UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
Marta Gonçalves Amaral
Pelotas, 2009
TRANSFERÊNCIA GÊNICA EM CÉLULAS
ESPERMÁTICAS DE MUS MUSCULUS E RAMDIA
Marta Gonçalves Amaral
TRANSFERÊNCIA GÊNICA EM CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE MUS
MUSCULUS E RAMDIA QUELEM
Orientador: João Carlos Deschamps
Pelotas, 2009
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (Área de concentração: Transgênese Animal).
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/1032 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
A485t Amaral, Marta Gonçalves
Transferência gênica em células espermáticas de Mus
musculus e Ramdia quelen / Marta Gonçalves Amaral ;
orientador João Carlos Deschamps ; co-orientador Tiago Collares e Fabiana K. Seixas. – Pelotas, 2009. – 76f. : fot. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2009.
1.Biotecnologia. 2.Espermatozóides. 3.DNA exógeno. 4.TMGT não cirúrgica. 5.Transgênes animal. 6.DNase. 7.Mamíferos. 8.Peixes.9.Mus musculus. 10.Ramdia quelen. I.Deschamps, João Carlos. II.Collares, Tiago. III.Seixas, Fabiana K. IV.Título.
Banca examinadora:
Prof. Dr. Luis Fernando F. Marins, Universidade Federal de Rio Grande Prof. Dr. Tiago Collares, Universidade Federal de Pelotas
Profa. Dra. Fabiana K. Seixas, Universidade Federal de Pelotas
Prof. Ph.D. João Carlos Deschamps, Universidade Federal de Pelotas
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realização do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Ao meu orientador, prof. Deschamps, por ter me aceitado em seu laboratório, por sua orientação, pela confiança dispensada na execução deste trabalho e também pela contribuição para o meu crescimento profissional.
Ao meu pai, meu maior incentivador, saudade! À minha mãe, pelo carinho incondicional. À minha filha, pela compreensão diária.
Ao meu marido, companheiro de todas as horas, pelo apoio, compreensão, paciência, carinho e incentivo.
Aos incansáveis amigos e colegas Tiago, Fabiana e Vinícius pela compreensão, apoio e incentivo.
À Claudia pelo carinho e companheirismo.
Aos colegas do laboratório de Embriologia molecular e Transgênese animal, Priscila, Thaís, Cristian, Evelise, Karine, Elias, Ingrid, Breno e Fabrício.
À Michele por sua boa vontade e seu indispensável auxílio na execução diária das tarefas.
Aos demais professores, colegas, estagiários e amigos do Centro de Biotecnologia, pela amizade e pelo agradável convívio .
A todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
RESUMO
Amaral, Marta G. TRANSFERÊNCIA GÊNICA EM CÉLULAS
ESPERMÁTICAS DE MUS MUSCULUS E RAMDIA QUELEM 2009. 76 f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós - Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Os animais transgênicos vêm sendo empregados como modelos biológicos em estudos das funções dos genes e dos seus mecanismos de ação, bem como para melhorar a produção animal. Pesquisadores vêm tentando produzir animais transgênicos que serão doadores de órgãos em xenotransplantes. Outra utilização da transgênese animal é a produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico a partir de diversos tecidos e fluidos corporais de diferentes espécies de animais. Em relação à TMGT (Testis
Mediated Gene Transfer) foi avaliada a eficiência da transmissão do transgene
EGFP em camundongos, utilizando a TMGT não cirúrgica, sem o uso de eletroporação no epidídimo; utilizando transfectantes como o DMSO, lipossomos, e pela primeira vez o DMA. A detecção da expressão do EGFP foi avaliada in vivo na F0 e por PCR, para comprovar a eficiência da TMGT não cirúrgica. Também foi analisado qual dos transfectantes propiciou a maior taxa de transmissão e se eles causaram danos histológicos aos testículos, através de análise histológica. Não foi detectada a expressão de EGFP, através da luz ultravioeta na F0. Os resultados da análise de PCR demonstraram que o lipossomo e o DMSO foram os melhores transfectantes do pEGFP na F0. A análise histológica demonstrou que a injeção de DMSO com o DNA exógeno,
pode comprometer o desenvolvimento das células germinativas do túbulo seminal. O objetivo em relação à SMGT (Sperm-mediated gene transfer) foi avaliar a interação dos espermatozóides de silver catfish (Rhandia quelen) com o vetor pEGFP. Foi observado que o sêmen após três lavagens em solução isosmótica e centrifugadas à 1000 x g, eliminaram as proteínas do plasma seminal e preservaram a motilidade celular. O tempo de atividade da DNase no plasma seminal foi de 30 minutos, a temperatura de atividade da DNase variou entre 33-53°C e sua inativação ocorreu aos 70°C. Na presença de EDTA 30mM a atividade da DNase foi inibida. Através da PCR foi detectada a presença do pEGFP no DNA dos espermatozoides do silver catfish, que incorporaram o vetor em diferentes concentrações (5-100 ng/106 espermatozoides). Concluímos que os espermatozoides do silver catfish precisam ser lavados para retirada do da DNase do plasma seminal antes de entrar em contato com o DNA exógeno, e que após as lavagens ocorreu a internalização do DNA exógeno no espermatozoide.
Palavras-chave: espermatozoides, DNA exógeno, TMGT não cirúrgica, DNase, mamíferos, peixes.
