PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Efeito do tratamento com inibidor de protease do tipo
Bowman-Birk
na infecção experimental pelo
Trypanosoma cruzi
KÁTIA DA SILVA FONSECA
Kátia da Silva Fonseca
Efeito do tratamento com inibidor de protease do tipo
Bowman-Birk
na infecção pelo
Trypanosoma cruzi
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas como exigência parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Ouro Preto na área de concentração de Imunobiologia de Protozoários.
Orientadora: Profa Dra. Cláudia Martins Carneiro
Co-orientadora: Profª Dra. Paula Melo de Abreu Vieira
Dra. Nívia Carolina Nogueira de PaivaI Dr. Milton Hercules Guerra de AndradeII Dr. Policarpo Ademar Sales JuniorIII Dra. Karina Barbosa Queiroz IV Ms. Levi Eduardo Soares ReisI
Ms. Fernando Augusto Siqueira MathiasI Ms. Luísa Helena Perin de MeloI
Iago César Martins de AssisI
I - Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais, Brasil.
II – Laboratório de Enzimologia e Proteômica, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais, Brasil.
III- Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz-FIOCRUZ, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.
Agradeço primeiramente à Deus, pelo dom da vida, por sempre me acompanhar e iluminar o meu caminho. Obrigada por me permitir concluir mais uma etapa.
Aos meus amados pais José Fonseca e Maria da Consolação da Silva Fonseca por abdicarem de seus sonhos em prol dos meus e pelo amor incondicional. Mesmo que eu não consiga expressar em palavras o amor e a gratidão que sinto por vocês, saibam que agradeço todos os dias por ter vocês em minha vida e por fazer parte da nossa família. Eu amo muito vocês!
Ao meu irmão Felipe, melhor amigo, por todo apoio, amor e cumplicidade. Amorzinho, você é o melhor irmão que eu poderia querer e agradeço muito por ter você ao meu lado em todos os momentos!!
Ao meu amor Guilherme, pelo apoio nos bons e maus momentos, conselhos e por caminhar sempre ao meu lado. Sem você tudo teria sido mais difícil. Te amo muito!
À toda minha família, avós, tios e primos pelo carinho, orações e apoio durante essa e todas as outras etapas.
À professora Cláudia, a minha eterna gratidão pela oportunidade, confiança, todos esses anos de orientação e acima de tudo amizade! Muito obrigada pelo exemplo de profissionalismo e competência!
À minha co-orientadora Paula, meu anjo da guarda, pela disponibilidade e amizade construída ao longo de todos estes anos! Obrigada pelo apoio, pela ótima convivência e pelos incontáveis ensinamentos.
Ao professor Alexandre Reis, obrigada pelo apoio durante minha caminhada acadêmica e exemplo de paixão pela pesquisa.
À Maria, pelos ensinamentos técnicos histopatológicos e pelo carinho.
A Luísa, Jam e Carol pela amizade e pela colaboração nos momentos que mais precisei durante essa jornada! Vocês foram essenciais para a finalização desta etapa e tornaram esta caminhada mais leve!
Ao Levi e ao Fer pela amizade, disponibilidade, bons momentos e contribuição na realização dos experimentos.
À Josefa e Lu pela amizade e apoio, principalmente nos meus momentos de tensão.
À Karina, pela realização da técnica de qPCR
À todos os amigos do LIMP e LMP pela ótima convivência e apoio em todos os momentos. Vocês conseguem fazer dos momentos de trabalho muito mais prazerosos!
Ao Centro de Ciência Animal da UFOP e funcionários por todo auxílio durante a experimentação animal.
À República Hangar, pela união, histórias, irmandade em todos estes anos. Vocês são minha segunda família!!
À República Saideira, pelos ótimos momentos compartilhados e por me permitirem fazer parte desta gloriosa família!
À todos os meus amigos pelo amor, apoio, torcida e por sempre compreenderem minha ausência.
A Doença de Chagas (DCh) apresenta patogênese inflamatória, exibindo no coração um processo difuso que pode se manifestar tanto na fase aguda quanto na fase crônica. Esta inflamação cardíaca pode desencadear o processo de fibrose, uma das manifestações mais significativas da cardiopatia chagásica crônica. Além disso, lesões inflamatórias do sistema nervoso entérico induzem perda de neurônios e células gliais, sendo consideradas fundamentais na patogênese da forma digestiva da DCh. Sendo assim, torna-se importante a busca por um tratamento capaz não apenas de eliminar o parasito, mas também de reduzir o processo inflamatório associado. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com o inibidor de protease do tipo Bowman-Birk (BBI), potente
inibidor da inflamação pelas vias COX-2/PGE-2 e iNOS/NO, e do BBI associado ou não ao benznidazol (BNZ) na infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi em
camundongos. Primeiramente foi realizada avaliação in vitro da atividade do BBI sobre as
formas tripomastigotas e amastigotas do T. cruzi e, posteriormente, a avaliação in vivo.
Neste sentido, 240 camundongos Swiss, machos, com 30 dias de idade foram distribuidos
em cinco grupos: não infectado e não tratado (CNI); infectado e não tratado (CI); infectado e tratado com BNZ (BNZ); infectado e tratado com BBI (BBI); infectado e tratado com BNZ e BBI (BNZ/BBI). Os animais infectados foram inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y. Para o tratamento foi empregado 100 mg/kg de peso corporal de BNZ e/ou 3mg de BBI via gavagem, por 20 dias consecutivos, a partir do primeiro dia em que foi identificada parasitemia no exame de sangue a fresco, sendo seis animais de cada grupo infectado utilizados para a avaliação da parasitemia e mortalidade diária. No 10º, 20º, 30º e 120º dia após infecção (DAI) seis animais de cada grupo foram necropsiados para a coleta de sangue, coração e cólon. O sangue foi utilizado para a realização de imunofenotipagem do sangue periférico e os órgãos foram submetidos a avaliação da carga parasitária, da histologia (processo inflamatório e neoformação de colágeno) e dos níveis teciduais de citocinas. Em relação à avaliação in vitro, foi verificado
que o BBI apresentou-se inativo nas concentrações de 40 à 320 µg/mL. Já em relação à avaliação da parasitemia, observou-se que, in vivo, o BBI também não apresentou ação
tripanomicida, assim como na avaliação do parasitismo tecidual, em que os animais do grupo tratado apenas com BBI não controlaram o parasitismo, ao contrário dos animais tratados com BNZ. Já os animais tratados com BNZ e BBI controlaram o parasitismo tecidual na fase aguda da infecção, porém no 120º d.a.i. observou-se a presença de parasitos em alguns animais deste grupo. Ao avaliar o sangue periférico, os resultados
percentual de IFN-e MCP-1 nos animais tratados apenas com BBI. Dessa forma, conclui-se que o BBI, apesar de conclui-seu efeito imunomodulador, não conclui-se mostrou benéfico no tratamento da doença de Chagas, provavelmente por não permitir o estabelecimento de uma resposta imune eficaz contra o T. cruzi.
