Influência das raças bovinas ibéricas na estrutura genética das populações de bovinos crioulos da América Latina

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(1)Universidade Técnica de Lisboa Instituto Superior de Agronomia. Influência das raças bovinas Ibéricas na estrutura genética das populações de bovinos Crioulos da América Latina. Catarina Jorge Ginja. Orientador: Doutor Luís Lavadinho Telo da Gama Co-orientador: Doutora Maria Cecília Torres Penedo. Júri: Presidente: Reitor da Universidade Técnica de Lisboa Vogais: Doutora Maria Teresa Rangel de Figueiredo, Professora Catedrática da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Doutor João Pedro Bengala Freire, Professor Catedrático do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa Doutor Luís Lavadinho Telo da Gama, Professor Catedrático Convidado da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa Doutor José António dos Santos Pereira Matos, Investigador Auxiliar do Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação, l.P. Doutor Albano Gonçalo Beja-Pereira, Investigador do Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, na qualidade de especialista Doutora Maria Cecília Torres Penedo, Associate Director of Veterinary Genetics Laboratory of University of California, Estados Unidos da América. Doutoramento em Engenharia Zootécnica Lisboa 2009.

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(3) Universidade Técnica de Lisboa Instituto Superior de Agronomia. Influência das raças bovinas Ibéricas na estrutura genética das populações de bovinos Crioulos da América Latina. Catarina Jorge Ginja Tese apresentada neste Instituto para a obtenção do grau de Doutor. Orientador: Doutor Luís Lavadinho Telo da Gama Co-orientador: Doutora Maria Cecília Torres Penedo. Júri: Presidente: Reitor da Universidade Técnica de Lisboa Vogais: Doutora Maria Teresa Rangel de Figueiredo, Professora Catedrática da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Doutor João Pedro Bengala Freire, Professor Catedrático do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa Doutor Luís Lavadinho Telo da Gama, Professor Catedrático Convidado da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa Doutor José António dos Santos Pereira Matos, Investigador Auxiliar do Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação, l.P. Doutor Albano Gonçalo Beja-Pereira, Investigador do Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, na qualidade de especialista Doutora Maria Cecília Torres Penedo, Associate Director of Veterinary Genetics Laboratory of University of California, Estados Unidos da América. Doutoramento em Engenharia Zootécnica Lisboa 2009.

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(5) O presente trabalho foi realizado na Estação Zootécnica Nacional, em Vale de Santarém, e no Laboratório de Genética Veterinária da Universidade da Califórnia, em Davis, tendo sido financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia através de uma bolsa de doutoramento (SFRH/BD/13502/2003). Complementarmente obteve, também, financiamento da Direcção Geral de Veterinária, da Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais e do Laboratório de Genética Veterinária da Universidade da Califórnia..

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(7) De início, o fim não é visível. Heródoto.

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(9) À minha avó materna.

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(11) AGRADECIMENTOS No final deste percurso de cinco anos de investigação houve espaço para motivação, desânimo, alegrias e infelicidades. Foram muitos os que de alguma forma contribuíram para a concretização deste estudo e por isso lhes quero deixar aqui o meu mais profundo agradecimento. Ao Professor Doutor Luís Lavadinho Telo da Gama, Director do Departamento de Genética e Melhoramento Animal da Estação Zootécnica Nacional, pelo desafio que me colocou, pela confiança que sempre depositou em mim, pela orientação, revisão e correcção do trabalho. À Fundação para a Ciência e a Tecnologia por ter providenciado a ajuda financeira necessária ao desenvolvimento deste trabalho no âmbito da bolsa de Doutoramento que me foi atribuída. Ao Professor Doutor João Manuel Ramalho Ribeiro, Director da Estação Zootécnica Nacional, por ter disponibilizado as instalações necessárias à realização deste trabalho, nomeadamente para o estabelecimento de um Banco de DNA das raças bovinas autóctones de Portugal. Aos meus colegas do Departamento de Genética e Melhoramento Animal da Estação Zootécnica Nacional, Dr. Nuno Carolino, Engenheira Inês Carolino, Engenheira Fátima Santos Silva, Dr. Conceição Oliveira e Sousa, e Dr. Rosário Marques pelo apoio que me deram, à D. Elisa pela prontidão com que sempre tratou dos assuntos burocráticos, à D. Esperança que é uma excelente técnica e companheira de laboratório, à D. Isabelina pelos “doces” com que me presenteou. Ao Dr. Mário Costa e à Dr. Filomena Afonso, da Direcção de Serviços de Produção e Melhoramento Animal da Direcção Geral de Veterinária, e à Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais pelo apoio financeiro fornecido para a implementação do Banco de DNA das raças bovinas autóctones de Portugal. Às Associações de Produtores de bovinos que apoiaram o extenuante mas, também, gratificante processo de recolha de amostras, e em particular ao Engenheiro Pedro Espadinha, ao Engenheiro Carlos Bigares, ao Engenheiro Cirnes, ao Engenheiro Manuel Machado, ao Dr. José Vieira Leite, ao Engenheiro Rui Dantas, ao Dr. Vasco Almeida, ao Dr. Joaquim Grave, ao Engenheiro Samuel Pinto, ao Dr. Carlos Bettencourt, Engenheiro Jaime Bento, ao Engenheiro Vaz, ao Professor Doutor Virgílio Alves, ao Engenheiro José Pais, ao Engenheiro Nuno Henriques, ao Engenheiro Humberto Machado, ao Engenheiro Fernando Sousa, ao Dr. Canas Simões, à Engenheira Filomena Ferreira, à Engenheira Ana Luísa Pavão. Ao Dr. Manuel Abreu do Matadouro Regional do Alto Alentejo, em Sousel, bem como à Dr. Cristina do Matadouro Regional do Ribatejo Norte, em Santarém, pela ajuda na recolha de amostras de animais da raça Brava de Lide. Ao meu primo Dr. Mário Ginja pela ajuda imprescindível na recolha de amostras e pela boa disposição durante longas horas de trabalho de campo. À Rede Iberoamericana para a Conservação da Biodiversidade de Animais Domésticos Locais e para o Desenvolvimento Rural Sustentável (Rede CYTED XII-H), nomeadamente ao coordenador Dr. Juan Vicente Delgado, à Dr. Amparo Martínez e ao Dr. José Luís Vega Pla pelo incentivo,. xi.

(12) Agradecimentos pelo interesse neste projecto, pelo carinho com que me acolheram em Córdova, e por toda a colaboração na realização deste estudo. Um agradecimento muito especial aos Colegas da América Latina que contribuíram com amostras de bovinos Crioulos e cuja ajuda foi fundamental para a elaboração deste trabalho de investigação, nomeadamente à Dr. Lilia Melluci (Argentina), à Engenheira Maria Antónia Revidatti (Argentina), ao Dr. Jorge Quiróz (México), e ao Dr. Roberto Martínez López (Paraguay). À Dr. Amparo Martínez pelo envio de amostras das raças de Espanha e ao Dr. Vincenzo Landi pela ajuda na revisão dos genótipos de microssatélites nestas raças. Aos colegas e amigos do Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação, Dr. José Matos, Dr. Fernanda Simões e Dr. Elisabete Pires pela motivação que sempre demonstram, apesar de todas as dificuldades inerentes à realização de trabalhos de investigação em Portugal, pelo exemplo que constituem. Ao Professor Doutor Raul Bruno de Sousa do Instituto Superior de Agronomia pela sua disponibilidade e apoio. Às minhas amigas Íris e Carolina pelo apoio emocional, pelos sorrisos, pela sua integridade, enfim pela amizade que retribuo com gratidão. À minha amiga Elisabete pelo companheirismo, por rever cuidadosamente os artigos científicos inerentes a este estudo e o texto final desta tese, pela persistência, o meu mais sincero obrigada. Aos meus amigos Zélia Carvalhais e ao Francisco Vasconcelos, que são a minha família adoptiva, pelo abrigo carinhoso que sempre me deram. Ao Sr. Joaquim, à D. Isabel, ao Armando e à Paula, pela ajuda nas três mudanças de casa, pelo carinho com que me recebem, por todo o apoio moral, financeiro e pessoal. Ao meu irmão porque apesar de resmungar disponibiliza-se sempre para ajudar e porque me transmitiu o gosto pelos animais e pela natureza. A ele e à Ana Pinto um agradecimento especial por cuidarem dos meus gatos durante a minha já longa ausência. Aos meus pais por tudo o que me ensinaram! À minha mãe pela força e coragem com que enfrenta a vida, pelos “mimos” que encurtaram a distância entre Portugal e a Califórnia, pelas longas horas de desabafos, e acima de tudo pelo amor incondicional. Ao meu pai, pela determinação, pelo rigor, pelo gosto pela Cultura, ele que é o responsável pelos livros que fui lendo com imenso prazer ao longo destes últimos três anos na Califórnia e que me ajudaram a manter o contacto com a Língua Portuguesa, alargaram os meus horizontes, e reforçaram a minha vontade de conhecer o Mundo. Ao Joaquim por estar sempre ao meu lado, mesmo quando este percurso pareceu demasiado longo, pelo apoio incondicional, pelo companheirismo e algo mais que é difícil descrever por palavras. Aos meus gatos porque foram “abandonados” por mim sem perceberem porquê!. xii.