ABSTRACT
Amaral, Marta G. GENIC TRANSFER IN SPERM CELLS IN MUS MUSCULUS AND RAMDIA QUELEM 2009. 76 f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós - Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Transgenic animals have been used as biological models in studies of the genes functions and their mechanisms of action, as well as to improve animal production. Researchers are trying to produce transgenic animals that will be organs donors in xenotransplants. Another use of the transgenic animal is in the production of recombinant proteins for pharmaceutical interest, starting from several tissues and corporal fluids of different animal species. Using TMGT (Testis Mediated Gene Transfer), the efficiency of pEGFP transgene transmission in mice using non surgical TMGT was evaluated, without epididymis electroporation; using transfectants as DMSO, liposomes, and for the first time the DMA. To evaluate the efficiency of non surgical TMGT in F0 the EGFP expression was evaluated in vivo and detection in genome was conducted by PCR analysis. Moreover, we evaluated which transfectants were more efficient in transgene transmission and if it induce histological damage in testis, by histological analysis. EGFP expression was not detected in F0 through the ultraviolet light.The result of the PCR analysis shows that liposomes and DMSO were the best transfectants for pEGFP in F0. The histological analysis shows that injections of DMSO with exogenous DNA could affect the development of the germ cell of seminal tubules. The purpose about SMGT was to evaluate the interaction of the spermatozoa of silver catfish with pEGFP
vector. It was observed that the semen after three washes in isosmotic solution and at 1000 x g centrifugation could eliminate seminal plasma proteins and preserve cellular motility. The time of action of DNase in the seminal plasma was 30 minutes, the temperature of action of DNase ranged between 33-53°C and its inhibition was detected at 70°C. In the presence of EDTA 30mM the activity of DNase was inhibited. Through PCR it was detected that in the DNA of the silver catfish’s spermatozoids, the amplicon of EGFP at different concentrations of pEGFP vector (5-100 ng/106 spermatozoa). We demonstrate that spermatozoa of the silver catfish need to be washed to remove seminal plasma before contact with exogenous DNA, after several washes exogenous DNA was internalized in spermatozoa.
Key words: spermatozoa, exogenous DNA, non surgical TMGT, DNase, mammals, fish.
SUMÁRIO
TRANSFERÊNCIA GÊNICA EM CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE MUS
MUSCULUS E RAMDIA QUELEM ... 1
RESUMO... 5
ABSTRACT ... 7
1 INTRODUÇÃO GERAL... 11
2 ARTIGO I ... 14
Geração de animais transgênicos pela transferência gênica mediada por espermatozoides (REVISÃO BIBLIOGRÁFICA) ... 15
RESUMO... 15
ABSTRACT ... 17
INTRODUÇÃO ... 17
TRANSFERÊNCIA GÊNICA MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES (SMGT)... 19
CONCLUSÕES ... 27
REFERÊNCIAS ... 28
3 ARTIGO II ... 34
Testis-mediated gene transfer in mice: non surgical injection, DNA complexes, transgene transmission and histological analyses of testicular damage ... 35
ABSTRACT ... 36
INTRODUCTION ... 37
METHODS ... 38
DISCUSSION ... 41 AKNOWLEDGEMENTS ... 43 REFERENCES ... 43 FIGURE LEGEND ... 46 TABLE I ... 47 TABLE II ... 48 TABLE III ... 49 FIGURE 1 ... 50 4 ARTIGO III ... 51
Genetic manipulation of silver catfish (Rhamdia quelen) spermatozoa by Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT) as biotechnologycal potential alternative ... 52
ABSTRACT ... 53
INTRODUCTION ... 54
MATERIALS AND METHODS ... 57
RESULTS ... 61 DISCUSSION ... 62 ACKNOWLEDGEMENTS... 65 REFERENCES ... 65 FIGURE CAPTIONS ... 71 FIGURE 1 ... 72 5 CONCLUSÕES ... 73 6 REFERÊNCIAS ... 74
1 INTRODUÇÃO GERAL
A transferência gênica pode ser empregada na produção de animais transgênicos, que serão utilizados em estudos básicos, ou direcionada ao desenvolvimento de animais com alto valor genético, na geração de animais para consumo humano e animal; também pode ser aplicada na indústria farmacêutica e na produção de órgãos para xenotransplante em humanos (GANDOLFI, 2000; HOUDEBINE, 2002; MONTOLIU, 2002; NIEMANN & KUES, 2003; KEEFER, 2004; EKSER, 2009).
A geração de animais transgênicos vem sendo relatada em quase todas as espécies animais, mas seu uso ainda apresenta dificuldades, como a baixa integração do transgene, baixa percentual de animais, dependendo da metodologia e da espécie utilizada. Os animais transgênicos podem ser gerados por Transferência Nuclear em Células Somáticas (TNCS), por microinjeção de DNA exógeno no pró-núcleo de oócitos fertilizados, por Transferência gênica mediada por testículos (TMGT) ou por Transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT), usando células espermáticas como vetores do DNA exógeno (WALL et al., 1999; HOUDEBINE, 2002). Já foi comprovado que os espermatozóides são capazes de permitir a entrada do DNA exógeno e entregá-lo ao oócito no momento da fecundação, gerando embriões transgênicos (LAVITRANO et al., 1997; SPADAFORA, 1998; KIM et al., 2009). Os espermatozoides possuem características espécie-específicas, bem como a composição do plasma seminal. O sucesso ou insucesso, na geração de transgênicos, irá depender do conhecimento dessas diferenças
com a combinação da técnica eleita. (LAVITRANO, 1992; MAIONE et al., 1998; LU et al., 2002; NAGASHIMA et al., 2003; WEBSTER et al., 2005; BACCI et al., 2009).
Foram estudadas nesta tese variações da técnica de transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT) em camundongos e em peixes. O objetivo no estudo da TMGT foi verificar qual dos transfectantes (DMSO, DMA e lipossomas) foi capaz de internalizar o DNA exógeno, sem causar lesões testiculares, através de injeção não cirúrgica em Mus musculus. Para a SMGT o objetivo foi estabelecer um protocolo de inserção do DNA exógeno para o sêmen de silver catfish. Os objetivos específicos são expostos a seguir na descrição de cada artigo.
Inicialmente é apresentada uma revisão bibliográfica (artigo I) sobre a técnica de TMGT (transferência gênica mediada por espermatozóides) na geração de animais transgênicos , intitulada: "Geração de animais transgênicos pela transferência gênica mediada por espermatozoides". Nesta revisão, foi pesquisado os principais avanços na utilização dos espermatozoides como vetores de DNA exógeno na geração de animais transgênicos, através das modificações da SMGT. Esta revisão foi submetida à publicação na revista Ciência Rural.
Em seguida, o artigo II intitulado: "Testis-mediated gene transfer (TMGT) in mice: non surgical injection, DNA complexes, transgene transmission and histological analyses of testicular damage". O objetivo foi avaliar uma modificação da técnica de TMGT. Experimentamos uma técnica não cirúrgica usando diferentes transfectantes que podem ser utilizados na TMGT e se algum transfectante poderia causar danos aos testículos, prejudicando a
reprodução e consequente geração destes transgênicos. Os objetivos específicos foram: verificar a expressão do DNA exógeno na F0, através da luz ultravioleta, comprovar a inserção do DNA exógeno pela PCR, eleger o transfectante mais eficiênte na geração de camundongos transgênicos pela TMGT não cirúrgica. Esse trabalho foi submetido à publicação, como artigo completo, ao periódico Biological Research.
