República Federativa do Brasil
Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial
(22) Data de Depósito: 17/12/2004 (51) Int. CL:
(43) Data de Publicação: 10/04/2007 A61K 39/00 (2007.01)
(RPI 1892) A61K 39/38 (2007.01)
(54) Título: MÉTODOS PARA CONJUGAR UM IMUNOGENE DE PEPTÍDEO E PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO, CONJUGADO DE PORTADOR DE PEPTÍDEO DE IMUNOGENE-PROTEÍNA/POLIPEPTÍDEO E COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA
(30) Prioridade Unionista: 17/12/2003 US 60/530480
(71) Depositante(s): Wyeth (US)
(72) Inventor(es): Rasappa G. Arumugham, A. Krishna Prasad
(74) Procurador: Momsen, Leonardos & Cia
(86) Pedido Internacional: PCT US2004/042701 de 17/12/2004
(87) Publicação Internacional: WO 2005/058940 de 30/06/2005
(57) Resumo: "MÉTODOS PARA CONJUGAR UM IMUNOGENE DE PEPTÍDEO E PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO, CONJUGADO DE PORTADOR DE PEPTÍDEO DE IMUNOGENE-PROTEÍNA/POLIPEPTÍDEO E COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA". A presente invenção é dirigida a métodos de produzir conjugados de imunógenos de peptídeo com moléculas portadoras de proteina/polipeptídeo, que são úteis como imunógenos, em que os imunógenos de peptídeo são conjugados com portadores de proteína via grupos funcionais ativados de resíduos de aminoácido do portador ou da molécula ligadora opcionalmente fixada e em que quaisquer grupos funcionais reativos não-conjugados nos residuos de aminoácido são inativados via capeamento, assim retendo a funcionalidade imunológica da molécula portadora, porém reduzindo a propensão para reações indesejáveis, que poderiam tornar o conjugado menos seguro ou eficaz. Além disso, a invenção também refere-se a tais produtos imunogênicos e composições imunogênicas contendo tais produtos imunogênicos, produzidos por tais métodos.
Titulos por Dia 125000 6121819 100000 Dia 29 Meg Dia 36 gffiii Dia 57 mi Dia 64 75000 o 50000 25000 o
-7C12M/QS-21 1-5GRid/Aiume 1-7CRMIreuine.1-5CRWRC529 1-7CRMIRC529 Grupo de Tratamento
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"MÉTODOS PARA CONJUGAR UM IMUNOGENE DE PEPTÍDEO E PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO, CONJUGADO DE PORTADOR DE PEPTÍDEO DE IMUNOGENE-PROTEÍNA/POLIPEPTÍDEO E COMPOSIÇÃO 5 IMUNO GÊNI CA"
REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o beneficio sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 60/530.480, depositado em 17 de dezembro de 2003, que é incorporado aqui por referência em sua 10 totalidade, para todas as finalidades.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A essência da imunidade adaptativa é a capacidade de um organismo reagir à presença de substâncias estranhas e produzir componentes (anticorpos e células) capazes de especificamente interagir com o hospedeiro 15 e protegê-lo de sua invasão. Um "antígeno" ou "imunógeno" é uma
substância que é capaz de eliciar este tipo de resposta imune e também é capaz de interagir com as células sensibilizadas, que são manufaturadas contra ela.
Os antígenos ou imunógenos são usualmente macromoléculas 20 que contêm sítios antigênicos distintos ou "epítopos", que são reconhecidos e interagem com os vários componentes do sistema imune. Eles podem existir como moléculas individuais, compostas de químicos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, RNA, DNA ou polissacarídeos orgânicos sintéticos, ou eles podem ser partes de estruturas celulares (bactérias ou fungos) ou vírus 25 (Harlow and Lane 1988a, b, c; Male et al., 1987).
As moléculas pequenas, como os peptídeos curtos, embora normalmente capazes de interagirem com os produtos de uma resposta imune, com freqüência não podem causar uma resposta sozinhos. Estes imunógenos de peptídeo ou "haptenos", como eles são também chamados, são realmente
antígenos incompletos e, embora não capazes sozinhos de provocar imunogenicidade ou eliciar produção de anticorpos, podem ser tornados imunogênicos por seu acoplamento a um portador adequado. Os portadores tipicamente são antígenos de proteína de mais elevado peso molecular, que 5 são capazes de causarem uma resposta imunológica quando administrados in
vivo.
Em uma resposta imune, os anticorpos são produzidos e secretados pelos linfócitos-B, em conjunto com as células auxiliares-T (T H). Na maior parte dos sistemas de hapteno-portador, as células B produzem 10 anticorpos que são específicos tanto para o hapteno como para o portador. Nestes casos, os linfócitos-T terão domínios de ligação específicos no portador, porém não reconhecerão o hapteno sozinho. Em uma espécie de sinergismo, as células B e T cooperam para induzir uma resposta anticorpo específica de hapteno. Após tal resposta imune ter ocorrido, se o hospedeiro 15 for subseqüentemente provocado com somente o hapteno, usualmente ele
responderá produzindo anticorpos específicos de hapteno pelas células de memória formadas após a imunização inicial.
Os haptenos sintéticos, imitando algumas estruturas epitópicas críticas em macromoléculas maiores, são com freqüência conjugados com 20 portadores, para criar uma resposta imune para a molécula "precursora" maior. Por exemplo, os segmentos de peptídeos curtos podem ser sintetizados da seqüência conhecida de uma proteína e acoplados a um portador, para induzir imunogenicidade em relação à proteína nativa. Este tipo de abordagem sintética para a produção de imunógenos tornou-se a base de 25 muito da pesquisa atual para a criação de vacinas. Entretanto, em muitos exemplos, meramente criando-se uma resposta de célula-B, utilizando-se conjugados sintéticos de peptídeo-portador, embora bem projetados, nem sempre garantirá completa imunidade protetora com respeito a um antígeno intacto. A resposta imune, gerada por um epítopo de peptídeo curto de uma
maior partícula viral ou célula bacteriana, pode somente ser suficiente para gerar memória no nível da célula B. Nestes casos é geralmente agora aceito que uma resposta a célula-T citotóxica é um indicador mais importante da imunidade protetora. A projeção de imunógenos de peptídeo, com os 5 apropriados sítios de ligação epitópicos, para o reconhecimento tanto das células-B como das células-T, é uma das áreas de pesquisa mais desafiadoras da imunologia hoje em dia.
A abordagem de aumentar a imunogenicidade de moléculas pequenas ou fracamente imunogênicas, conjugando-se estas moléculas com 10 moléculas grandes "portadoras", tem sido utilizada com sucesso por décadas (vide, por exemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53). Por exemplo, muitas composições imunogênicas têm sido descritas, em que polímeros capsulares purificados têm sido conjugados a proteínas portadoras, para criar composições imunogênicas mais eficazes, pela exploração deste "efeito 15 portador". Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582 — 591). A
conjugação tem também mostrado desviar-se da fraca resposta anticorpo, usualmente observada em crianças, quando imunizadas com um polissacarídeo livre (Anderson et al. (1985) 1 Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).
20 Os conjugados portadores de hapteno têm sido gerados com
sucesso, empregando-se vários reagentes de reticulação/acoplamento, tais como homobifuncional, heterobifuncional ou reticuladores de comprimento zero. Muitos de tais métodos são atualmente disponíveis para acoplamento de sacarídeos, proteínas e peptídeos a portadores de peptídeos. A maioria dos 25 métodos criam ligações amina, amida, uretano, isotiouréia ou dissulfeto, ou em alguns casos tioéteres. Uma desvantagem do uso de reagentes de acoplamento, que introduzem sítios reativos nas cadeias laterais das moléculas de aminoácido reativas das moléculas de portador e/ou hapteno, é que os sítios reativos, se não neutralizados, são livres para reagir com
qualquer molécula indesejada in vitro (assim adversamente afetando a funcionalidade ou estabilidade do(s) conjugado(s)) ou in vivo (assim apresentando um risco potencial de eventos adversos em pessoas ou animais imunizados com as preparações). Tais sítios reativos em excesso podem ser 5 reagidos ou "capeados", de modo a inativar estes sítios, utilizando-se várias
reações químicas, porém estas reações podem ser, por outro lado, rompedoras da funcionalidade dos conjugados. Isto pode ser particularmente problemático quando tentando-se criar um conjugado pela introdução dos sítios reativos dentro da molécula portadora, visto que seu tamanho maior e estrutura mais 10 complexa (em relação ao hapteno) podem torná-lo mais vulnerável aos efeitos rompedores do tratamento químico. De fato, não são conhecidos exemplos de métodos por meio dos quais um conjugado seja produzido ativando-se primeiro o portador, em seguida reagindo-se com o hapteno em uma reação de conjugação e, finalmente, "cobrindo-se" os restantes sítios reativos, 15 enquanto preservando-se a capacidade do conjugado resultante funcionar como uma composição imunogênica, tendo as desejadas propriedades de "efeito portador".