Palavras – chave: Doença de Chagas, Inibidor de protease, Bowman – Birk,
The DCh has a inflammatory pathogenesis, exhibiting a diffuse component in the heart that can manifest in both the acute and the chronic phase. This heart inflammation can trigger the process of fibrosis, one of the most significant manifestations of chronic Chagas disease. In addition, inflammatory lesions of the enteric nervous system induce loss of neurons and glial cells being considered fundamental in the pathogenesis of the digestive form of DCh. Thus, it becomes important to search for a treatment capable of not only eliminate the parasite, but also to reduce the associated inflammation. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of treatment with the protease inhibitor Bowman-Birk type
(BBI), a potent inhibitor of inflammation by COX-2 / PGE-2 and iNOS/ NO pathways, and benznidazole (BNZ) association with BBI along the Trypanosoma cruzi infection, on the
inflammatory process. We first carried out an assessment in vitro of the BBI activity on
trypomastigotes and amastigotes of T. cruzi and subsequently the evaluation in vivo. To
this end, 240 male Swiss mice, 30 days old were divided into five groups: non-infected and
untreated (CNI); infected and untreated (CI); infected and treated with BBI (BBI); infected and treated with BNZ (BNZ); infected and treated with BBI and BNZ (BNZ/BBI). The infected animals were inoculated intraperitoneally with 500 blood trypomastigotes of Y strain. For the treatment was employed 100 mg / kg body weight of BNZ and / or 3mg of BBI via gavage, during 20 days, from the first day on which was identified parasitaemia on the examination of fresh blood. Six animals from each infected group was used for evaluation of parasitemia and mortality daily. On the 10th, 20th, 30th and 120th day after infection (DAI) six animals from each group were necropsied to collect blood, heart and colon. The blood was used for the realization of immunophenotype of peripheral blood and the organs were subjected to evaluation of parasitic burden, histology (inflammation and collagen neoformation) and tissue levels of cytokines. Regarding the in vitro evaluation,
BBI presented himself inactive in the same concentration or in concentrations of less than 320 ug / mL. Regarding the evaluation of parasitemia, it was observed that, in vivo, BBI
did not show trypanocidal action, so as in evaluation of the tissue parasitism in which was observed that animals of the group treated only with BBI were unable to control parasitism unlike animals treated with BNZ. The animals treated with BNZ / BBI controlled tissue parasitism in the acute phase of infection, however it was observed in 120th DAI the presence of parasites in some animals from this group. When assessing peripheral blood, the results of this study showed that in 10th DAI there was a reduction in the percentage of NK cells in the group treated with BBI and CI relative to CNI group. Moreover, at this time it was also observed a reduction in the percentage of CD14+ monocytes on BBI group in relation to BNZ and BNZ / BBI groups. It was also observed a reduction in B cell percentage in the treated groups, as well as increased CD8+ cell percentage in the peripheral blood of all infected and treated groups, in the 20th DAI, and the percentage of these cells returned to normal levels 30 DAI. Upon histopathological evaluation, even though it was not observed any significant difference between groups with respect to collagen neoformation, there was a reduction in the inflammatory process in both BNZ and BNZ / BBI group, wherein the treatment with the BNZ associated with BBI allowed this reduction occurred in the 20th DAI, while the animals of the BNZ group the inflammatory process had been reduced only at 30th DAI. Regarding cytokine levels in cardiac tissue was observed in 10th DAI an increase in the percentage of IFN- e MCP-1 in animals
despite its immunomodulatory effect, did not prove beneficial in the treatment of DCh, probably due to non-establishment of an effective immune response against T. cruzi.
Keywords: Chagas disease, protease inhibitor, Bowman-Birk, chemotherapy,
1. Introdução ... 1
1.1 - O Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas ... 2
1.2 - Imunopatologia da doença de Chagas... 4
1.3 - Tratamento ... 7
1.4- Inibidor de protease do tipo Bowman-Birk ... 11
2. Justificativa ... 13
3. Objetivos ... 15
3.1 - Objetivo Geral ... 16
3.2 - Objetivos Específicos... 16
4. Material e Métodos ... 17
4.1 - Avaliação do efeito do BBIin vitro ... 18
4.2 - Animais, inóculo e tratamentos utilizados ... 18
4.3 - Curvas de parasitemia e taxa de sobrevida ... 21
4.4 - Necropsia ... 23
4.5 - Imunofenotipagem do sangue periférico ... 25
4.5.1- Estratégias para análise imunofenotípica do sangue periférico por citometria de fluxo ... 26
4.6 - Análise das alterações histopatológicas ... 30
4.7 - Carga parasitária ... 32
4.7.1 - Curva padrão e determinação da carga parasitária por qPCR ... 33
4.8 - Quantificação de citocinas por CBA (Cytometric Bead Array)... 35
4.9 - Análises Estatísticas ... 36
5. Resultados ... 37
5.1 - Atividade do BBI sobre o T. cruziin vitro... 38
5.2 - Parasitemia ... 39
5.5 - Imunofenotipagem do sangue periférico ... 44
5.4.2 - Distribuição percentual das populações de linfócitos T e linfócitos B ... 47
5.5. Quantificação do processo inflamatório no coração ... 51
5.6. Quantificação do processo inflamatório no cólon ... 54
5.7. Quantificação da área ocupada por fibras colágenas ... 55
5.8 - Quantificação de citocinas no coração por Cytometric Bead Array ... 56
6. Discussão ... 58
7. Conclusão ... 69
8. Referências...71
BBI: Bowman - Birk
BNZ: Benznidazol
CBA: Cytometric Bead Array
CCC: Cardiomiopatia chagásica crônica CEUA: Comitê de Ética no Uso de Animais CK-MB: Isoenzima MB da creatina quinase
COBEA: Colégio Brasileiro de Experimentação Animal COX-2: Ciclooxigenase 2
Ct: Threshold cycle DAI: Dia após infecção DCh: Doença de Chagas DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) DPMP: Dia do pico máximo de parasitemia
EAE: Encefalomielite autoimune experimental EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
FITC: Fluorescein Isothiocyanate (Isotiocianato de fluoresceína) FL1: Fluorescência 1
FL3: Fluorescência 3 FL4: Fluorescência 4
FSC: Forward Scatter (Tamanho)
HE: Hematoxilina-Eosina
IC50: Concentração inibitória de 50%
IL-4: Interleucina 4 IL-10: Interleucina 10 IL-12: Interleucina 12 IL-32: Interleucina 32 KO: Nocaute
LIT: Liver Infusion Tryptose
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1 (Proteína de quimioatração para monócitos 1)
Natural Killer Cells (Células Natural Killer)
Oxido nítrico
OMS: Organização Mundial da Saúde PBS: Tampão Salina-Fosfato
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) PE: R-phycoerythrin (Ficoeritrina)
PerCP: Peridinin-Chlorophyll-protein (Proteína clorofila peridinina) pH: Potencial Hidrogeniônico
PGE-2: Prostaglandina E
PMP: Pico máximo de parasitemia PP: Período patente
PPP: Período pré-patente
qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real ou quantitativa)
RNAse: Ribonuclease
RPMI: Meio Roswell Park Memorial Institute SMF: Sistema fagocitário mononuclear
SSC: Side Scatter (Complexidade/Granulosidade)
TNF-Fator de necrose tumoral TGF-Fator de crescimento tumoral
Figura 1: Estrutura química do benznidazol (Fórmula molecular: C12H12N4O3 e Peso molecular: 260.25g/mol). ... 7
Figura 2: Estrutura química do inibidor de protease do tipo Bowman-Birk. ... 11
Figura3: Fluxograma representativo dos grupos
experimentais...20
Figura 4: Fluxograma representando os animais utilizados para determinação da curva de parasitemia e taxa de sobrevida. ... 22
Figura 5: Fluxograma representativo das atividades relacionadas à avaliação in vivo. ... 24
Figura 6: Sequência de métodos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos T CD3+CD4+ e T CD3+CD8+, no sangue periférico de camundongos Swiss infectados com a cepa Y do T. cruzi e submetidos a diferentes protocolos terapêuticos. ... 27