O artigo III, intitulado "Genetic manipulation of silver catfish (Rhamdia
quelen) spermatozoa by Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT) as
biotechnologycal potential alternative", foi observado o comportamento dos espermatozoides na presença do DNA exógeno. Nesse experimento, foi estabelecido um protocolo que impeça a ação da DNase sobre o DNA exógeno e que simultaneamente, não prejudique o espermatozoide permitindo a internalização do DNA exógeno ao DNA endógeno na geração de silver catfish transgênico por SMGT. Os objetivos específicos foram: detectar a presença da DNase no plasma seminal, verificar o tempo de atividade da DNase, verificar a temperatura de ação da DNase, verificar a temperatura de desnaturação desta enzima, determinar a concentração de EDTA que inibe a atividade da DNase e determinar a concentração ideal de DNA exógeno para ser internalizado pelo espermatozóide do silver catfish. Este trabalho será submetido à publicação, como artigo completo, para a revista Animal Reproduction Science.
Os dados encontrados estão apresentados na forma de artigos científicos apresentados a seguir. Os artigos estão compilados na formatação exigida por cada um dos periódicos científicos em que foram ou serão submetidos.
2 Artigo I
Geração de animais transgênicos pela transferência gênica mediada por espermatozoides
I
Aluno do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Centro de Biotecnologia; Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil.
II
Professor do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Centro de Biotecnologia, UFPel, Pelotas, RS, Brasil.
Autor para correspondência e-mail: [email protected]
Geração de animais transgênicos por transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT).
Generation of transgenic animals by sperm-mediated gene transfer (SMGT).
Marta G. AmaralI Vinicius F. CamposI Fabiana K. SeixasII Tiago CollaresII João Carlos DeschampsII
-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA-
RESUMO
A geração de animais transgênicos através da SMGT(Sperm metiated gene
transfer) vêm crescendo nos últimos anos, por ser uma técnica de fácil execução, baixo
custo e ainda pode ser usada em diversas espécies para o desenvolvimento de novos modelos transgênicos. Os animais transgênicos são usados como modelos biológicos em estudos das funções dos genes e dos seus mecanismos de ação, no melhoramento da produção animal, na geração de animais resistentes a determinadas doenças, na produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico, como doadores de órgãos para xenotransplantes. Células espermáticas de diversas espécies, são usadas como vetores de DNA exógeno para gerar animais transgênicos. Nosso objetivo foi buscar a atualização dos principais avanços na utilização dos espermatozoides como vetores de DNA exógeno para gerar animais transgênicos, através das modificações na metodologia da SMGT ou do uso de novos transfectantes. Notamos que o problema central da SMGT é que a integração do gene exógeno ao DNA endógeno, não é completa, gerando mosaicos. Ainda são necessárias alterações na metodologia da
SMGT, para diminuir a expressão epissômica na prole. Esperamos que aumento da utilização de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico, instigue novas mudanças na metodologia da SMGT, solucionando o problema da expressão epissômica.
ABSTRACT
The generation of transgenic animals has been growing in the last years by SMGT for the following reasons; it is an easy technique to be executed, it has a lower price and it could be used in many species to develop new transgenic models. The transgenic animals are used as biologic models in studies of gens’ functions and its mechanisms of action, for better production of animal and in animals generation resistant to some diseases, in the production of recombinant proteins for pharmaceutics interests, and as organs donor to xenotransplants. Spermatic cells of many species are used as exogenous DNA vector to generate transgenic animals. Our propose was to get the actualization of principal progress in the use of spermatozoids as a vector of exogenous DNA to generate transgenic animals, trough SMGT methodology modification or the use of new transfectant. We observed that the main problem of SMGT was that the integration of the exogenous gen of endogenous DNA is not complete, therefore developing mosaics. Alterations in SMGT methodology are still necessary to reduce epissomic expression in the descendants. We hope that the amplification of the utilization of recombinants proteins for pharmaceutics interests provokes new changes in SMGT methodologies, finding a solution to the epissomic expression problem.
Key-words: transgenic animals, spermatozoids, exougenous DNA, transfection.
INTRODUÇÃO
Há quase 40 anos foi gerado o primeiro animal transgênico, através da manipulação espermática, por BRACKETT et al. (1971). Eles produziram embriões de coelhos transgênicos pela fertilização de oócitos por espermatozoides pré-incubados
com o simian virus 40 (SV40), nesta época, esta metodologia de geração de animais transgênicos por produção em massa, não recebeu denominação, posteriormente foi denominada "Transferência gênica mediada por espermatozoides ou SMGT". Desde então, vários relatos como os de GORDON et al. (1980), BRINSTER et al. (1981) e PALMITER et al. (1982) descreveram outra técnica para a criação de linhagens de animais transgênicos, a microinjeção de DNA no pró-núcleo de oócitos fertilizados, levando a geração de camundongos transgênicos, isto é, com os genes exógenos inseridos de forma estável ao seu genoma. Outra forma de gerar animais transgênicos é por Transferência Nuclear em Células Somáticas (TNCS), onde o núcleo de uma célula doadora é transferido para uma célula receptora anucleada. A TNCS foi utilizada por WILMUT & SCHNIEKE (1997), para a geração da ovelha Dolly.
A transgênese animal é uma das técnicas usadas na biotecnologia moderna defendida por CHANG et al. (2008), HOUDEBINE (2009), HAREL- MARKOWITZ et al. (2009), LEE et al. (2009) e AL-GHOBASHY et al. (2009). Os animais transgênicos vêm sendo usados como modelos biológicos em estudos das funções dos genes e dos seus mecanismos de ação, bem como para melhorar a produção animal (SARMASIK, 2003). Apesar do grande interesse em produzir animais com maior taxa de crescimento corporal e rendimento de carcaça, existem poucos trabalhos nesse campo.
