais e
Métodos: Camundongos C57BL/6J, com 2 meses (jovens) e 2 anos (idosos) foram
utilizados. Os animais idosos foram submetidos a dois protocolos de exercício físico crônico: O primeiro [Estudo 1] com 60 minutos, em intensidade moderada. O segundo [Estudo 2] com 30 minutos, em bouts intervalados de alta intensidade (HIIT), ambos durante 4 semanas. Ao final das intervenções, combinamos análises fisiológicas e moleculares para avaliar os efeitos do treinamento sobre o desencadeamento do desequilíbrio mitonuclear, UPRmt e metabolismo mitocondrial no músculo esquelético de animais idosos. Por fim, análises de bioinformática foram realizadas utilizando bases de dados de camundongos e humanos idosos, associando genes da UPRmt com o metabolismo mitocondrial no tecido muscular e fatores fisiológicos. Resultados: O envelhecimento diminuiu marcadores da UPRmt no músculo esquelético de camundongos. Contudo, ambos os protocolos de exercício foram capazes de induzir o desequilíbrio mitonuclear e a ativação da UPRmt nos animais idosos. Em adição, ambos os protocolos aumentam o conteúdo mitocondrial na musculatura esquelética, além de aumentar a performance física. Análises de bioinformática corroboram os resultados, demonstrando correlações positivas entre genes da UPRmt e do metabolismo mitocondrial no musculo esquelético em camundongos e humanos. Conclusão: Em conjunto, os resultados evidenciam que a UPRmt é um mecanismo conservado de longevidade, e que o exercício físico é uma ferramenta não farmacológica altamente eficiente em induzir o desequilíbrio mitonuclear, a ativação da UPRmt e a funcionalidade mitocondrial na musculatura esquelética de camundongos idosos.
ABSTRACT
Introduction: The mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) is
understood as a control and quality system of mitochondrial proteins, which ensure the integrity, morphology and functionality of mitochondria over the presence oxidative stress and proteotoxic damages. The UPRmt is activated after a stoichiometric imbalance between proteins encoded by mitochondrial DNA (mtDNA), and proteins synthesized by the nuclear DNA (nDNA), activating chaperones and proteases that remodel and assure the functionality of mitochondrial proteins, improving mitochondrial metabolism and its functions. However, during aging occurs downregulation of UPRmt, culminating in mitochondrial dysfunction diminishing the machinery for energy production. However, it is known that exercise induces beneficial responses against conditions promoting physiological impairments, as cellular senescence. In this sense, it is plausible to consider that physical exercise could induces mitonuclear imbalance and UPRmt, counteracting the mitochondrial dysfunction occurred during aging. Materials and Methods: C57BL/6J mice, with 2 months (young) and 2 years (aged) used in this study. The animals were submitted to different protocols of exercise training during 4 weeks: The first protocol consisted in moderated exercise during 60 minutes [Study 1]. The second protocol consisted in high-intensity (HIIT) interspaced bouts [Study 2]. Next, we combined physiological and molecular analyzes to evaluate the roles of exercise training on the mitonuclear imbalance, UPRmt and mitochondrial metabolism in the skeletal muscle of the aged animals. Finally, to confirm the UPRmt mechanism in different experimental models, were performed transcriptomic analysis in animals and humans, correlating markers of UPRmt with mitochondrial metabolism and physiological parameters. Results: Aging decreases markers of UPRmt in the skeletal muscle of mice. However, both exercise protocols were able to induce mitonuclear imbalance and UPRmt activation in trained animals. In addition, both protocols improved metabolism and mitochondrial content in the skeletal muscle, in addition to increasing physical performance. Lastly, bioinformatics analysis corroborated with our findings, evidencing a positively correlation between markers of UPRmt and mitochondrial metabolism in skeletal muscle of aged animals and humans. Conclusion: Taken together, the results showed that UPRmt is a conservative longevity mechanism, affected by aging. In addition, exercise training is an efficient non-pharmacological strategy to induce mitonuclear imbalance, UPRmt activation and mitochondrial functions in the skeletal muscles of aged animals.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Protocol description of High-Intensity Interval Training (HIIT) ……….…. 50 Tabela 2. Primers of mitochondrial-encoded genes design and characteristics ……… 50
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT: Associação Brasileira de Normas Técnicas
ATF4 Fator de Transcrição 4
ATP Adenosina Trifosfato
C. Elegans Caenorhabditis elegans
CAM Calmodulina
CAMK Proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CLpP Peptidase caseinolítica dependente de ATP
CS Citrato Sintase
CTE Cadeia Transportadora de Elétrons
CytB Citocromo B
CytC Citocromo C
gDNA DNA genômico
mtDNA DNA mitocondrial
nDNA DNA nuclear
EDTA Ácido Etilenodiamino tetra-acético
EPM Erro Padrão da Média
ER Estresse de Retículo
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase Heatmap Mapa de Calor
HIIT Treinamento Intervalado de Alta Intensidade HSP60 Proteína de Choque Térmico com peso 60 kDa HSPs Proteínas de Choque Térmico
LonP1 Protease Lon-Homóloga mitocondrial
m metros
MEF2 Fator intensificador de miócito 2
MICT Treinamento Contínuo de Intensidade Moderada
min Minutos
Mitoss Fração Mitocondrial no Sarcolema
ILT Incremental Load Test
MTCO1 Subunidade 1 da Citocromo C Oxidase mtND1 Subunidade 1 NAD desidrogenase
N Newtons
NAD+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo NRF-1 Fator de Respiração Nuclear 1
OXPHOS Fosforilação Oxidativa
pAMPK AMPK fosforilada
pCAMKII CAMKII fosforilada
PGC-1α Co-ativador 1 alfa ativado por proliferadores de peroxissoma RT-qPCR PCR quantitativo em tempo real
mRNA RNA mensageiro
EROs Espécies Reativas de Oxigênio Rpl13a Proteína Ribossomal L13a
rt-qPCR Transcrição reversa quantitativa da reação em cadeia polimerase
seg segundos
SIRT1 Sirtuína 1
TCA Ciclo do Ácido Cítrico
Tfam Fator de Transcrição Mitocondrial 1
UPR Complexo Responsivo à Proteínas Malformadas
UPRmt Complexo Mitocondrial Responsivo à Proteínas Malformadas UQCRC1 Proteína Nuclear ubiquinol-citocromo c redutase 1
VO2máx Consumo Máximo de Oxigênio
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
A funcionalidade mitocondrial e seu papel na regulação metabólica ... 15