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é dirigida a métodos de produzir um 20 conjugado imunogênico de um imunógeno de peptídeo com um portador de proteína/polipeptídeo, em que o imunógeno de peptídeo é conjugado com o portador, via grupos funcionais derivados de resíduos de aminoácido do portador, tais como resíduos de lisina, e em que quaisquer grupos funcionais derivados não-conjugados dos resíduos de aminoácido são inativados via 25 capeamento, para bloquear sua reação com outras moléculas, incluindo proteínas/polipeptídeos, desse modo preservando a funcionalidade do portador, de modo ele retenha sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo que, de outro modo, não ocorreria sem um portador. Além disso, a invenção também refere-se a conjugados
produzidos pelos métodos acima e a composições imunogênicas contendo tais conjugados.
Em uma formas de realização, a invenção é dirigida a um primeiro método para conjugar um imunógeno de peptídeo, via um grupo 5 reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo, com um portador de proteína/polipeptídeo, tendo um ou mais grupos funcionais, o método compreendendo as etapas de: (a) derivar um ou mais grupos funcionais do portador de proteína/polipeptídeo, para gerar uma molécula derivada com sítios reativos; (b) reagir o portador de proteína/polipeptídeo 10 derivado da etapa (a) com um grupo reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo, sob condições de reação, de modo que o imunógeno de peptídeo seja conjugado com o portador de proteína/polipeptídeo derivado, via os grupos funcionais; e (c) reagir ainda o conjugado com um reagente de capeamento, para inativar os grupos funcionais reativos livres do portador de 15 proteína/polipeptídeo ativado, desse modo preservando a funcionalidade do portador em relação ao imunógeno de peptídeo, o que, de outro modo, não ocorreria sem um portador.
Em uma formas de realização, o portador de proteína/polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo de albumina de soro 20 humano, hemocianina de lapa buraco de fechadura, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, hemaglutinina da influenza, peptídeo de ligação PAN-DR (polipeptídeo PADRE), proteína da circunsporozita (CS) da malária, antígeno de superficie da hepatite B (HB,Ag 19_28), Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Bacilo Calmette-Guerin 25 (BCG), toxina da cólera, mutantes da toxina da cólera com toxicidade reduzida, toxina da difteria, proteína CRIVI 197 que tem reação cruzada com a toxina da difteria, Streptococal C5a peptidase recombinante, Streptococcus pyogenes ORF 1224, Streptococcus pyogenes ORF 1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia
pneumoniae ORF T858, toxóide do Tétano, HIV gp120 T1, componentes de superficie microbianos, reconhecendo moléculas de matriz adesivas (MSCRAMMS), fator de crescimento / hormônio, citocinas e quimiocinas.
Em outra formas de realização, o portador de 5 proteína/polipeptídeo contém um epítopo de célula-T.
Em ainda outra formas de realização, o portador de proteína/polipeptídeo é um toxóide bacteriano, tal como um toxóide do tétano, toxina da cólera ou mutante de toxina da cólera, como descrito acima. Em uma formas de realização, o portador de proteína/polipeptídeo é CRM 197. 10 Em ainda outra formas de realização, o portador de
proteína/polipeptídeo pode ser uma hemaglutinina da influenza, um polipeptídeo PADRE, uma proteína CS da malária, um antígeno de superficie da Hepatite B (HSBAg 19_28), uma proteína de choque térmico 65 (HSP 65), ou um polipeptídeo de Mycobacterium tuberculosis (BCG).
15 Em uma formas de realização preferida, o portador de
proteína/polipeptídeo é selecionado de Streptococcal rC5a peptidase,
Streptococcus pyogenes ORF 1224, Streptococcus pyogenes ORF 1664 ou
Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, e
Chlamydia pneumoniae ORF T858.
20 Em uma forma de realização, o portador de
proteína/polipeptídeo é um fator ou hormônio do crescimento, que estimula ou aumenta a resposta imune e é selecionado do grupo consistindo de IL-1, IL-2, y-interferon, IL-10, GM-CSF, MIP-la, MIP-113 e RANTES.
Em uma formas de realização, o imunógeno de peptídeo é 25 selecionado de uma proteína bacteriana, uma proteína viral e uma proteína
eucariótica.
Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é selecionado de uma proteína bacteriana, uma proteína virai e uma proteína eucariótica.
Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína bacteriana de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Esherichia coli, 5 Klebstella enterobacter, Listeria monocitogenes, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonas species, Salmonella
typhimurium, Borrelia burgdorferi, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella dysentriae, Alloiococcus otitidis e estreptococos do Grupo B.
Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é 10 derivado de um antígeno de proteína de um vírus selecionado do grupo
consistindo de vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do herpes simples (HSV), vírus do papiloma humano (HPV), vírus da parainfluenza (PIV), vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus sincicial respiratório (RSV), vírus Epstein-Barr (EBV), coronavírus, vírus da vacínia, rotavírus, vírus da 15 raiva, vírus da hepatite C (HCV) e vírus da hepatite B (HBV).
Em ainda outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína de um fungo selecionado da espécie Candida, espécie Cryptococcus, espécie Coccidioides, espécie Histoplasma e espécie Aspergillus.
20 Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é
derivado de um antígeno de proteína de um parasita selecionado de um Plasmodium, um Trypanosome, um Schistosome e um Leishmania.
Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína de um eucarioto. Em uma forma de 25 realização, o eucarioto é um humano.
Em ainda outra forma de realização preferida, o imunógeno de peptídeo do humano é derivado de um tumor maligno. Em uma forma de realização preferida, o imunógeno de peptídeo é de um antígeno de tumor de um carcinoma de célula renal, um carcinoma da mama, um melanoma e um
carcinoma da próstata. Em outra forma de realização preferida, o antígeno de peptídeo é derivado do antígeno de tumor, antígeno carcinoembriônico (CEA).
Em um aspecto, a invenção provê um imunógeno de peptídeo 5 compreendendo peptídeo Al3 ou fragmentos de Af3 ou seus análogos eliciando uma resposta imunogênica contra certos epítopos dentro de Af3. Os peptídeos imunogênicos da invenção incluem peptídeos heterólogos imunogênicos. Em alguns peptídeos imunogênicos, um fragmento Af3 é ligado a um portador para formar um peptídeo heterólogo imunogênico e então este peptídeo 10 heterólogo é ligado a um portador empregando-se um método da presente
invenção, para formar um conjugado.
Em outro aspecto da invenção, o imunógeno de peptídeo é um polipeptídeo compreendendo um segmento de terminal-N de pelo menos os resíduos 1-5 de A(3, o primeiro resíduo de AO sendo o resíduo de terminal-N 15 do polipeptídeo, em que o polipeptídeo é livre de um segmento de terminal-C de AO. Em ainda outro aspecto da invenção, o imunógeno de peptídeo é um polipeptídeo compreendendo um segmento de terminal-N de Af3, o segmento começando no resíduo 1-3 de AO e terminando nos resíduos 7-11 de A(3. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um agente que inclui 20 uma resposta imunogênica contra um segmento de terminal-N de AP, o
segmento começando no resíduo 1-3 de Af3 e terminando nos resíduos 7-11 de A(3, sem induzir uma resposta imunogênica contra um epítopo dentro dos resíduos 12-43 de A(343. Em outro aspecto da invenção, o imunógeno de peptídeo é um polipeptídeo heterólogo, compreendendo um segmento de Af3 25 ligado a uma seqüência amino ácida heteróloga que induz uma resposta de célula auxiliar-T contra a seqüência amino ácida heteróloga e, desse modo, uma resposta de célula-B contra o segmento de terminal-N.