(13) ACKNOWLEDGMENTS I thank Dr. Niels Pedersen, Director of the Veterinary Genetics Laboratory at the University of California, in Davis, for giving me the opportunity to visit and work in this laboratory. The technical and financial support obtained from the Veterinary Genetics Laboratory was essential to accomplish this study. I thank Dr. Cecília Penedo for the strong support she always gave me during the time spent in the Veterinary Genetics Laboratory, for her guidance and mentorship, for carefully revising the scientific manuscripts, and for her friendship throughout the years. I am grateful for the support provided by all members of the Veterinary Genetics Laboratory, particularly by my colleagues Angel Del Valle, Thea Ward, Stephanie Bricker and Leah Brault for their help in the laboratory. I also thank the Service Unit of the Veterinary Genetics Laboratory for their technical support, namely Larry Gordon, Glen Byrns, Mona Christiansen and Julia Malvick. I thank Ben Sacks, Sarah Brown and Mark Statham for useful discussions and comments regarding my research. I wish to leave a special thank to Angel Del Valle for his friendship, encouragement, and interesting discussions during our funny lunch times. I thank Beth, Dennis and Olivia Greenwood for being such a nice family and providing a pleasant environment during my stay at their house. I am also grateful to Robert Murphey for his friendship, for interesting trips around California, for preparing pleasant dinners and the best Caipirinhas which were a relief after long working hours. A special thank to my friends in Davis, whom contributed to make my stay really pleasant and funny, namely my housemate Helena, Diego, Joana, Donatella, Maria, Rosa and Mario, Aura and Pepe, Michael, Marina, Giuseppe, Sandra and Jeff, Jerome, Mari Paz, Marco, Daniel, and many other members of this “rich” international community!. xiii.

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(15) RESUMO A diversidade, estrutura genética e as origens dos bovinos Iberoamericanos foram investigadas através de polimorfismos de DNA mitocondrial, cromossoma Y e microssatélites. Os bovinos Ibéricos apresentaram elevada diversidade e estrutura genética e alguma influência de raças exóticas. A contribuição de bovinos Africanos para as raças Ibéricas foi inferida pelos haplotipos maternos T1a e pelo alelo paterno INRA189-90. As linhagens Y1 Ibéricas podem reflectir influência de auroques. A proximidade genética entre raças Crioulas e Ibéricas reflectiu-se na partilha de haplotipos maternos e paternos. A linhagem materna Europeia foi a mais comum entre Crioulos, seguida das linhagens Africanas T1a e AA. O Caracú apresentou uma linhagem paterna distinta que sugere a introdução directa de bovinos Africanos. A variação genética está estruturada geograficamente, com 62% da variação genética paterna explicada pelas diferenças entre raças, enquanto as diferenças entre indivíduos justificaram >88% da variação materna e de microssatélites. As análises Bayesianas demonstraram que os Crioulos retêm sinais da influência Ibérica, principalmente o Argentino e Caracú, mas apresentam heterogeneidade devida a cruzamentos com zebu e Hereford. As raças Palmera, Mirandesa e Caracú foram as que mais influenciaram a diversidade genética global. Estudos que incluam raças Africanas podem ajudar a elucidar sobre as origens dos Crioulos.. Palavras-chave: bovinos Crioulos; raças autóctones Ibéricas; marcadores moleculares; caracterização genética; conservação. xv.

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(17) INFLUENCE OF IBERIAN CATTLE BREEDS ON THE GENETIC STRUCTURE OF EXTANT CREOLE CATTLE POPULATIONS OF LATIN AMERICA ABSTRACT The genetic diversity, structure and origins of Iberian and Creole cattle from the Americas were investigated with mitochondrial, Y chromosome, and microsatellite polymorphisms. Iberian cattle showed high genetic diversity and breed structuring, although influence of imported breeds was also detected. Influence of African cattle in Iberia was inferred from the presence of T1a matrilines and INRA189-104 Y-allele. Iberian Y1 patrilines could reflect ancient influence of aurochs. Among Creole matrilines, the European T3 was prevalent, followed by the African T1a and AA lineages. Genetic proximity among Creoles and Iberian breeds was reflected through their sharing of mtDNA and Y chromosome haplotypes. Caracú had a distinct patriline, which suggested direct introduction of cattle from Africa. Genetic variation was geographically structured, with breed differences explaining 62% of patriline variation, whereas individual differences accounted for >88% of mtDNA and microsatellite variation. Bayesian clustering showed that Creoles retain signatures of Iberian ancestry, mainly Argentinean and Caracú, and disclosed genetic heterogeneity from admixture with zebu and Hereford. The breeds Palmera, Mirandesa and Caracú were genetically distinct and had the highest contribution to overall genetic diversity. Additional studies of African breeds can further elucidate the origins of Creoles and help identifying the source of the African lineages.. Keywords: Creole cattle; Iberian native breeds; molecular markers; genetic characterization; conservation. xvii.