Figura 7: Sequência de métodos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos B CD19+ e percentual de células NK CD49b+ no sangue periférico de camundongos Swiss infectados pela cepa Y do T. cruzi e submetidos a diferentes tratamentos. ... 28
Figura 8: Sequência de métodos utilizados para quantificar o percentual de monócitos CD14+, no sangue periférico de camundongos Swiss infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi e submetidos a diferentesprotocolos terapêuticos. ... 29
Figura 9: Exemplo da curva padrão referente ao Trypanosoma cruzi ... 34
Figura 10: Curvas de parasitemia de camundongos inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 40
Figura 11: Percentual de sobrevida dos camundongos inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos ... 41
Figura 12: Avaliação da carga parasitária no coração e cólon dos camundongos inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 43
Figura 14: Percentual médio de monócitos (CD14+) no sangue periférico de camundongos infectados com o Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 46
Figura 15: Percentual médio dos linfócitos T CD4+ no sangue periférico de camundongos infectados com o Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 48
Figura 16: Percentual médio dos linfócitos T CD8+ no sangue periférico de camundongos infectados com o Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos.. ... 49
Figura 17: Percentual médio dos linfócitos B (CD19+) no sangue periférico de camundongos infectados com o Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 50
Figura 18: Quantificação de células no tecido cardíaco de camundongos infectados por 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 52
Figura 19: Fotomicrografias de cortes histológicos do coração de camundongos infectados experimentalmente com 500 formas tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi. submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos.. ... 53
Figura 20: Quantificação de células no cólon de camundongos infectados por 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e submetidos ou não a diferentes protocolos terapêuticos. ... 54
Figura 21: Quantificação da área de neoformação de colágeno no coração de camundongos infectados por 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi avaliados no 30º e 120º dia após a infecção (DAI). ... 55
Tabela 1: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações celulares ... 25
Tabela 2: A atividade tripanomicida do BBI, in vitro, contra as formas amastigotas e
tripomastigotas do Trypanosoma cruzi ... 38
Tabela 3: Dados referentes aos períodos pré-patente e patente, valor e dia do pico máximo de parasitemia dos camundongos inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com BNZ,
1.1 - O Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas
O Trypanosoma cruzi (T. cruzi) agente etiológico da doença de Chagas (DCh), é
um protozoário hemoflagelado cujos principais hospedeiros invertebrados, vetores da DCh, são insetos hematófagos da subfamília Triatominae (Chagas, 1909). Nos hospedeiros invertebrados podem ser encontradas formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas, enquanto no hospedeiro vertebrado são encontradas as formas amastigotas e tripomastigotas sanguíneas (Brener, 1987).
Quando o triatomíneo se alimenta com sangue de mamíferos infectados observa-se o início do ciclo biológico do T. cruzi. Neste momento, formas tripomastigotas sanguíneas
são ingeridas pelo inseto, e se transformam em esferomastigotas no estômago seguindo posteriormente para o intestino onde se transformam em epimastigotas e se reproduzem por divisão binária. Já no reto, as formas epimastigotas se diferenciam em tripomastigotas metacíclicas que são então eliminadas juntamente com as fezes e/ou urina do triatomíneo durante o seu repasto sanguíneo. Ao entrarem em contato com a mucosa lesada ocorre a penetração do parasito e consequentemente infecção das células do sistema mononuclear fagocitário (SMF). No hospedeiro vertebrado, as formas trpomastigotas metacíclicas diferenciam em amastigotas intracelulares dando inicio ao processo de multiplicação por divisão binária. Logo após, as formas amastigotas se diferenciam em tripomastigotas sanguíneas, que são liberadas na corrente circulatória infectando outras células, de maneira a disseminar a infecção para outros tecidos (Chagas, 1909; Dias, 1934).
Pode-se destacar a via vetorial como a mais frequente via de transmissão da DCh. No entanto, existem outras formas de transmissão, como a via placentária, transfusional, oral, congênita ou ainda acidentes em laboratórios (Brener 1987, Prata, 2001).
A implementação de medidas para o controle da transmissão vetorial na América Latina permitiu uma redução consideravel na incidência da DCh (Moncayo e Ortiz Yanine, 2006), entretanto, ainda assim, esta continua sendo uma importante via de transmissão da doença.
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, o número de pessoas infectadas pelo T. cruzi é de aproximadamente 6 - 7 milhões, sendo estes indivíduos distribuídos em
Em grande parte destes países não endêmicos o controle dos bancos de sangue não tem sido realizado rigorosamente, sendo relatados diversos casos de transmissão congênita, por transfusão sanguínea e também por transplante de órgãos (Muñoz et al., 2009; Gascon et al., 2010). Dessa forma, países que recebem imigrantes latino-americanos devem realizar triagens sempre que forem realizados transplantes e doações de sangue, além de criar programas de prevenção de transmissão de mães para filhos e capacitar os profissionais para diagnosticar e tratar a doença (Salvador et al. 2014).
A DCh possui duas fases, a aguda é iniciada logo após a infecção e caracterizada por elevado parasitismo tecidual, parasitemia patente e intenso processo inflamatório (Prata, 2001; Golgher e Gazzinelli, 2004). Nesta fase da doença, embora os sinais e sintomas sejam escassos, alterações inespecíficas como febre, mal-estar, taquicardia e esplenomegalia podem ocorrer (Prata, 2001).
Já na fase crônica, os níveis de parasitemia tornam-se mais baixos, devido à ação do sistema imunológico do hospedeiro que atua no controle da multiplicação do parasito. Nessa fase, podem-se observar três formas clínicas principais: indeterminada, cardíaca e digestiva, podendo também ser observada a forma cardiodigestiva (Tafuri, 1971, Tafuri et al., 1971).
Os indivíduos infectados pelo T. cruzi podem permanecer na forma indeterminada
pelo resto da vida, sendo observados apenas exames sorológicos ou parasitológicos positivos. Entretanto, 20 a 35% destes podem desenvolver lesões irreversíveis no sistema nervoso autônomo do coração, esôfago e/ou cólon, que levam ao desenvolvimento das formas crônicas, cardíaca e digestiva (Prata, 2001; Moncayo, 2003).
A forma indeterminada é caracterizada por lesões inflamatórias focais que podem ou não estar associadas à presença de parasitos, observados normalmente apenas por meio de técnicas com sensibilidade elevada, como PCR e imuno-histoquímica (Higuchi et al., 1993; Jones et al., 1993).
Embora sejam demonstrados poucos parasitos na fase crônica da DCh, alguns grupos de pesquisa consideram que a resposta imunológica observada nesta fase está diretamente relacionada aos parasitos persistentes. Em contrapartida, somado à falta de relação entre a intensidade do processo inflamatório e a carga parasitária, é evidenciada a presença de células e anticorpos auto-reativos, sugerindo que a doença possa ser autoimune (Cunha-Neto et al., 1995; Leon e Engman, 2001).
No entanto, estudos demonstraram que tanto a presença do parasito (Jones et al., 1993; Tarleton e Zhang, 1999; Lages-Silva et al., 2001; Da Silveira et al., 2005), como a
indução de uma resposta imunológica contra as células próprias (Cunha-Neto et al., 1995; Leon et al., 2004) parecem estar diretamente associadas à manutenção do processo inflamatório e consequentemente às lesões teciduais, de forma que a autoimunidade e a persistência do parasitismo tecidual deixaram de ser teorias opostas para se tornarem complementares (Soares et al., 2001, Dutra et al., 2009).