Em alguns imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de Af3 é ligado em seu terminal-C a um polipeptídeo heterólogo. Em alguns
imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de Af3 é ligado em seu terminal-N a um polipeptídeo heterólogo. Em alguns imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de AP é ligado em seus términos N e C aos primeiro e segundo polipeptídeo heterólogos. Em alguns imunógenos de 5 peptídeo, o segmento de terminal-N de Ap em seu terminal-N a um
polipeptídeo heterólogo e em seu terminal-C a pelo menos uma cópia adicional do segmento de terminal-N. Em alguns imunógenos de peptídeo, o polipeptídeo compreende do terminal-N ao terminal-C, o segmento de terminal-N de A13, uma pluralidade de cópias adicionais do segmento de 10 terminal-N e o segmento aminoácido heterólogo.
Em alguns dos imunógenos de peptídeo acima, o polipeptídeo compreende ainda pelo menos uma cópia adicional do segmento de terminal-N. Em alguns dos imunógenos de peptídeo acima, o fragmento é livre de pelo menos os 5 aminoácidos de terminal-C de Af343.
15 Em alguns aspectos dos imunógenos de peptídeo acima, o
fragmento compreende até 10 aminoácidos contíguos de A.
Em outro aspecto, a invenção provê um imunógeno de peptídeo, compreendendo peptídeo AP ou fragmentos de AP ou seus análogos, eliciando uma resposta imunogênica contra certos epítopos dentro 20 de A(3, que pode ser em uma configuração referida como uma configuração
de múltiplos peptídeos antigênicos (MAP).
Em alguns dos aspectos da invenção acima, o imunógeno de peptídeo da metade de terminal-N de A. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Af3 selecionado do grupo 25 consistindo de AP1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 3-6 e 3-7. Em alguns dos aspectos acima da invenção, o imunógeno de peptídeo é da região interna de AP. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de A(3 selecionado do grupo consistindo de AP13-28, 15-24,
peptídeo da extremidade do terminal-C de A/3. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de AP selecionado do grupo consistindo de AP-33-42, 35-40 e 35-42. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Af3 selecionado do 5 grupo consistindo de Af31-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28,
3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 e 35-42. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de AP selecionado do grupo consistindo de Af31-5, AP1-7, A131-9 e Af31-12. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Af3 10 selecionado do grupo consistindo de Af31-5-L, A131-7-L, A131-9-L e
A131-12-L, em que L é um ligador. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de AP selecionado do grupo consistindo de A(31-5-L-C, Af31-7-A(31-5-L-C, A131-9-L-C e Af31-12-A(31-5-L-C, onde C é um resíduo de aminoácido de cisteína.
15 Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é
um fragmento de Af3 selecionado do grupo consistindo de A316-22, Af316-23, AP-17-23, AP17-24, A018-24 e A018-25. Em alguns aspectos da invenção, imunógeno de peptídeo é um fragmento de AP selecionado do grupo consistindo de AP16-22-C, A1316-23-C, AP17-23-C, AP17-24-C, AP18-24-C 20 e Af318-25-C, onde C é um resíduo de aminoácido de cisteína. Em outros aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de AP selecionado do grupo consistindo de A1316-22, AP16-23, Aí317-23, C-Af317-24, C-AP18-24 e C-Af318-25, em que C é um resíduo de aminoácido de cisteína.
25 Em alguns dos imunógenos de peptídeo acima, o polipeptídeo
heterólogo é selecionado do grupo consistindo de peptídeos tendo um epítopo de célula-T, um epítopo de célula B e suas combinações.
Em uma forma de realização, o grupo funcional de uma ou mais moléculas de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou do
ligador de polipeptídeo opcionalmente ligado é derivado empregando-se um reagente de reticulação. Em outra forma de realização, o reagente de derivação é um reagente de reticulação de comprimento-zero. Em outra forma de realização, o reagente de derivação é um reagente de reticulação 5 homobifuncional. Em ainda outra forma de realização, o reagente de
derivação é um reagente de reticulação heterobifuncional.
Em uma forma de realização preferida, o reagente heterobifuncional é um reagente que reage com um grupo funcional primário • ou de c-amina de uma ou mais moléculas de aminoácido do portador de 10 proteína/polipeptídeo e um grupo tiol pendente de uma ou mais moléculas de aminoácido do imunógeno de peptídeo. Em uma forma de realização, o reagente heterobifuncional é bromoacetato de N-succinimidila.
Em outra forma de realização, o grupo funcional primário ou c-amina é lisina. Em ainda outra forma de realização, a derivação do grupo 15 funcional primário ou c-amina da lisina do portador de proteína/polipeptídeo
com bromoacetato de N-succinimidila resulta na bromoacetilação dos resíduos primários ou de c-amina nas moléculas de lisina do portador de proteína/polipeptídeo. Em uma mais preferida forma de realização, o grupo tiol pendente é um resíduo de cisteína do imunógeno de peptídeo, que pode 20 ser localizado no término amino do imunógeno de peptídeo, no término carbóxi do imunógeno de peptídeo ou internamente no imunógeno de peptídeo.
Em outra forma de realização, o grupo tiol pendente é gerado por um reagente tiolante, tal como N-acetil homocisteinetio lactona, reagente 25 de Traut (2-iminotilano) SATA (N-succinimidil S-acetiltioacetato), SMPT (4-
succinimidiloxicarbonil-metil-12-piridilditio tolueno), SulfoLC SPDP (Sulfo Succinimidil piridil ditio propionamido hexanoato), SPDP (Succinimidil piridil ditio propionato). Em uma forma de realização preferida, o reagente de capeamento, que é usado para inativar o reativo livre, grupos funcionais do
portador de proteína/polipeptídeo ativado, é selecionado do grupo reagente consistindo de cisteamina, N-acetilcisteamina e etanolamina.
Em uma forma de realização particularmente preferida, o reagente de capeamento, que é usado para inativar os grupos funcionais 5 reativos do portador de proteína/polipeptídeo ativado, é selecionado do grupo
reagente consistindo de hidróxido de sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de amônio e amônia.
Em uma forma de realização, o grupo reativo do resíduo de - aminoácido do imunógeno de peptídeo é um grupo sulfidrila livre.
10 Em outra forma de realização, um ou mais dos grupos funcionais estão em um ligador, que é opcionalmente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo. Em uma forma de realização preferida, o ligador é um ligador de peptídeo. Em uma forma de realização mais preferida, o ligador de peptídeo é polilisina.
15 Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a um
segundo método para conjugar um imunógeno de peptídeo de uma proteína/polipeptídeo com um portador de proteína/polipeptídeo tendo a estrutura:
em que,
20 C é um portador de proteína/polipeptídeo e X é um grupo
funcional derivável de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo e em que m é um inteiro maior do que 0, porém menor 25 do que ou igual a 85, o método compreendendo as etapas de: (a) derivar um ou mais dos grupos funcionais do portador de proteína/polipeptídeo ou da
molécula ligadora opcionalmente ligada, para gerar uma molécula derivada com sítios reativos; (b) reagir o portador de proteína/polipeptídeo derivado da etapa (a) com um grupo reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo, para formar um conjugado de imunógeno de peptídeo-portador 5 de proteína/polipeptídeo covalentemente acoplado; e (c) reagir ainda o dito
conjugado com um reagente de capeamento, para inativar os grupos funcionais reativos livres do portador de proteína/polipeptídeo, de modo que os grupos capeados não fiquem livres para reagir com outras moléculas, incluindo proteínas/polipeptídeos, desse modo preservando a funcionalidade 10 do portador, de modo que retenha sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo, quede outro modo não ocorreria sem um portador para gerar um conjugado de imunógeno de peptídeo/portador de proteínalpolipeptídeo capeado, tendo a fórmula:
P
rysl_R
)
p
em que,
15 C é o portador de proteína/polipeptídeo e X d é um grupo
funcional derivado de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo e em que
20 P é a molécula de imunógeno de peptídeo covalentemente
ligada ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do portador de proteína ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento covalentemente ligada ao grupo funcional 25 derivado de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo
covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, n é um inteiro maior do que O, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que O, porém menor do que 85.
As formas de realização detalhadas para o primeiro método 5 descrito acima são também aplicáveis aos conjugados há pouco descritos,
preparados pelo segundo método.