As implicações da disfunção mitocondrial durante o envelhecimento... 16
Os mecanismos de adaptação mitocondrial em condições adversas ... 17
Estratégias de indução do desequilíbrio mitonuclear e ativação da UPRmt ... 18
O Exercício Físico e seus efeitos no metabolismo ... 20
2. JUSTIFICATIVA ... 22 3. HIPÓTESE ... 23 4. OBJETIVOS ... 23 4.1 Objetivo Geral ... 23 4.2. Objetivos Específicos ... 23 5. RESULTADOS ... 25 Trabalho de Mestrado 01: ... 25 Trabalho de Mestrado 02: ... 45 6. DISCUSSÃO ... 70 7. CONCLUSÃO. ... 73 8. REFERÊNCIAS ... 74 APÊNDICES ... 82
APÊNDICE 1: Certificado de Curso em Manipulação Animal (CEUA) ... 82
APÊNDICE 2: Aprovação Comitê de Ética (CEUA) – 4572-1/2017 ... 83
APÊNDICE 3: Aprovação Comitê de Ética (CEUA) – 4573-1/2017 ... 84
APÊNDICE 4: Certificado de Submissão de Artigo [Estudo 1] ... 85
1.INTRODUÇÃO
A FUNCIONALIDADE MITOCONDRIAL E SEU PAPEL NA REGULAÇÃO METABÓLICA
Em 1981, Lynn Margulis publicou um brilhante trabalho, intitulado “Symbiosis in
Cell Evolution” [1], no qual levanta-se a hipótese da “Teoria Endossimbiótica”, sugerindo
que em decorrência de um processo evolutivo, as mitocôndrias (anteriormente proteobactérias) foram incorporadas pelas células eucarióticas por uma relação de simbiose [1]. Hoje, sabe-se que essas organelas ainda possuem diversos resquícios de sua ancestralidade bacteriana, como um DNA próprio em formato circular – que codifica 13 proteínas -, uma membrana em bicamada, mecanismos específicos como fissão e fusão, dentre outros [2]. Acredita-se que foi devido à tais particularidades, e especialmente por possuírem um maquinário enzimático altamente capaz de produzir energia celular, que as mitocôndrias foram incorporadas pelas células eucarióticas [3].
Contudo, em decorrência do processo evolutivo e de tal relação simbiótica, atualmente as mitocôndrias de eucariontes possuem cerca de 1500 proteínas, sendo que a maior parte delas é codificada pelo núcleo celular [4]. Dessa forma, mecanismos celulares de codificação, tradução e comunicação precisaram ser desenvolvidos, para manter a homeostase mitocondrial frente a diversas disfunções nesse robusto maquinário celular, e assegurar a funcionalidade do maquinário de produção energética.
Devido a seus papeis fundamentais na funcionalidade metabólica, especialmente nos processos de produção energética [5], [6], as mitocôndrias são conhecidas como o “Centro de Energia” de todas as células eucarióticas [7]. A importância dessas organelas está principalmente por estas orquestrarem os processos de produção energética, como a β-oxidação [8], o Ciclo do Ácido Cítrico (TCA) [9] e a Cadeia Transportadora de Elétrons (CTE) [10], produzindo a energia necessária para todo o funcionamento celular [11].
No entanto, estudos produzidos nas últimas décadas demonstraram que, além das funções no metabolismo bioenergético, as mitocôndrias são essenciais para a realização de diversas outras funções no metabolismo celular [7], [12], [13]. Uma interessante revisão recentemente publicada, demonstrou os mecanismos de funcionalidade mitocondrial em condições normais e sob condições patofisiológicas [14]. Nesse sentido, diversos mecanismos mitopatogênicos começaram a ser investigados, associando as
disfunções mitocondriais com doenças genéticas, oncológicas, neurológicas e imunológicas [13]. Em adição, outros estudos vêm demonstrando diversas outras funções mitocondriais, como na síntese de macromoléculas [15], ciclo celular [16], [17], mecanismos imunológicos [18], [19], produção de enzimas antioxidantes [20], dentre outros.
Contudo, sabe-se que as mitocôndrias são essenciais para a homeostase energética, sendo altamente adaptativas a condições de estresse celular. Assim, fatores externospodem moldar as características morfofuncionais das mitocôndrias, podendo induzir adaptações benéficas ou maléficas ao metabolismo celular. Nessa linha de raciocínio, um tópico que ganhou muita importância na literatura recentemente, são as complicações metabólicas decorrentes de disfunções mitocondriais, especialmente na musculatura esquelética, como o desenvolvimento de diabetes tipo-II [21]–[23] e obesidade [24], [25]. Esses achados demonstram que condições de estresse oxidativo e disfunção mitocondrial provocam o desenvolvimento de diversas doenças, com um decréscimo na produção energética e funcionamento celular. Notavelmente, dentre todas as associações entre disfunção mitocondrial e desordens metabólicas, um tópico chama atenção: A relação entre disfunção em mecanismos que controlam o metabolismo mitocondrial e as complicações decorrentes do envelhecimento [26].
AS IMPLICAÇÕES DA DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL DURANTE O ENVELHECIMENTO
O envelhecimento pode ser entendido como uma progressiva queda na integridade morfofuncional, a qual culmina em disfunções metabólicas, aumento na vulnerabilidade celular e até morte [27]. Em uma brilhante revisão, intitulada “Hallmarks of Aging”, os autores classificaram os marcadores do envelhecimento em 3 principais categorias: Marcadores principais (como a perda de proteostase), marcadores antagonísticos (como as disfunções mitocondriais) e marcadores integrativos (como alterações na comunicação intercelular) [28]. Ainda, os autores apontam que os principais marcadores, em sua maioria, ocorrem em decorrência de danos moleculares, enquanto os marcadores antagonísticos podem ser protetores ou deletérios, dependendo dos seus níveis, e os marcadores integrativos surgem como para tentar quando os mecanismos celulares não são capazes de compensar os danos celulares [26], [28]. Interessantemente, as disfunções mitocondriais decorrentes do envelhecimento acontecem nas 3 categorias, especialmente
em relação a perda de proteostase (e.g. mitofagia), danos oxidativos e diminuição da maquinaria enzimática [26].
O declínio da funcionalidade mitocondrial observado durante o envelhecimento, acontece em diferentes tipos celulares, incluindo hepatócitos [29], neurônios [30] e células musculares [31]. Em adição, foi demonstrado diversos mecanismos que podem culminar na disfunção mitocondrial advinda do envelhecimento, como a localização das chaperonas, a funcionalidade das proteases e a atividade de enzimas antioxidantes [32]– [34]. Nesse sentido, considera-se que a atividade desses mecanismos de controle e qualidade mitocondrial possa ser peça-chave na prevenção de proteínas malformadas, que acarretam em danos celulares e desregulam a homeostase metabólica [35].
