Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp.
isoladas no Brasil e na Espanha
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências.
São Paulo
Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp.
isoladas no Brasil e na Espanha
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Disciplina de Infectologia - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
São Paulo 2012
DA SILVA, Rodrigo Cayô
Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isolados no Brasil e na Espanha. Rodrigo Cayô da Silva - São Paulo, 2012.
xxvi, 239f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Dynamics of β-lactams resistance in clinical samples of Acinetobacter spp. isolated in Brazil and Spain.
Key-words: Acinetobacter spp., β-lactâmicos, Brasil, Espanha, resistência aos antimicrobianos, biologia molecular, carbapenems.
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Alvaro Nagib Atallah
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Eduardo Alexandrino Servolo de Medeiros
São Paulo 2012
Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp.
isoladas no Brasil e na Espanha
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.
Titulares:
Profa. Dra. Gertrudes Corção
Professora Associada III do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Básicas da Saúde - ICBS e Vice-diretora do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS.
Profa. Dra. Marina Baquerizo Martinez
Professora Titular da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo - USP e Diretora do Laboratório Clínico do Hospital Universitário da USP.
Prof. Dr. Nilton Erbet Lincopan Huenuman
Professor Doutor do Instituto de Ciências Biomédicas - ICB da Universidade de São Paulo - USP.
Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Marra
Médico Infectologista Pesquisador da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP e Coordenador do Grupo de Suporte em Infecção do CTI-A do Hospital Israelita Albert Einstein - HIAE.
Suplentes:
Profa. Dra. Anna Sara Shafferman Levin
Professora Associada do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Presidente da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do Hospital das Clínicas - HC-FMUSP.
Prof. Dr. Afonso Luís Barth
Professor Adjunto do Departamento de Análises da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS e Chefe do Serviço de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas de Porto Alegre.
Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.
Francisco Cândido Xavier
Dedico este trabalho aos meus amados pais, Evandro e Elizabeth, cujo amor incondicional me fizeram sentir especial e amado em todos os momentos da minha vida. Obrigado por terem me dado princípios e educação, e pelo incansável incentivo para que eu lutasse pelos meus sonhos.
Agradeço as minhas queridas irmãs Cida, Cristina, Alessandra e Ana Paula (in memorian), pelo apoio e carinho constantes, e junto dos nossos pais me mostraram o verdadeiro significado da palavra família.
Agradeço a DEUS, por dar sentido a minha vida, por ser a força em todos os momentos, e por estar sempre ao meu lado, mesmo quando não me lembro dele.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Profa. Dra. Ana Cristina Gales pelo exemplo e determinação como profissional e microbiologista. Pelos ensinamentos constantes que permitiram a conclusão dessa tese. Pelo carinho e atenção que sempre teve comigo, por acreditar na minha capacidade e no meu trabalho, possibilitando a minha ida ao exterior para continuar os meus estudos. Por ter me confiado a supervisão do Laboratório ALERTA, permitindo o meu crescimento como microbiologista. Por ter me mostrado que é possível trabalhar com razão e sensibilidade. Muito obrigado por tudo. Sinto-me honrado por ter tido a sua orientação no meu doutorado.
Ao Prof. Dr. Luis Mártinez Mártinez, meu tutor no estágio sanduíche, por ter me ensinado tanto, com muita atenção e paciência. Por ter me entregado um projeto tão pessoal, como foi o projeto das PBPs, e por ter confiado sempre no meu trabalho e na minha capacidade. Por ter feito eu me sentir parte do grupo durante os quase dois anos em que vivi na Espanha. Pelos valiosos conselhos que sempre levarei comigo ao longo da minha vida acadêmica. Fico muito feliz e honrado pela oportunidade de ter trabalhado com você. Além de tutor, sei que posso te chamar de amigo.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari por ter acreditado na minha capacidade, permitindo que começasse meu estagio no LEMC a muitos anos atrás. Por ter sido meu orientador no meu mestrado e por ter me incentivado a fazer meu doutorado sanduíche. Sei que sempre esteve torcendo pela minha vitória. Muito obrigado.
Aos meus queridos amigos de Santander Jorge, Mapi, Javi, Pepe, Carmen e Liset por terem sido tão carinhosos e gentis comigo. Agradeço em especial a Jorge e a Mapi cujas palavras
dispensadas agora serão poucas para expressar toda a minha gratidão pelo tanto que me foi oferecido por vocês dois. Além de amigos, vocês dois são exemplos de que as dificuldades da vida são efêmeras quando se tem determinação e força de vontade. Fui tão feliz nos dois anos em que passei junto a vocês meus amigos, conheci lugares tão bonitos cujas lembranças desses momentos tão especiais estarão sempre comigo. Sei que não existe distancia, quando existe amizade verdadeira.
Aos meus colegas do “Laboratorio de Investigación” do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla - HUMV Belén Ruiz, Belén Campo, Fabián Unda, Alícia Marques, María Romo, Cristina Mirones, Elena Román, Patrícia Goicochea, Maria-Cruz Rodrigues e Alain Ocampo Sosa pela alegre e agradável companhia. A Maria-Cruz muito obrigado por todo o conhecimento transmitido que foram muito importantes no estudo das PBPs. Aprendi muito com você. A Belén Ruiz, cujo carisma e personalidade fizeram do nosso convívio tão alegre e descontraído. Ao querido grupo do “Cámara-café” pelos divertidos momentos que faziam nossas manhãs tão agradáveis.
A todos os funcionários do “Servicio de Microbiología” do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla - HUMV por terem me recebido tão bem, sempre com um sorriso no rosto para todas as minhas dúvidas. Em especial agradeço a todos os médicos e farmacêuticos microbiologistas responsáveis por cada seção do “Servicio de Microbiología”: Prof. Dr. Jesus Aguero Balbin, Dr.
Jorge Calvo Montes, Dra. Maria Eliecer Cano Garcia, Dr. Carlos Fernandez Mazarrasa, Dra.