Em uma forma de realização, a invenção é dirigida a conjugados de imunógeno de peptídeo-portador de proteína/polipeptídeo, em que o portador de proteína/polipeptídeo tem a fórmula:
(X)
10 em que
C é um portador de proteína/polipeptídeo e X é um grupo funcional derivável de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado ao portador de 15 proteína/polipeptídeo e em que m é um inteiro maior do que O, porém menor do que ou igual a 85 e em que o conjugado imunógeno de peptídeo-portador de proteína/polipeptídeo capeado tem a fórmula:
Xd- P)
(X--R)
em que,
C é o portador de proteína/polipeptídeo e X d é um grupo 20 funcional derivável de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo e em que P é a molécula de imunógeno de peptídeo,
covalentemente ligada ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do portador de proteína ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento, covalentemente 5 ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, desse modo preservando a funcionalidade do portador, - de modo a reter sua capacidade para eliciar as desejadas respostas imunes 10 contra o imunógeno de peptídeo, o que de outro modo não ocorreria sem um
portador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.
As formas de realização detalhadas para os primeiro e segundo métodos descritos acima são também aplicáveis aos conjugados há pouco 15 descritos.
Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a conjugados de imunógeno de peptídeo-portador de proteína/polipeptídeo gerados de acordo com o segundo método da invenção, tendo a fórmula:
( Xd
(xg---wp
em que20 C é o portador de proteína/polipeptídeo e X d é um grupo
funcional derivado de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo, covalentemente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo, e em que P é a molécula de imunógeno de peptídeo, 25 covalentemente ligada o grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do portador de proteína ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de
um ligador de peptídeo, covalentemente ligado a um portador de proteínalpolipeptídeo, R é uma molécula de capeamento covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do portador de proteínalpolipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de 5 um ligador de peptídeo, covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, desse modo preservando a funcionalidade do portador, de modo a reter sua capacidade para eliciar as respostas imunes desejadas contra o imunógeno de peptídeo, o que, de outro modo, não ocorreria sem um portador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e 10 p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.
As formas de realização detalhadas para o segundo método descrito acima são também aplicáveis aos conjugados gerados pelo segundo método, como há pouco descrito.
Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a 15 composições imunogênicas compreendendo um conjugado de um imunógeno
de peptídeo com um portador de proteína/polipeptídeo gerado pelo segundo método da invenção, junto com um ou mais excipientes, diluentes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
As formas de realização detalhadas para o segundo método e 20 os conjugados gerados, assim, descritos acima, são também aplicáveis a composições imunogênicas contendo aqueles conjugados há pouco descritos.
Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo mamífero, que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição 25 imunogênica da presente invenção ao indivíduo.
As formas de realização detalhadas, aplicáveis à composição imunogênica contendo os conjugados da presente invenção, são também aplicáveis à forma de realização da invenção dirigida ao método de uso destas composições imunogênicas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Fluxograma representando a química de processamento usada para conjugação de fragmentos de peptídeo Af3 ao portador de proteína/polipeptídeo CRM 197, para formar o conjugado 5 A(3/CRM197.
Figura 2: Fluxograma representando a química de hidrólise ácida usada para determinação quantitativa de carboximetilcisteína e S-carboximetilcisteamina, como avaliação do grau de conjugação dos conjugados de imunógeno de peptídeo-portador de proteína/polipeptídeo, tais 10 como o conjugado A(3/CRM197.
Figura 3: Esta figura representa a dependência de H da reação da conjugação de peptídeo A13/CRM.
Figura 4: Esta figura representa a dependência da conjugação de peptídeo A(3/CRM da relação peptídeo: CRM.
15 Figura 5: Verificação do processo de capeamento para
conjugação A131-7/CRM. O pH da reação foi de 9.15. O tempo de reação com o peptídeo foi de 16 h, o capeamento com N-acetilcisteamina foi de 8 h.
Figura 6: Conjugação e capeamento com várias relações de peptídeo: CRM com peptídeo. O pH da reação foi de 9,0. O tempo de reação 20 com o peptídeo foi de 16 h, o capeamento com a N-acetilcisteamina foi de 8
h.
Figura 7: Titulações do dia 36 de soros de primatas, em seguida à imunização dos primatas com conjugados de peptídeo Af3 com vários adjuvantes.
25 Figura 8: Titulações do dia 64 de soros de primata, em seguida
à imunização de primatas com conjugados de peptídeo AO com vários adjuvantes.
Figura 9: Titulações de primatas por dia e grupo de tratamento. Os primatas foram imunizados com conjugados AO 1-7 ou AO 1-5 CRM197
com alume ou 529 como adjuvantes e os títulos de anticorpos anti-A0 foram medidos nos dias 29, 36, 57 e 54.
Figura 10: Conjugados de peptídeo-proteína foram caracterizados empregando-se análise SDS-PAGE Western blot com um gel 5 pré-moldado de tris-tricina. As faixas são: marcador (faixa 1); L-28375 24/01
(faixa 2); L-28375 24/02 (faixa 3); L-28375 24/03 (faixa 4); L28375 24/04 (faixa 5); L-28375 24/05 (faixa 6); L-28375 24/06 (faixa 7) L-28375 24/07 (faixa 8); L-28375 24/08 (faixa 9); L-28375 24/09 (simulado) (faixa 10); e BrAcCRM 197 (faixa 11).
Descrição SEQ ID NO: DAEFREID-GAGA-C A/31-7-1,-C A131-9-1.-C 9 VEYGSDERFEAD-C 11 PKYVKQNTLICLAT 12 AXXVAAW111~ 13 FICKIAKMEKASSVFNV QVIEFQPIXPAVVICL QYLECANSKFIGITEL FNNFIVSFWLIWPKVSASHLE KQDNIvIWQEVOKAlvfY DAEFRITD-QYIEANSKFIGIt EL-C- FNNFIVSFWLR.VPKVSASHLE- DAEFRHD DAEFRHDSGYEVF111Q1CLVFFAEDVGSN KGAFIGLMVGGVVIA DAEFRIIDQYIKANSKFIGITEL ESG-QMANSICEIOITEL A$12-1-C Peptídeo ligador Hemaglutinina da LA3ty7.119 influenza
tídeo PAN-DR(Peptideo PADRE)
Malaria CS Antígeno de superfície Hepatite B H135Ag13-28 Proteína de choque p65153•71 térmico 65 Toxóide do tétano :TTE~ Toxóide do tétano :11'.90.96 A-131--7rrr830-544/errr547-9671Af31-7 AP1-42 AN90549:AMM10.~ (usado em uma config. 1CAP4)
AN9 055 0: AP 1.71TT947_967
(usado em uma config. HAP4)
AN90576: Ap3_9/TTF,30444
(usado em uma config. HAP4) epítopo T3
SEQ ID NO: Seqüência Descrição 27 DAEFRHD-DAEFRBDD- AEFRHDAKXVAAWTLICAAA
AN90543: AN, x .3/PADRE
28 AKXSTAAW-IIKAAA-DAEFRBD- DAEFRHD-DAEFRHD PADRE/AN.7 x 3 29 DAEFRBD-AIOCVAAWFLICAAA x 3/PADRE 30 DAEFRBD-ISQAVHAARAEMAGR A 141 Fragmento de albumina 31 FRBDSGY-ISQAVHAARAEINEAGR An4_10/ albmiina Fragmento de
32 EFRBDSG-ISQAVHAAHAELNEAGR a_ _ 1, Fragmento de Al-'s"" albumina PKYVICQNTL T-DAEFRBD- DAEFRHD-DAEFRBD HA,„,,, Ar3,„ x 3 34 DAEFRIID-PICYVKQNTLIWAT- DAEFRHD AP 7/RA307,10FAr31-7 35 DAEFRHD-DAEFRBD-DAEFRFID- PICYVKQNTLICLAT A 1,.7 x 3/ FIA3cm19 36 DAEFRI3D-D~D-
PKYVKQNTLELAT A1314 x 2/ HA3074319
37 DAEFREID-PICYVICQNTLKLAT- EKKIAKMEKASSVFNV- QYIKANSKFIGITEL- FNNFIVSFWLRVPICVSASHI.E-DAEFRBD AÍS1-7/HA307-319,Malaria CS/ 17n0-844/11'947.967fAP 1 -7 38 DAEFRBD-DAEFRIID-DAEFRHD- QYIKANSKF1GrfEL-C-FNNFTVSFW1RVPKVSASBLE A 31.E x 3Ins30444fenT947.967 39 DAEFRIID-QYIKANSEFIGITEL-C FNNFTVSFWLRVPICVSASBIE Ar3i_irrE30444icirT947.967
SEQ ID NO: Seqüência Descrição 40 OADDVVDSSKSFVNIENFSSYHGTKYGY VDSIQKGIQICPKSGTQGNYDDDWEEPY S'IDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVV KVTYFGLTKVLALKVDNAETIKKELGLS LTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLS LPFAEGSSSVEYDNWEQAICALSVELEN FETRGKRGQDAIWYEYMAQACAGNRVR ` RSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKTESLK EFIGPIKNKMSESPNICIVSEEKAKQYLEE FIIQTALEHPELSELKTVTGTINTPVFAGAN YAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAAL suPGIGSVMGIADGAVEI-INTEEIVAQSI ALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFV ESIINLFQVVILNSYNIZPAYSPGHKTQPFL IfDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDI KTTAENTPLPIAGVLLFTIPGKLDVNKSK THISVNGRKTRIvIRCRAIDGDVTFCRPICSP VYVGNGV~HVAFHRSSSEKIHSNEI SSDSIGVLGYQKTVDIITICVNSKLSLWEI KS CR/4[3197 ISQAVHAAHAEINEAGR 42 DAEFGHDSGFE'VRIIQKLVFFAEDVGSN
KOADGLIVIVGGVVIA Murino AN-42
44
gel
VFFÀEDVG-C A131g-2s -CLVFFAEDV-C A117-24 -C 46
el
KLVFFAED -C AP) 6-23 -C C-VFFAEDVG c-Ap.?, 47 C-LVFF.AEDV c-Ap1744a
C- 49 KLVFFAED C-A016-23 VFFAEDV-C A-018-24 -C VFFAED-C Af31723 -Ca
KLVFFAE -C AP16-22 -Clel
C-VETAEDV C-ANL:24Eal
C-LVFFAED C-A1317-23a
C-KLVFFAE C- 14-22DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção é dirigida a métodos de gerar conjugados de imunógeno de peptídeo-proteína, em que os grupos funcionais ativos não 5 reagidos do portador, que são gerados durante a ativação, são inativados
utilizando-se reagentes de capeamento, tais como N-acetilcisteamina, a fim de evitar que reajam mais. A presente invenção é também dirigida a conjugados de portador-imunógeno de peptídeo capeados, gerados por aqueles métodos, e a composições imunogênicas compreendendo ditos conjugados.