Dessa forma, as mitocôndrias desenvolveram um mecanismo de resposta à proteínas malformadas, denominado “mitochondrial Unfolded Protein Response” (UPRmt), conhecido por ser um fenômeno evolucionário conservado entre diversas espécies, que culmina na melhora da função mitocondrial e aumenta a longevidade [36]. A UPRmt é um mecanismo de adaptação mitocondrial, em resposta a condições adversas, podendo ser uma resposta tanto benéfica, quanto maléfica, dependendo da condição e ambiente na qual é ativada [37].
OS MECANISMOS DE ADAPTAÇÃO MITOCONDRIAL EM CONDIÇÕES ADVERSAS
Dentre diversas funções no metabolismo, a funcionalidade das mitocôndrias se dá por meio da capacidade das mesmas em produzir ATP, através de sua maquinaria enzimática denominada Cadeia de Fosforilação Oxidativa (Oxidative Phosphorylation,
OXPHOS) [14].
Durante o funcionamento normal da OXPHOS, há uma contínua produção de radicais livres e espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais são comumente produzidas e degradadas pela maquinaria enzimática mitocondrial [38]. A formação das EROs promove um desequilíbrio na homeostase celular, denominado de “Estresse Oxidativo”. Em condições de estresse celular - como ocorre no envelhecimento -, altos níveis de estresse oxidativo podem produzir mutações no DNA, danos integridade estrutural e diminuição na funcionalidade das mitocôndrias [38], podendo inclusive levar à morte celular [39].
Contudo, os compartimentos celulares são capazes de reagir contra as EROs, por meio de maquinarias de reparo celular, resposta imunológica e especialmente da capacidade antioxidante, aumentando a atividade de enzimas antioxidativas [40]. Nesse sentido, baixos e transitórios níveis de produção das EROs podem estimular respostas adaptativas que aumentam a defesa celular, potencializando a capacidade de adaptação celular frente a danos oxidativos [41].
Nesse sentido, para garantir a integridade estrutural e funcional das mitocôndrias frente aos estresses oxidativos (alta produção de EROs e radicais livres) e danos proteotóxicos (erros em importação, dobramento ou função de proteínas), diversas proteínas são essenciais. Algumas proteínas ganham destaque, como as chaperonas mitocondriais de choque térmico (HSPs), como a HSP60 [42]; proteínas envolvidas na fusão [43] e fissão mitocondrial [44]; e as proteínas envolvidas na proteostase mitocondrial, como a proteína mitocondrial Lon-Homóloga (Lonp1), a Metaloprotease dependente de ATP (Yme1L1) a proteína peptidase caseinolítica dependente de ATP (CLpP), as quais são extremamente importantes por clivar outras proteínas malformadas com danos proteotóxicos irreversíveis [45]. O conjunto desses mecanismos de controle e comunicação promovem uma rigorosa sinalização celular entre as mitocôndrias e o núcleo que, quando ativados, podem promover o aumento da transcrição gênica. Esse conjunto de mecanismos é conhecido como a UPRmt [46], [47].
Sendo assim, entender os mecanismos que podem induzir a UPRmt surgem como um potencial alvo terapêutico, pois a sua sinalização celular aumenta a proteostase núcleo-mitocondrial, estabilizando as funções mitocondriais e a homeostase celular [27].
ESTRATÉGIAS DE INDUÇÃO DO DESEQUILÍBRIO MITONUCLEAR E ATIVAÇÃO DA UPRMT
Nas mitocôndrias, uma das formas de ativar a UPRmt é pela redução ou inibição das subunidades da cadeia de transporte de elétrons, podendo impedir a formação e/ou a funcionalidade dos complexos da cadeia oxidativa [48]. Em nematódeos Caenorhabditis
Elegans (C. Elegans), já foi demonstrado que a disfunção das proteínas ribossomais na
mitocôndria são capazes de ativar robustamente a UPRmt [49], visto que a deficiência na tradução das proteínas mitocondriais leva a redução na produção das subunidades da CTE mitocondrial, aumentando a quantidade das subunidades da CTE de origem nuclear. Esse
acontecimento, que leva à ativação da UPRmt, é conhecido por “desequilíbrio mitonuclear”.
Notavelmente, Zhang e colaboradores publicaram recentemente um estudo demonstrando que a elevação dos níveis do cofator Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD+)potencializa a função mitocondrial, diminui a senescência das células musculares e aumenta a longevidade de camundongos idosos, através da ativação da UPRmt [50]. Interessantemente, eles utilizaram um precursor dessa molécula, e descobriram que o aumento nos níveis de NAD+ gera um estresse oxidativo, promovendo um desequilíbrio mitonuclear e a consequente ativação da UPRmt, que aumenta a função mitocondrial e diminui a senescência celular, melhorando a performance física e aumentando a longevidade em camundongos idosos [50]. Ainda, outros resultados similares também já foram demonstrados, evidenciando que a UPRmt é capaz de melhorar a função mitocondrial, aumentando a longevidade mediada pelo desequilíbrio mitonuclear em resposta ao estresse [51], [52].
A figura abaixo ilustra os mecanismos moleculares advindos do desequilíbrio estequiométrico mitonuclear e a subsequente ativação da UPRmt, culminando no fenômeno de biogênese mitocondrial.
Figura 1. Etapas do processo de ativação da UPRmt no músculo esquelético. A razão entre as proteínas
codificadas pelo mtDNA (MTCO1) e as proteínas de origem nuclear (nDNA, como a ATP5a) demonstra o equilíbrio mitonuclear (1). O acúmulo de proteínas malformadas pela mitocôndria sinaliza a transcrição de chaperonas (HSP60) e proteases (CLpP) no núcleo celular (2), aumentando a expressão dessas proteínas
(3). Assim, o desencadeamento da UPRmt redobra ou degrada as proteínas malformadas (4), melhorando
a função e promovendo biogênese mitocondrial (5).
Alguns estudos investigando a UPRmt comprovam que esta via está relacionada diretamente à sinalização adaptativa no reparo mitocondrial, na melhora de função e da capacidade oxidativa em diversos modelos animais [53]–[55], de modo que distúrbios em seu funcionamento possam facilitar a ocorrência de distúrbios metabólicos. Por exemplo, já foi demonstrado que o aumento na biodisponibilidade de NAD+ culmina no aumento
da atividade de SIRT1, e está diretamente relacionado com o desencadeamento da UPRmt e de biogênese mitocondrial, no músculo esquelético. Não obstante, estudos investigaram que compostos nos quais aumentam NAD+, são capazes de ativar a UPRmt e melhorar a performance em exercícios predominantemente oxidativos, mostrando que o acúmulo desse cofator, por uma via alternativa à desacetilação da SIRT-1, pode promover biogênese mitocondrial [49], [53]. Em adição, em um estudo com C. Elegans, a ativação da UPRmt demonstrou acarretar em um aumento na expressão de algumas enzimas da via glicolítica [56]. Tal fato sugere que, em condições de estresse mitocondrial que levam ao desregulamento na funcionalidade da mitocôndria, a produção energética alterne da via da OXPHOS para a glicólise.