Na área da saúde humana, muitos pesquisadores vêm tentando produzir animais transgênicos que serão doadores de órgãos em xenotransplantes (transplante de órgãos entre diferentes espécies), a espécie suína é a que está se destacando mais para essa utilização em humanos (EKSER et al., 2009). Outra utilização da transgênese animal na área biomédica está relacionada à produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico (HWANG et al., 2004) em diversos tecidos e fluidos corporais de diferentes espécies de animais (COLLARES et al., 2007). O leite produzido por animais
transgênicos vem sendo citado na maioria dos estudos desta área, onde é produzida altas concentrações de proteínas recombinantes. Espécies como vaca, cabra, porco, coelho e ovelha já foram usadas para produzir proteínas recombinantes humanas como a lactoferrina, α1-antitripsina, hormônio do crescimento, anticorpo monoclonal contra o câncer de cólon, proteína ativadora do plasminogênio, proteína C, calcitonina, eritropoetina, insulina-como fator 1 do crescimento, interleucina 2, fibrinogênio, fator VIII e fator IX da coagulação sanguínea (RUDOLPH, 1999).
O desenvolvimento de técnicas de fácil execução e baixo custo para a geração destes animais transgênicos é crucial para o incremento de novos modelos transgênicos em diferentes espécies. Esta revisão busca apresentar os principais avanços na utilização dos espermatozoides como vetores de DNA exógeno na geração de animais transgênicos e discutir os principais problemas dessa metodologia.
TRANSFERÊNCIA GÊNICA MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES (SMGT) Um crescente número de publicações científicas usando a técnica da transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT), nas mais variadas espécies como em mamíferos, aves (NAKANISHI & IRITANI, 1993), peixes (KOOH et al., 1992), anfíbios (HABROVA et al.,1996), ouriço do mar (AREZZO, 1989) e insetos (ATKINSON et al., 1991). A SMGT é o método mais barato para produzir animais transgênicos de grande porte (SHEMESH et al., 2000; WEBSTER et al., 2005) e seu uso vem obtendo um grande sucesso em bovinos e suínos (BACCI et al., 2009). Em camundongos a eficiência da SMGT é aproximadamente 33% (YIN et al., 2009) e quando comparamos com microinjeção, que é uma técnica muito usada na geração de camundongos transgênicos, observamos que a eficiência da microinjeção é bem mais baixa variando entre 0,5 - 4% (WOLF et al., 2000). Provavelmente, os resultados
obtidos com o uso da SMGT se deve a habilidade espontânea que os espermatozoides apresentam em transportar e incorporar o DNA exógeno ou RNA, porque a membrana nuclear apresenta proteínas de ligação específicas para as ácidos nucléicos, permitindo sua interiorização (ANZAR & BUHR, 2006; SCIAMANNA et al., 2009). Foi observado que as moléculas de DNA maiores são levadas preferencialmente em relação às menores devido, possivelmente, porque as moléculas maiores possuem mais carga negativa que as moléculas menores (LAVITRANO et al., 1992). O mecanismo RT - dependente (transcriptase reversa- dependente) que opera nos espermatozoides é responsável pela gênese de novos retrogenes que poderão ser entregues a embriões durante a fertilização e mais adiante propagados em tecidos de indivíduos adultos (SCIAMANNA et al., 2009). Quando a RT endógena é funcional dentro do espermatozoide e as moléculas de RNA exógeno são internalizadas, elas irão servir de substrato para a transcrição reversa formando cópias de cDNA.
O primeiro DNA exógeno introduzido com sucesso em espermatozoides foi realizado por BRACKETT et al. (1971), onde o DNA exógeno foi tratado com timidina tritiada e incubado com sêmen de coelhos; foi verificado que o DNA marcado estava dentro da cabeça do espermatozoide. Quase 20 anos depois, AREZZO (1989) mostraram que tanto o DNA homólogo, como o heterólogo, penetraram no esperma de ouriço-do-mar permitindo que o transgene pudesse ser expresso nos embriões.
Para execução da SMGT não são necessários equipamentos sofisticados ou habilidade manual como na microinjeção, ou como no sistema robótico de microinjeção automática. O espermatozoide torna-se o vetor de DNA, isto é, o DNA exógeno é transfectado para o núcleo do espermatozoide, viabilizando a transferência gênica em massa (LAVITRANO et al., 1989; LAVITRANO et al., 1992; LAVITRANO et al., 1997). Através da SMGT é possível produzir embriões em massa em um mesmo
momento, o que desperta grande interesse na geração de animais transgênicos de espécies marinhas (SPADAFORA, 1998). O uso de espermatozoides como vetor de DNA é o método menos invasivo para gerar animais transgênicos (CHAN, 1999). Na produção de peixes transgênicos, a SMGT é a técnica com maior potencial para ser a mais utilizada devido ao mecanismo natural de fecundação e também porque em algumas espécies de peixes os espermatozoides, podem ser conservados com viabilidade por vários dias (SARMASIK, 2003). As moléculas de DNA exógeno podem se associar a estas células, conforme foi demonstrado por SIN et al. (2000), que usaram espermatozoides de salmão eletroporados em conjunto com a técnica de SMGT.
LAVITRANO et al. (1989) demonstraram que, através de uma simples incubação, os espermatozoides de ratos, retirados do epidídimo, foram capazes de incorporar o DNA exógeno. Quando foi incubado o DNA linear aos espermatozoides, obtiveram 30% de expressão, provavelmente porque a origem dos espermatozoides testados era do epidídimo, isto é, estas células não entraram em contato com o plasma seminal. Por outro lado, os espermatozoides do epidídimo reagem à invasão do DNA exógeno liberando nucleases que degradam o DNA exógeno (MAIONE et al., 1997).
Nos testes de FRANCOLINI et al. (1993) e MAIONE et al. (1998) a frequência de incorporação do DNA nos espermatozoides foi uniforme (90%), mas, a proporção de fetos transgênicos era muito variável na progênie (0-100%) estes dados foram comprovados por Southern blot.
Algumas proteínas espermáticas com tamanho entre 30-35 kDa presentes na membrana celular dos espermatozoides de muitos vertebrados foram identificadas por LAVITRANO et al. (1992). Estes autores sugerem que estas proteínas participam na captação do DNA através da membrana celular do espermatozoide e observaram que
estas proteínas agem como substratos para a ligação do DNA, formando um complexo estável espermatozoide-DNA.