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(19) Índice. Índice AGRADECIMENTOS _________________________________________________________________________ XI ACKNOWLEDGMENTS _____________________________________________________________________ XIII RESUMO ________________________________________________________________________________ XV ABSTRACT ______________________________________________________________________________ XVII CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO GERAL _____________________________________________________________ 3 1.1. ORIGENS E DOMESTICAÇÃO DOS BOVINOS ________________________________________________________ 3 1.2. OS BOVINOS DO VELHO E DO NOVO MUNDO _____________________________________________________ 7 1.3. MARCADORES GENÉTICOS E O ESTUDO DAS ORIGENS, DA DIVERSIDADE E DA ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES _____ 13 1.3.1. Microssatélites autossómicos _______________________________________________________ 15 1.3.2. DNA mitocondrial _________________________________________________________________ 17 1.3.3. Cromossoma Y ___________________________________________________________________ 19 1.4. OBJECTIVOS ___________________________________________________________________________ 21 CAPÍTULO 2. Y CHROMOSOME HAPLOTYPE ANALYSIS IN PORTUGUESE CATTLE BREEDS USING SNPS AND STRS _____________________________________________________________________________________ 27 2.1. INTRODUCTION _________________________________________________________________________ 29 2.2. MATERIAL AND METHODS _________________________________________________________________ 30 2.2.1. Sampling and DNA extraction _______________________________________________________ 30 2.2.2. Sequencing and SNP detection through Pyrosequencing _________________________________ 31 2.2.3. Microsatellite genotyping __________________________________________________________ 34 2.2.4. Statistical Analysis ________________________________________________________________ 34 2.3. RESULTS _____________________________________________________________________________ 35 2.3.1. Genetic diversity _________________________________________________________________ 36 2.3.2. Differentiation and AMOVA _________________________________________________________ 39 2.3.3. Phylogenetic Analysis ______________________________________________________________ 41 2.4. DISCUSSION ___________________________________________________________________________ 43 2.5. FUTURE PERSPECTIVES ____________________________________________________________________ 46 CAPÍTULO 3. ORIGINS AND GENETIC DIVERSITY OF NEW WORLD CREOLE CATTLE: INFERENCES FROM MITOCHONDRIAL AND Y CHROMOSOME POLYMORPHISMS _______________________________________ 49 3.1. INTRODUCTION _________________________________________________________________________ 51 3.2. MATERIALS AND METHODS _________________________________________________________________ 53 3.2.1. Sample collection and DNA extraction ________________________________________________ 53 3.2.2. PCR amplification and mtDNA sequencing _____________________________________________ 53 3.2.3. Statistical Analysis of mtDNA data ___________________________________________________ 54 3.2.4. Analysis of Y chromosome SNPs and STRs _____________________________________________ 55 3.3. RESULTS _____________________________________________________________________________ 55 3.3.1. mtDNA haplotype diversity _________________________________________________________ 55 3.3.2. mtDNA differentiation and AMOVA __________________________________________________ 56 3.3.3. mtDNA phylogenetics _____________________________________________________________ 58 3.3.4. Y chromosome diversity ___________________________________________________________ 62 3.3.5. Y chromosome differentiation and AMOVA ____________________________________________ 64 3.3.6. Y chromosome phylogenetics _______________________________________________________ 66 3.4. DISCUSSION ___________________________________________________________________________ 70. xix.

(20) CAPÍTULO 4. ANALYSIS OF STR MARKERS REVEALS HIGH GENETIC STRUCTURE IN PORTUGUESE NATIVE CATTLE ___________________________________________________________________________________ 75 4.1. INTRODUCTION _________________________________________________________________________ 77 4.2. MATERIAL AND METHODS _________________________________________________________________ 79 4.2.1. Sampling and DNA extraction _______________________________________________________ 79 4.2.2. STR genotyping ___________________________________________________________________ 79 4.2.3. Statistical Analysis ________________________________________________________________ 80 4.3. RESULTS _____________________________________________________________________________ 81 4.3.1. Molecular markers ________________________________________________________________ 81 4.3.2. Within-breed genetic diversity ______________________________________________________ 82 4.3.3. Genetic relationship between breeds _________________________________________________ 83 4.3.4. Genetic structure and admixture analysis _____________________________________________ 86 4.4. DISCUSSION ___________________________________________________________________________ 89 CAPÍTULO 5. GENETIC DIVERSITY AND STRUCTURE OF CREOLE CATTLE BASED ON STRS: A CONSERVATION PERSPECTIVE ______________________________________________________________________________ 95 5.1. INTRODUCTION _________________________________________________________________________ 97 5.2. MATERIAL AND METHODS _________________________________________________________________ 99 5.2.1. Sampling and DNA extraction _______________________________________________________ 99 5.2.2. STR genotyping __________________________________________________________________ 100 5.2.3. Statistical analysis _______________________________________________________________ 101 5.3. RESULTS ____________________________________________________________________________ 102 5.3.1. Molecular markers _______________________________________________________________ 102 5.3.2. Genetic diversity ________________________________________________________________ 103 5.3.3. Genetic relationships among Old and New World cattle _________________________________ 105 5.3.4. Genetic structure and admixture in Creoles ___________________________________________ 108 5.3.5. Conservation perspective _________________________________________________________ 112 5.4. DISCUSSION __________________________________________________________________________ 114 CAPÍTULO 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS __________________________________ 121 6.1. CONSIDERAÇÕES FINAIS __________________________________________________________________ 121 6.2. PERSPECTIVAS FUTURAS __________________________________________________________________ 125 DIVULGAÇÃO DO CONHECIMENTO ___________________________________________________________ 129 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ______________________________________________________________ 133 ANEXOS _________________________________________________________________________________ 149 ANEXO I. FIGURAS E TABELAS SUPLEMENTARES AO CAPÍTULO 2___________________________________________ 149 ANEXO II. FIGURAS E TABELAS SUPLEMENTARES AO CAPÍTULO 3 __________________________________________ 155 ANEXO III. FIGURAS E TABELAS SUPLEMENTARES AO CAPÍTULO 4__________________________________________ 219 ANEXO IV. FIGURAS E TABELAS SUPLEMENTARES AO CAPÍTULO 5 _________________________________________ 227.

(21) Capítulo 1. INTRODUÇÃO GERAL.

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(23) CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO GERAL. 1.1. Origens e domesticação dos bovinos Investigações recentes têm demonstrado que a domesticação animal foi um processo gradual extremamente complexo e que não está ainda completamente esclarecido (Zeder 2008). A domesticação dos bovinos remonta à data da revolução agrícola do Neolítico e ocorreu há aproximadamente 8.000-10.000 anos atrás, primariamente na região do Crescente Fértil (Geigl 2008). A combinação de informação arqueológica e molecular constitui a base de uma nova disciplina, a arqueogenética (Renfrew 2001), que tem contribuído para um melhor entendimento sobre as origens das várias espécies de animais domésticos e sobre a sua dispersão pelo globo, em paralelo com as diversas comunidades humanas (Zeder et al 2006). O DNA ancestral (aDNA) permite estudar a constituição genética de bovinos selvagens e, também, dos pré-domésticos, para investigar as origens evolutivas das raças domésticas modernas (Zeder et al. 2006). No entanto, existem limitações associadas à qualidade do aDNA que se consegue obter a partir de material biológico antigo e à dificuldade em replicar os resultados, e que estão intimamente ligadas às condições de humidade e temperatura dos locais onde estas amostras são recolhidas (Cooper & Poinar 2000; Geigl 2008). O auroque (Bos primigenius) é considerado o ancestral selvagem dos bovinos domésticos. cujo. último. exemplar. desapareceu. na. Polónia. em. 1627. (http:. www.iucnredlist.org; Felius 1985). Estes animais encontravam-se dispersos por uma vasta área do globo, que abrangia as Ilhas Britânicas, uma grande parte do território Europeu, o norte de África, o Médio Oriente, a Ásia Central e a Índia, e deram origem à maioria das populações de bovinos domésticos hoje existentes na Europa continental (Troy et al. 2001; Geigl 2008). A dispersão das populações de bovinos domésticos a partir do Médio Oriente parece ter seguido duas rotas principais: Danúbio e Mediterrâneo (Cymbron et al. 2005). Os bovinos da região do Mediterrâneo e da Península Ibérica têm origem em animais que se dispersaram a partir do Médio Oriente através de uma via continental, mas também em animais introduzidos por mar, nomeadamente a partir do Norte de África (Zilhão 2001; BejaPereira et al. 2006; Pellecchia et al. 2007), pelo que a contribuição do auroque para a 3.