Nessa linha de raciocínio, faz sentido ponderar que o exercício físico possa induzir o desequilíbrio mitonuclear e ativar a UPRmt no músculo esquelético, devido ao estresse metabólico provocado pela contração muscular, bem como ao acúmulo de íons e outras moléculas dentro das células. Dessa forma, o exercício físico pode acarretar adaptações mitocondriais que retardam a progressão do envelhecimento, por potencializar o metabolismo mitocondrial através da UPRmt
OEXERCÍCIO FÍSICO E SEUS EFEITOS NO METABOLISMO
Por meio das diversas evidencias encontradas na literatura científica, entende-se o exercício físico é um dos principais promotores de biogênese mitocondrial em diversos tecidos e modelos experimentais [57]–[62]. Sabe-se que a quantidade de mitocôndrias dentro das células musculares é o principal determinante da capacidade aeróbia [63]. E ainda, a capacidade muscular oxidativa devido ao treinamento aeróbio, pode ser efetiva tanto por aumentar o número de mitocôndrias [64], quanto por aumentar o tamanho destas organelas [65], e até mesmo alterar a sua composição [66] em razão da necessidade
funcional do organismo [67], [68]. Recentemente, foi publicado um interessante trabalho, intitulado “Exercise Attenuates the Major Hallmarks of Aging”, no qual os autores apresentam evidências sobre os papéis terapêuticos multi-sistêmicos do exercício físico contra os efeitos patofisiológicos do envelhecimento [69]. Esse trabalho descreve evidências sobre as adaptações sistêmicas em resposta ao treinamento físico, enfatizando seu papel terapêutico contra instabilidade genômica [70], encurtamento dos telômeros [71], perda da proteostase [72] e disfunção mitocondrial [73].
À nível molecular, o exercício físico promove biogênese mitocondrial de diversas formas, sendo mais evidenciada na literatura, a ativação pela molécula coativadora 1α do receptor γ do proliferador ativado por peroxissoma (PGC-1α), uma das principais reguladoras deste processo [74], [75].
A ação da PGC-1α se inicia a partir de sua importação ao núcleo, que resulta na co-ativação de diversas proteínas, como o fator de respiração nuclear-1 (NRF-1), que regula os processos de função e replicação mitocondrial. Nesse sentido, pode-se afirmar que o aumento nos níveis nucleares de PGC-1α, leva ao consequente aumento nos níveis de NRF-1, e então ao provável aumento do conteúdo mitocondrial. A proteína NRF-1 foi descoberta por Scarpulla e colaboradores [76]–[78], sendo peça fundamental para a indução de biogênese mitocondrial, pois a sua ativação culmina no aumento do DNA mitocondrial [75]. Em adição, a NRF-1 é capaz de ativar todas as subunidades da citocromo C oxidase (CytC) [79], e sua deleção em modelo animal causa morte embrionária [80].
Não obstante, sabe-se ainda que a NRF-1 aumenta os níveis do fator de transcrição mitocondrial A (Tfam) [76], [81]. Alguns estudos demonstraram que a Tfam é considerada proteína-chave final para que ocorra o processo de biogênese, pois ela coordena a expressão de genes codificadores de proteínas nucleares e mitocondriais [82], [83]. Sendo assim, a via molecular PGC-1α/NRF-1/Tfam fornece um mecanismo para ligar a expressão da cadeira respiratória e integrá-la com as funções mitocondriais relacionadas a energia celular [84]–[86].
A Figura 2, ilustrada abaixo, demonstra as formas de indução de biogênese mitocondrial por meio da ativação da via PGC-1α/NRF-1/Tfam, que pode culminar no aumento do DNA mitocondrial.
Figura 2: A indução da PGC-1α e o processo de biogênese mitocondrial, no músculo esquelético, em resposta ao exercício físico. A indução da PGC-1α no músculo esquelético através de diferentes maneiras,
frente ao exercício físico. Acompanhados pelo processo de translação da PGC-1α para o núcleo, co-ativando diversos fatores, dentre eles, o fator de respiração nuclear 1 (NRF-1) e o subsequente processo de biogênese mitocondrial.
Dessa forma, as evidências apontam que o aumento na expressão gênica e conteúdo proteico dos marcadores supracitados podem promover biogênese mitocondrial, além de potencializar o metabolismo oxidativo e prevenir desordens metabólicas, provenientes de deficiência na função mitocondrial (e.g. disfunção mitocondrial), como acontece no envelhecimento.
2.JUSTIFICATIVA
À luz das evidências apresentadas, entende-se que o declínio nas funções mitocondriais é um dos principais fatores que culminam no envelhecimento [28]. Contudo, estudos recentes demonstram que estratégias que visem aumentar o conteúdo de proteínas capazes de induzir o desequilíbrio mitonuclear e ativar a UPRmt, podem melhorar o metabolismo e a funcionalidade mitocondrial, e ainda aumentar o conteúdo mitocondrial [53]–[55], [87]. Além disso, análises de bioinformática mostraram fortes associações entre genes marcadores da UPRmt e metabolismo mitocondrial com marcadores de performance aeróbia, VO2máx e diminuição da massa adiposa [55].
Nesse sentido, sabe-se que a UPRmt é um mecanismo conservado ao longo da vida, e que o desencadeamento da UPRmt se dá pelo desequilíbrio mitonuclear e pode culminar em biogênese e melhora das funções mitocondriais, retardando os efeitos do envelhecimento. No entanto, até o momento nenhum estudo almejou investigar, na condição de envelhecimento, o desencadeamento da UPRmt e as possíveis respostas mitocondriais, em resposta protocolos de exercício físico. Em adição, avaliar se as disfunções mitocondriais advindas do envelhecimento poderiam ou não, serem moduladas por tais protocolos de exercício. Sendo assim, investigar os efeitos de diferentes protocolos de exercício físico no desencadeamento da UPRmt e nos processos de biogênese mitocondrial, função e conteúdo total no músculo esquelético de camundongos idosos, faz-se de extrema relevância no entendimento das adaptações fisiológicas e estratégias terapêuticas não-farmacológicas que retardam o envelhecimento.