SPADAFORA (2008), também descreve que a maioria das sequências exógenas que são captadas pelo espermatozoide de camundongos, permanece de forma não integrada ao DNA endógeno, aparecendo como estruturas epissômicas (DNA exógeno que não se integra ao DNA endógeno). Algumas características notáveis podem ser observadas nestes animais: (1) os animais transgênicos positivos frequentemente apresentam uma manutenção estável do baixo número de cópias (<1 cópia por genoma), ficando abaixo do poder de detecção pela análise de Southern blot convencional, mas, o que pode ser detectável através da amplificação por PCR; (2) os animais transgênicos obtidos por SMGT apresentam distribuição de mosaicos (tecidos que têm duas ou mais populações celulares com constituições cromossômicas ou genéticas distintas); (3) a manutenção da estrutura como extracromossômica não integrada e; (4) herança não Mendeliana.
Em uma comparação entre mamíferos e peixes transgênicos biorreatores, os últimos, apresentam vantagens sobre mamíferos transgênicos como um tempo de geração curto; apresentam um rápido crescimento, uma breve maturação sexual e grande geração da prole. O zebrafish Danio rerio, produz cerca de 200 ovas por fêmea; o salmão Salmo salar, 10.000 por fêmea, a carpa Cyprinus carpio, 100.000 por fêmea (ROCHA et al., 2004). A geração de peixes transgênicos apresenta outras vantagens em relação aos mamíferos; nos peixes os embriões se desenvolvem fora do organismo materno; também oferecem baixo custo de manutenção e uma baixa probabilidade de transmitir patógenos aos humanos, isto é, a transmissão de vírus e príons não é conhecida entre peixes e humanos (CHEN & POWERS, 1990; MOFFAT, 1998; LIN, 2000). Por outro lado, quando os peixes transgênicos são produzidos através da
microinjeção, frequentemente apresentam baixo percentual de integração do gene exógeno e a maioria dos transgênicos são mosaicos (ROCHA et al., 2004). Além disso, em alguns peixes transgênicos, o gene exógeno não está integrado ao genoma (epissômico) e não é transmitido para a prole (NIILER, 2000). Nos mamíferos, genes epissômicos não são observados com frequência, por isso, alguns pesquisadores preferem produzir mamíferos transgênicos, enquanto outros consideram que os genes epissômicos facilitam a regulação da expressão do transgene, porque a localização do gene exógeno no genoma pode evitar ou não sua expressão (HOUDEBINE & CHOURROUT, 1991; HOUDEBINE, 2000). Na opinião de HOUDEBINE (2002), a disponibilidade de vetores epissômicos seguros, simplificaria o controle da geração de animais de transgênicos em todas as espécies, onde os peixes já levam vantagem. Na maioria das vezes, a SMGT em animais aquáticos é um procedimento simples, onde os espermatozoides, obtidos de machos doadores, são incubados com o DNA exógeno, contudo, SPADOFORA (1998) salienta que altas concentrações de DNA exógeno podem matar os espermatozoides. A concentração de DNA exógeno para cada espermatozoide varia de acordo com a espécie, SMITH (2002) sugere três características consistentes: (a) a quantidade de DNA exógeno é positivamente correlata a quantidade de DNA que o espermatozoide carrega; (b) o DNA exógeno é internalizado quando a sua concentração é em torno de 10-30 ng/106 espermatozoides, variações acima disto podem matar os espermatozoides; (c) o DNA exógeno transportado pelo sêmen poderá ter um efeito tóxico dose-dependente no embrião.
No entanto, o sucesso da produção de proteínas terapêuticas produzidas através de animais transgênicos irá depender da eleição da técnica e dos avanços na inserção de genes exógenos, seja pela microinjeção ou pela transferência gênica mediada por espermatozoides (BÖSZE et al., 2008; HOUDEBINE, 2009; MOISYADI et al., 2009).
Em busca de melhores resultados, variações e adaptações da técnica de SMGT vão surgindo, uma delas foi à lavagem dos espermatozoides com soluções de diferentes concentrações osmóticas e eletroporação, visando aumentar a entrada de DNA exógeno no espermatozoide, esta combinação é adequada para os peixes, uma vez que os espermatozoides dos peixes precisam ser hidratados para se ativarem. O mecanismo de entrada de água no espermatozoide é aproveitado para inserir o DNA exógeno. O método requer que o sêmen seja desidratado com uma solução hiperosmótica, e reidratado com uma solução hiposmótica, contendo a construção gênica (KANG, et al., 1999).
Baseado nestes relatos é possível observar que o sucesso na SMGT depende de três etapas essenciais: ligação do DNA exógeno ao espermatozoide, internalização e integração do DNA exógeno (SPADAFORA, 2008). Algumas variações desta técnica adicionam outras denominações a SMGT, normalmente, de acordo com o processo experimental que é realizado. Estas variantes são:
1) ICSI (Intra Citoplasmatic Sperm Injection): é uma variação da SMGT conjunta com a microinjeção, onde ocorre a injeção direta do espermatozoide, previamente incubado com o DNA exógeno, no oócito. Nesta metodologia, geralmente são usados lipossomos ou DMSO como transfectante do DNA exógeno. É uma ferramenta muito usada para a produção de camundongos transgênicos, mas ainda é ineficiente para mamíferos maiores (GARCIA-VÁZQUEZ et al., 2009). A taxa de fertilização em bovinos varia entre 50-80%, em suínos varia de 6.1% a 40.1%, entretanto em pequenos ruminantes a taxa varia entre 11,7 a 35% (GARCÍA-ROSELLÓ et al., 2009). A vantagem da ICSI é que, a observação da expressão gênica é uniforme, porque esse método evita o
problema do mosaicismo, decorrente da integração tardia ou da expressão epissômica. Nesta técnica, o percentual de animais transgênicos é baixo, mas, aqueles que são transgênicos têm 100% de integração do DNA exógeno (POLEO et al., 2001). Recentemente foi testado um novo transfectante, composto por nanopartículas magnéticas (MNPs) nos espermatozoides de suínos. Os resultados dessa pesquisa demonstraram que o DNA exógeno foi internalizado pelo vetor de nanopartículas ao espermatozoide e que também foi entregue ao oócito através de fecundação in vitro (KIM, et al., 2009).