(24) Capítulo1 – Introdução geral composição genética de raças bovinas modernas é hoje amplamente discutida (Beja-Pereira et al. 2006). Informação obtida a partir de aDNA da Europa do Norte e Central parece indicar que os bovinos domésticos dessas regiões constituem uma reminiscência dos seus ancestrais selvagens, e representam apenas uma pequena parte da variabilidade genética inicialmente existente nos auroques, mas também que a hibridação entre fêmeas selvagens e touros já domesticados foi um acontecimento raro (Edwards et al. 2007b; Geigl 2008). Por outro lado, a análise de marcadores moleculares específicos do cromossoma Y sugeriu a contribuição de touros selvagens para as populações bovinas actualmente existentes na Europa (Gotherstrom et al. 2005). O estudo de amostras de aDNA provenientes do Sul da Europa confirmou a presença de material genético de fêmeas auroques em bovinos domésticos modernos, o que parece indicar que, pelo menos em alguns locais, existiram processos de hibridação entre populações de animais selvagens e domésticos, mas também que no Norte e no Sul da Europa havia formas distintas de criação de animais domésticos (Anderung et al. 2005; Beja-Pereira et al. 2006; Achilli et al. 2008). As raças taurinas Africanas têm origem num processo de domesticação independente, a partir do B. p. opisthonomous e que terá ocorrido há 9.000 anos atrás na região Nordeste do continente Africano (Wendorf & Schild 1994; Bradley et al. 1996; Hanotte et al. 2002). Os primeiros bovinos Africanos terão sido B. taurus existentes no deserto do Sahara e na Abissínia, tendo-se expandido ate à costa Oeste, e também para Sul (Hanotte et al. 2000; Hanotte et al. 2002). A maioria das raças autóctones taurinas Africanas sofreu introgressão com gado zebu, excepto os bovinos da costa Oeste do continente (e.g. raças N’Dama e Baoulé), pois são resistentes à tripanossomíase, cuja incidência é elevada nestas regiões, o que lhes confere uma vantagem grande em termos de adaptação (Bradley et al. 1994; Hanotte et al. 2000). Os bovinos com bossa denominados zebu (B. indicus) foram domesticados há cerca de 7.000-8.000 anos no vale do Indo, na região do actual Paquistão, a partir da subespécie B. p. nomadicus (Loftus et al. 1994). Análises moleculares demonstraram uma enorme divergência genética entre B. taurus e B. indicus, e que as duas (sub)espécies divergiram há mais de 200.000 anos, o que é consistente com a ocorrência de processos independentes de domesticação (Loftus et al. 1994). O gado zebu terá surgido inicialmente na Índia e só mais tarde foi introduzido em África (Bradley et al. 1996). Um estudo exaustivo de várias 4.

(25) Capítulo1 – Introdução geral populações de bovinos Africanos demonstrou que a influência de zebu se concentra na costa Este de África, e resulta maioritariamente da introdução de animais por via marítima, através de rotas comerciais pelo Oceano Índico (Hanotte et al. 2002; Zeder et al. 2006). Foi sugerida a ocorrência de um quarto processo de domesticação independente de bovinos na região Nordeste da Ásia (Mannen et al. 2004), mas este não foi comprovado, podendo estar apenas relacionado com a hibridação entre auroques da Eurásia e bovinos domésticos locais com origem no Médio Oriente (FAO 2007). A área de dispersão dos auroques era tão vasta que não é improvável terem ocorrido processos de domesticação em diversos locais e em épocas distintas (Diamond 2002). Ao longo dos tempos os animais domésticos foram sendo moldados pelas mais diversas civilizações humanas, que os seleccionaram em função das suas conveniências de tal forma que, juntamente com a deriva genética e a adaptação a ambientes específicos, foram originadas as inúmeras populações que hoje existem. As raças de animais domésticos constituem grupos de animais com características distintas, seleccionadas pelo Homem, e que são herdadas entre gerações (Clutton-Brock 1999). A importância dos bovinos enquanto animais domésticos é inegável, tendo o processo de domesticação e subsequente fragmentação e selecção originado um número considerável de raças (> 800), que representam aproximadamente 22 % das raças de mamíferos do Mundo (FAO 2007). No entanto, e de acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO), estes recursos genéticos estão ameaçados, e estima-se que nos últimos seis anos se perderam 62 raças domésticas, à escala de uma por mês, e que aproximadamente 20 % das raças documentadas estão em risco de extinção (FAO 2007). Acresce ainda o facto de, para muitas das raças, não existir informação detalhada sobre os efectivos ou a sua diversidade genética. As inúmeras raças locais, que são o resultado de vários anos de evolução, têm vindo a ser gradualmente substituídas por um número reduzido de raças comerciais altamente produtivas. Globalmente, existem dois grupos de raças que se distribuíram a nível Mundial: as de origem Europeia e as do Sul da Ásia (FAO 2007). No primeiro grupo, a raça mais difundida foi a Holstein-Friesian, mas também raças como a Jersey e a Charolesa. No segundo grupo incluem-se as raças Brahman e Gir, tendo a primeira sido desenvolvida nos 5.

(26) Capítulo1 – Introdução geral Estados Unidos da América (E.U.A.), a partir de animais importados da Índia. O cruzamento indiscriminado de bovinos comerciais com raças locais, com o objectivo de maximizar a produção, tem provocado a erosão e consequente desintegração das raças autóctones. Por outro lado, as raças comerciais tendem a ter níveis de consanguinidade elevados e têm um tamanho efectivo reduzido (< 50), apesar do número total de animais ser elevado, pelo que a sua diversidade genética está também ameaçada (Taberlet et al. 2008). A manutenção da diversidade genética inerente às raças domésticas é essencial para poder continuar a seleccionar animais em função das necessidades da população humana, assegurando a exploração sustentada e a longo prazo destes recursos. A preservação das raças de animais domésticos é, também, importante pelo valor histórico e sociocultural que lhes está associado. É unânime a necessidade de caracterizar os recursos genéticos de animais domésticos (AnGr), para poder implementar medidas de conservação adequadas, e identificar as raças prioritárias a preservar (FAO 2007). É fundamental analisar a estrutura demográfica destas populações e estimar parâmetros demográficos, tais como o tamanho efectivo da população, a contribuição genética de animais fundadores e ascendentes, e a evolução da consanguinidade, para poder implementar programas de conservação e melhoramento (Carolino & Gama 2008). As técnicas moleculares constituem um instrumento essencial para a caracterização da diversidade genética destas raças, para estudar as suas origens, para esclarecer as possíveis relações evolutivas entre populações de animais domésticos, e também para auxiliar na definição de medidas de conservação (Bruford et al. 2003). O desafio que se coloca em termos da preservação dos AnGr é enorme, pois implica considerar vários factores, como sejam as peculiaridades de cada raça, a sua contribuição para a diversidade genética global, o seu valor cultural e económico (nomeadamente em regiões marginais), estando no entanto condicionada pela disponibilidade de recursos financeiros e implicando o envolvimento de autoridades internacionais e locais.. 6.

(27) Capítulo1 – Introdução geral. 1.2. Os bovinos do Velho e do Novo Mundo Os bovinos foram introduzidos no continente Americano pelos colonizadores Europeus após a primeira viagem de Cristóvão Colombo, em 1492, ao serviço do reino de Castela (Espanha). Os primeiros animais foram transportados apenas na segunda expedição de Colombo, no ano de 1493, que se destinava à colonização do território que se julgava ser o das Índias (Primo 2004). Durante as primeiras duas décadas o número de animais transportado para o Novo Mundo foi pequeno e concentrou-se nas ilhas das actuais Caraíbas (Rouse 1977). A informação sobre o tipo e o aspecto dos animais transportados desde a Península Ibérica para as Américas é escassa, e supõe-se que os bovinos existentes em Espanha e Portugal na época dos Descobrimentos eram idênticos (Rouse 1977). Bishko (1952) refere que na época Medieval os bovinos domésticos da Península Ibérica se encontravam nas zonas húmidas do Norte, desde a região centro de Portugal, atravessando a Galiza em direcção à Cantábria e ao vale dos Pirenéus, até a Catalunha. Estes animais eram criados em efectivos pequenos, para trabalho e produção de carne e leite, e pertenciam às raças autóctones Ibéricas que persistiram nestas regiões até aos dias de hoje: Galega/Minhota, Barrosã, Arouquesa, Mirandesa, Asturiana e Pirenaica (Bishko 1952). Nas regiões mais áridas do Sul da Península Ibérica e à medida que a conquista do território aos Mouros foi avançando, estabeleceu-se a exploração de bovinos em regime de pastoreio extensivo, sendo os animais extremamente heterogéneos, de pelagem castanha escura, vermelha ou preta, supostamente resultantes de cruzamentos entre as raças das zonas húmidas e de bovinos “selvagens” da Península Ibérica (Bishko 1952). Estes animais eram famosos pela sua corpulência e bravura, eram mantidos num estado semi-selvagem, e deram origem ao denominado gado bravo (Bishko 1952; Cortes et al. 2008). Existem, também, registos da introdução de bovinos provenientes do Norte de África durante a ocupação Árabe, provavelmente ancestrais das raças que hoje existem em Marrocos, e que eram substancialmente diferentes do gado Ibérico (Bishko 1952; Rouse 1977). Se por um lado os bovinos do Sul da Ibéria constituíram a principal fonte de animais introduzidos no Novo Mundo, por outro também há registos de bovinos transportados desde o Norte de Portugal e da Galiza (Primo 1992; Rodero et al. 1992).. 7.