5 A abordagem de aumentar a imunogenicidade de moléculas
pequenas ou fracamente imunogênicas, tais como sacarídeos, através da conjugação, tem sido utilizada com sucesso por décadas (vide, por exemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53) e muitas composições imunogênicas foram descritas em que polímeros capsulares purificados foram conjugados 10 com proteínas portadoras, para criar composições imunogênicas mais eficazes, pela exploração deste "efeito portador". Por exemplo, Schneerson et al. (J. Exp. Med. 152: 361 — 3786, 1980) descrevem conjugados de
Haemophilus influenzae b proteína polissacarídeo que conferem imunidade a doenças invasivas causadas por aquele microorganismo. Os conjugados de 15 PRP (poliribosilribitol fosfato, um polímero capsular de H. influenzae b)
mostraram ser mais eficazes do que as composições imunogênicas baseadas apenas no polissacarídeo (Chu et al. (1983) Infect. Immun. 40: 245; Schneerson et al. (1984), Infect. Immun. 45: 582-591). A conjugação também mostrou desviar-se da fraca resposta anticorpo, usualmente observada em 20 crianças, quando imunizadas com um polissacarídeo livre (Anderson et al.
(1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158:294.
Uma outra vantagem de utilizar-se como o portador de proteína uma toxina ou toxóide bacteriano, contra o qual a imunização de rotina de humanos (por exemplo, tétano ou difteria) é uma prática padrão, é 25 que uma imunidade desejada para a toxina ou toxóide é induzida juntamente
com a imunidade contra os patógenos associados com o polímero capsular. Os conjugados de determinante antigênico/portador-hapteno estão também sendo usados para produzir anticorpos monoclonais altamente específicos, que podem reconhecer epítopos químicos distintos no hapteno
acoplado. Os monoclonais resultantes com freqüência são usados para investigar a estrutura epitópica e as interações entre as proteínas nativas. Em muitos casos, os determinantes antigênicos/haptenos usados para gerar estes monoclonais são pequenos segmentos de peptídeo, representando sítios 5 antigênicos cruciais da superficie de proteínas maiores. Os critérios para um portador bem sucedido, a serem usados na geração de um conjugado de determinante antigênico/portador-hapteno, são o potencial para imunogenicidade, a presença de grupos funcionais adequados para a • conjugação com um determinante antigênico/hapteno, propriedades de 10 solubilidade razoáveis, mesmo após derivação, e falta de toxicidade in vivo.
Estes critérios são satisfeitos pelos conjugados gerados pelos métodos da presente invenção. Os conjugados podem ser quaisquer conjugados de imunógeno de peptídeo-portador, gerados utilizando-se o processo de conjugação aqui descrito. Os conjugados são gerados utilizando-
15 se um processo da presente invenção, em que um portador de
proteína/polipeptídeo, tendo a seguinte estrutura:
é covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, em que,
C é um portador de proteína/polipeptídeo e X é um grupo 20 funcional derivável de um resíduo de aminoácido do portador de
proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo, covalentemente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo e em que m é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85, é covalentemente ligado a um imunógeno de peptídeo e 25 em que o conjugado de imunógeno de peptídeo-portador de
fórmula:
em que
C é o portador de proteína/polipeptídeo e X d é um grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do portador de 5 proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo, covalentemente ligado ao portador de proteína/polipeptídeo, P é um imunógeno de peptídeo covalentemente ligado ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um 10 ligador de peptídeo, covalentemente ligado a um portador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento, covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do portador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligador de peptídeo, covalentemente ligado a um portador de 15 proteína/polipeptídeo, desse modo preservando a funcionalidade do portador,
de modo a reter sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo que, de outro modo, não ocorreria sem um portador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.
20 Seleção de Portadores
Alguns imunógenos de peptídeo contêm o apropriado epítopo para induzir uma resposta imune, porém são demasiados pequenos para serem imunogênicos. Nesta situação, os imunógenos de peptídeo são ligados a um portador adequado, para ajudar a eliciar uma resposta imune. Na 25 representação esquemática acima do conjugado de imunógenos de peptídeo- portador, gerado por um processo da presente invenção, C é um portador de
proteína/polipeptídeo com que os imunógenos de peptídeo são conjugados diretamente via grupos funcionais derivados dos próprios resíduos de aminoácido do portador ou indiretamente via grupos funcionais derivados dos ligadores de peptídeo, covalentemente ligados aos portadores. Portadores de 5 proteína/polipeptideo adequados incluem mas não são limitados a albumina
(incluindo albumina de soro humano), hemocianina de lapa buraco de fechadura, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxóide de tétano ou um toxóide de outras bactérias patogênicas, tendo reduzida toxicidade, incluindo mutantes, tais como difteria, E. coli, cólera ou H pylori 10 ou um derivado de toxina atenuado. Um tal portador é a proteína CRM 197
(SEQ. ID NO: 40), que tem reação cruzada com a toxina da difteria. Outros portadores incluem epítopos de célula-T, que se ligam a múltiplos alelos de MHC, por exemplo, pelo menos 75% de todos os alelos MHC humanos. Tais portadores são às vezes conhecidos na técnica como 15 "epítopos de célula-T universais". Portadores exemplificativos, com epítopos
de célula-T universais, incluem:
Hemaglutinina da Influenza: HA307.319 PKYVKQNTLKL AT (SEQ. ID NO: 11) Peptídeo PAN-DR (peptídeo PADRE) AKXVAAWTLKAAA
20 (SEQ. ID NO: 12)
CS da Malária: epítopo T3 EKKIAKMEKASSVFNV
(SEQ. ID NO: 13) Antígeno superfície Hepatite B: HB gAg 19_28 FELLTRILTI
(SEQ. ID NO: 14)
25 Proteína Choque Térm. 65:hsp65 153_ 171 QSIGDLIAEAMDKVGNEG
(SEQ. ID NO: 15)
Bacilo Calmette-Guerin (BCG) QVHFQPLPPAVVKL
(SEQ. ID NO: 16)
(SEQ. ID NO: 17)
Toxóide do Tétano: TT947.967 NNFTVSF WLRVPKV S A SHLE
(SEQ. ID NO: 18)
HIV gp120 Ti: KQIINMWQEVGKAMY
5 (SEQ. ID NO: 19)
CRM 197 Vide a Breve Descrição das
Seqüências (SEQ. ID NO: 40)
Fragmentos de Albumina I SQAVHAAHAEINEAGR
(SEQ. ID NO: 41)
10 Outros portadores para estimular ou aumentar uma resposta
imune e com que um imunógeno de peptídeo ou um hapteno pode ser conjugado, incluem citocinas tais como IL-1, IL-1 a e peptídeos 13, IL-2, yINF, IL-10, GM-CSF e quimiocinas, tais como MIP 1 a e j3 e RANTES. Os peptídeos imunogênicos podem também ser ligados a portador de 15 proteína/peptídeo, que aumentam o transporte através dos tecidos, como descrito em O'Mahony, WO 97/17163 e WO 97/17614, que são por este meio incorporados por referência em sua totalidade, para todas as finalidades.