Na forma digestiva da DCh, as principais manifestações clínicas são o megaesôfago e megacólon, embora lesões no intestino delgado também já tenham sido observadas (Oliveira et al.,1983; Matsuda et al., 2009). Diversas alterações anatômicas, como hipertrofia muscular, aumento do lúmen e dilatação caracterizam a lesão observada no trato gastrointestinal (TGI) durante a doença de Chagas, sendo microscopicamente demonstrados infiltrados inflamatórios nas camadas musculares, além de ganglionites e periganglionites. Estas lesões inflamatórias no sistema nervoso entérico estão associadas à redução no número de neurônios, o que pode induzir a denervação e dilatação do órgão, sendo fundamentais no desenvolvimento da forma digestiva da doença (Köberle, 1957 e 1970; Tafuri, 1970, 1971).
1.2 - Imunopatologia da doença de Chagas
A resistência do hospedeiro durante a doença está relacionada tanto à imunidade inata quanto à adquirida, sendo necessária a atuação de diversas células que respondem coletivamente na tentativa de controlar a multiplicação do parasito (Rottenberg et al., 1988;
A fase aguda da DCh apresenta intenso processo inflamatório com produção de citocinas que apresentam papel crucial na tentativa de eliminação do parasito e sobrevivência do hospedeiro (Abrahamsohn, 1996).
Inicialmente, células fagocitárias infectadas liberam citocinasimportantesna resistência do hospedeiro à infecção pelo parasito, como por exemplo, a interleucina-12 (IL-12) e o fator de necrose tumoral – alpha (TNF-Estas contribuem para a produção de
Interferon-gamma (IFN- por células Natural Killer (NK) e linfócitos T, estimulando o
recrutamento de leucócitos e consequentemente a redução da parasitemia. Ademais, o
IFNjuntamente com o TNF-auxilia a ativação de macrófagos permitindo a produção da molécula microbicida oxido nítrico (NO) e, portanto, auxiliando no controle da replicação do T. cruzi (Silva et al., 1992; Holscher et al., 1998; Michailowsky et al., 2001).
Sendo assim, apesar das células do sistema fagocitário mononuclear serem infectadas pelo
T. cruzi, representam o primeiro mecanismo de defesa celular contra o parasito após a
infecção do hospedeiro.
Ainda em relação à resposta imune inicial, foi observado que animais deficientes em células NK apresentaram alta parasitemia na fase aguda da infecção pelo T. cruzi. Além
disso, estas células representam uma fonte importante de IFN-γ no início da infecção, sendo demonstrado que camundongos resistentes se tornaram susceptíveis ao serem tratados com anticorpo monoclonal anti-NK, comprovando a importância das células NK no controle da infecção aguda (Cardillo et al., 1996).
Após ativação dos linfócitos T e produção de INF- a resposta imune adaptativa é
iniciadasendo as células TCD4+ e TCD8+ fundamentais na elaboração da resposta imunológica especifica contra o parasito (Tarleton, 1995; Dos Reis et al., 1997).
Em avaliação imunohistoquimica do infiltrado inflamatório cardíaco de pacientes com cardiopatia chagásica, foi demonstrado que as células T CD8+ (citotóxicas) predominavam quando comparadas às células T CD4+ (Higuchi et al., 1993). Estas células,
além de produzirem granzimas e perforinas, também produzem IFN- permitindo a atvivação de macrófagos, e consequentemente, produção de NO. Dessa forma, se tornam fundamentais na eliminação da célula infectada, contribuindo no controle do parasitismo na fase aguda da infecção (Muller et al., 2003; Martin e Tarleton, 2004; Borges et al., 2009).
tecidual, devido provavelmente à não ativação de macrófagos e à proliferação de linfócitos T CD8+ e B normalmente induzida por linfócitos T CD4+ (Russo, 1988; Rottenberg et al., 1995).
Durante a fase aguda da DCh, a resposta imune humoral também contribui para o controle da infecção como evidenciado por Cardillo et al. (2007), que utilizaram em seus estudos camundongos nocautes para linfócitos B e constataram que estes animais apresentaram menor porcentagem de linfócitos T CD8+ ativados e de memória no baço e no infiltrado inflamatório no tecido muscular esquelético. Ademais, observou-se, nestes mesmos camundongos, quando comparados aos camundongos selvagens, redução do infiltrado inflamatório e aumento no parasitismo tecidual durante a fase aguda da infecção. No entanto, tem sido demonstrado em diversos estudos que camundongos infectados pelo T. cruzi apresentam ativação policlonal de células B, bem como
hipergamaglobulinemia e atraso na imunidade humoral específica, o que poderia propiciar a infecção, contribuindo para a suceptibilidade do hospedeiro (Minoprio et al., 1989, Bryan et al., 2010).
Bryan et al. (2010) notaram que, duas semanas após a infecção, camundongos C57Bl/6 desenvolveram resposta imune humoral específica contra o T. cruzi , bem como
baixa ativação policlonal, possibilitando a resistência à infecção pela cepa Y do T. cruzi.
Em contrapartida, camundongos BALB/c, também infectados com a cepa Y, apresentaram elevada ativação policlonal anterior às duas semanas de infecção e baixa resposta imune humoral específica, resultando na susceptibilidade à infecção. Além disso, o perfil de citocinas observado nos camundongos susceptíveis à infecção foi Th2, enquanto nos animais resistentes foi observada uma resposta do tipo Th1.
Sabe-se que o desenvolvimento de uma resposta de perfil Th1, observada durante a infecção pelo T. cruzi, é fundamental para o controle da infecção e eliminação do parasito
(Hoft et al., 2000). Entretanto, já foi constatado que citocinas da resposta tipo Th2, como a IL-4, além de citocinas consideradas imunomoduladoras, como a IL-10 e o TGF- permitem o controle da resposta imunológica observada após a infecção pelo T. cruzi, de
1.3 - Tratamento
A DCh é sabidamente uma doença negligenciada do ponto de vista terapêutico, uma vez que o financiamento por parte da indústria farmacêutica em pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos ainda é escasso. Além disso, a falta de marcadores claros e precoces tanto de eficácia terapêutica quanto de progressão da doença prejudica o desenvolvimento de novos tratamentos (DNDI, 2012).
No Brasil, o único fármaco disponível para o tratamento DCh é o benznidazol – BNZ (N-benzil-2-nitro-1-imidazol acetamida). Este apresenta capacidade tripanomicida para todas as formas do parasito e promove bons níveis de cura na fase aguda, entretanto na fase crônica demonstra baixa atividade antiparasitária, sendo esta uma das maiores limitações do mesmo (Coura e de Castro, 2002).
Figura 1: Estrutura química do Benznidazol (Fórmula molecular: C12H12N4O3 e Peso molecular:
260.25g/mol).
Independente da via de transmissão do parasito, o tratamento com BNZ durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi é recomendado. Todavia, embora o tratamento da DCh
nesta fase seja capaz de curar cerca de 80% dos pacientes e tenha apresentado bons resultados em casos de fase crônica recente, infecções congênitas e acidentes laboratoriais, na fase crônica tardia a sua eficácia é constantemente questionada. Ainda assim, o tratamento tem sido proposto em casos de infecção crônica tardia sem manifestações clínicas ou com manifestações moderadas, objetivando a prevenção da progressão da doença (Viotti et al., 2007; Lana et al., 2009; Bern, 2015).
(Sosa-Estani e Segura, 2006; Viotti et al., 2006; Viotti e Vigliano, 2007). Este efeito positivo do tratamento na evolução clínica da doença pode ser explicado pela redução do parasitismo tecidual e do processo inflamatório associado ao mesmo (Tarleton, 2001; Viotti et al., 2006; Viotti e Vigliano, 2007; revisado por Urbina, 2010). Além disso, Campi – Azevedo et al. em 2015, observaram que o tratamento com BNZ induziu mudanças no perfil imunológico em pacientes com a forma cardíaca, favorecendo a produção das citocinas IL-10 e TGF-β pelos monócitos, o que pode contribuir para evitar a progressão da doença.