(28) Capítulo1 – Introdução geral Os colonizadores Espanhóis introduziram animais maioritariamente nas Grandes Antilhas e destas ilhas para o continente (Figura 1.1), à medida que foram avançando desde Española (República Dominicana) para Porto Rico, Jamaica e Cuba (Rouse 1977). O porto de Sevilha foi o ponto de partida da maior parte das expedições Espanholas, sendo frequente efectuar paragem nas Ilhas Canárias para abastecimento (Rodero et al. 1992). Os primeiros bovinos foram transportados desde as Antilhas para o continente Americano, para a região do Istmo do Panamá (1510-15), para o território denominado de Nova Espanha (1521) que corresponde ao actual México, para a Colômbia (1525), e para a Venezuela (1527) (Rouse 1977; Primo 2004). Os Portugueses transportaram animais para o Brasil após a sua descoberta, em 1500, por Pedro Álvares Cabral (Primo 2004). Os primeiros bovinos chegaram ao Brasil, juntamente com outros animais domésticos, apenas em 1533, na expedição de Martín Afonso de Sousa que resultou na fundação da primeira Capitania Portuguesa na ilha de São Vicente (Primo 2004). No final do século XVI havia já uma grande abundância de bovinos na região do litoral Brasileiro e em todas as Capitanias Portuguesas (Primo 2004). De forma análoga à dos conquistadores Espanhóis, os Portugueses partiam maioritariamente do Sul de Portugal, do Cabo de São Vicente no Algarve, e efectuavam paragens para abastecimento nas Ilhas Atlânticas sob o seu domínio, nomeadamente na Madeira e em Cabo Verde (Figura 1.1.) (Primo 1992; Rodero et al. 1992; Primo 2004). Os Portugueses governaram o Brasil até à altura da independência do país em 1822. A dispersão dos bovinos de origem Ibérica acompanhou o processo de colonização à medida que os conquistadores foram avançando pelo continente Americano. Estes bovinos constituíram o denominado gado Crioulo, que se adaptou aos mais diversos ambientes: aos climas semi-árido (México), sub-húmido (Colômbia, Venezuela, e região centro do Brasil) e húmido dos trópicos (América central, Caraíbas e Brasil); às regiões de montanha (Andes, América Central e México); e às zonas áridas (Patagonia, Nordeste Argentino, deserto de Atacama, Nordeste Brasileiro) (Rodero et al. 1992; FAO/UNEP 2000).. 8.

(29) Capítulo1 – Introdução geral. Figura 1.1. Ilustração das principais rotas de colonização das Américas por Espanhóis (linha a cheio) e Portugueses (linha picotada) na época dos Descobrimentos (séculos XV a XVII).. Do pequeno grupo de animais inicialmente introduzido (< 1.000) constituíram-se diversos tipos de bovinos Crioulos, que se diferenciaram entre si, e que têm uma variabilidade fenotípica enorme (Rouse 1977). No entanto, as semelhanças entre estes animais e os bovinos da Península Ibérica são ainda hoje notórias (Figura 1.2), e a excelente adaptação dos bovinos domésticos do Velho ao Novo Mundo representa uma faceta de sucesso do processo de colonização.. 9.

(30) Capítulo1 – Introdução geral. Figura 1.2. Bovinos Ibéricos das raças Preta (canto inferior esquerdo) e Mertolenga (canto inferior direito) e bovinos Crioulos da Argentina.. A partir de meados do século XIX os bovinos Crioulos sofreram a influência de raças comerciais Europeias (Shorthorn, Hereford e Angus) e, também, de bovinos zebu importados da Índia (Rouse 1977). As raças com aptidão para a produção de leite, tais como as Jersey, Ayrshire e Holandesa (hoje denominada Holstein-Friesian) também foram introduzidas, mas tiveram menor impacto na diluição genética dos Crioulos (Rouse 1977). Os bovinos zebu, oriundos da Índia, foram transportados inicialmente para o Brasil (1870) e eram, maioritariamente, machos (. 7.000) que foram utilizados em cruzamentos com. fêmeas Crioulas (Meirelles et al. 1999). As raças Nellore e Gir são as mais comuns na América do Sul, enquanto na América do Norte predomina a raça Brahman, oriunda dos E.U.A. (Meirelles et al. 1999).. No Brasil foi desenvolvido (1910-30) o zebu Indo-Brasileiro a partir das raças Gir, Guzerat e Nellore, que se difundiu amplamente, chegando mesmo a ser importado para os E.U.A. 10.

(31) Capítulo1 – Introdução geral (1946) e a contribuir para os bovinos da raça Brahman (Felius 1985). As Américas do Norte, Centro e Sul acomodam aproximadamente 40 % da população mundial de bovinos, sendo que a América Latina, por si só, contabiliza 28 % e o Brasil é o país com o maior efectivo bovino comercial do mundo (FAO 2007). Estes bovinos correspondem a raças do tipo Europeu, Zebu, ou a cruzamentos, enquanto os Crioulos persistiram apenas em regiões localizadas e em núcleos semi-isolados (Rouse 1977; Giovambattista et al. 2001). Na América do Norte, o gado de origem Ibérica foi introduzido na região da Flórida (1565) a partir de animais transportados desde as Antilhas e, também, no Novo México (1598), Texas (1717) e na Califórnia (1769) a partir de animais provenientes do México (Rouse 1977; Sponenberg & Olson 1992). Estes bovinos deram origem às raças Florida Cracker e Texas Longhorn, respectivamente, sendo que estas sofreram a diluição por cruzamento com raças da Europa do Norte desde o final do século XIX e estão actualmente ameaçadas (Sponenberg & Olson 1992). O México constitui um dos primeiros pontos de entrada de bovinos Ibéricos no continente Americano, transportados desde as Antilhas por Villalobos, em 1521, para o local de Tampico (Rouse 1977). A primeira região a ser abastecida com gado foi a dos vales e das planícies a sul da cidade do México e, à posteriori, os planaltos do Norte (Rouse 1977). No final do século XVIII, a região de Guadalajara desempenhava um papel importante no comércio de gado bovino (Quiroz 2007). Os bovinos Crioulos adaptaram-se às diversas condições ambientais, mas não se diferenciaram substancialmente (Rouse 1977). No final do século XIX foram importados os primeiros zebus provenientes dos E.U.A. e do Brasil, e que praticamente substituíram as populações de bovinos Crioulos das regiões costeiras do país (Rouse 1977) e, a Norte da cidade do México, as populações de Crioulos sofreram influência das raças Shorthorn, Hereford, Angus e Charolesa. Presentemente, as populações de bovinos Crioulos reconhecidas no México são as seguintes: Baja Califórnia (Chinampo), Chihuahua, Chiapas, Nayarit (Coreño) e Poblano (Mixteco) (Quiroz 2007).. Os bovinos do Paraguai, supostamente, têm origem nas “sete vacas e um touro de Gaete” que foram transportadas (1555) desde São Vicente (Brasil) até Assunção, sem o consentimento da Coroa Portuguesa, por dois Espanhóis (Salazar e Melgrejo) e pelos irmãos 11.