3.HIPÓTESE
Aventamos à hipótese de que o exercício físico pode induzir o desequilíbrio mitonuclear e ativar a UPRmt na musculatura esquelética de camundongos idosos. Assim, podendo culminar em uma melhora do metabolismo mitocondrial e oxidativo, além da performance física.
4.OBJETIVOS
4.1OBJETIVO GERAL
O objetivo principal do presente trabalho, foi elucidar os efeitos do exercício físico sobre o desequilíbrio mitonuclear, ativação da UPRmt e marcadores mitocondriais, na musculatura esquelética de camundongos idosos.
4.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Avaliar o conteúdo proteico de marcadores do desequilíbrio mitonuclear (razão MTCO1/ATP5a) na musculatura esquelética de camundongos idosos, treinados em intensidade moderada (Estudo 1) e alta (Estudo 2), durante 4 semanas.
II. Avaliar a expressão gênica e o conteúdo proteico de marcadores da UPRmt e biogênese mitocondrial na musculatura esquelética de camundongos idosos, treinados em intensidade moderada (Estudo 1) e alta (Estudo 2), durante 4 semanas.
III. Avaliar o conteúdo e de marcadores do metabolismo mitocondrial, no músculo esquelético de camundongos idosos, treinados em intensidade moderada (Estudo 1) e alta (Estudo 2), durante 4 semanas.
III. Mensurar a performance física de camundongos idosos por meio de testes de força, resistência de força e corrida em resposta à diferentes protocolos de treinamento físico, durante 4 semanas.
IV. Monitorar diariamente o peso corporal dos animais ao longo do período de treinamento físico. Posteriormente, comparar o efeito dos protocolos de treinamento sobre o conteúdo tecido adiposo em camundongos idosos.
5.RESULTADOS
TRABALHO DE MESTRADO 01:
Aerobic Exercise Training Induces the Mitonuclear Imbalance and
UPRmt in the Skeletal Muscle of Aged Mice
André V. Cordeiro1, Rafael S. Brícola1, Renata R. Braga1, Luciene Lenhare1, Vagner R. R. Silva1, Chadi P. Anaruma1,2, Carlos K. Katashima1, Barbara M. Crisol1, Fernando M. Simabuco3 Adelino S. R. Silva4, Dennys E. Cintra5, Leandro P. Moura1,2,6, José R. Pauli1,6, and Eduardo R. Ropelle1,6,7
1. Laboratory of Molecular Biology of Exercise, University of Campinas, Limeira, SP, Brazil.
2. Department of Physical Education, Institute of Biosciences, São Paulo State University, Rio Claro, SP,
Brazil.
3. Laboratory of Functional Properties in Foods, University of Campinas, Limeira, SP, Brazil.
4. Postgraduate Program in Rehabilitation and Functional Performance, University of São Paulo, Ribeirão
Preto, SP, Brazil. School of Physical Education and Sport of Ribeirão Preto, University of São Paulo.
5. Laboratory of Nutritional Genomics. University of Campinas, Limeira, SP, Brazil.
6. CEPECE - Center of Research in Sport Sciences. School of Applied Sciences, University of Campinas
(UNICAMP), Limeira, São Paulo, Brazil.
7. Department of Internal Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas (UNICAMP),
Campinas-SP, Brazil.
Please address correspondence to:
Eduardo Rochete Ropelle, PhD.
School of Applied Sciences.
University of Campinas (UNICAMP), Limeira, São Paulo, Brazil.
Phone: + 55 - 19 37016706 Email: eduardoropelle@gmail.com
ABSTRACT
Background: The impairment of the mitochondrial function is a hallmark of aging. The
mitonuclear imbalance and the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) are mechanisms activated to ensure mitochondrial integrity and functionality. Here, we evaluated the effects of aerobic exercise in the mitonuclear imbalance and UPRmt markers in the skeletal muscle of old mice. Materials and Methods: We combined the physiological tests, molecular and transcriptomic analyzes to evaluate the effects of chronic aerobic exercise in the mitonuclear imbalance and UPRmt markers in the skeletal muscle of young (2-months old) and aged (24-months old) C57BL/6J mice. Results: Transcriptomic analysis revealed that aging reduced several mitochondrial genes in the gastrocnemius muscle, and it was accompanied by the low levels of UPRmt markers, including Yme1L1 and CLpP mRNA. As expected, physical training improved the whole-body metabolism and physical performance of aged mice. The aerobic exercise increased key proteins involved in the mitochondrial function/biogenesis such as VDAC, SIRT1, NRF-1 and mitochondrial-encoded genes (mtNd1, mtCytB, and mtD-Loop) in the muscle of old mice. Interestingly, aerobic exercise induced the mitonuclear imbalance, increasing MTCO1/ATP5a ratio and UPRmt markers in the skeletal muscle, including HSP60, Lonp1, and Yme1L1 protein levels in the gastrocnemius muscle. Conclusion: These data demonstrate that aerobic exercise training induced mitonuclear imbalance and UPRmt in the skeletal muscle during aging. These phenomena could be involved in the improvement of the mitochondrial metabolism and oxidative capacity in aged individuals.
Keywords: Ageing, UPRmt, Skeletal Muscle, Mitochondrial Biogenesis, Aerobic
INTRODUCTION
Aging induces a progressive decline in functional integrity, which culminates in metabolic dysfunctions, increased cell vulnerability, and death1. The decline in
mitochondrial functions noticed during aging is observed in different cell types, including hepatocytes2, neurons3, and skeletal muscle cells4,5. Also, several phenomena of mitochondrial dysfunction enhance cellular senescence and aging processes such as the flawed chaperones, proteases, and the activity of antioxidant enzymes6–8. Thus, intracellular mechanisms involving the control of mitochondria quality and functions may be the cornerstone to prevent the synthesis of abnormal proteins, which may lead to cellular damages and deregulated metabolic homeostasis9.
Mitochondria are highly organized organelles, presenting their own DNA which encodes several genes and key proteins to maintain their structure and functions. However, most proteins with mitochondrial functions are encoded by the nucleus and then imported to mitochondria10. Notably, this connection requires a highly orchestrated mechanism to keep mitochondrial homeostasis and energy production. To counteract adverse events, the mitochondria have developed a highly sensitive mechanism in cellular stress conditions, named mitonuclear imbalance11. The mitonuclear imbalance is activated upon disturbances between mitochondrial proteins encoded by the nucleus (nDNA) and mitochondria (mtDNA) such as an increased ratio between MTCO1 (mitochondrial-encoded) and Atp5a (nuclear-(mitochondrial-encoded) proteins. Once activated, the mitonuclear imbalance stimulates a mechanism described mitochondrial Unfolded Protein Response (UPRmt) to maintain the optimal mitochondrial functions, as energy production by the Oxidative Phosphorylation (OXPHOS) machinery12,13. Thus, the UPRmt is an
evolutionarily conserved among several species, being able to improve mitochondrial function and to increase longevity12. Therefore, this mechanism may be a useful therapeutic target, since UPRmt may improve mitochondrial proteases and chaperones activity, stabilizing mitochondrial functionality, and cellular homeostasis13.