Ainda outros portadores incluem Streptococcal C5a peptidase recombinante, Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664 e 2452, Chlamydia 20 pneumoniae ORFs T367 e T858, fatores de crescimento e hormônios.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a proteína portadora é CRM 197, um mutante não-tóxico da toxina da difteria com uma mudança amino ácida em sua seqüência primária. A glicina presente na posição amino ácida 52 da molécula é substituída por um ácido glutâmico, 25 devido a uma única mudança do códon do ácido nucléico. Devido a esta mudança, a proteína não tem atividade de transferase de ribosil-ADP e torna-se não-tóxica. Ela tem um peso molecular de 58.408 Da. A CRM 197 é produzida em grandes quantidades por expressão recombinante de acordo com a Patente U.S. 5.614.382, que é por este meio incorporada por referência.
As conjugações dos sacarídeos bem como dos peptídeos com CRM 197 são realizadas por ligação através dos grupos amino-c dos resíduos de lisina. Foi bem estabelecido, através de diversos produtos comerciais, que CRM 197 é um excelente e seguro portador para os epítopos de célula-B.
5 Peptídeos imunogênicos
Como aqui usada, a expressão "imunógeno de peptideo" ou "hapteno" é qualquer proteína ou estrutura/fragmento/análogo subunitário derivado dela, que pode eliciar, facilitar ou ser induzido para produzir uma resposta imune na administração a um mamífero. Em particular, a expressão é 10 usada para referir-se a um determinante antigênico de polipeptídeo de qualquer fonte (bactérias, vírus ou eucarioto), que pode ser acoplado a um portador empregando-se um método aqui descrito. Tais imunógeno de polipeptídeo/determinantes antigênicos podem ser de origem celular viral, bacteriana ou eucariótica.
15 Imunógenos de peptídeo de uma célula bacteriana incluem
aqueles derivados de superfície de célula bacteriana ou proteínas secretadas, que podem ser usadas nas composições imunogênicas baseadas em proteína. Cepas bacterianas exemplificativas incluem Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, 20 Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp.,
Alloiococcus otiditis e streptococci Grupo B.
Imunógenos de peptídeo exemplificativos de vírus incluem aqueles derivados do vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do herpes simples (HSV), vírus do papiloma humano (HPV), vírus da 25 parainfluenza (PIV), vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus sincial
respiratório (RSV), vírus Epstein-Barr (EBV), coronavírus, vírus da vacínia, rotavírus, vírus da raiva, vírus da hepatite C (HCV) e vírus da hepatite B (HBV), para citar alguns.
aqueles derivados de Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidoides spp., Histoplasma spp. e Aspergillus spp. Antígenos parasíticos incluem aqueles derivados de Plasmodium spp., Trypanosoma spp., Schistosoma spp., Leishmania spp. e similares.
5 Imunógenos de peptídeo eucarióticos exemplificativos, que
podem ser conjugados com um portador para uso como um imunoterapêutico na prevenção, tratamento, profilaxia ou melhoria de várias doenças humanas, incluem aqueles associados com células tumorais, aqueles derivados de Af3, um peptídeo de 39-43 aminoácidos, preferivelmente 42 aminoácidos, que são 10 o componente principal das placas características da doença de Alzheimer
(AD) (vide US 4.666.829; Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophy. Rs. Commun. 120: 1131, Hardy (1984) TINS 20: 1131; Hardy (1977) TINS 20: 154), aqueles derivados de peptídeos amilóides da amilina, um material de polipeptídeo produzido pelas células ilhotas pancreáticas, que tem estado 15 implicado no diabetes tipo II, peptídeos derivados dos produtos genéticos da
lipoproteína de baixa densidade, que têm estado implicados na aterosclerose e peptídeos antigênicos derivados de citocinas inflamatórias e fatores de crescimento, tais como interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral (TNF-a) e GDF-8. Tais imunógenos de peptídeo eucarióticos podem incluir 20 epítopo de célula-T (CTL) ou célula-B.
Um "epítopo CTL" é um derivado das regiões epitópicas selecionadas de antígenos alvo potenciais, tais como antígenos associados a tumor, incluindo mas não limitado a carcinoma de célula renal, câncer de mama, antígenos carcinoembriônicos, antígenos de melanoma (MAGE) e 25 antígenos específicos de câncer da próstata, tais como antígeno de membrana
específico de próstata (PSMA) e antígeno de célula tronco da próstata (PSCA), antígenos da hepatite C.
Ar3, também conhecido como peptídeo amilóide-(3 ou peptídeo A4 (vide US 4.666.829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 120, 1131 (1984)), é um peptídeo de 39 — 43 aminoácidos, que é o principal componente das placas características da doença de Alzheimer. AP é gerado pelo processamento de uma proteína APP maior por duas enzimas, denominadas secretases 13 e y (vide Hardy, TINS 20, 154 (1997)). As 5 mutações conhecidas de APP, associadas com a doença de Alzheimer,
ocorrem próximo ao sítio da secretase 13 ou y, ou dentro de AO. Por exemplo, a posição 717 é próxima ao sítio de clivagem da secretase-y de APP em seu processamento para AP e as posições 670/671 são próximas ao sítio de clivagem da secretase-(3. Acredita-se que as mutações causem AD pela 10 interação com as reações de clivagem pelas quais AP é formada, a fim de
aumentar a quantidade da forma de aminoácidos 42/43 de AO gerado.
AO tem a propriedade incomum de que pode fixar e ativar cascatas complementares clássicas e alternativas. Em particular, ele liga-se a Clq e, finalmente, a C3bi. Esta associação facilita a ligação em macrófagos, 15 resultando na ativação das células-B. Além disso, C3bi decompõe-se mais e então liga-se a CR2 das células B em uma maneira dependente de célula T, resultando em um aumento 10.000 vezes de ativação destas células. Este mecanismo faz com que AO gere uma resposta imune excedente àquela de outros antígenos.
20 AP tem diversas formas naturalmente ocorrentes. As formas
humanas de AO são referidas como A(339, A1340, Ar341, A(342 e A(343. As seqüências destes peptídeos e sua relação com o precursor APP são ilustradas pela Figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por exemplo, A(342 tem a seqüência:
25 H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-
His- His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn- Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile- Ala-OH (SEQ. ID NO: 21).
Ala-Ile e Ala-Ile-Val, respectivamente da extremidade do terminal-C. AP difere de AP42 pela presença de um resíduo de treonina no terminal-C.
Os imunógenos de peptídeo, que são fragmentos de A13, são vantajosos em relação à molécula intacta para uso nos presentes métodos por 5 diversas razões. Primeira, em razão de somente certos epítopos dentro de AP
induzirem uma resposta imunogênica útil, para tratamento da doença de Alzheimer, uma dosagem igual de massa de um fragmento contendo tais epítopos provê uma maior concentração molar dos epítopos imunogênicos úteis do que uma dosagem de AP intacto. Segunda, certos imunógenos de 10 peptídeo de AP geram uma resposta imunogênica contra depósitos amilóides, sem gerar uma significativa resposta imunogênica contra a proteína APP de que AP deriva-se. Terceira, os imunógenos de peptídeo de AP são de manufatura mais simples do que Ap intacto, devido a seu mais curto tamanho. Quarta, os imunógenos de peptídeo de A13 não se agregam da mesma maneira 15 que o AP intacto, simplificando a preparação dos conjugados com portadores. Alguns dos imunógenos de peptídeo de AP têm uma seqüência de pelo menos 2, 3, 5, 6, 10 ou 20 aminoácidos contíguos de um peptídeo natural. Alguns imunógenos de peptídeo não têm mais do que 10, 9, 8, 7, 5 ou 3 resíduos contíguos de AP. Em uma forma de realização preferida, os 20 imunógenos de peptídeo da metade de terminal-N de Al3 são usados para preparar conjugados. Os imunógenos de peptídeo preferidos incluem A131-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 e 1-4. A designação AI31-5, por exemplo, indica um fragmento de terminal-N incluindo os resíduos 1-5 de A13. Os fragmentos de AP começando no terminal-N e terminando em um resíduo dentro dos 25 resíduos 7-11 de AP, são particularmente preferidos. O fragmento AP1-12 pode também ser usado, porém é menos preferido. Em alguns métodos, o fragmento é um fragmento de terminal-N que não Ala 1-10. Outros fragmentos preferidos incluem Af313-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 e outros fragmentos internos e fragmentos de terminal-C.