A diferença na eficácia dos compostos nitro – heterocíclicos, nas fases aguda e crônica da DCh, pode estar relacionada a propriedades farmacocinéticas, como uma meia vida relativamente curta (Urbina, 2002; Urbina e Docampo, 2003). Além disso, a resistência caracteristica de diversas cepas de T. cruzi a nitroderivados pode explicar a
baixa taxa de cura observada em pacientes tratados (Filardi e Brener,1987; Murta et al., 1998; revisado por Murta, 1999).
O mecanismo de ação do BNZ ainda não está totalmente esclarecido, no entanto, sabe-se que se baseia na formação de radicais livres intermediários ou metabólitos nucleofílicos, através da redução do grupo nitro pela ação de enzimas do tipo nitroredutases do citocromo P-450 (Polak e Richle, 1978; Docampo e Moreno, 1984). Estes radicais livres formam ligações covalentes com lipídios, proteínas e DNA, lesando os componentes celulares dos parasitos (Dias de Toranzo et al., 1988, Urbina, 1999). Além disso, estudos demonstram que o BNZ aumenta a fagocitose do T.cruzi devido ao aumento
de IFN- e inibição da NADH-fumarato redutase do parasito (Docampo e Moreno, 1984). Durante o tratamento com BNZ podem surgir reações adversas, tais como: sintomas de hipersensibilidade, dermatites com erupções cutâneas, edema, purpura, febre, anorexia, perda de peso corporal, linfadenopatia, dor muscular, depressão da medula óssea, distúrbios gastrointestinais, trombocitopenia e agranulocitose, polineuropatia, parestesias e polineurites periféricas (Coura e de Castro, 2002; Lamas et al., 2006). Sendo assim, devido
à conhecida toxicidade do BNZ e seu efeito limitado em relação às fases da doença, a busca por novos fármacos se faz necessária (Coura e De Castro, 2002; Soeiro e De Castro, 2009).
Os derivados nitrofuranos provocam a inativação irreversível da enzima tripanotiona redutase do T. cruzi, que está envolvida no metabolismo oxidativo do parasito.
Estudos in vitro obtiveram um derivado a partir do nitrofural, a hidroximetilnitrofurazona,
e demonstraram que este pró-farmaco apresentou atividade tripanomicida superior à Nitrofurazona e ao BNZ, e toxicidade menor que o fármaco original (Chung etal., 2003).
Fármacos inibidores da biossíntese de esteróis como o Cetoconazol, Fluconazol e Itraconazol também demonstraram ação tripanomicida in vitro, visto que o parasito precisa
de esteróis específicos para a sobrevivência e multiplicação. Entretanto, trabalhos indicam que estes compostos não são suficientemente eficazes para erradicar a infecção em animais crônicos experimentalmente infectados ou em humanos, embora uma redução na carga parasitária, bem como nas reações adversas possa ser observada (Revisado em Urbina 2001, 2002).
Posteriormente, foram sintetizados compostos estruturalmente semelhantes a estes, como o Posaconazol que permitiu a cura parasitológica em modelos murinos nas fases aguda e crônica da DCh (Molina et al., 2000; Urbina e Docampo, 2003). Entretanto, ao ser avaliado o efeito do tratamento com esse composto em pacientes crônicos portadores da DCh não foi observada a mesma eficácia demonstrada em camundongos. Uma possível explicação para esta divergência de resultados seria que a fase crônica no modelo murino fosse correspondente à fase crônica recente em pacientes, sendo a resposta superestimada. Já que na fase crônica tardia, o T. cruzi pode ter formas amastigotas quiescentes, contra os
quais o composto não apresenta efeito satisfatório (Molina et al., 2014).
As proteases também foram selecionadas como potenciais alvos no desenvolvimento de novos fármacos anti – T. cruzi, pois estão diretamente envolvidas na
sobrevivência, multiplicação do parasito, e consequentemente no desenvolvimento desta doença (McKerrow et al., 1993).
Um grande número de pesquisas a respeito do papel das proteases em doenças inflamatórias tem sido realizado (Safavi et al., 2012). Estas são enzimas que hidrolisam ligações peptídicas e são classificadas de acordo com a interação do seu resíduo catalítico com inibidores específicos, sendo distribuídas nas seguintes categorias: serino proteases; aspártico-proteases, metaloproteases e cisteíno-proteases, além da treonino-protease e glutâmico-protease, incluídas recentemente (Barret e McDonald, 1986).
T. cruzi, sendo observada sua expressão em diferentes níveis nos diferentes estágios do
mesmo (Cazzulo et al., 2001). Além disso, alguns inibidores de protease demonstraram ter ação tripanomicida tanto in vitro quanto in vivo (Chen et al., 2010), além de permitirem
redução da inflamação e lesão tecidual (Jelicks et al., 2002; Barr et al., 2005).
As serino proteases participam de vários processos fisiológicos e patológicos, e estão diretamente envolvidas na resposta imunológica com ação pró-inflamatória (Safavi et al, 2012). A proteinase 3 e a Catepsina G, por exemplo, são serino proteases armazenadas em grandes quantidades nas células polimorfonucleares (Korkmaz et al., 2010) que induzem a atividade pró-inflamatória da IL-32 e a produção de IFN- pelos linfócitos T, respectivamente (Novick et al., 2006; Tani et al., 2001).
Já as granzimas são serino proteases produzidas por linfócitos T e células NK, que induzem a morte por apoptose de células-alvo, além de auxiliar a proliferação de células B e facilitar a chegada de células T ao local da infecção (Mullbacher et al., 1999; Trapani, 2001, Safavi et al., 2012).
Dessa forma, acredita-se que os inibidores das serina proteases, podem ser eficazes no tratamento de doenças inflamatórias, modificando diversas vias de inflamação e modulando o sistema imune, por meio do controle da produção de citocinas e quimiocinas, uma vez que estas se encontram amplamente envolvidas em respostas imunológicas pró-inflamatórias (Safavi et al., 2012).
A combinação de compostos também pode representar uma alternativa terapêutica relevante para o tratamento da DCh, sendo uma estratégia já utilizada no tratamento de várias doenças tais como o câncer, doenças infecciosas e protozoonoses (Fivelman et al., 2004).
Diversas combinações de fármacos já foram avaliadas para o tratamento da infecção pelo T. cruzi, tanto em modelos in vitro quanto in vivo. Urbina et al. (1993)
avaliaram a eficácia da combinação do cetaconazol e da lovastatina e observaram uma atividade anti – proliferativa sobre as formas epimastigotas e amastigotas in vitro, no
entanto este resultado não foi observado quando a mesma associação foi avaliada in vivo.
Já Araújo et al. (2000) observaram que o BNZ associado ao Cetaconazol induziu um efeito sinérgico em camundongos infectados pela cepa Y e CL, mas não em camundongos infectados pela cepa Colombiana. No mesmo estudo, avaliaram também a associação entre BNZ e Ofloxacino, no entanto esta combinação não apresentou resultados positivos.
biossíntese de ergosterol e, López-Munoz et al., em 2010, demonstraram um efeito sinérgico de aspirina com o nifurtimox e o BNZ na infecção pelo T. cruzi in vitro,
considerando que a capacidade da aspirina em aumentar a atividade antiparasitária dos macrófagos resulta no aumento do efeito dos fármacos avaliados.
Pelizzaro-Rocha et al. (2010) ao avaliarem o efeito da combinação do BNZ com
Partenólido, produto natural que exibe propriedades anti-inflamatórias, sobre o T. cruzi,
observaram efeito sinérgico dos dois compostos sobre as formas epimastigotas. Além disso, demonstraram que combinações de drogas podem não apenas controlar a infecção, mas também reduzir o dano às células do hospedeiro, uma vez que o efeito citotóxico do BNZ foi reduzido quando administrado juntamente com o Partenólido.