Noteworthy, it is known that enhancements in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) levels improve mitochondrial function, decrease cell senescence and increase aged mice lifespan, by activating the UPRmt14. Interestingly, augmented intracellular NAD+ levels in the skeletal muscle through the pharmacological agents induce the mitonuclear imbalance and UPRmt, thus enhancing mitochondrial function in mice15 and type-2 diabetic patients16. Similar studies also showed that UPRmt can improve
mitochondrial function and longevity, mediated by a mitonuclear imbalance in response to stress17,18. It has been proposed that SIRT1 plays a critical role to mediate the
mitonuclear imbalance, once SIRT1-loss of function abolished the capacity of the NAD+
precursor to stimulate the mitonuclear imbalance and mitochondrial biogenesis in primary hepatocytes19.
Recent studies have shown that targeting molecules whose could trigger UPRmt may improve the whole-body metabolism and mitochondrial function during obesity conditions19–21. Also, genes associated with UPRmt activation were correlated with improvements in aerobic performance, maximal oxygen consumption (VO2max) and
decreased adipose mass15. In this sense, other studies evidenced another strategy to improve UPRmt, showing that contractile activity could trigger UPRmt in skeletal muscle of young rats, accompanied by mitochondrial biogenesis stimulation22,23. Interestingly, physical exercise stimulates the NAD+ synthesis in the skeletal muscle cells 24. Based on the previous information, we hypothesized that aerobic exercise training might stimulate the mitonuclear imbalance and UPRmt, improving the mitochondrial metabolism in skeletal muscle of aged animals.
MATERIALS AND METHODS
Animals
Male C57BL/6J aged 2 months (young) and 24 months (old) were obtained from the University of Campinas Breeding Center. The animals were maintained in 12h:12h light/dark cycles and were housed in five animals per cage, with water and food ad
libitum. The experiments were approved by the ethics committee (CEUA 4573-1/2017)
and followed the University guidelines for animals used in experimental studies and experiments, in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, approved by the National Research Council and recently revised 25.
Aerobic Exercise Training Protocol
The animals were submitted to the incremental treadmill running training for 4-wk, and performed daily sessions of aerobic exercise, with 75 minutes per session performed at 60% of the maximal speed-of-exhaustion (MSE), consisting in 5 sessions per week. The exercise intensity was adjusted weekly, by increasing 2m/min every week.
Each session of training consisted of 4 stages: Warm up during 5 minutes at 8m/min; 1st effort of 30 minutes at 60% of MSE; Active rest during 5 minutes at 6m/min;
2nd effort of 30 minutes at 60% of MSE; Cool down during 5 minutes at 8m/min. Treadmill Performance Evaluations
This physical performance evaluation allowed us to determine the maximal aerobic capacity and prescribe each aerobic exercise training sessions. Animals initiated the test with 6 m/min, augmenting 3 m/min every 3 minutes until exhaustion. Exhaustion was defined by the time at rodents were unable to respond the gentle encouragement to run, staying at the end of the treadmill during more than 15 seconds. The speed achieved, running distance, and time-to-exhaustion were monitored.
Maximal Interval Test of Aerobic Capacity
Twenty-four hours after the incremental load test, the animals performed a high-intensity interval test (85% MSE) to determine the Interval Aerobic Capacity. This test consisted in bouts of 20 seconds at 85% MSE, interspaced by 10 seconds of active rest (at 8m/min) until exhaustion. Time-To-Exhaustion and running distance were monitored.
Body Weight and Adipose Tissue Mass Measurements
The body mass of all animals were monitored during the 4-wk of intervention. Twenty-four hours after the last session, the animals were weighted to comparison between groups. After euthanasia, adipose tissues (retroperitoneal, epididymal, subcutaneous, and mesenteric) were extracted and weighted to comparison between groups.
Skeletal Muscle Tissue Sampling
Twenty-four hours after the last session of aerobic exercise, the animals were anesthetized with an intraperitoneal injection of chlorohydrate of ketamine (300 mg/kg, ketamine, Parke-Davis, Ann Arbor, MI) and xylazine (30 mg/kg, Rompun, Bayer, and Leverkusen). After this, the corneal and pedal reflexes were verified and assured. Samples weighting 50mg from the left paw of gastrocnemius were extracted and homogenized in a 400 uL tissue buffer, at 4 °C using a Bead Ruptor 12 Homogenizer (OMNI®) operated at 3000 rpm, for 120 seconds. The lysates were centrifuged (Eppendorf® 5804R) at 11000
rpm at 4 °C for 15 min to remove insoluble material, and the supernatants were used for the assay. The protein content was determined according to the bicinchoninic acid (BCA) method. Proteins were denatured by boiling in Laemmli sample buffer containing 100 mM DTT.
Western Blot Analysis
The samples were applied in a polyacrylamide gel for separation by electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membranes 0.45 µm. To assure that the total protein content was equally fractionated among all the samples and to ensure that all the previous steps before antibodies incubation were perfectly performed, the membranes were blocked for 3 minutes in a Ponceau Red-Staining solution for protein load control in all membranes. Subsequentially, the membranes were blocked with 5% of non-fat dry milk (NFDM) at room temperature during one hour, and finally incubated with specific antibodies. Specific bands were labeled by chemiluminescence and visualization was performed by the exposure of membranes in specific software (GeneSys Software®). The images of protein bands were quantified using the software UN-SCAN- IT®. Western blotting results were normalized by endogenous control (GAPDH or α-Tubulin, from Cell Signalling®) from membranes made at the same electrophoresis, and the final values were presented as percentage relativized by the control group. The entire membranes, Ponceaus, endogenous, and the statistical analyses of the Western blots are shown in the supplementary material.