Alguns peptídeos A13 da invenção são peptídeos imunogênicos que, na administração a um paciente humano ou animal, geral anticorpos que especificamente ligam-se a um ou mais epítopos entre os resíduos 16 e 25 de AP. Fragmentos preferidos incluem AP16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24 e 5 18-25. Os anticorpos especificamente ligam-se a epítopos entre os resíduos 16
e 25, especificamente ligam-se a AP solúvel, sem se ligarem às placas de AP. Estes tipos de anticorpo podem especificamente ligar-se a AP solúvel na circulação de um paciente ou modelo animal, sem especificamente ligarem-se a placas de depósitos de Af3 do cérebro do paciente ou modelo. A ligação 10 específica dos anticorpos em AP solúvel inibe a AP de ser incorporado dentro das placas, assim inibindo o desenvolvimento das placas de um paciente ou inibindo um outro aumento do tamanho ou freqüência de placas, se tais placas já tiverem se desenvolvido antes do tratamento ser administrado.
Preferivelmente, o fragmento de AP administrado não tem um 15 epítopo que geraria uma resposta de célula T ao fragmento. Geralmente, os
epítopos de célula-T são maiores do que 10 aminoácidos contíguos. Portanto, fragmentos preferidos de A[3 são de tamanho 5-10 ou, preferivelmente, 7-10 aminoácidos contíguos ou, muitíssimo preferivelmente, 7 aminoácidos contíguos; isto é, suficiente comprimento para gerar uma resposta anticorpo, 20 sem gerar uma resposta de célula T. A ausência de epítopos de célula-T é preferida porque estes epítopos não são necessários para atividade imunogênica de fragmentos e podem provocar uma indesejada resposta inflamatória em um subconjunto de pacientes (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3).
25 O fragmento de A1315-25 e subfragmentos de 7-8 aminoácidos
contíguos dele são preferidos porque estes peptídeos geram consistentemente uma alta resposta imunogênica ao peptídeo AP. Estes fragmentos incluem A1316-22, A1316-23, A[316-24, A1317-23, A1317-24, A1318-24 e A1318-25. Subfragmentos A1315-25 particularmente preferidos são 7 aminoácidos
contíguos de comprimento. A designação A[315-21, por exemplo, indica um fragmento incluindo os resíduos 15-21 de Ai3 e não tendo outros resíduos de A13 e, preferivelmente, 7-10 aminoácidos contíguos. Estes fragmentos podem gerar uma resposta anticorpo que inclui anticorpos específicos de 5 extremidade.
Os imunógenos de peptídeo de Al3s requerem avaliação quanto à atividade de remover ou evitar depósitos amilóides (vide WO 00/72880, que é incorporado aqui em sua totalidade para todas as finalidades). A administração de fragmentos de terminal-N de A13 induz a produção de 10 anticorpos que reconhecem os depósitos AP in vivo e in vitro. Os fragmentos não tendo pelo menos um e às vezes pelo menos 5 ou 10 aminoácidos de terminal-C presentes, em formas naturalmente ocorrentes de AP, são usados em alguns métodos. Por exemplo, um fragmento não tendo 5 aminoácidos da extremidade de terminal-C de A[343 inclui os primeiros 38 aminoácidos da 15 extremidade de terminal-C de A[3.
A menos que de outro modo indicado, referência a AP inclui as seqüências amino ácidas humanas naturais indicadas acima, bem como análogos incluindo alélicos, espécies e variantes induzidas. Os análogos tipicamente diferem dos peptídeos naturalmente ocorrentes em uma, duas ou 20 algumas posições, com freqüência em virtude de substituições conservativas. Os análogos tipicamente exibem pelo menos 80 ou 90% de identidade de seqüência com peptídeos naturais. Alguns análogos também incluem aminoácidos não naturais ou modificações de aminoácidos de terminal-N ou C em uma, duas ou algumas posições. Por exemplo, o resíduo ácido aspártico 25 natural da posição 1 e/ou 7 de Af3 pode ser substituído por ácido iso-aspártico. Exemplos de aminoácidos não naturais são D, alfa, aminoácidos D, alfa, alfa-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido lático, 4-hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetilisina, épsilon-N-acetilisina, 0-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-
metilistidina, 5-hidroxilisina, ômega-N- metilarginina, ornitinina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido gama-amino butírico, homosserina, citrulina e ácido isoaspártico. Os peptídeos imunogênicos também incluem análogos de AO e seus fragmentos. Alguns agentes 5 terapêuticos da invenção são todos peptídeos-D, por exemplo, todos D Ar3,
todos fragmento D AO ou análogos de todos D Al3 ou todos fragmento de D A[3. Os fragmentos e análogos podem ser avaliados quanto à eficácia profilática ou terapêutica em modelos de animais transgênicos, em comparação com controles não-tratados ou placebo, como descrito em WO 10 00/72880.
Os imunógenos de peptídeo também incluem polipeptídeos mais longos, que incluem, por exemplo, um imunógeno de peptídeo Af3, junto com outros aminoácidos. Por exemplo, peptídeos imunogênicos preferidos incluem proteínas de fusão compreendendo um segmento de Ar3 ligado a uma 15 seqüência amino ácida heteróloga, que induz uma resposta de célula T
auxiliar contra a seqüência amino ácida heteróloga e, desse modo, uma resposta de célula-B contra o seguimento AI3. Tais polipeptídeos podem ser avaliados quanto à eficácia profilática ou terapêutica em modelos animais, em comparação com controles não-tratados ou placebo, como descrito no WO 20 00/72880.
O peptídeo AP, análogo, fragmento imunogênico ou outro polipeptídeo pode ser administrado em forma desagregada ou agregada. Aja desagregado ou seus fragmentos significa unidades de peptídeo monoméricas. AO desagregado ou seus fragmentos são geralmente solúveis e são capazes de 25 auto-agregarem para formar oligômeros solúveis, protofibrilas e ADDLs. Os oligômeros de AO e seus fragmentos são usualmente solúveis e existem predominantemente como hélices-alfa ou espirais aleatórias. Ai3 agregado ou seus fragmentos significa oligômeros de Al3 ou seus fragmentos, que se associaram em conjuntos de folha-beta insolúveis. AO agregado ou seus
fragmentos também significa polímeros fibrilares. As fibrilas são usualmente insolúveis. Alguns anticorpos ligam-se a Af3 solúvel ou seus fragmentos ou Al3 agregado ou seus fragmentos. Alguns anticorpos ligam-se tanto a AJ3 solúvel ou seus fragmentos e Af3 agregado ou seus fragmentos.
5 Os peptídeos imunogênicos também incluem multímeros de
peptídeos imunogênicos monoméricos. Os peptídeos imunogênicos que não peptídeos Af3 devem induzir uma resposta imunogênica contra um ou mais dos fragmentos preferidos de AP listados acima (por exemplo, A(33, 7, 1-10 e 3-7).
10 Os peptídeos imunogênicos da presente invenção são ligados a
um portador empregando-se um método da presente invenção, para formar um conjugado. O peptídeo imunogênico pode ser ligado em seu término amino, seu término carboxila, ou ambos, a um portador, para formar um conjugado. Opcionalmente, múltiplas repetições do peptídeo imunogênico 15 podem estar presentes no conjugado.