Celia Garcia de la Fuente, Dra. Maria Asuncion Rodriguez Feijoo, Dra. Maria Pia Roiz Mesones, Dra. Ana Saez Lopez, Dr. Carlos Antonio Salas Venero, Dra. Maria Victoria San Juan Bilbao, Dra. Raquel Viar Diego, Dra. Maria Antonia Bernal Rubio, Dr. Ricardo Salesa Gutiérrez de Rozas e Dra. Begoña Perea; e também aos residentes: Carlos Ruiz de Alegria,
Maitane Aranzamendi, Monica Gonzalo, Inmaculada Concepción Bernal, Omara Rivera e Laura Guzman.
A todos os grupos de pesquisa na Espanha aos quais tive a oportunidade de trabalhar em conjunto para a conclusão de alguns dos trabalhos aqui apresentados: Prof. Dr. Jordí Vila do Hospital Clinic de Barcelona, Prof. Dr. Gérman Bou do Complejo Hospitalario Universitario A Coruña de La Coruña, Prof. Dr. Juan A. Ayala do Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de Madrid, Prof. Dr. Álvaro Pascual e Prof. Dr. Felipe Fernández-Cuencado Hospital Virgen Macarena de Sevilha e Dra. Lucrecia Yañez San Segundo e Dra. Maria Aranzazu Bermúdez Rodríguez do Servicio de Hematología do HUMV de Santander. Em especial agradeço a Paula Espinal e a María Merino.
As minhas queridas amigas e colegas de laboratório Raquel Girardello e Cecilia Carvalhaes pelo apoio e incentivo diários. Muito obrigado pela força e companheirismo e principalmente pelos braços abertos com que me receberam na minha volta ao Brasil. A Raquel pela personalidade forte e decidida, sempre disposta a me ajudar nos meus experimentos e na supervisão do laboratório. A Cecilia pelo carinho e companheirismo e por ter sido pra mim o Brasil na Espanha.
Aos meus queridos amigos Alinne Guimarães e André Doi pelos momentos tão alegres e descontraídos que passamos juntos e com quem sei que posso contar sempre. A Alinne por ser meu ombro amigo, sempre disposta a me escutar com um conselho de ânimo. Prezo muito a nossa amizade. Ao André pelo profissionalismo e pelos conselhos. Obrigado por serem meus amigos.
As amigas Kelly Santiago e Fernanda Inoue pela amizade e pelos momentos diários compartilhados. Já faz tanto tempo que começamos juntos no LEMC, bons momentos e lembranças que certamente levaremos conosco. Obrigado pela força nos momentos de dificuldade. Quando se está longe da família os amigos se tornam uma segunda família.
Aos pós-graduandos do Laboratório ALERTA Adriana Nicolletti, Adriana Pereira, Ana Carolina Ramos, Bruna Nonato, Danilo Xavier, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun, Juliana Provasi, Lorena Fehlberg, Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Rafael Affini e Talita Barone pela agradável e divertida convivência, pelos conhecimentos divididos e as experiências compartilhadas. Obrigado por me aguentarem diariamente na supervisão do laboratório. Em especial agradeço as minhas co-orientandas Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Juliana Provasi e Lygia Schandert, por me permitirem transmitir o pouco que sei e aprendi.
Ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, onde comecei e por quem tenho um enorme carinho e muitas boas lembranças. Em especial agradeço a Rosana Capecce pela ajuda, amizade e carinho constantes.
Aos “meus” acinetos que foram meu objeto de estudo e cuja diversidade e complexidade taxonômica tornaram meus últimos quatro anos ocupados e felizes.
Sumário
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... XVII ÍNDICE DE TABELAS ... XX ÍNDICE DE FIGURAS ... XXI RESUMO ... XXII ABSTRACT ... XXIV
1 - INTRODUÇÃO ... 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5
2.1 - Agente Etiológico ... 5
2.2 - Identificação das Espécies Pertencentes ao Gênero Acinetobacter ... 15
2.3 - Epidemiologia das Infecções por Acinetobacter spp. ... 21
2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Acinetobacter spp. ... 27
2.4.1 - Polimixinas ... 27
2.4.2 - Tigeciclina ... 29
2.4.3 - Ampicilina/Sulbactam ... 30
2.4.4 - Minociclina ... 31
2.4.5 - Carbapenens ... 32
2.5 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos por Acinetobacter spp. ... 36
2.5.1 - Produção de β-Lactamases ... 38
2.5.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa ... 50
2.5.3 - Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ... 54
2.5.4 - Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) ... 57
3 - APRESENTAÇÃO ... 61
4 - ARTIGOS CIENTÍFICOS ... 62
4.1 - Analysis of Genes Encoding for Penicillin-Binding Proteins in Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii ... 64
4.2 - OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem resistance in Acinetobacter pittii in Spain ... 93
4.3 - Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University Hospital in the North of Spain ... 119
4.4 - Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with Acute
Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation ... 132
4.5 - Low Prevalence of blaOXA-143 in Private Hospitals in Brazil... 143
4.6 - Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in a Brazilian Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier Dissemination of blaOXA-143 in Brazil. 148 4.7 - Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter baumannii from Brazil: a case report... 162
5 - DISCUSSÃO ... 170
6 - CONCLUSÕES ... 193
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 196
Índice de Abreviaturas e Siglas
ABC - ATP-Binding Cassette
ADC - Acinetobacter-Derived Cephalosporinases AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism AIM - Australian Imipenemase
APACHE II - Acute Physiological and Chronic Health Evaluation II ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
ATCC - American Type Culture Collection C - Citosina
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase CIP - Collection of l’Institut Pasteur
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute CTX-M - Cefotaximase
DBL - DBL numbering system DHP-1 - Deidropeptidase-1
DMT - Drug-Metabolite Transporter DNA - Ácido desoxirribonucleico
EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético ESAC - Extended-Spectrum AmpC ESββββL - Extended Spectrum β-Lactamase EUA - Estados Unidos da América
GES - Guiana Extended Spectrum GIM - German Imipenemase HSP - Hospital São Paulo
HUMV - Hospital Universitário Marqués de Valdecilla ICS - Infecção de Corrente Sanguínea
IFIMAV - Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla IJSEM - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology IMI - Imipenem-hydrolysing β-Lactamase
IMP - Imipenemase IS - Insertion Sequence
KCTC - Korean Collection for Type Cultures KHM - Kyorin Hospital metalo-beta-lactamase KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica LPS - Lipopolissacarídeo
LPSN - List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature
MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry
MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion MββββL - Metalo-β-Lactamase
MDR - Multi-Drug Resistance MFS - Major Facilitator Superfamily
MRSA - Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus NaCl - Cloreto de Sódio
NMC-A - Nonmetallocarbapenamase of Class A
OMP - Outer Membrane Protein OXA - Oxacilinase
PAββββN - Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide
PBP - Penicillin-Binding Protein PCR - Polymerase Chain Reaction
PDEE - Programa de Doutorado com Estágio no Exterior PER - Pseudomonas Extended Resistant
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis PI - Ponto Isoelétrico
qRT-PCR - Quantitative Real Time Polimerase Chain Reaction REIPI - Red Española de Investigación en Patología Infecciosa RND - Resistance-Nodulation-Division
rRNA - RNA Ribossomal
SBSV - Société de Bactériologie Systématique et Vétérinaire
SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SFC - Serratia fonticola carbapenemase
SHV - Sulfhydryl-Variable β-Lactamase SIM - Seul Imipenemase
SME - Serratia marcescens enzyme SMR - Small Multidrug Resistance SPM - São Paulo Metallo-β-Lactamase TEM - Temoniera β-Lactamase tRNA - RNA transportador
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
VEB - Vietnamese Extended-Spectrum β-lactamase VIM - Verona Imipenemase
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Nomenclatura atual, frequência, significância clínica e etimologia das 27 espécies de Acinetobacter spp. descritas e das 6 novas espécies propostas, mas ainda não validadas até o momento... 8
Tabela 2 - Genetic characterization of the 26 A. baumannii clinical isolates... 86
Tabela 3 - The penicillin-binding proteins (PBPs) of A. baumannii………... 87
Tabela 4 - Point mutations observed in the PBP genes in susceptible and resistant A. baumannii strains to carbapenems... 89
Tabela 5 - Point mutations observed in the PBP genes of the 10 A. baumannii genomes and the reference strain RUH-134... 91
Tabela 6 - MICs determined by broth microdilution for OXA-207-producing clinical isolate A. pittii HUMV-1588, recipient strain A. baylyi ADP1 with the plasmid alone, clone A. baylyi ADP1 harboring the plasmid pETRA with blaOXA-24, and clone A. baylyi ADP1 harboring the plasmid pETRA with blaOXA-207 are shown………... 116 .
Tabela 7 - Kinetic parameters of purified β-lactamases OXA-24 and OXA-207………... 117
Tabela 8 - ARDRA profile, source of infection and CHDL content according to Acinetobacter species………... 128
Tabela 9 - Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the carbapenemase coding genes ………..………... 146
Tabela 10 - Frequency of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. isolates in a Brazilian teaching hospital during an 18-year period... 148
Índice de Figuras
Figura 01 - “Confusão” taxonômica que perdurou por mais de quatro décadas e atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies do gênero Acinetobacter ... xxv
Figura 02 - Martinus W. Beijerinck no seu laboratório em 12 de maio de 1921... 05
Figura 03 - Comparação das estruturas química dos ácidos oliovânicos, tienamicina e dos carbapenens... 34
Figura 04 - Estrutura da parede celular, mecanismos de resistências aos β-lactâmicos em Acinetobacter spp. e principais proteínas envolvidas... 37
Figura 5 - Identification of the conserved motifs in the consensus sequences encoded by the HMM PBP genes of A. baumannii genomes used for the classification of PBPs, according to the work of
Sauvage et al………... 92
Figura 6 - Alignment of the amino acid sequences of the OXA-24 and its variants (OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-143, OXA-160, OXA-182 and OXA-207)... 118 .
Figura 7 - Dendrogram of the 86 different Rep-PCR patterns obtained between the 603 A.
calcoaceticus-baumannii complex isolates during the period of 2004 to 2008…... 127
Figura 8 - Distribution of the 86 Acinetobacter spp. isolates showing different Rep-PCR patterns according to ARDRA method………...…... 130
Figura 9 - Distribution of the 603 Acinetobacter spp. isolates in the period of 2004 to 2008……….…. 131
Resumo
Durante mais de quatro décadas o gênero Acinetobacter sofreu com as constantes modificações na sua taxonomia o que atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies pertencentes a esse gênero. Atualmente o gênero Acinetobacter compreende 33 espécies descritas e mais 28 grupos genômicos aguardando uma posição taxonômica definitiva em relação a sua nomenclatura. Dentre essas espécies destacam-se o complexo A. calcoaceticus-baumannii devido a sua importância clínica, principalmente aquela que é um dos mais importantes patógenos da atualidade, A. baumannii. Devido a fenótipo de multirresistência apresentado pelos isolados de A. baumannii, os carbapenens são uma das poucas opções no limitado arsenal terapêutico para o tratamento de infecções causadas por esses micro-organismos. Entretanto, surtos causados por cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens tem se tornado um problema mundial. A erradicação das cepas de A. baumannii no ambiente hospitalar é difícil, pois uma vez que clones multirresistentes se estabelecem nesse nicho, eles se tornam endêmicos.
Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens em A. baumannii, somente a produção de β-lactamases tem sido estudada com maior frequência. Embora se saiba que o principal grupo de carbapenemases produzidas por isolados de A. baumannii seja o grupo das oxacilinases, que hidrolisam fracamente os carbapenens, esse fato reforça a hipótese de que outros mecanismos poderiam estar contribuindo nesse fenótipo. Sendo assim, os artigos aqui apresentados buscaram avaliar a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha. Artigo científico 1: Ainda é limitada as informações sobre o papel das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) na resistência aos β- lactâmicos em Acinetobacter baumannii. Este estudo teve como objetivo determinar as sequências de nucleotídeos dos genes que codificam as PBPs em A. baumannii e analisar as variações alélicas nesses genes em isolados sensíveis ou resistentes aos β-lactâmicos. Sete genes de PBPs e um gene codificador de uma transglicosilase monofuncional (MGT) foram identificadas nos seis genomas de A. baumannii sequenciados, codificadores de (i) quatro proteínas de alto peso molecular (dois da classe A, PBP1a [ponA] e PBP1b [mrcB], e duas PBPs de classe B, PBP2 [pbpA/mrdA] e PBP3 [ftsI]), (ii) três PBPs de baixo peso molecular (sendo duas do Tipo-5, PBP5/6 [dacC] e PBP6b [dacD], e uma PBP do Tipo-7 (PBP7/8 [pbpG]), e (iii) uma enzima monofuncional (MtgA [mtgA]). Regiões de grandes variações foram observadas, embora a maior parte das alterações alélicas encontradas foram traduzidas em mutações silenciosas. As sequências de aminoácidos dos genes das PBPs nos genomas e nos isolados clínicos apresentaram ser altamente conservadas. As mutações encontradas nas sequencias de aminoácidos estavam mais associadas aos perfis clonais, do que diretamente relacionadas sensibilidade ou resistência aos β-lactâmicos. Artigo científico 2: Uma cepa de A. pittii resistente aos carbapenems carreando um nova variante do cluster OXA-24 foi isolada em Santander, localizada no norte da Espanha em 2008. O isolado também apresentava altos níveis de resistência à penicilina e aos monobactâmicos, e era sensível às cefalosporinas de amplo espectro. A análise da sequência de nucleotídeos confirmou a presença do gene blaOXA-207
codificador de uma nova carbapenemase, que apresenta uma mutação pontual Gly222Val em relação à OXA-24. Clonagem e análise da cinética enzimática mostrou que a OXA-207 apresenta uma redução na eficiência catalítica contra carbapenems, mas aumentou consideravelmente a especificidade para a oxacilina comparada com OXA-24, de acordo com os dados anteriores da função estrutural dessa. Artigo científico 3: Oitenta e seis isolados clínicos identificados pelo sistema MicroScan-WalkAway ® como complexo A. calcoaceticus-baumannii e coletados durante o período 2004-2008 em um hospital universitário e terciário, teve sua identificação confirmada por ARDRA. Apenas 44,2% dos isolados foram confirmados como
identificados oito diferentes espécies não-baumannii, sendo A. pittii (41,8%) a espécie mais freqüente. Todos os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens carreavam os genes blaOXA-24/40 ou blaOXA-51 associado a ISAba1. O gene blaOXA-58 foi encontrado em 19 dos 24 isolados de A. pittii pertencentes a um clone sensível aos carbapenems. Espécies emergentes de Acinetobacter foram identificadas em nosso hospital e sua incidência real pode ser subestimada pela identificação apenas por meio de sistemas automatizados. Artigo científico 4:
Acinetobacter junii é um patógeno humano raro associado a bacteremia em recém-nascidos e pacientes de unidade de oncologia pediátrica. Apresentamos um caso de A. junii causando bacteremia em um paciente adulto transplantado com leucemia. A correta identificação de espécies de Acinetobacter pode esclarecer o real significado clínico das diferentes espécies deste gênero. Artigo científico 5: Uma alta prevalência de blaOXA-23 e uma baixa prevalência de blaOXA-143 foi encontrada entre os isolados de A. baumannii em hospitais privados brasileiros. A prevalência das CHDLs pode variar de acordo com o clone disseminado em um hospital ou em uma região geográfica específica e realçam a importância da aderência adequada às medidas de controle de infecção hospitalar. Assim, estudos de vigilância nacionais são necessários para analisar a prevalência real da CHDLs nos hospitais brasileiros. Artigo científico 6: O objetivo deste estudo foi avaliar a dinâmica temporal de carbapenemases em uma coleção de isolados de Acinetobacter spp coletados durante um período de 18 anos em um hospital brasileiro. Um total de 215 isolados apresentando altas taxas de resistência aos carbapenenens foi analisado no período de 1993 a 2010. A. baumannii foi responsável por 96,3% dos isolados. O gene blaOXA- 23 foi detectada em 36,7% (79/215) das amostras, seguido por blaOXA-143 (n=49, 22,7%), blaIMP-1
(n=24, 11,2%), blaIMP-10 (n=3, 1,4%) e blaOXA-72 (n=2, 0,9%). O primeiro isolado de A. baumannii carreando gene blaOXA-143 foi identificado em 1995, sete anos antes da introdução do clone de A.
baumannii produtor de OXA-23 em 2002. Nós descrevemos pela primeira vez, a presença de IMP-1 em A. pittii e A. bereziniae, e a OXA-58 em A. genomic species "Close to 13TU". A OXA- 143 demonstrou ser uma enzima antiga em nosso hospital. A dinâmica da produção carbapenemase é complexa e varia drasticamente em função do tempo. Artigo científico 7:
Este estudo relata a ocorrência da OXA-231, uma nova variante do cluster OXA-143, em uma cepa clínica de A. baumannii resistente aos carbapenens isolada em um hospital de terciário universitário localizado no Sul do Brasil.