1.4- Inibidor de protease do tipo Bowman-Birk
O inibidor de proteases do tipo Bowman-Birk (BBI) foi isolado em sementes de
soja, e posteriormente encontrado em outras leguminosas (Norioka et al., 1983), e gramíneas (Odani et al., 1986). O BBI identificado na soja (Glycine max) consiste em uma
cadeia de 71 aminoácidos ligados por sete pontes dissulfeto, devido às quais forma-se uma estrutura rígida composta por dois sítios independentes de ligação à protease, um capaz de inibir tripsina e o outro com alta afinidade de ligação para quimotripsina (Odani e Ikenaka, 1973).
Este inibidor de protease é capaz de resistir a temperaturas e a valores de pH elevados, bem como a enzimas proteolíticas do trato gastrointestinal, atingindo o intestino com suas estruturas praticamente inalteradas, características relevantes que o tornam um excelente candidato para administração oral (Birk, 1985; Losso, 2008; Marin-Manzano et al, 2009).
Estudo demonstrou que o BBI é um poderoso inibidor da inflamação através das vias COX-2/PGE2 e iNOS/NO permitindo assim redução nos danos proteolíticos e oxidativos que ocorrem durante o processo inflamatório. Em baixas concentrações (20 uM), o BBI foi capaz de inibir 45% da produção de PGE2 e 50% de NO em cultura de macrófagos (Dia et al., 2008). Além disso, foi observado que o BBI concentrado foi benéfico para camundongos com colite ulcerativa induzida por dextran sulfato de sódio, reduzindo a inflamação no cólon quando administrado durante e após o tratamento (Ware, 1999).
Estudos sugerem que o efeito positivo do tratamento com BBI em encefalomielites autoimunes experimentais (EAE) ocorre principalmente devido à alteração no perfil de citocinas produzidas por células da resposta imune. O tratamento com BBI aumenta a produção de IL-5 e IL-10, sendo este um dos mecanismos associados ao efeito imunoregulatório do BBI (Touil et al., 2008).
Dai e colaboradores (2012) observaram que o tratamento com BBI não teve efeito benéfico em camundongos KO para IL-10. Estes apresentaram desenvolvimento normal da EAE, demonstrando claramente que a IL-10 é fundamental na redução da inflamação induzida por BBI, assim como demonstraram também que durante o tratamento com este inibidor de protease, a principal fonte de IL-10 seriam as células T CD4+.
Sabe-se que a DCh apresenta patogênese inflamatória, exibindo no coração um componente difuso que pode se manifestar tanto na fase aguda quanto na fase crônica. Esta inflamação cardíaca pode desencadear o processo de fibrose, uma das manifestações mais significativas da cardiopatia chagásica crônica, que se encontra associada a infiltrados inflamatórios e cardiomiócitos em degeneração. Além disso, lesões inflamatórias do sistema nervoso entérico induzem perda de neurônios e células gliais, sendo consideradas fundamentais na patogênese da forma digestiva da DCh.
Sendo assim, é importante buscar um tratamento capaz não apenas de eliminar o parasito, mas também de reduzir a inflamação causada pelo mesmo. Dessa maneira a associação do benznidazol com o BBI, conhecido por reduzir o processo inflamatório em outras doenças, poderia induzir a redução da inflamação causada pelo T. cruzi, diminuindo
3.1 - Objetivo Geral
Avaliar os efeitos do tratamento com o inibidor de protease do tipo Bowman-Birk,
combinado ou não com o benznidazol, ao longo da infecção experimental de camundongos
Swiss pela cepa Y do T. cruzi.
3.2 - Objetivos Específicos
• Avaliar o efeito in vitro do tratamento com inibidor de protease do tipo Bowman-Birk
sobre as formas tripomastigotas e amastigotas do T. cruzi;
• Analisar o efeito in vivo do tratamento com inibidor de protease do tipo Bowman-Birk,
associado ou não ao benznidazol, sobre a curva de parasitemia, a taxa de sobrevida e sobre as células mononucleares do sangue periférico;
• Realizar a avaliação, post-mortem, do tratamento com inibidor de protease do tipo Bowman-Birk, associado ou não ao benznidazol, sobre o processo inflamatório, a
neoformação de colágeno, carga parasitária e produção de citocinas no coração e no cólon.
4.1 - Avaliação do efeito do BBI in vitro
A avaliação, in vitro, do efeito do BBI sobre as formas tripomastigotas e
amastigotas (formas do parasito relevantes na infecção humana) foi realizada no centro de pesquisas Rene Rachou – Fiocruz, de acordo com o protocolo descrito por Buckner et al. (1996) com modificações.
A cepa do T. cruzi utilizada neste ensaio foi a Tulahuen que expressa o gene de
Escherichia coli -galactosidase, cultivada em monocamada de fibroblastos L929 de
camundongo. Esta cepa foi utilizada devido à dificuldade em se utilizar diferentes cepas do
T. cruzi, como Y e Colombiana transfectadas com -galactosidase, outras enzimas, ou
proteína verde fluorescente, sendo esta uma das limitações do método.
Em resumo, placas de cultura de 96 poços foram cobertas com fibroblastos L929 (4x103) em 80l de RPMI por poço e posteriormente incubadas overnight em estufa a 37ºC
e 5% de CO2. Em seguida, tripomastigotas da cepa Tulahuen (4x104 diluidos em 20l de
RPMI), expressando o gene -galactosidase foram adicionadas nos poços previamente revestidos com fibroblastos L929. Após duas horas, o sobrenadante com as tripomastigotas
que não conseguiram penetrar nas células foi substituído por 200l de meio RPMI por poço e a placa foi novamente incubada a 37ºC e 5% de CO2 por 48h. Posteriormente o
sobrenadante foi descartado e em cada poço foi acrescentado 180l de meio RPMI e 20l de BBI em diferentes concentrações. Após incubação de 96 horas, o substrato cromogênico vermelho de clorofenol--D-galactopiranosido (500 M de concentração final) e Nonidet P-40 (0,5% de concentração final) foram adicionados às placas e incubados overnight a
37°C. A densidade óptica foi então mensurada em leitor de Microelisa no comprimento de onda de 570 nm, sendo que o controle positivo utilizado foi o BNZ na concentração necessária para inibir 50% do número de tripomastigotas (IC50 = 1 mg/ml = 3,81 uM). Os resultados foram expressos como percentagem de atividade tripanomicida (Oliveira et al., 2006).
4.2 - Animais, inóculo e tratamentos utilizados
Foram utilizados 240 camundongos Swiss, machos, com 30 dias de idade
inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y. Esta cepa foi obtida de camundongos albinos Swiss mantidos no Centro de Ciência Animal
da Universidade Federal de Ouro Preto.
Para o tratamento com BBI foram empregados três mg de BBI de Glycine max via
Camundongos
Swiss
(240)
Inf
ectado
e
tratado
co
m
BNZ/BB
I
(n
=
48)
Inf
ectado
e
não
tratado
(n
=
48
)
Inf
ecta
do
e
tra
tado
com
BNZ
(n
=4
8)
Não
inf
ecta
do
e
não
tra
tado
(n
= 48
)
Inf
ectado
e
tratado
co
m
BB
I
(n
=
48)
Figura 3: Fluxograma representativo dos cinco grupos experimentais: grupo controle não infectado, controle infectado e não tratado, infectado e tratado com benznidazol, infectado e tratado com BBI e infectado e tratado com benznidazol e BBI. Os animais infectados foram inoculados com 500 formas tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi.