(32) Capítulo1 – Introdução geral Góis (Primo 2004). Há, também, registo da introdução, em 1569, de animais provenientes do Perú. No início do século XVII registou-se um grande progresso agrícola no sul do país, instituído por padres Jesuítas que se dedicavam também à criação de bovinos (Rouse 1977). O gado Crioulo do Paraguai provavelmente sofreu influência de animais vindos do Norte, da Argentina, do Uruguai e, em menor escala, do Brasil. A introdução, já no século XX, de bovinos Hereford e Brahman ameaçou seriamente os Crioulos (Rouse 1977), existindo actualmente no Paraguai quatro populações de bovinos Crioulos: Pampa Chaqueño, Pilcomaio, Neembucú e Arrovense (Blaires 2004). Na Argentina, os bovinos foram introduzidos na região norte (Tucumán) por colonizadores Espanhóis (1549-1557), e eram provenientes do Peru e do Chile (Rouse 1977; Primo 2004). O primeiro registo de bovinos na região das pampas remonta a 1580 e corresponde a animais transportados do Paraguai (Assunção) para Buenos Aires, havendo no final do século XIX grande abundância de gado Crioulo na região de pastagem das pampas Argentinas (Rouse 1977). As raças de origem Britânica introduzidas na Argentina foram a Shorthorn, Hereford e Angus, que eram utilizadas em cruzamentos com bovinos Crioulos. Mais recentemente, foram importados alguns zebus do Brasil, que parecem não ter tido grande influência nos Crioulos (Rouse 1977), à excepção possivelmente na zona de fronteira entre a Argentina e o Brasil. O gado Crioulo persistiu em regiões marginais, existindo presentemente três populações distintas: Chaqueño, Patagónico e Crioulo Argentino (http://dad.fao.org). No Brasil existe uma grande variedade de populações de bovinos denominados autóctones, e há alguma tradição na sua classificação e preservação enquanto raças, considerando-se a existência de sete raças de bovinos Crioulos, das quais cinco estão ameaçadas: Caracú, Curraleiro, Franqueiro, Crioulo Lageano, Crioulo Pantaneiro, Mocho Nacional, Crioulo Mocho Pereira Camargo (http://dad.fao.org). Os Crioulos Caracú, Franqueiro e Curraleiro são considerados descendentes dos bovinos introduzidos pelos Portugueses, enquanto o Lageano e o Pantaneiro têm influência de raças Espanholas (Primo 1992; Egito et al. 2002). Os bovinos zebu tiveram uma forte influência no Brasil e foram mantidos em raças bem definidas e correspondentes às originalmente importadas da Índia, mas também foram 12.

(33) Capítulo1 – Introdução geral desenvolvidos vários tipos de cruzamentos com raças Crioulas e comerciais (Mariante et al. 2003), de tal forma que o zebu e seus cruzamentos representam actualmente mais de 80% do efectivo bovino brasileiro (Mariante et al. 2003). Os bovinos Crioulos do continente Americano constituem resquícios do gado Ibérico transportado para o Novo Mundo e que, ao longo dos anos, se adaptaram a condições ambientais diversificadas e sofreram, em maior ou menor escala, influência de várias raças, nomeadamente das raças de origem Britânica e de zebus importados da Índia em finais do séc. XIX. Os Crioulos são considerados recursos genéticos valiosos e que importa preservar, no entanto a informação inerente à estrutura genética e demográfica destas populações é escassa (FAO 2007). Tanto quanto sabemos, não existe nenhum estudo genético exaustivo das várias populações de bovinos Crioulos, em que se proceda a uma comparação entre estes animais e as raças que contribuíram para o seu pool genético. Um estudo à escala global, incorporando a informação disponibilizada por vários tipos de marcadores moleculares, poderia fornecer informação importante sobre as origens e a evolução do gado Crioulo, contribuindo assim para um melhor conhecimento destes bovinos, que representam um valiosíssimo recurso genético, de importância económica, social, histórica e cultural, em todos os países da América Latina.. 1.3. Marcadores genéticos e o estudo das origens, da diversidade e da estrutura genética de populações As tecnologias moleculares e bioinformáticas estão hoje amplamente desenvolvidas e deram origem às novas disciplinas denominadas “ómicas”. A genómica, proteómica e metabolómica complementam-se e permitem processar, analisar e integrar uma grande quantidade de informação, de forma a obter uma perspectiva global desde a variação genética, às funções metabólicas, e às interacções entre processos biológicos e factores ambientais (FAO 2007). Neste contexto e após a publicação recente do genoma completo dos bovinos (Elsik et al. 2009), abrem-se novas perspectivas para o estudo da biologia e evolução dos animais domésticos. A diversidade genética entre indivíduos é enorme, e resulta de variações ao nível das sequências de DNA e da interacção com o ambiente. Estas alterações, ou mutações, podem 13.

(34) Capítulo1 – Introdução geral ser funcionais e ter consequências a nível fisiológico ou do fenótipo dos indivíduos, quando ocorrem ou interferem com regiões codificantes (exões), ou ser neutras, quando não produzem efeitos ao nível da transmissão da informação genética. As mutações podem resultar da substituição de um único nucleótido (single nucleotide polymorphisms, SNPs), da inserção ou deleção de um ou vários nucleótidos (indel), ou da duplicação ou inversão de fragmentos de DNA. A informação inerente a estas variações pode ser analisada através de marcadores moleculares distintos e que permitem caracterizar a diversidade genética e identificar polimorfismos associados a características funcionais. A genética de populações baseia-se no estudo de processos demográficos e de dinâmica das populações, e da sua relação com a distribuição da variabilidade genética (Sunnucks 2000). Os marcadores moleculares têm sido extremamente úteis para investigar as origens e a evolução dos animais domésticos e, também, para analisar a relação genética entre diferentes raças. É difícil identificar o marcador ideal para estudos de populações de animais domésticos, mas as características gerais podem ser definidas de acordo com o seguinte: ser suficientemente conservado, para poder identificar ancestrais de populações actuais; ser suficientemente variável e estruturado geograficamente, para poder estudar os processos de domesticação; ter uma taxa de mutação relativamente elevada, mas constante ao longo do tempo, para poder datar a ocorrência dos polimorfismos (Bruford et al. 2003). Existem vários tipos de marcadores moleculares, que fornecem informações igualmente distintas sobre a biologia das espécies, pelo que é desejável complementar a informação genética associada aos diferentes marcadores, de forma a fazer inferências mais precisas. Neste estudo utilizaram-se três tipos de marcadores moleculares úteis em análises de genética de populações, nomeadamente: marcadores nucleares autossómicos (microssatélites); variação nas sequências de DNA mitocondrial (mtDNA); e marcadores específicos do cromossoma Y. No texto que se segue descrevem-se as características e o tipo de informação associadas a cada um destes marcadores.. 14.