Abstract
During four decades the genus Acinetobacter suffered with the constant changes in their taxonomy which delayed understanding of the epidemiology of the species belonging to that genus. Currently the genus Acinetobacter comprises 33 described species and 28 other genomic groups awaiting a definitive taxonomic position in relation to its nomenclature. Among these species highlights the A. calcoaceticus-baumannii complex due to its clinical importance, especially one that is one of the most important pathogens of nowadays, A. baumannii. Because of multidrug resistance phenotype displayed by isolates of A. baumannii, carbapenems are one of the few limited therapeutic options for the treatment of infections caused by these micro- organisms. However, outbreaks caused by strains of A. baumannii resistant to carbapenems have become a global problem. The eradication of the A. baumannii strains from the hospital environment is difficult, because once multiresistant clones are established in this niche, they become endemic. Among the mechanisms of resistance to carbapenems in A. baumannii, only the production of β-lactamases has been studied most frequently. Although it is known that the main group of carbapenemases produced by A. baumannii isolates is the group of oxacilinases that weakly hydrolyze carbapenems, this fact reinforces the hypothesis that other mechanisms could be contributing in this phenotype. Thus, the articles presented here aimed to assess the dynamics of resistance to β-lactams in clinical samples of Acinetobacter spp. isolated in Brazil and Spain. Article 01: There is limited information on the role of penicillin-binding proteins (PBPs) in the resistance of Acinetobacter baumannii to β-lactams. This study aimed to determine the nucleotide sequences of the genes encoding for PBPs in A. baumannii and to analyze their allelic variations in isolates susceptible or resistant to β-lactams. Seven PBP genes and one monofunctional transglycosylase (MGT) gene were identified in the six genomes, encoding (i) four high molecular mass proteins (two of class A, PBP1a [ponA] and PBP1b [mrcB], and two of class B, PBP2 [pbpA/mrdA] and PBP3 [ftsI]), (ii) three low-molecular-mass proteins (two of Type- 5, PBP5/6 [dacC] and PBP6b [dacD], and one of Type-7 (PBP7/8 [pbpG]), and (iii) a monofunctional enzyme (MtgA [mtgA]). Hotspot mutation regions were observed, although most of the allelic changes found translated into silent mutations. The amino acid consensus sequences corresponding to the PBP genes in the genomes and the clinical isolates were highly conserved. The changes found in amino acid sequences were associated with concrete clonal patterns but were not directly related to susceptibility or resistance to β-lactams. Article 2: A carbapenem-resistant A. pittii strain carrying an OXA-24-like enzyme was isolated in Santander, Northern Spain in 2008. The isolate also exhibited high level resistance to penicillins and monobactams, and remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. Sequence analysis confirmed the presence of the novel blaOXA-207 carbapenemase gene that presented a point Gly222Val substitution with respect to that of OXA-24. Cloning and kinetic analysis showed that OXA-207 presents a reduction in the catalytic efficiency against carbapenems and a noticeably increased in specificity for oxacillin compared with OXA-24, in agreement with the previous structural-function data of OXA-24. The mutation probably caused a misorientation of carbapenems to gain access to the active center of the OXA-enzyme. Article 3: Eighty six no repetitive clinical isolates identified by MicroScan-WalkAway® as A. calcoaceticus-baumannii complex collected during 2004-2008 period in a tertiary teaching hospital, had their identification confirmed by ARDRA. Only 44.2% of isolates was confirmed to be A. baumannii harboring 12 different blaOXA-51-like genes. Eight different non-baumannii species were also identified and A. pittii (41.8%) was the most frequent among them. All carbapenem-resistant A. baumannii isolates carried the blaOXA-24/40 or blaOXA-51-like-ISAba1 genes. The blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24 isolates of a carbapenem-susceptible A. pittii clone. Emerging Acinetobacter species have been
automated identification systems. Article 4: Acinetobacter junii is a rare human pathogen associated with bacteraemia in neonates and paediatric oncology patients. We present a case of A. junii causing bacteraemia in an adult transplanted patient with leukaemia. The correct identification of Acinetobacter species can highlight the clinical significance of the different species of this genus. Article 5: A high prevalence of blaOXA-23 and a low prevalence of blaOXA-143
werefound among A. baumannii isolates in private Brazilian hospitals. The prevalence of CHDLs may vary according to the disseminated clone in a specific hospital or region and emphasize the importance of appropriate adherence to infection control measures. Thus, wide national surveillance studies are necessary to analyze the real prevalence of CHDLs in Brazilian hospitals.
Article 6: The aim of this study was to evaluate the temporal dynamic of carbapenemases in a collection of Acinetobacter spp. isolates collected during an 18 year-period in a Brazilian hospital.
A 215 non-duplicate isolates showing high carbapenem resistance rates were analyzed from 1993 to 2010. A. baumannii was responsible for 96.3% of the isolates. The blaOXA-23 gene was detected in 36.7% (79/215) of the isolates, followed by blaOXA-143 (n=49, 22.7%), blaIMP-1 (n=24, 11.2%), blaIMP-10 (n=3, 1.4%) and blaOXA-72 (n=2, 0.9%). The first A. baumannii isolate carrying the blaOXA-143 gene was identified in 1995, seven years before the introduction of blaOXA-23 in 2002 and its widespread in the following 8 years of the study. We described for the first time the presence of IMP-1 in A. pittii and A. bereziniae, and OXA-58 in A. genomic species “Close to 13TU”. The OXA-143 is an ancient enzyme. The dynamic of carbapenemase production is complex and varied drastically according to time. Article 7: This study reports the occurrence of OXA-231, a novel variant of OXA-143, in an A. baumannii clinical isolate (Ac-141 strain) recovered from a tertiary teaching hospital located in Southern Brazil.
Figura 01 - “Confusão” taxonômica que perdurou por mais de quatro décadas e atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies do gênero Acinetobacter. Figura obtida do artigo de Ledermann (2007).
1 - Introdução
Até o final da década de 80 pouco ou quase nada se sabia a respeito das espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter spp., e ainda não havia sido descrita aquela que viria a ser um dos mais importantes patógenos multirresistentes causadores de infecções nosocomiais da atualidade, A. baumannii (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Passados pouco mais de 30 anos, A. baumannii é um dos micro-organismos mais importantes, prevalentes e bem adaptados ao ambiente nosocomial (Higgins et al., 2010a). Isso se deve em parte, a sua incrível rapidez em adquirir ou desenvolver resistência aos antimicrobianos, aliada ao seu já amplo espectro de resistência intrínseca. Este fato é contrário à maioria das bactérias patogênicas tradicionais, que parecem necessitar de um tempo maior para adquirirem mecanismos de resistência efetivos em resposta à introdução de novas estratégias terapêuticas. Essa habilidade de adaptação verificada em A. baumannii talvez seja uma consequência da sua exposição evolucionária, por um longo período, na complexa e competitiva tarefa de manter-se no meio ambiente. Além disso, o uso indiscriminado de antimicrobianos nas últimas décadas pode também ter contribuído para o sucesso desse patógeno oportunista.
Nas últimas décadas, surtos causados por isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens têm se tornado um problema mundial e infecções causadas por estes micro- organismos estão associadas a uma maior morbi-mortalidade (Perez et al., 2007). Os últimos dados do programa SENTRY para a América Latina demonstram que a taxa de resistência aos carbapenens no Brasil aumentou de 12,6% entre 1997 a 1999 para 71,4% entre 2008 e 2010, um aumento de quase 60% em apenas uma década (Gales et al., 2012). Os dados gerais da América Latina também seguem essa mesma tendência, apresentando uma taxa de resistência aos carbapenens > 66% (Gales et al., 2012).