Antibodies and Chemicals
The primary antibodies anti-Acetyl Lysine (Abcam®, #ab80178), anti-MTCO1 (Bioss®, #bs3953R), anti-CLpP (Abcam®, #ab124822), anti-HSP60 (Santa Cruz
Biotechnology®, #sc13115), anti-VDAC (Cell Signalling®, #4866s), anti-NRF1 (Abcam®, ab55744), and anti-SIRT1 (Cell Signaling®, #2028s), anti-LONP1 (Bioss®, #bs-4245r), and anti-Yme1L1 (Proteintech®, #11510-1-AP) were used according to the manufacturer’s instructions. The anti-OXPHOS protein cocktail (Abcam®, #ab110413),
was used to evaluate OXPHOS subunits (CI-NDUF8, CIV-MTCO1, and CV-ATP5a). The antibodies anti-GAPDH (Cell Signalling®, #2118s) and anti-α-Tubulin (Cell Signalling®, #2144s) were used as endogenous control to relativize the protein content of
the markers above. The Ponceau Red-Staining solution were imported from Sigma Aldrich®, and each membrane is presented in the supplementary material.
Real-time quantitative PCR
The total gastrocnemius RNA was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) Two micrograms (μg) from total RNA was used as a template for cDNA synthesis, using the High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®, Carlsbad, CA, USA). The RT-qPCR was performed using 300 ng of cDNA, 7.5-60 μM primers, 2.0x Sybr Green Master Mix (Invitrogen®) and DEPC-treated water. The cycling parameters and relative content of mRNA were analyzed as previously described 27.
Mitochondrial DNA markers
The protocol was carried out according to protocols previously described 28. The primers were designed for three gene regions encoded only by mitochondrial genes. The extraction of the genomic DNA was performed according to the Invitrogen® PureLink™ Genomic DNA kit instructions. Then, the quantitative PCR was performed from the total DNA extracted from tissues. To guarantee the protocol accuracy, each gene was relativized by Rpl13a, a housekeeping gene encoded only by the nuclear DNA. The primers utilized and individual values are available in the supplementary material.
Transcriptomic Analysis
The transcriptomic analysis was performed using a muscle-skeletal data base (AGEMAP) from Young and Old Mice, as previously published 29. The Morpheus
software was used to build the Heatmap panel. The Morpheus software is assessable in
https://software.broadinstitute.org/morpheus. All the values used from the database are
described in the supplementary material.
Statistical Analysis
All results were expressed as mean ± standard error of mean (SEM). The data were analyzed by Student's t-test, multiples T-tests or ANOVA one-way analyses of variance. Post-hoc tests were performed utilizing the Holm-Sidak method for multiple comparisons and Bonferroni post-hoc test for ANOVA analyses. The statistical
significance used was fixed in a p-value <0.05. All statistical analyses and graphic images were performed in the software GraphPad Prism 8.0.
RESULTS
Evaluation of mitochondrial metabolism and UPRmt markers in the skeletal muscle of aged mice.
First, we sought to determine the mitochondrial metabolism and UPRmt markers in the skeletal muscle of aging model. The transcriptomic analysis using the AGEMAP database29 revealed that several mitochondrial genes were downregulated in the skeletal muscle of aged animals (Fig 1A). In our aging model, we found that aging increased the total body weight (Fig. 1B). Consistent with the fact that the beneficial impact of NAD+ on Sirtuin-mediated protein deacetylation and that aging affects the SIRT1 activity 30, we observed that the global protein acetylation was increased in the gastrocnemius muscle of old mice (Fig. 1C). In accordance with the transcriptomic data, the Western blot analysis demonstrated that aging reduced a multi-functional mitochondrial voltage-dependent anion channel protein, (VDAC) (Fig. 1D). Also, aging reduced the gene expression of Activating Transcription Factor 4 (Atf4) (Fig. 1E), one of the main regulators of the stress response[88], and it was accompanied by the gene expression downregulation of two ATP-dependent proteases related to the UPRmt response, Yme1L1 and CLpP (Fig. 1F), in the gastrocnemius muscle. These initial data demonstrated that aging reduced UPRmt and mitochondrial markers in skeletal muscle.
[INSERT FIGURE 01 HERE].
Aerobic exercise training reduces adiposity and increases the aerobic capacity in aged mice
After that, the aged animals were submitted to the 4-wk intervention of aerobic exercise training and performed the maximal power and aerobic capacity tests, as detailed in the experimental design (Fig. 2A). Our exercise protocol was efficient to reduce body weight and fat mass content in aged mice (Fig. 2B and C).
After the exercise-training period, we evaluated the physical performance in the old mice. Sedentary and trained aged animals performed the maximal power test and interval test. We observed that trained mice showed better performance during the
maximal power test (Fig. 2D and E) and interval test (Fig. 2F and G) when compared to the control group. These results demonstrated that this protocol of aerobic exercise training is an excellent instrument to increase the aerobic capacity in aged mice.
[INSERT FIGURE 02 HERE].
Aerobic Exercise Training enhances several mitochondrial markers in skeletal muscle of aged mice.
Based on the improvement in the aerobic capacity in response to the exercise training, we sought to evaluate whether the aerobic training promotes mitochondrial alterations in the skeletal muscle of old mice.
Physical exercise reduced the global profile of protein acetylation in the gastrocnemius muscle of old mice (Fig. 3A) and it was accompanied by the increase of the NAD-dependent deacetylase, SIRT1, protein levels (Fig. 3B). Furthermore, exercise increased the Nuclear respiratory factor 1 (NRF-1) protein content in the muscle (Fig 3B). Also, we found an increase of approximately two-fold in VDAC protein content (Fig. 3C). Mitochondrial-encoded genes mt-Nd1 and mt-CytB were also increased in the skeletal muscle of trained old mice (Fig. 3D). These data demonstrate that beyond the aerobic capacity, the exercise training promotes significant alterations in the muscle mitochondrial metabolism, triggering the molecular signals toward the mitochondrial biogenesis.
[INSERT FIGURE 03 HERE].
Aerobic exercise training promotes mitonuclear imbalance and increases the protein content of UPRmt markers in skeletal muscle of aged mice
Since the mitonuclear imbalance and UPRmt control the mitochondrial metabolism, we next evaluate the effects of exercise training on mitonuclear imbalance and UPRmt markers in the skeletal muscle of old animals.
The 4-wk of exercise protocol activated the mitonuclear imbalance, measured by the alteration in the MTCO1/Atp5a ratio (Fig. 4A-B). Also, aerobic training markedly increased several markers of UPRmt such as the heat shock protein 60 kDa (HSP60), Lon protease homolog 1 (Lonp1) and the ATP-dependent metalloprotease-1 (Yme1L1) (Fig. 4C).
Finally, the transcriptomic analysis confirmed our experimental data. We found that old mice (24 months) with the preserved level of UPRmt genes (High) displayed high levels of several genes related to mitochondria in the skeletal muscle. Conversely, old mice with low levels of UPRmt gene displayed low levels of genes related to mitochondria (Fig. 4D), suggesting that UPRmt activation could be determinant for the maintenance of mitochondrial function in the skeletal muscle.