(35) Capítulo1 – Introdução geral 1.3.1. Microssatélites autossómicos Os microssatélites são sequências de 2-6 nucleótidos repetidas em série (short tandem repeats, STRs) que se encontram distribuídas por todo o genoma eucariota e que são herdados de forma codominante (Schlotterer 2004). Microssatélites autossómicos são STRs que se localizam nos autossomas. Estes marcadores são altamente polimórficos (hipervariáveis), pois durante o processo de transmissão da informação genética o número de repetições em série pode alterar-se por mutação, gerando variabilidade genética. Este processo de mutação foi denominado de DNA slippage e consiste no desalinhamento das cadeias de DNA durante a replicação, com a consequente alteração no número de pares de bases (bp) repetidas em série, sendo a taxa de mutação destes marcadores extremamente elevada (10-6 – 10-2 por geração), apesar de existirem mecanismos de “correcção” (mismatch repair) destas alterações (Schlotterer 2000).. A possibilidade de amplificar STRs através da reacção em cadeia pela Taq polimerase (PCR) e de analisar os fragmentos amplificados em sequenciadores automáticos, que permitem processar um número elevado de marcadores e de amostras, facilitou a sua utilização. Os STRs tornaram-se nos marcadores de escolha em estudos de caracterização da diversidade genética intra e inter-populacional, na identificação de indivíduos/populações cruzados (admixture), e na classificação de indivíduos em grupos populacionais geneticamente próximos (Bruford et al. 2003). Estes marcadores são, também, utilizados em testes de parentesco, estudos de diferenciação genética de populações (F statistics), e estimativas de distâncias genéticas (FAO 2007). O grau de variabilidade genética associada a estes marcadores (vários alelos em cada locus), o facto de serem herdados de forma Mendeliana (para cada locus um indíviduo possui dois alelos, provenientes de cada um dos progenitores), e de ser possível diferenciar indivíduos homozigóticos (duas cópias do mesmo alelo num locus) de heterozigóticos (dois alelos distintos num locus) permite utilizar estes marcadores em análises de discriminação, estrutura genética, grau de relacionamento e classificação ao nível do indivíduo e das populações (Wan et al. 2004). Por outro lado, a variabilidade genética inerente aos STRs resulta essencialmente dos processos de deriva genética e mutação, já que a maioria dos STRs são considerados neutros face à selecção (Charlesworth et al. 1994). 15.

(36) Capítulo1 – Introdução geral No entanto existem, também, desvantagens inerentes ao uso de STRs em análises genéticas e que se descrevem de seguida. A presença de homoplasia, em que as diferenças nos tamanhos dos alelos podem não estar associadas a processos de divergência evolutiva, pois é difícil determinar se dois alelos são idênticos porque foram herdados de um ancestral comum (identical by descent) ou porque ocorreu uma alteração análoga do número de repetições (identical by state) (Zhang & Hewitt 2003; Wan et al. 2004). Este problema pode conduzir a interpretações incorrectas em análises de diferenciação e estrutura genética de populações. A ocorrência de alelos nulos, que pode estar associada a mutações ao nível das zonas de emparelhamento dos oligonucleótidos iniciadores (primers) utilizados na amplificação pela PCR, e que resultam num aumento do número de indivíduos homozigóticos (Chapuis & Estoup 2007). O principal efeito da presença de alelos nulos é a diminuição da variabilidade genética intra-populacional e o aumento artificial do grau de diferenciação entre populações (Chapuis & Estoup 2007). A identificação de desvios à situação de Equilíbrio Hardy-Weinberg poderá assim indiciar a presença de alelos nulos, e não necessariamente resultar de alterações na estrutura genética da população. A falta de neutralidade, ou seja existe evidência de que alguns STRs poderão estar sujeitos a pressões de selecção por se encontrarem associados a regiões codificantes, pelo que a interpretação dos resultados da análise destes loci em estudos de genética de populações pode ser complicada (Zhang & Hewitt 2003; Wan et al. 2004). Neste caso, estes marcadores podem reflectir os resultados da selecção (adaptação) em vez de processos de deriva genética, como é esperado e requisito de muitos programas de análise deste tipo de informação genética. A utilização de STRs polimórficos e de métodos estatísticos apropriados para diagnosticar alguns destes problemas em estudos de diversidade e estrutura genética das populações permite contornar algumas das limitações destes marcadores, mas é necessário ter consciência de que as inferências evolutivas elaboradas com base em dados de microssatélites podem, por vezes, ser ambíguas.. A FAO produziu uma serie de recomendações relativamente à utilização de STRs em estudos de genética de populações de animais domésticos, das quais se destacam o uso de um painel de marcadores recomendado e de amostras standard para ajuste dos tamanhos dos alelos, de forma a possibilitar estudos comparativos futuros (FAO 2004a). Os resultados do balanço realizado pela FAO (2004a) indicam que os STRs foram os marcadores mais 16.

(37) Capítulo1 – Introdução geral utilizados em estudos de caracterização genética de bovinos (88%). Uma breve revisão da literatura confirma a ampla aplicação de STRs no estudo de raças bovinas das mais diversas origens (MacHugh et al. 1997; MacHugh et al. 1998; Loftus et al. 1999; Martin-Burriel et al. 1999; Edwards et al. 2000a; Kantanen et al. 2000; Cañon et al. 2001; Ginja 2002; Hanotte et al. 2002; Kim et al. 2002; Maudet et al. 2002; Beja-Pereira et al. 2003; Jordana et al. 2003; Kumar et al. 2003; Chikhi et al. 2004; Freeman et al. 2004; Mateus et al. 2004a; Mateus et al. 2004b; Moioli et al. 2004; Cymbron et al. 2005; Ciampolini et al. 2006; Econogene 2006; Liron et al. 2006b; Cañon et al. 2008). A importância de uniformizar os resultados de investigações que recorrem à utilização de STRs está relacionada com a necessidade de estabelecer estudos a escalas geográficas amplas, que permitam obter uma perspectiva global sobre a diversidade das espécies domésticas, para implementação de medidas de conservação.. 1.3.2. DNA mitocondrial O DNA mitocondrial (mtDNA) é um pequeno plasmídeo (molécula de DNA circular) que nos bovinos tem aproximadamente 17 Kilobases (Kb), possui 13 genes codificantes, 45 RNAs estruturais, e localiza-se no interior das mitocôndrias (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Existe ainda uma região não codificante, denominada região controlo (control region), que abrange aproximadamente 1 Kb do genoma mitocondrial, e que contém o local de iniciação da replicação e transcrição (displacement loop, D-loop). A primeira sequência completa do genoma mitocondrial de B. taurus foi produzida por Anderson et al. (1982) e é utilizada como referência (número de acesso na base de dados do GenBank V00654) para anotar polimorfismos em sequências de mtDNA de bovinos.. O mtDNA é herdado via materna, tem uma taxa de mutação elevada, que é de aproximadamente 3x10-7 e, portanto, superior à do DNA nuclear cuja taxa de mutação se estima ser de 10-7 – 10-8 por nucleótido e por geração (no entanto o mtDNA apresenta heterogeneidade na taxa de substituição), e não sofre recombinação (troca de material genético entre moléculas de DNA durante o processo de divisão celular), ou seja, em princípio qualquer alteração da sequência de nucleótidos do mtDNA resulta de mutações 17.

(38) Capítulo1 – Introdução geral (Bruford et al. 2003; Tapio & Grigaliunaite 2003; White et al. 2008). Devido ao facto de evoluir rapidamente, o mtDNA é extremamente útil em estudos filogenéticos intraespecíficos e permite detectar processos demográficos relativamente recentes (< 10.000 anos), inerentes à história evolutiva das populações (Bruford et al. 2003; Wan et al. 2004). A definição de haplotipos (combinações de um conjunto de loci ligados ou de polimorfismos que são herdados em simultâneo) para cada indivíduo simplifica a interpretação dos resultados.. Apesar do mtDNA ser considerado o marcador ideal para estudos de domesticação e das origens dos animais domésticos (Bruford et al. 2003), existem limitações inerentes à sua utilização como marcador molecular e que se descrevem em seguida. O mtDNA representa apenas linhas maternas e um único locus, pelo que fornece uma perspectiva simplificada do complexo processo evolutivo que deu origem às diferentes populações animais, subestima a diversidade genética total e possui dinâmicas evolutivas específicas (Bruford et al. 2003; Zhang & Hewitt 2003). A existência de um elevado número de cópias nucleares de sequências de mtDNA (numtDNA) pode confundir a interpretação de resultados (Zhang & Hewitt 2003), pois as cópias nucleares são, geralmente, mais conservadas e, portanto, mais semelhantes ao genoma mitocondrial ancestral do que o mtDNA (Bensasson et al. 2001). Um outro problema é a presença de heteroplasmia, ou seja indivíduos que não possuem apenas um único haplotipo, o que pode estar associado a taxas de mutação elevadas e à inexistência de processos eficientes de reparação de “erros” durante o processo de divisão celular (White et al. 2008). A introdução “acidental” de mtDNA paterno no citoplasma do ovo materno durante a fertilização (paternal leakage) pode, também, estar associada à presença de duas moléculas de mtDNA distintas num indivíduo (White et al. 2008). A ocorrência de recombinação, embora a informação relativamente à presença de mtDNA recombinante em espécies animais seja ainda escassa (White et al. 2008). Algumas destas limitações podem ser contornadas através de procedimentos experimentais adequados, ou ter um efeito relativamente reduzido nas análises filogenéticas e de genética de populações realizadas com base em polimorfismos do mtDNA. No entanto, é importante ter consciência de que existem excepções inerentes ao processo de herança genética do mtDNA e que podem conduzir a interpretações erróneas da biologia evolutiva das espécies.. 18.