Quando se avalia as opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens, o panorama é estarrecedor (Neonakis et al., 2011). As polimixinas (B e E) geralmente constituem um dos únicos antimicrobianos clinicamente eficazes. Entretanto, os seus efeitos colaterais aliados aos escassos dados da sua farmacocinética e farmacodinâmica tem limitado o uso das polimixinas (Maragakis & Perl, 2008).
A tigeciclina somente é aprovada para o uso em infecções de pele e partes moles, pneumonia comunitária e infecções intra-abdominais, restringindo o seu emprego terapêutico. Além disso, estudos clínicos tem demonstrado cautela quanto ao uso desse antimicrobiano para o tratamento de infecções causadas por A. baumannii, já que tem sido observado o surgimento de resistência durante o tratamento clínico (Fishbain & Peleg, 2010). Já o sulbactam, que no Brasil é comercializado na formulação ampicilina/sulbactam, é outra opção, mas com resultados discrepantes quanto a sua real eficácia terapêutica (Fishbain & Peleg, 2010; Neonakis et al., 2011). Embora a resistência aos carbapenens tenha aumentado a cada dia, e no Brasil os dados sejam alarmantes, variando drasticamente de acordo com a região geográfica, o uso desses antimicrobianos ainda é factível e importante, devido a sua boa tolerabilidade associado a efeitos adversos mínimos e pela sua excelente concentração na grande maioria dos tecidos (Nicolau, 2008).
A produção de β-lactamases, principalmente as carbapenemases de classe D, é o mecanismo de resistência mais estudado em A. baumannii, talvez por ser o mais “fácil” de ser caracterizado, o que relegou os demais mecanismos a uma relativa obscuridade e esquecimento, principalmente no que concerne ao estudo das PBPs. Esse grupo de proteínas de membrana interna é alvo de todos os β-lactâmicos e um dos meios mais efetivos de aquisição de resistência bacteriana a estes antimicrobianos, principalmente em Gram positivos (Sauvage et al., 2008). Entretanto, assim como ocorre com outros bacilos Gram negativos de importância clínica, raros são os estudos que se dedicaram a estudar tais proteínas em A. baumannii. Talvez
o desinteresse em estudar esse grupo de proteínas esteja fundamentado na teoria de que o papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos em bacilos Gram negativos teria uma importância secundária frente aos demais mecanismos de resistência, uma vez que esses mecanismos atuariam em fases anteriores à ligação do β-lactâmico às PBPs. Apesar disso, os resultados obtidos indicam que a alteração ou modificação nas PBPs em A. baumannii pode estar relacionada à resistência aos carbapenens nesse micro-organismo (Gehrlein et al., 1991;
Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003; Russo et al., 2009; Cayô et al., 2011b; Yun et al., 2011).
Ainda que a produção de carbapenemases de classe D seja o mecanismo mais prevalente em A. baumannii, essas enzimas hidrolisam fracamente os carbapenems e não apresentam atividade frente às cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010). Além disso, a grande maioria dos genes codificadores dessas β-lactamases necessita da presença de sequências de inserção, que trazem um promotor forte, para aumentar a expressão enzimática (Poirel et al., 2010). Tais observações somente aumentam a importância de outros mecanismos adjuvantes na elevação das concentrações inibitórias mínimas, não somente para os carbapenens, como também para os demais β-lactâmicos. Outro dado importante a ser enfatizado é que, de algum modo ao longo da sua escala evolutiva, A. baumannii desenvolveu, de maneira única, sequências de inserção em seu genoma de modo a reorganizar a expressão de diferentes genes conforme a sua necessidade e com menor custo energético (Vallenet et al., 2008). A presença de varias cópias nos genomas de A. baumannii sequenciados comprova a importância dessas sequências de inserção para sua adaptação e sobrevivência.
A realidade de A. baumannii nos hospitais brasileiros e em diversas partes do mundo é alarmante e tende a agravar-se, uma vez que o desenvolvimento de novas opções terapêuticas não acompanha a rapidez e a evolução da resistência aos antimicrobianos expressa por esse micro-organismo. O conhecimento do papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos e como
funciona a interação entre esses compostos, poderia fornecer informações valiosas sobre possíveis novos alvos terapêuticos e minimizar o panorama preocupante verificado nos nossos isolados de A. baumannii.
Sendo assim, os artigos aqui apresentados buscaram avaliar a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha.
Obviamente, a complexidade e abrangência da epidemiologia que envolve esses micro- organismos não permitiu responder todas as perguntas propostas, e com certeza outras tantas surgiram a partir dos resultados obtidos. Mas com certeza fica a satisfação de ter contribuído, ainda que pouco, com a caracterização do fascinante gênero Acinetobacter.
2 - Revisão Bibliográfica
2.1 - Agente Etiológico
Acinetobacter é uma palavra composta derivado das palavras gregas “ακινητο” ou “akineto”
que significa não móvel e “bakter” de bactéria, e juntas significam bacilo não móvel (Howard et al., 2012). O gênero Acinetobacter tem uma longa e complicada história de mudanças quanto a sua taxonomia (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996;
Towner, 2009). A história deste gênero bacteriano começou em 1911, na cidade holandesa de Delft, onde o microbiologista e botânico holandês Martinus Willem Beijerinck (16 de Março de 1851 a 1 de Janeiro de 1931) (Chung & Ferris, 1996), mostrado na Figura 1, isolou e descreveu em uma amostra de solo, usando meios mínimos
enriquecidos com acetato de cálcio (Beijerinck, 1911), o primeiro exemplar de um micro- organismo que seria posteriormente chamado Acinetobacter (Towner, 2009; Howard et al., 2012). Desde então, os membros desse gênero foram classificados durante décadas com diferentes nomes, sendo alguns destes Mima polymorpha (De Bord, 1939), Bacterium anitratum (Schaub & Hauber, 1948), Moraxella lwoffii (Piéchaud et al., 1956) e Micrococcus calcoaceticus (Juni, 1978). A falta de um consenso e a confusão causada em decorrência disso resultou no atraso em se estabelecer a importância clínica e a epidemiologia desses micro-organismos (Towner, 2009).