4.3 - Curvas de parasitemia e taxa de sobrevida
4.3.1. Curva de parasitemia
Para determinação da parasitemia, seis camundongos de cada grupo foram avaliados diariamente por exame de sangue à fresco a partir do 4o dia após a infecção até a negativação do exame, por cinco dias consecutivos, segundo a metodologia de Brener (1962). Para isso, cinco µL de sangue foram retirados da veia caudal dos camundongos e analisados diariamente ao microscópio óptico, sendo a curva de parasitemia plotada para cada grupo experimental e expressa em número de tripomastigotas sanguíneas por 0,1ml de sangue.
As curvas de parasitemia representam as médias diárias de parasitos observados no sangue periférico dos camundongos de cada grupo e por meio de sua avaliação foram determinados os seguintes parâmetros:
Período Pré-patente (PPP)
Período compreendido entre o dia em que foi realizado o inóculo e o primeiro dia no qual foi observado parasito no sangue periférico do camundongo por meio do exame de sangue à fresco (Resultado expresso em dias).
Período Patente (PP)
Período compreendido entre o primeiro e o último dia no qual foi detectado parasito no exame de sangue à fresco (Resultado expresso em dias).
Pico Máximo de Parasitemia (PMP)
Valor máximo de parasitemia detectado pelo exame de sangue à fresco (Resultado expresso em número de tripomastigotas sanguíneos/0.1mL de sangue).
Dia do Pico Máximo (DPMP)
Parasitemia
(diariamente)Inf
ectado
e
não
tratado
(n
=
6)
Inf
ecta
do
e
tra
tado
com
BNZ
(n
= 6)
Inf
ecta
do
e
tra
tado
com
BBI
(n
=
6)
Camundongos
Swiss
(n = 24)
Inf
ectado
e
tratado
co
m
BNZ/BB
I
(n
=
6)
Taxa de sobrevida
(diariamente)
4.3.2. Taxa de Sobrevida
Para definir a taxa de sobrevida, 24 animais (mesmos utilizados na determinação da parasitemia) foram acompanhados diariamente até o 120º DAI sendo a sobrevida registrada e expressa em percentagem cumulativa (Figura 4).
4.4 - Necropsia
Seis animais de cada grupo experimental foram eutanasiados, por deslocamento cervical, aos 10º, 20º, 30º e 120º DAI. Durante a necróspia, foram coletadas amostras de 300l de sangue do plexo orbital para a realização de imunofenotipagem do sangue periférico. Além disso, amostras de coração in totum e cólon (região retossigmóide) foram
Parasitismo tecidual
Camundongos Swiss(240)
Inf ectado e tratado co m BNZ/BB I (n = 48)
Necropsia (10º, 20º, 30º e 120º DAI)
Coração e Cólon
Inf ectado e não tratado (n = 48 ) Inf ectado e tratado co m BNZ (n =4 8) Não in fectado e não tratado (n = 48) Inf ectado e tratado co m BB I (n = 48) Sangue
Inflamação Neoformação de colágeno
Dosagem de citocinas Imunofenotipagem de células do sangue periférico
Figura 5: Fluxograma representativo das atividades relacionadas à avaliação in vivo. Os animais foram distribuidos em cinco grupos experimentais: grupo controle não
infectado, controle infectado e não tratado, infectado e tratado com benznidazol, infectado e tratado com BBI e infectado e tratado com benznidazol e BBI. Os animais dos grupos infectados foram inoculados com 500 formas trypomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi. Todas as análises foram realizadas em amostras coletadas no 10º, 20º,
4.5 - Imunofenotipagem do sangue periférico
Para realizar a caracterização do perfil fenotípico celular do sangue periférico, foram adicionados cinco μL de anticorpo monoclonal com especificidade para marcadores de superfície celular de interesse conjugado com fluorocromo em tubos de poliestireno 12x75 mm (Tabela 1). Para cada tubo com anticorpo, foram transferidas alíquotas de 25 μL de sangue, sendo em seguida incubados por 30 minutos e ao abrigo da luz. Após a incubação, foi realizada a lise dos eritrócitos, utilizando dois mL de solução de lise Billig diluída 10 vezes em água destilada e homogeneizadas em vórtex. As preparações foram novamente incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente e então submetidas à centrifugação por 7 minutos a 1300rpm e 18° C. O sobrenadante foi descartado e os leucócitos lavados com três mL de PBS (pH 7,4), empregando-se as mesmas condições de centrifugação anterior. Terminada esta etapa, os leucócitos foram fixados com 200 μL de solução fixadora (10 g/L de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67 g/L de cloreto de sódio, pH 7,2). Após um período de pelo menos 15 minutos a 4° C, procedeu-se a leitura no citômetro de fluxo (FACScan® – Becton Dickinson), e os parâmetros fenotípicos e morfométricos das células presentes em cada um dos tubos foram definidos. O programa CELLQuest® foi utilizado para a aquisição de dados.
Tabela 1: Anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos utilizados na análise do perfil fenotípico celular do sangue periférico em camundongos Swiss infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi.
Anticorpos Fluorocromo Fabricante Fenótipo alvo no estudo
Anti-CD3 PE BioLegend Linfócitos T
Anti-CD4 Perc P BioLegend Linfócitos T auxiliares Anti-CD8 FITC Invitrogen Linfócitos T citotóxicos
Anti-B cell FITC eBioscience Linfócitos B
Anti-CD14 FITC eBioscience Monócitos
4.5.1- Estratégias para análise imunofenotípica do sangue periférico por citometria de fluxo
Os perfis fenotípicos das populações e subpopulações celulares foram obtidos por meio da frequência (%) de subpopulações de linfócitos T (CD3+CD4+ e CD3+CD8+), de linfócitos B (CD19+), de células NK (CD49b+) e de monócitos (CD14+).
Para a análise da frequência de linfócitos T CD3+CD4+ e T CD3+CD8+ foi utilizada a estratégia convencional. Para isso, a população celular de interesse foi delimitada, com base em aspectos morfométricos dos linfócitos, em gráficos de distribuição pontual de FSC
versus SSC (Figura 6A). A partir da seleção da população interesse (R1) foi obtido o
As análises das frequências de linfócitos B CD19+ e de células NK CD49b+ também foram realizadas utilizando-se a estratégia de análise convencional, com seleção da população celular de interesse nos gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC
(Figura 7A e C). Após a seleção da região de interesse (R1), foi obtido o percentual de B A
C
R1
SSC
FSC
FL2
/CD3
PE
FL3/CD4 PerCP
FL2
/CD3
PE
FL1/CD8 FITC
Linfócitos
Figura 6: Sequência de métodos utilizados na quantificação do percentual de linfócitos T CD3+CD4+ e T
CD3+CD8+, no sangue periférico de camundongos Swiss infectados com a cepa Y do T. cruzi e submetidos a
diferentes tratamentos. (A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de linfócitos, R1. (B) Gráficos de distribuição pontual FL2/CD3-PE versus FL3/CD4-PerCP, contendo as células selecionadas na região R1, utilizados para quantificar o percentual das subpopulações de linfócitos T CD3+CD4+. (C) Gráficos de distribuição pontual FL2/CD3-PE versus FL1/CD8-FITC, contendo as
A B
C D
R1
R1
Linfócitos
Linfócitos
SSC
SSC
FSC
FSC
FL4
FL4
FL1 /CD19 FITC
FL1 /CD49b FITC
linfócitos B CD19+ e de células NK CD49b+ em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência, como demonstrado nas Figuras 7B e 7D, respectivamente.