(39) Capítulo1 – Introdução geral A análise da variabilidade de sequências de mtDNA tem sido amplamente utilizada em estudos sobre as origens, domesticação e dispersão de várias espécies animais (Giuffra et al. 2000; Luikart et al. 2001; Bruford et al. 2003; Beja-Pereira et al. 2004; Tapio et al. 2006b; Zeder et al. 2006; Driscoll et al. 2007; Larson et al. 2007). Este tipo de marcador tem sido útil para identificar ancestrais selvagens, caracterizar a diversidade de linhas maternas e analisar a variação genética do mtDNA entre regiões geográficas distintas (FAO 2007). No que respeita ao estudo genético dos bovinos domésticos, o mtDNA foi utilizado para identificar sequências de ancestrais selvagens ou pré-domésticos (Bailey et al. 1996; MacHugh et al. 1999; Anderung et al. 2005; Beja-Pereira et al. 2006; Bollongino et al. 2006; Edwards et al. 2007b; Pellecchia et al. 2007; Achilli et al. 2008), detectar potenciais centros de domesticação (Loftus et al. 1994; Bradley et al. 1996; Troy et al. 2001; Mannen et al. 2004; Hiendleder et al. 2008), analisar processos de hibridação e estudar as origens e dispersão das diferentes raças (Cymbron et al. 1999; Magee et al. 2002; Miretti et al. 2002; Carvajal-Carmona et al. 2003; Mirol et al. 2003; Miretti et al. 2004; Lai et al. 2006; Liron et al. 2006a; Cai et al. 2007; Cortes et al. 2008; Dadi et al. 2009).. 1.3.3. Cromossoma Y Os bovinos possuem 60 cromossomas: 58 autossomas e dois cromossomas sexuais (Fries & Popescu 1999). Nos bovinos, bem como nos restantes mamíferos, os machos são heterogaméticos e possuem dois cromossomas sexuais distintos, o cromossoma X e o Y (Liu et al. 2002). Este último é transmitido apenas pelas linhas paternas, pelo que pais e filhos partilham a mesma informação genética associada ao cromossoma Y. Este cromossoma é um dos mais pequenos do cariótipo bovino e contém uma zona que não troca informação genética com o cromossoma X durante a meiose, pelo que é específica de machos, que é denominada de região não-recombinante (NRY). Esta zona constitui aproximadamente 95% do cromossoma Y e os restantes 5 % correspondem à região pseudo-autossómica (PAR) e que troca informação genética com o cromossoma X (Liu et al. 2002). O mapeamento genético do cromossoma Y tem sido dificultado pelas suas peculiaridades, nomeadamente a ausência de recombinação na região NRY, e a complexidade de regiões repetitivas que existem ao longo do cromossoma (Skaletsky et al. 2003). 19.

(40) Capítulo1 – Introdução geral Liu et al. (2002) produziram um mapa do cromossoma Y de bovinos (radiation hybrid map) e identificaram 13 genes localizados na PAR e 46 marcadores genéticos associados à região NRY, incluindo os genes SRY (sex determining) e TSPY (testis-specific protein). Nos mamíferos, os genes localizados no cromossoma Y são responsáveis pela determinação sexual (SRY) e intervêm nos processos de espermatógenese, podendo estar associados a problemas de fertilidade masculina (Lahn et al. 2001). Os genes específicos da região NRY, de forma análoga ao que acontece para o mtDNA, são herdados em bloco e permitem a definição de haplotipos. A taxa de mutação do cromossoma Y é considerada superior à dos autossomas e à do cromossoma X (Hellborg & Ellegren 2003).. A análise de polimorfismos específicos do cromossoma Y, nomeadamente STRs e SNPs, tem sido aplicada ao estudo das origens e da história de populações humanas (Jorde et al. 2000; Hammer et al. 2001; Kayser et al. 2001; Roewer et al. 2005; Kayser et al. 2008) e na resolução de casos forenses (Kayser et al. 1997), estando já constituída uma base de dados para utilizar como referência na definição de haplotipos do cromossoma Y em humanos (http://www.yhrd.org/; Roewer et al. 2001). Nas espécies de animais domésticos, a informação relativa a marcadores específicos do cromossoma Y é escassa e estudos recentes têm demonstrado que a variabilidade genética é relativamente reduzida (Hellborg & Ellegren 2004; Lindgren et al. 2004; Bannasch et al. 2005; Meadows et al. 2006; Li et al. 2007). A diversidade do cromossoma Y é inferior à dos autossomas (Jobling & Tyler-Smith 2003) e, no caso de animais domésticos, o número efectivo de machos tende a ser ainda menor devido aos esquemas de acasalamento em que vários machos produzem um número elevado de descendentes (Hellborg & Ellegren 2004).. Nos bovinos foram identificados alguns marcadores específicos do cromossoma Y, em particular STRs (Bishop et al. 1994; Vaiman et al. 1994; Kappes et al. 1997; Liu et al. 2003) e, também, SNPs (Gotherstrom et al. 2005). Apesar do número limitado de marcadores disponíveis, e de algumas dificuldades na amplificação pela PCR e na análise dos perfis obtidos (bandas múltiplas, amplificação inespecífica, nomeadamente em fêmeas), os marcadores específicos do cromossoma Y têm sido úteis para identificar o fluxo de genes entre populações mediado por machos (Hanotte et al. 2000; Verkaar et al. 2003) e. 20.

(41) Capítulo1 – Introdução geral para complementar a informação genética de linhas maternas (Verkaar et al. 2004; Anderung et al. 2007; Edwards et al. 2007a). Alguns dos STRs do cromossoma Y têm sido amplamente utilizados na detecção de hibridação entre B. taurus e B. indicus (Edwards et al. 2000b; Giovambattista et al. 2000; Li et al. 2007). Recentemente, a utilização de SNPs específicos do cromossoma Y em análises de aDNA de bovinos tem fornecido informação importante sobre a variação genética de ancestrais selvagens e a detecção de hibridação entre fêmeas domésticas e auroques (Gotherstrom et al. 2005; Svensson et al. 2007; Bollongino et al. 2008).. 1.4. Objectivos O objectivo geral deste estudo é contribuir para a caracterização genética dos bovinos domésticos, em particular das raças da Iberoamerica, através da análise de três tipos de marcadores moleculares: marcadores específicos do cromossoma Y, sequências de mtDNA e microssatélites autossómicos. Pretende-se: Caracterizar a diversidade e a estrutura genética das raças bovinas autóctones de Portugal; Investigar as origens dos bovinos Crioulos e analisar a influência de várias raças, incluindo raças zebuínas, para a sua formação.. Este constitui um estudo molecular global de bovinos Ibéricos e Crioulos, cuja história está intimamente associada à da colonização das Américas pelos navegadores Portugueses e Espanhóis.. 21.