2) REMI (Restrict enzimatic mediatet integration): esta variação utiliza enzimas de restrição para criar extremidades coesivas no DNA genômico, a fim de facilitar a integração do DNA exógeno também digerido com as mesmas enzimas de restrição. O DNA exógeno é introduzido no espermatozoide junto com a enzima de restrição através de lipofecção ou eletroporação. Esta técnica foi bem sucedida para a produção de aves transgênicas como foi demonstrado por HAREL-MARKOWITZ et al. (2009).
3) LB-SMGT (Linker-based SMGT): esta variante foi relatada por CHANG et al. (2002), visa aumentar a ligação do DNA exógeno com os espermatozoides e minimizar qualquer interferência prejudicial à fertilização. O DNA exógeno linear contendo um gene repórter ligado de forma não covalente a um anticorpo monoclonal (mAb), reconhece o antígeno específico, que está localizado na superfície da membrana do espermatozoide. O complexo ―DNA exógeno + anticorpo‖ promove a marcação dos espermatozoides e facilita a internalização do complexo de
―DNA exógeno + anticorpo‖, por endocitose na membrana celular. Os resultados obtidos com o uso dessa técnica foram altamente eficientes na F1 (37.5% em suínos e 33% em camundongos). A Transmissão para F2 em suínos foi de 61%.
4) RT-SMGT (Reverse transcriptase – Sperm mediated gene transfer): esta variante da SMGT, utiliza a transcriptase reversa endógena de um retrotransposon, que transcreve reversamente um RNA viral exógeno em fragmentos de cDNA, que são transferidos para embriões, pelos espermatozoides no momento da fertilização. Os espermatozoides podem transcrever reversamente o RNA exógeno e gerar sequências transcricionalmente competentes, que serão transmitidas para a progênie (SPADAFORA, 2008). Métodos alternativos de transgênese viral relatam o uso do retrovírus recombinante da Leucemia Murina de Moloney, para levar os genes ao embrião demonstraram que esta variação é eficaz em murinos, suínos e bovinos (JAENISCH, 1976; CHAN et al., 1998; CABOT et al., 2001). Porém, os retrovírus estão sujeitos a modificações epigenéticas e sua expressão pode ser perdida durante embriogênese (JAENISCH, 1976) ou logo após nascimento (CHAN et al., 1998). HOFMANN et al. (2003) usaram retrovírus (LV-PGK e LV-K14) para produzir suínos e bovinos transgênicos obtendo alta taxa de embriões suínos, que variou entre 70 - 94%; e no embriões bovinos a taxa variou de 45 - 92%. O vetor retroviral (PLNCX2), usado por ZI et al., (2009) para produzir lactoferrina recombinante humana em Bos grunniens, gerou aproximadamente 26% de embriões transgênicos.
5) TMGT (Testis mediated gene transfer): é uma simples variação da SMGT, onde o DNA exógeno é introduzido no testículo ou no epidídimo, por meio de uma seringa, o DNA exógeno linear e/ou circular é injetado juntamente com um transfectante (lipossomas, DMSO, DMA). CHAN (1999) observou que o DNA exógeno não estava integrado ao genoma do espermatozoide e que a integração só acontece após a fertilização. LU et al. (2002) demonstraram esta técnica em sea bream. A construção gênica foi injetada 48 horas antes da coleta de sêmen permitindo a internalização com os espermatozoides. Os resultados obtidos pela análise da PCR variou entre 59-76% de transgênicos. Quando injetaram nos testículos, múltiplas doses de lipossomo-construção gênica, obtiveram 80% de transgênicos, comprovados pela PCR e por Southern blot, demonstraram que o transgene integrado ao genoma poderia ser transmitido à progênie.
CONCLUSÕES
Espermatozoides de diferentes espécies têm sido usados como vetores de DNA exógeno, produzindo animais transgênicos através de protocolos semelhantes, o que sugere um mecanismo análogo na interação DNA exógeno e espermatozoides. Modificações nas metodologias usadas em SMGT, bem como o uso de novos transfectantes, são necessários para de resolver a integração do gene exógeno, impedindo a expressão epissômica, a fim de diminuir a geração de mosaicos, obtendo assim, animais transgênicos. Observamos que a escolha do tipo SMGT que será empregada irá depender da escolha da espécie animal que será produzida, somada as condições financeiras dos pesquisadores. Acreditamos que em um futuro próximo,
aumente consideravelmente, a demanda para a produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico, estimulando o aprimoramento da SMGT na produção de animais biorreatores mais eficientes.
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3 ARTIGO II
Testis-mediated gene transfer in mice: non surgical injection, DNA complexes, transgene transmission and histological analyses of testicular damage
Testis-mediated gene transfer in mice: non surgical injection, DNA complexes, transgene transmission and histological analyses of testicular damage
MARTA G. AMARAL, VINICIUS F. CAMPOS, PAULO V. CAVALCANTI, FABIANA K. SEIXAS, LISIANE P. R. SELAU, JOÃO C. DESCHAMPS, TIAGO COLLARES*
Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Campus Universitário, CEP 96010-900 - Pelotas, RS, Brazil.
*Corresponding author: Tiago Collares, Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas, Caixa Postal 354 • CEP 96010-900, Pelotas – RS / Brazil, Phone: +55 53 32757588, [email protected]
ABSTRACT
Testis-mediated gene transfer (TMGT) has been used as in vivo gene transfer technology to introduce foreign DNA direct into testes, allow mass gene transfer, and the natural mating. We demonstrate the use of different DNA complexes with DMSO, DMA and Liposomes, and non surgical injection to improve TMGT, as well as consecutive DNA complex injection into mice testis. In vivo evaluation of EGFP expression and PCR were used to detect the expression and the presence of exogenous DNA in the progeny. We also evaluate the possible testicular damage by histological procedures. PCR-based analyses shows that liposome and DMSO treated groups were the best transfectans for transgene transmission of pEGFP vector. However, in vivo EGFP expression was not detected in all of treatements.The histological analyses demonstrate that injection of DNA complexes could affect the development of germ epithelium, mainly in the DMSO treated group. In summary, we demonstrate the transgene transmission by non surgical TMGT using different DNA complexes and also for the first time the testicular damage is possibly generated by consecutive injections of DNA complexes.
Key-words: TMGT, DMA (N,N-Dimethylacetamide), Liposome, mice, transgenesis, histological damage.