Figura 02. Martinus W. Beijerinck no seu laboratório em 12 de maio de 1921.
Foto obtida dos arquivos da Delft School of Microbiology.
Originalmente descrito como Micrococcus calco-aceticus, o gênero Acinetobacter somente foi proposto depois de 43 anos por Brisou e Prevot em 1954, para diferenciá-lo dos organismos móveis dentro do gênero Achromobacter (Brisou & Prevot, 1954). Entretanto, essa denominação foi amplamente aceita somente em 1968, quando Baumann e colaboradores (1968) publicaram um estudo no qual avaliaram diferentes micro-organismos como Micrococcus calco-aceticus, Alcaligenes hemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginicola e Bacterium anitratum (Baumann et al., 1968). Os autores concluíram que todos esses micro- organismos pertenciam a um único gênero e não poderiam mais ser classificados como espécies diferentes com base apenas nas suas características fenotípicas (Baumann et al., 1968). Em 1971, o “Subcomitê de Taxonomia de Moraxella e Bactérias Relacionadas” oficialmente reconheceu o gênero Acinetobacter com base nos resultados do estudo de 1968 (Howard et al., 2012). Apesar disso, até 1986, apenas as espécies Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter lwoffii haviam sido descritas como pertencentes a esse gênero (Bouvet & Grimont, 1986).
Atualmente o gênero Acinetobacter é classificado no reino Bacteria, filo Proteobacteria, classe Gammaproteobacteria, ordem Pseudomonadales e família Moraxellaceae (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). Na mesma família ainda estão incluídos os gêneros Moraxella spp., Oligella spp. e Psychrobacter spp. (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). As espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter são cocobacilos Gram negativos, não fermentadores da glicose, estritamente aeróbicos, não fastidiosos, motilidade negativa, catalase positiva, oxidase negativa e com um conteúdo G + C no seu DNA variando de 39% a 47%
(Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Vaneechoutte et al., 2011; Howard et al., 2012). Pelo menos quatro espécies podem apresentar hemólise em ágar sangue: A. beijerinckii, A. gyllenbergii, A.
junii (positivo para 11 a 89% dos isolados) e A. haemolyticus (Vaneechoutte et al., 2011). No teste de Gram, frequentemente esses micro-organismos podem apresentar dificuldade na etapa de descoloração, podendo, portanto, serem identificados erroneamente como Gram positivos e
na maioria das vezes como cocos Gram lábeis (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996;
Vaneechoutte et al., 2011; Howard et al., 2012).
Até o momento, foram descritas 27 espécies reconhecidas e validadas e mais seis espécies propostas, mas ainda não reconhecidas pela comunidade internacional, como mostrado na Tabela 01.
Tabela 1. Nomenclatura atual, frequência, significância clínica e etimologia das 27 espécies de Acinetobacter spp. descritas e das 6 novas espécies propostas, mas ainda não validadas até o momento.a
Designação
Atual Designação Prévia
Dados Clínicos
Cepa
Referência Local de Isolamento Etimologia Referência Frequência Significância
A. calcoaceticus
A. genoespécie 1, Micrococcus calco- aceticus, Moraxella
calcoacetica
+ 3 ATCC 23055 solo, humanos
O nome calcoaceticus se refere ao meio usado por Beijeirink em 1911 enriquecido com acetato de cálcio para
o cultivo do primeiro isolado de Acinetobacter spp.
Bouvet & Grimont, 1986
A. baumannii A. genoespécie 2,
Bacterium anitratum ++++ 1 ATCC 19606 humanos, animais Homenagem a Paul e Linda Baumann,
microbiologistas americanos
Bouvet & Grimont, 1986 A. pittii A. genoespécie 3,
Herellea vaginicola +++ 1 ATCC 19004 humanos, solo e
vegetais
Homenagem a Tyrone Pitt, médico
microbiologista britânico Nemec et al., 2011
A. nosocomialis A. genoespécie 13TU,
Acinetobacter anitratus +++ 1 RUH 2376 humanos
O nome nosocomialis deriva do latim nosocomium que significa hospital/enfermaria e do sufixo -alis usado com sentido de pertencente ao
hospital
Nemec et al., 2011
A. haemolyticus
A. genoespécie 4, Achromobacter
haemolyticus
+ 3 ATCC 17906 humanos
O nome haemolyticus vem do latim haima que significa sangue e lutikos que
significa capaz de dissolver
Bouvet & Grimont, 1986
A. juniib
A. genoespécie 5, Achromobacter
citrocaligenes
++ 2 ATCC 17908 humanos, lodo Homenagem a Elliot Juni,
microbiologista americano
Bouvet & Grimont, 1986
A. johnsonii
A. genoespécie 7, Achromobacter metalcaligenes
+ 3 ATCC 17909 humanos, animais Homenagem a John L. Johnson, médico americano
Bouvet & Grimont, 1986 A. lwoffii A. genoespécie 8/8TU,
Moraxella lwoffii ++ 2 ATCC 15309 humanos, animais Homenagem a André Michael Lwoff,
microbiologista francês
Bouvet & Grimont, 1986
A. bereziniae A. genoespécie 10,
Achromobacter anitrata ++ 2 ATCC 17924 humanos, animais,
esgoto
Homenagem a Eugénie Bergogne- Bérézin, médica microbiologista
francesa
Nemec et al., 2010
A. guillouiae A. genoespécie 11 ++ 2 ATCC 11171
humanos, leite, água, solo, esgoto, lodo
ativado
Homenagem a Marie-Laure Joly-Guillou,
microbiologista francesa Nemec et al., 2010
A. radioresistens A. genoespécie 12 + 3 ATCC 43998 humanos, solo,
algodão
O nome radioresistens deriva do latim radius que significa raio e do latim
resistens que significa resistente (resistente ao raio), se referindo à alta
resistência aos raios gama verificada nesta espécie
Nishimura et al., 1988
A. ursingiic NA + 3 LUH 3792 humanos Homenagem a Jan Ursing,
bacteriologista e taxonomista sueco Nemec et al., 2001
A. schindleri NA + 3 LUH 5832 humanos Homenagem a Jiri Schindler,
microbiologista e taxonomista checo Nemec et al., 2001
A. parvus NA + 3 LUH 4616 humanos, animais
O nome parvus significa em latim pequeno, se referindo ao tamanho diminuto da colônia em meio de cultura
comparado as demais espécies do gênero Acinetobacter spp.