Um fragmento de terminal-N de A13 pode ser ligado em seu termino-C a um peptídeo portador, para formar um conjugado. Em tais conjugados, o resíduo de terminal-N do fragmento de AP constitui o resíduo de terminal-N do conjugado. Portanto, tais conjugados são eficazes na 20 indução de anticorpos que se ligam a um epítopo que requer o resíduo de terminal-N de
Ap
para ficar em forma livre. Alguns peptídeos imunogênicos da invenção compreendem uma pluralidade de repetições de um segmento de terminal-N de Af3 ligado no terminal-C a uma ou mais cópias de um peptídeo portador, para formar um conjugado. O fragmento de terminal-N de A(3, 25 incorporado dentro de tais conjugados, às vezes começa em A(31-3 e terminaem A(37-11. Af31-7, 1-3, 1-4, 1-5 e 3-7 são fragmentos de terminal-N de A. Alguns conjugados compreendem diferentes segmentos de terminal-N de Af3 em tandem. Por exemplo, um conjugado pode compreender A(31-7, seguido por Af31-3 ligado a um portador.
Em alguns conjugados, um segmento de terminal-N de
Ao
é ligado em sua extremidade de terminal-N a um peptídeo portador. A mesma variedade de segmentos de terminal-N de AP pode ser usada como com a ligação de terminal-C. Alguns conjugados compreendem um peptídeo 5 portador, ligado ao terminal-N de um segmento de terminal-N de AP, que é, por sua vez, ligado a um ou mais segmentos de terminal-N de AP em tandem. Preferivelmente, tais fragmentos de AP imunogênico, uma vez conjugados a um portador apropriado, induz uma resposta imunogênica, que é especificamente dirigida ao fragmento AP, sem ser dirigida a outros 10 fragmentos de AP.Os peptídeos imunogênicos da invenção incluem peptídeos heterólogos imunogênicos. Em alguns peptídeos imunogênicos, um fragmento AP é ligado a um portador para formar um peptídeo heterólogo imunogênico. Este peptídeo heterólogo é ligado a um portador empregando-se um método 15 da presente invenção, para formar um conjugado. Alguns destes peptídeos
heterólogos imunogênicos compreendem fragmentos de AP ligados aos epítopos de toxóide de tétano, tal como descrito em US 5.196.512, EP 378.881 e EP 427.347. Opcionalmente, um peptídeo imunogênico pode ser ligado a uma ou múltiplas cópias de um portador, por exemplo, em ambos os 20 términos N e C do portador, para formar um peptídeo heterólogo imunogênico. Outros destes peptídeos heterólogos imunogênicos compreendem fragmentos de AP ligados a peptídeos portadores descritos em US 5.736.142. Por exemplo, um peptídeo heterólogo imunogênico pode compreender Af31-7, seguido por Af31-3, seguido por um portador. Exemplos 25 de tais peptídeos heterólogos imunogênicos incluem:
AP 1-7/toxóide do Tétano 830-844 + 947-767 em uma configuração linear DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFT VSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.: 24)
configurações lineares): PADRE/A(3 1-7:
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 26) A(31-7 x 3/PADRE: 5 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO.: 27) PADRE/A(31-7 x 3: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRIID-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 28) 10 A(31-7/PADRE:
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO.: 29) Af31-7/fragmento de albumina:
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.: 30) A(34-10/fragmento de albumina:
15 FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.:31)
A03-9/fragmento de albumina:
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.: 32) HA307-319/A(31_7 x 3:
PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD
20 (SEQ ID NO.: 33)
A(31_7/HA307-319/A01-7:
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 34)
A131_7x3/HA307-319:
25 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT
(SEQ ID NO.: 35) A13- 1 _7x 2/HA307-319:
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO.: 36)
AO 1 _7/HA307_319/CS Malária CS/TT830-844/TT947-967/A01-7
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKAS SVFNV- QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 37)
5 AO 1 .7x 3/TT830-844/C/TT947-967
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.: 38) A01_7/TT830-844/C/17947-967
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFN NFTVSF
10 WLR VPKVSASHLE (SEQ ID NO.: 39)
A31_71TT830-844/C/TT947-967/A01-7
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRV PKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 20)
Alguns peptídeos heterólogos imunogênicos compreendem um 15 multímero de peptídeos imunogênicos, representados pela fórmula 2', em que
x é um inteiro de 1 — 5. Preferivelmente, x é 1, 2 ou 3, com 2 sendo muitíssimo preferido. Quando x é dois, tal multímero tem quatro peptídeos imunogênicos ligados em uma configuração preferida, referida como MAP4 (vide US 5.229.490). Tais peptídeos imunogênicos são então ligados a um
20 portador utilizando-se um método da presente invenção para formar um
conjugado.
A configuração MAP4 é mostrada abaixo, onde estruturas ramificadas são produzidas iniciando-se a síntese do peptídeo tanto no terminal-N como nas aminas de lisina de cadeia lateral. Dependendo do 25 número de vezes que a lisina é incorporada dentro da seqüência e permitida ramificar, a estrutura resultante apresentará múltiplos terminais-N. Neste exemplo, quatro terminais-N idênticos foram produzidos no núcleo contendo lisina ramificado. Tal multiplicidade aumenta grandemente a responsividade das células B cognatas.
Peptídeo Peptídeo
KGG
Peptídeo
Exemplos de tais peptídeos heterólogos imunogênicos incluem:
AP 1-7/Toxóide do Tétano 830-844 em uma configuração MAP4: DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID NO: 22) 5 AP 1-7/Toxóide do Tétano 947-967 em uma configuração MAP4:
• DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
(SEQ. ID NO: 23)
AP 3-9/Toxóide do Tétano 830-844 em uma configuração MAP4: EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID NO: 25) 10 DAEFRHD-QYIKANSKFGITEL de uma resina 2 ramificada
Peptídeo
Lys-Gly-Cys
Peptídeo
O peptídeo Af3, análogo, fragmento ativo ou outro polipeptídeo pode ser administrado em forma associada ou multimérica ou em forma dissociada. Os agentes terapêuticos também incluem multímeros de agentes imunogênicos monoméricos. Agentes que não peptídeos A13 devem 15 induzir uma resposta imunogênica contra um ou mais fragmentos preferidos de AP listados acima (por exemplo, 1-10, 1-7, 1-3 e 3-7) e podem também ser conjugados a um portador empregando-se um método da presente invenção. Preferivelmente, tais agentes, uma vez conjugados com um apropriado portador, induzem uma resposta imunogênica, que é especificamente dirigida 20 a um destes fragmentos, sem ser dirigida a outros fragmentos de A13. Para
facilitar a conjugação de um imunógeno de peptídeo com um portador, aminoácidos adicionais podem ser adicionados aos términos dos determinantes antigênicos. Os resíduos adicionais podem também ser usados
para modificar as propriedades físicas ou químicas do imunógeno de peptídeo. Aminoácidos tais como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou similares, podem ser introduzidos no terminal-C ou terminal-N do imunógeno de peptídeo. Adicionalmente, ligadores de peptídeo 5 contendo aminoácidos tais como glicina e alanina podem também ser introduzidos. Além disso, os determinantes antigênicos podem diferir da seqüência natural ao ser modificado pela acilação de grupo NH2 terminal, por exemplo, alcanoíla (C1-C20) ou acetilação de tioglicolila, amidação de carbóxi-terminal, por exemplo, amônia, metilamina etc. Em alguns exemplos, 10 estas modificações podem prover sítios para ligação a um suporte ou outra
molécula.
Os imunógenos de peptídeo usados para gerar conjugados da presente invenção, empregando-se um processo descrito aqui, podem ser combinados via ligação, para formar polímeros (multímeros) ou podem ser 15 formulados em uma composição sem ligação, como uma mistura. Onde um
peptídeo é ligado a um peptídeo idêntico, desse modo formando um homopolímero, uma pluralidade de unidades epitópicas repetidoras são apresentadas. Por exemplo, a tecnologia de múltiplos peptídeos antígenos (MAP) é usada para construir polímeros contendo tanto CTL e/ou peptídeos 20 anticorpo e peptídeos. Quando os peptídeos diferem, por exemplo, de um
coquetel representando diferentes subtipos virais, diferentes epítopos dentro de um subtipo, diferentes especificidades de restrição HLA, ou peptídeos que contêm epítopos auxiliares-T, heteropolímeros com unidades repetidoras são providos. Além de ligações covalentes, ligações não-covalentes, capazes de 25 formar ligações intermoleculares e intraestruturais são também contempladas.
Tais imunógenos de peptídeo e seus análogos são sintetizados por síntese de peptídeo de fase sólida ou expressão recombinante, ou são obtidos de fontes naturais. Sintetizadores de peptídeo automáticos são comercialmente disponíveis em numerosos fornecedores, tais como Applied