INTRODUCTION
During the last years, spermatozoa have been studied in order to be used for gene transfer in transgenic animal technology. Several distinct approaches have been developed. The first report that exogenous DNA could be introduced into sperm was made by Brackett et al. (1971). Several studies in distinct species have been reported the generation of transgenic animals using spermatozoa as vector to carry foreign DNA to the ova (Lu et al., 2002; Webster et al., 2005; Shen et al, 2006; Hoelker et al., 2007). One approach of TMGT is the direct introduction of foreign DNA into testes, so-called testis-mediated gene transfer (TMGT), that allows natural mating and mass gene transfer. This technique allows the abdication of the use of other procedures such as in vitro fertilization (IVF) and embryo transfer (ET). Sato et al. (2002) demonstrated this method by direct surgical injection of DNA solution into testes with subsequently "in vivo" electroporation to improve the uptake of foreign DNA by epididymal epithelial cells. Recently, Shen et al. 2006 demonstrated the efficient generation of rabbits and mice through TMGT using surgical injection in testes with a DMSO/DNA complex to improve uptake of foreign DNA by sperm cells. Further advancements of our knowledge in TMGT might offer an easier way to generate transgenic animals or an important route for germ line therapy in humans, once gene transfer into testicular somatic cells in order to rescue failing spermatogenesis become real one day (Coward, 2007).
Here we demonstrate the efficiency EGFP transgene transmission to mice offspring by TMGT with a non surgical injection of DNA solution and without electroporation of epididymis which reduces the injury to the male and laborious handling. As transfectants, we tested DNA complexes containing DMSO (Dimethilsulfoxide), liposomes (Lipofectin®
Transfection Reagent, Invitrogen®, USA) and for the first time, to our knowledge, DMA
(N,N-Dimethylacetamide) CH3CON(CH3)2 to improve the uptake of foreign DNA by sperm cells, substituting the in vivo electroporation. DMA is as a polar organic solvent and was used becouse it is not toxic, mutagenic, carcinogenic and it does not affect reproductive cells (IPCS INCHEM, 2010). In addition, we evaluated the injuries due to continuous injections of transfectants on testis by histological procedures.
METHODS
Animals
We used five groups with five 3-6 months old Balb/c Mus musculus male mice. After
treatments, each male was put to mate with two Balb/c females. The animals were maintained according to the guidelines of UFPEL’s Ethics Committee in Animal Experimentation.
Transfection Solutions
Twenty micrograms of circular eukaryotic expression vector pEGFP-N1® (Clontech®, USA) complexed with three different transfectants: DMSO 3%, DMA 3%, and Lipofectin 3%, all diluted in PBS without (Ca+2 and Mg+2 [PBS(-)], pH 7,2 ) and with 1% of trypan blue (Invitrogen®, USA), were used as transfection solutions (Sato et al., 2002). Also 20 µg of pEGFP diluted in the same PBS buffer with 1% of trypan blue, represent the fourth solution. The control group received only PBS buffer. To all treatments were added of 0, 1% of trypan blue.
Before testis injection, animals were sedated with 2mg/kg of acepromazine (Vetnil®, Brazil) by intraperitoneal way. The testes were exposed in scrotal sack by a digital pressure in the abdomen and were fixed with the fingertips to avoid a retraction during the injection and the asepsis of the scrotal sack was made with ethanol 70%. Briefly, 30 µl of each solution described previously was slowly injected in each testes of Balb/c mice of each group with a 30- G needle (BD Biosciences®, USA) attached to a 1-ml plastic disposable syringe at a depth of 3-4 mm through the scrotal sack. After injection the needle was slowly removed to avoid the leakage of the injected solution. Both testes were injected. Twenty four hours after injection, each male mated during a one week preriod with two Balb/c female without superovulation. This procedure was repeated three more times once a week, in the same males but mated new females.
pEGFP vector detection
After birth, in vivo EGFP expression was assessed using googles miner’s lamp GFsP-5 (BLS®, Hungary). The EGFP expression was researched in the skin, this procedure was repeated three times a week until the moment of DNA extraction. In addition, 60 days after birth, blood was collected for DNA extraction with PureLink™ Genomic DNA Purification Kit (Invitrogen®, USA). For vector detection in mouse genome polymerase chain reaction was performed using pEGFP –N1specific oligonucleotides (5'- CGGGACTTTCCAAAATGTCG -3' and 5'-GAAGATGGTGCGCTCCTGGA -3') to amplify a 500-base pair (bp) fragment. Primers were designed on the Vector NTI v.11 (Invitrogen, USA). PCR reactions were conducted as the following parameters: initial denaturation 94 °C/2 min followed by 30 cycles at 94 °C/1min, 50 °C/1 min and 72 °C/1 min more a final extension 72 °C/7 min. All PCR products were sequenced in automatic DNA sequencer MegaBACE 1000 (Amershan Biosciences, USA).
Histological damage analyses of injected testis.
Seven days after the last injection, the males were sacrificed and the testis were dissected out, fixed in Bouin, for 24 hours and then subjected to standard histological procedure, with sections of 5-6 µm thickness from each testis, and stained by hematoxilyn-eosin (HE). To compare treatments, testicular damages were ranked in a score described in table I. To each testes’ slide a score was attributed and comparison among treatments were conducted using the 126 score mean of each treatment.
Data analyses
Data from PCR and histological analyses were compared using one-way ANOVA followed by the Tukey's test for multiple comparisons. Significance was considered at p<0.05.
RESULTS
Transgene transmission to F0 offspring by non surgical testis injection
PCR analysis indicated that several born mice after weekly injections showed the presence of pEGFP vector in genomic DNA in all treatments. The sequencing analysis showed that all PCR products belonged to the pEGFP vector (data not showed). The transgene transmission was compared among treatments only in the second injection procedure, due to the presence of born mice in all treatments (table II). We found the best results using liposomes and DMSO tranfectants, followed by DNA and DMA. No born mice in the control group showed the presence of pEGFP vector in the PCR analysis. In all born mice the in vivo EGFP expression was not detected.
Histological damage analysis of injected testis
No testicular damage were found in the control group. For DNA, Liposomes and DMA treatments low testicular damage were observed but no significant differences were found among them. On the other hand the DMSO treatment has a high testicular damage (p < 0.0001 - see table III and figure 1).