[INSERT FIGURE 04 HERE]. DISCUSSION
Several biological functions decline due to the aging process, including the mitochondrial function5,32. Thus, strategies to maintain or restore the mitochondrial function during the aging could be interesting. Accumulating number of evidence have demonstrated that the stimulation of the mitonuclear imbalance and UPRmt in several cell types or tissues, by using nutritional component, pharmacological agents and genetic approaches, improve the mitochondrial respiration and promote the mitochondrial biogenesis14,15,19. Here, we demonstrated that aerobic training is also effective in activate these mitochondrial-related mechanisms. Physical exercise increased the aerobic performance in an aging mouse model. These data were accompanied by the increase of important mitochondrial markers in the skeletal muscle. Also, our data revealed that exercise-induced the mitonuclear imbalance and UPRmt markers in the muscle of old animals.
SIRT1 activity is a key regulator of mitochondrial metabolism 33,34. However, the
SIRT1 activity is reduced in aged organisms, contributing, at least in part, to the mitochondrial dysfunction 30,35. In the first part of our study, we observed high levels of
global acetylation profile in the muscle of aged mice when compared with the young group. This data was accompanied by low levels of proteins and several genes related to the mitochondria in the muscle of old mice. Interestingly, we evidenced that physical training promoted a consistent downregulation in the global acetylation profile in the muscle of aged mice and increased SIRT1 protein content, suggesting that physical exercise stimulates SIRT1 activity, as previously reported 36. It is important to mention that the expression of Sirtuins could be regulated by the alteration in the intracellular NAD+/NADH ratio in muscle cells 37. However, the NAD+/NADH ratio was not monitored in the present study.
The NAD+/SIRT1 signaling pathway plays an important role in mediate the
intracellular signals related to the mitochondrial biogenesis. Recently, it has been demonstrated that NAD+ boosters such as NAD+ precursors and inhibitors of NAD+
consumers, are capable to activate the SIRT1, stimulating the mitonuclear imbalance, UPRmt and improving the mitochondrial function13,14,19. Specifically, in the skeletal muscle, the oral treatment with Nicotinamide Riboside (NR), an NAD+ precursor, decreased cell senescence and upregulated mitophagy and mitobiogenesis. These cellular alterations resulted in higher running capacity, better muscle phenotype and longevity
14,38. Based on these findings, strategies to increase SIRT1 activity, mitonuclear
imbalance and UPRmt may counteract the effects of aging. For the first time, we demonstrated that aerobic training was sufficient to stimulate the mitonuclear imbalance and UPRmt markers in the skeletal muscle of old mice. Thus, exercising aged animals could present a potent strategy to stress mitochondrial homeostasis, promoting molecular adaptations to achieve a new condition of cellular homeostasis39. Furthermore, we evidenced that chronic exercise stimulated mitonuclear imbalance and UPRmt activation, enhancing mitochondrial metabolism.
The mechanism by which the aerobic exercise stimulates the UPRmt in the skeletal muscle was not evaluated in the current study. We speculate that exercise could stimulate SIRT1 activity and UPRmt by increasing the NAD+ accumulation in the skeletal
muscle, however, this mechanism remains unclear and deserves further investigations.
CONCLUSION
Taken together, our data demonstrated that aerobic exercise training was efficient to improve the aerobic capacity in aging mice. The skeletal muscle analyzes showed that exercise increased several mitochondrial molecules related to the mitochondrial biogenesis. These data were accompanied by the stimuli on mitonuclear imbalance and UPRmt in the skeletal muscle of aged mice. Overall, these results provide new insights into the mechanism by which exercise stimulates the mitochondrial metabolism and oxidative capacity in the skeletal muscle in the elderly.
Authors Contributions
AVC and ERR wrote the manuscript and prepared the figures. LL, CKK and VRRS accompanied the aging processes. AVC, RSB, and RRB performed the aerobic exercise training. RSB, CPA, RRB, BMC and LL performed the physical tests and the
extraction of tissues. FMS and AVC performed the PCR analyses. AVC and RRB performed the Western blot analyses. ERR performed the bioinformatics analyses. LPM, ASRS, DEC and JRP provided the laboratory structures and intellectual support to the present study.
Funding
This work was supported by State University of Campinas – UNICAMP, Brazil. This study was financed in part by National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (numbers 304771/2017-1 and 401189/2016-3), the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) (Finance Code 001) and by the São Paulo Research Foundation (FAPESP) (Grants 2011/09656-0 and 2018/07634-9).
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.
FIGURE LEGENDS
Figure 1. The effects of aging in mitochondrial and whole-body metabolism. (A) The
heatmap shows several mitochondrial markers in the skeletal muscle of young (6mo) and old (24mo) mice. (B) Total body mass (n=8). The Western blot analyzes was performed to evaluate; (C) protein acetylation and (D) VDAC in the skeletal muscle (n=4-5). PCR analyzes were performed to evaluate; (E) the mitochondrial-encoded gene Atf4 and (F) UPRmt markers, Yme1L1 and CLpP in the skeletal muscle. Each point represents a sample. Statistical significance was fixed in *p<0.05.
Figure 2. Aerobic exercise training attenuates aging-related dysfunctions and increases physical performance. (A) Figure represents the designed protocol of aerobic
exercise training for aged animals, during 4-weeks. (B) Total body mass (n=8-4) (C) and adipose tissues (n=5-4). Results achieved during Incremental (2D and 2E) and Intervaled (2F and 2G) physical tests (n= 5-4). Each point represents a sample. Statistical significance was fixed in *p<0.05.
Figure 3. Aerobic exercise training enhances markers of mitochondrial biogenesis in the skeletal muscle of aged mice. The Western blot analyzes demonstrate; (A) the
global protein acetylation (n=5-4), (B) the protein content of SIRT1 and NRF-1 after exercise training (n=5-4) and (C) VDAC protein levels in the muscle (n=5-4). (D) Mitochondrial-encoded genes (n=6-4). Each point represents a sample. Statistical significance was fixed in *p<0.05.
Figure 4. Exercise training induced the mitonuclear imbalance and activated the UPRmt in skeletal muscle of aged mice. The Western blot shows, (A) the effects of four
weeks of aerobic exercise on MTCO1 and Atp5a protein content in the skeletal muscle (n=5-4). (B) A stoichiometric imbalance between nuclear (Atp5a) and mitochondrially (MTCO1) encoded proteins. (C) The Western blot analyzes was performed to evaluate the UPRmt markers in the skeletal muscle (n=5-4). Each point represents a sample. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001. (D) The heatmap graph demonstrate the UPRmt markers and mitochondrial-related genes in the skeletal muscle of old (24mo) mice.
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