Figura 7:
Para análise de monócitos CD14+ foi selecionada a região de interesse (R1) nos gráficos de distribuição pontual de SSC versus FL1/CD14+, para a identificação da
população de monócitos como células CD14+ High SSC intermediário, o que reduz a contaminação da região selecionada por linfócitos e neutrófilos (Figura 8A). Em seguida, a região de interesse R2 foi obtida dentro de R1, em gráficos bidimensionais de SSC versus
FSC (Figura 8B). A confirmação de que a população R2 seria CD14+, foi realizada em Figura 7: Sequência de métodos utilizados na quantificação do percentual de linfócitos B CD19+ e de células NK CD49b+ no sangue periférico de camundongos Swiss infectados pela cepa Y do T. cruzi e submetidos a
SSC
FL1/CD14 FITC
SSC
FL1/CD14 FITC FL1/CD14 FITC
SSC
FL1/CD14 FITC
FSC
FL3
A B
C D
R1
R2
gráficos bidimensionais de FL3 versus FL1/CD14+ (Figura 8C) e para garantir que o
percentual observado era realmente de monócitos CD14+, foi feito um ungated
interpolando os gráficos.
Figura 8: Sequência de métodos utilizados na quantificação do percentual de monócitos CD14+, no sangue
periférico de camundongos Swiss infectados pela cepa Y do T. cruzi e submetidos a diferentes tratamentos.
4.6 - Análise das alterações histopatológicas
A análise da histopatologia foi realizada em cortes de coração e cólon submetidos à coloração Hematoxilina-Eosina (HE) e Tricrômico de Masson.
Para avaliação do processo inflamatório, os cortes foram submetidos a duas trocas de xilol para desparafinização, hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) e lavados em água corrente. Em seguida, foram corados pela Hematoxilina (10 minutos) e então lavados novamente em água corrente, objetivando a retirada de excesso do corante. Os cortes foram diferenciados em álcool acidulado (100 mL de álcool absoluto e 10 gotas de ácido clorídrico) e imersos em água corrente, evitando assim que ocorresse a acidificação excessiva dos mesmos. Posteriormente, foram corados pela Eosina (30 segundos) e lavados pela ultima vez em água corrente. Após a lavagem, foram desidratados em dois banhos de álcool absoluto e submetidos à secagem em estufa a 56ºC e montados com o auxilio de Entellan e lamínula.
Os núcleos celulares presentes nos cortes foram quantificados em 20 imagens aleatórias, de forma que a área percorrida fosse 1,5 x 106 m2, e as imagens foram visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B. As análises foram realizadas com o auxílio do
software Leica QwinV3 no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. O processo inflamatório foi considerado quando foi observada diferença significativa (p<0,05) entre o número de núcleos celulares presentes nos animais infectados pelo T. cruzi e aquele observado nos
animais não infectados ± desvio padrão (Caliari, 1997; Maltos et al., 2004; Ferreira Junior et al., 2015).
solução número III (azul de anilina, água destilada e ácido acético glacial) por cinco minutos, com posterior lavagem em água corrente por dois minutos. Por fim, os cortes foram desidratados, em dois banhos de álcool absoluto e submetidos à secagem em estufa (56ºC) e montados com o auxílio de Entellan e lamínula.
Nos fragmentos de coração, a área ocupada pelas fibras colágenas foi avaliada em 20 imagens aleatórias, percorrendo área de 1,3 x 106m2. As imagens foram visualizadas e capturadas pela objetiva de 20x e digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B. As análises foram realizadas com o auxílio do
software Leica QwinV3 no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. A área com neoformação de colágeno foi quantificada através de pixels em tons de azul, selecionados para a formação de uma imagem binária e em seguida utilizados para calcular a área total ocupada por colágeno, conforme equações abaixo:
Porcentagem de fibras de colágeno = área do colágeno x 100
área do colágeno + área do tecido
Colágeno acertado = porcentagem de colágeno x área do frame
100
4.7 - Carga parasitária
A carga parasitária foi avaliada utilizando a técnica de qPCR. Neste sentido, fragmentos de coração e cólon foram armazenados inicialmente à -80°C, cortados e pesados, obtendo-se fragmentos de 20-30 mg. Estes foram então submetidos aos métodos de extração de DNA utilizando o kit WizardTM Genomic DNA Purification Kit (Promega,
Madison, WI, USA), seguindo as recomendações do fabricante com algumas modificações. Nos tubos contendo os fragmentos de tecido foram adicionados, inicialmente, 500 μL de solução de lise nuclear e em seguida colocou-se os mesmos tubos no gelo por dois minutos. Posteriormente, estes foram homogeneizados por inversão, adicionados de 30 μL de Proteinase K (Sigma-Aldrich®, USA) a 20 mg/mL e mantidos overnight em banho seco
à 55°C. Após este período, eles foram adicionados de três μL de RNAse e colocados por 30 minutos em banho seco à 37°C. Em seguida, os tubos foram mantidos em temperatura ambiente por cinco minutos e adicionados de 200 μL de solução de precipitação protéica. As amostras foram homogeneizadas por 20 segundos utilizando-se o aparelho vortex (Certomat MV, B. Braun Biotech International, EUA), e centrifugadas por 5 minutos à
16.000g (Microcentrífuga Eppendorf®- Modelo 5418, NY, USA). Foi realizada a transferência dos sobrenadantes para outros tubos nos quais haviam sido adicionados previamente 600 μL de isopropanol (Merck®, Darmstad, Alemanha). Estes tudos contendo as amostras foram então homogeneizados e centrifugados por 1,5 minutos a 16.000 g. Os sobrenadantes foram então descartados e os sedimentos foram adicionados de 200 μL de etanol 70% (Merck®, Darmstad, Alemanha). Após ser realizada outra centrifugação a 16.000 g, os sobrenadantes foram descartados novamente e os tubos deixados abertos objetivando que o etanol 70% remanescente evaporasse. Foi acrescentado então 100 μL de solução de hidratação a cada tubo e o DNA foi mantido por 24h à temperatura ambiente para reidratação. Logo após, dois L da solução contendo o DNA extraído foram utilizados para determinar a concentração e avaliar o grau de pureza do mesmo por meio das razões nas absorbâncias de 230/280 nm e 260/280 nm em nanoespectrofotômetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, EUA). Em seguida, as amostras foram armazenadas à
4.7.1 - Curva padrão e determinação da carga parasitária por qPCR
Inicialmente foi preparada uma curva padrão para que fosse possível determinar o número de cópias do DNA do parasito (Figura 9). Neste sentido, utilizou-se epimastigotas do T. cruzi (cepa Y) cultivadas em meio de cultura LIT (Liver Infusion Triptose), até atingir
o número de 1 x 108 parasitos.
A quantidade de parasitos foi determinada realizando-se a contagem em câmara de Neubauer e após a extração de DNA da massa de epimastigotas, foi construída a curva padrão. Após eluição do pellet de DNA extraído em 100 mL de água ultra pura autoclavada,
a concentração final foi de 106 parasitos/mL, considerando a extração aproximadamente 100% eficiente. A concentração e a pureza do DNA extraído foram determinadas em nanoespectrofotômetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, EUA) nos comprimentos de
onda de 260/280 e 260/230 nm, e posteriormente foram realizadas diluições seriadas de 10x, com obtenção de sete pontos, de 106 a 1 parasito, utilizados na curva. A curva padrão foi utilizada como referência e acrescentada à todas as placas em triplicata.
As reações de qPCR foram realizadas em placas de 96 poços - MicroAmp®Optical
96 - Well Reaction Plate (Applied Biosystems by Life Technologies, EUA), seladas com
adesivos ópticos- Optical Adhesive Covers (Applied Biosystems by Life Technologies,
EUA) em termociclador ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems,