DISCUSSION
In the present study is reported the non surgical testis injection coupled to DNA complexes as the innovative DMA (N, N-dimetylacetamide) to improve transgene transmission. The non surgical TMGT was able to transmit the pEGFP vector to born mice. The use of DNA complexes to enhance incorporation of exogenous DNA by sperm was previously demonstrated by Sato et al. (2002) and Shen et al. (2006). In our study, using DMSO tranfection, we obtained similar results as the group where the exogenous DNA was injected without transfectants.
The comparison among transfection solutions in TMGT showed that DMA produced similar results to DNA without any transfectant. The liposomes and DMSO produced the best results in transgene transmission. Kim et al. (1997) carried out the experiments with the commercial liposome transfection agent. They observed a weak transfection efficiency of the seminiferous tubule cells in mice from 1 to 12 weeks after injection. Therefore, the transgene was transferred by sperm to the first generation of offspring, but it was lost from most tissues during growth. Using a lipid-based method of transfection, Celebi et al. (2002) reported the transient transmission of a transgene in the progeny of male mice undergoing in vivo germ cell transfection. The transgene was successfully transmitted to offspring but might be remained as episomal DNA. The absence of EGFP in vivo expression in our study might be
attributed to the sensitivity of the assay. The limit of detection of EGFP (~ 30 µM) in fluorescent microscope is equivalent to ~ 4.000 cytoplasmic molecules per cell and many of the cells express EGFP below this limit (Harel-Markowitz et al., 2009). Also, the vector might have remained as episomal DNA, since we did not investigate the integration of exogenous DNA into host genome. The precise mechanisms mediating these events remain unknown. Some groups have suggested that an endogenous enzymatic system, which might be activated for DNA repair, could be involved in the integration of foreign DNA (Smith and Spadofora, 2005). We obtained better results in the second injection/mating. In other injection procedures at least one treated group had any birth. This effect may have been caused by the fact that female's ovulation was not induced. Also, injections into testis could produce testicular damage as demonstrated by our histological analysis. In controls no damage was observed. In contrast, testis injected with DNA, DMA or liposome showed significant damage in relation to the control group. The fact that DMA have presented damages in the teste suggests that new studies are to be accomplished in order to determine the ideal DMA concentration as transfectant. Moreover, DMSO-injected testis showed a high degree of damage when compared to other treatments. All testes that presented the damage above also demonstrated fibrosis, with higher intensity in DMSO. We believe that consecutive transfectant injection as DMSO can induce testicular degenerations and this might lead to a reduction in the vascularization around the seminiferous tubules and this fact could inhibit the cellular differentiation of germ cells, visualized in low or absent of germ epithelium.
In summary, we report the transgene transmission in mice by non surgical TMGT using different trasnfectant like DMA as transfectant. We demonstrate that lipofectin was the best treatment to transgene transmission. Also, we demonstrate the reduction of germ epithelium of testis after DNA complex injections, fact that must be elucidate for further applications of TMGT for "in vivo" gene transfer technology.
AKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by FAPERGS/Edital PROADE III (# 05/2328.6). V. F. Campos is student of the Graduate Program in Biotechnology at Universidade Federal de Pelotas and is supported by Brazilian CAPES. J.C. Deschamps is research fellow of CNPq.
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FIGURE LEGEND
Figure 1. Hematoxylin and eosin staining of injected testes with different treatments. (A) Control, seminiferous tubule without histological damage. (B) DMSO, atrophic somniferous tubules without germ cells and without Sertoli cells (asterisk). Stromal fibrosis, absence of Leydig cells and lymphocyte infiltrate are indicated by arrow. (C) DMA, seminiferous tubules with low germ epithelium (arrow). (D) DNA, mice testis with a small number of seminiferous tubules that shows low germ epithelium. (E) Liposome, mice testes with some number seminiferous tubules that shows low epithelium germinative (arrow). The magnification is 400 x in all panels.
Table I. Score description used for histological analysis
Score Testicular damage description
0 Without histological damage
1 Testis with a small number of ST that shows low GE 2 Testis with a some number of ST that shows low GE
3 Testis with a high number of ST that shows low EG and some of them without EG. 4 Testis with a predominance of ST that shows low EG and some of them without EG and
small area of fibrosis in the stroma
5 Testis in absence of GE in the ST and also with biggest area of fibrosis in the stroma and presence of lymphocytic inflammation.
Table II. Transgene transmission evaluated by PCR in F0 offspring after each injection and in each treatment. Transfectants injected with DNA
Lipofectin DMSO DNA DMA Control
N° neonates PCR positive (%) N° neonates PCR positive (%) N° neonates PCR positive (%) N° neonates PCR positive (%) N° neonates PCR positive (%) 1ª Injection 36 1 (2.7) 24 0 (0) 14 0 (0) 0 0 (0) 12 0 (0) 2ª Injection* 10 8 (80) a 9 5 (55.5) ab 18 5 (27.8) bc 26 3 (11.5) c 5 0 (0)c 3ª Injection 8 2 (25) 0 0 (0) 29 3 (10.3) 15 0 (0) 13 0 (0) 4ªInjection 11 3 (27.3) 1 0 (0) 9 0 (0) 0 0 (0) 7 0 (0)
Table III. Histopatolological analyses of testis damage after four injections.
Treatment Histological damage*
Control 0 a
DNA 1.6 ± 0.26 b
Lipofectin 2.7 ± 0.25 b
DMA 3.0 ± 0.21 b
DMSO 3.4 ± 0.22 c
*Data are expressed as means ± SEM (n=10) and represent the mean of scores (table I) in each treatment. Different letters indicate differences among means.
4 ARTIGO III
Genetic manipulation of silver catfish (Rhamdia quelen) spermatozoa by
Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT) as biotechnologycal potential
alternative
Genetic manipulation of silver catfish (Rhamdia quelen) spermatozoa by
Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT) as biotechnologycal potential
alternative
M.G. Amarala, V.F. Camposa,F.K. Seixasa, J.L.O.F. Pouey b, L.P.R. Selauc, T.Collaresa, J.C. Deschampsa
a
Program of Post-Graduation in Biotechnology, b College of Agronomy, Departament of Zootecnia, c Institute of Physics and Mathematics, Departament of Mathematics and
Statistics, Federal University of Pelotas, RS, Brazil, 96010-900
*Correspondence and reprint requests to: João Carlos Deschamps, PhD, Phone: 55- 53- 32757588, [email protected]