Nemec et al., 2003
A. baylyi NA - 4 CIP 107474 solo
Homenagem a Ronald Bayly, microbiologista australiano que contribuiu com o conhecimento da fisiologia do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
A. brisouii NA - 4 DSM 18516
turfa (material vegetal decomposto em
pântanos)
Homenagem a Jean Brisou, microbiologista francês que contribuiu com o conhecimento da taxonomia do
gênero Acinetobacter spp.
Anandlham et al., 2011
A. rudis NA - 4 DSM 24031 leite, água O nome rudis em latim significa cru
(isolado de produtos não processados)
Vaz-Moreira et al., 2011
A. soli NA - 4 B1 Solo, humanos O nome soli que em latim significa solo Kim et al., 2009
A. indicus NA - 4 DSM 25388T Hexaclorociclohexano
– HCH (lixão)
O nome indicus se refere ao país de
isolamento, Índia Mallotra et al., 2012
A. antiviralisd NA - 4 KCTC 0699BP planta do tabaco
O nome antiviralis que deriva do grego anti que siginifica contra e do latim viralis que siginifca pertecente ao virus
(antiviral)
Lee et al., 2009
A. bouvetii NA - 4 CIP 107468 lodo
Homenagem a Philippe Bouvet, microbiologista francês que contribuiu com o conhecimento da taxonomia do
gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
A. towneri NA - 4 CIP 107472 lodo
Homenagem a Kevin Towner, microbiologista britânico que contribuiu
com o conhecimento da genética do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
A. tandoii NA - 4 CIP 107469 lodo
Homenagem a Valter Tandoi, bacteriologista italiano que contribuiu com o conhecimento de Acinetobacter
em lodo
Carr et al., 2003
A. tjernbergiae NA - 4 CIP 107465 lodo
Homenagem a Ingela Tjernberg, microbiologista e taxonomista sueca que
contribuiu com o conhecimento da genética do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
A. gerneri NA - 4 CIP 107464 lodo
Homenagem a Peter Gerner-Smidt, microbiologista dinamarquês que contribuiu com o conhecimento da taxonomia do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
A. beijerinckii NA + 3 LUH 4759 humanos, animais, solo e água
Homenagem a Martinus Beijeirink, microbiologista holandês que descreveu
o primeiro isolado
Nemec et al., 2009
A. gyllenbergii NA + 3 RUH 422 humanos Homenagem a Helge G. Gyllenberg,
bacteriologista e taxonomista finlandês Nemec et al., 2009
A. venetianus NA - 4 ATCC 31011 água do mar
O nome venetianus vem da palavra venetian que significa veneziano (uma
das cepas foi isolada da lagoa de Veneza no Mar Adriático)
Vaneechoutte et al., 2008
A. marinusd NA - 4 DSM 16312T água do mar O nome marinus que em latim significa
marinho (do oceano) Yoon et al., 2007
A. seohaensisd NA - 4 DSM 16313T água do mar
O nome seohaensis deriva do nome Seohae, nome coreano do Mar Amarelo,
onde foi isolada a espécie
Yoon et al., 2007
A.oryzaed NA - 4 B23 arroz O nome oryzae que em latim siginifca
arroz, onde foi isolada a primeira cepa Chaudhary et al., 2012
A. oleivoransd NA - 4 KCTC 23045 arroz
O nome oleivorans deriva do latim oleum que significa óleo e do latim vorans que siginifica que devora (aquele
que devora óleo/hidrocarboneto)
Kang et al., 2011
A. kyonggiensisd NA - 4 JCM 17071 esgoto O nome kyonggiensis se refere a
Kyonggi University Lee & Lee, 2010
a. Abreviações e símbolos: NA - não se aplica; (++++) muito frequente; (+++) frequente; (++) ocasionalmente; (+) raro; (-) nunca foi isolado em humanos;
(1) principal espécie patogênica ao homem; (2) raros casos de doença comprovada; (3) isolado de humanos, significância desconhecida; (4) não são espécies patogênicas; ATCC - American Type Culture Collection, Rockville, Md, USA; CIP - Collection de l’Institut Pasteur, Institut Pasteur, Paris, França; LUH e RUH - Collection Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda; KCTC - Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Coréia do Sul; DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen;
b. Recentemente foi demonstrado que Acinetobacter grimontii (Carr et al., 2003) na verdade se trata de Acinetobacter junii (Vaneechoutte et al., 2008).
c. Acinetobacter septicus que inicialmente foi descrita como sendo uma nova espécie (Kilic et al., 2008), teve sua classificação contestada pelo principal
grupo de taxonomia de Acinetobacter na atualidade (Nemec et al., 2008), que propuseram que estes isolados fossem considerados como sendo Acinetobacter ursingii;
d. Novas espécies de Acinetobacter propostas, mas que ainda não foram validadas pela “List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published” publicada periodicamente pelo “International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology - IJSEM” (anteriormente chamado International Journal of Systematic Bacteriology) (http://ijs.sgmjournals.org/) e, consequentemente, não foram ainda incluídas na “List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature - LPSN” para o gênero Acinetobacter (http://www.bacterio.cict.fr/a/acinetobacter.html) do Professor Jean Paul Marie Euzéby da “Société de Bactériologie Systématique et Vétérinaire (SBSV)” - França (Euzéby, 1997).
.
Outros 28 grupos genômicos ou genoespécies, que assim são classificados por compreenderem diversas cepas em cada grupo, ainda aguardam uma posição taxonômica definitiva em relação a sua nomenclatura (Towner, 2009). Dentre esses, encontram-se as seguintes genoespécies mais conhecidas: A. genoespécie 6 - previamente Moraxella glucidolytica (Bouvet & Grimont, 1986), A. genoespécie 13BJ/14TU (Bouvet & Jeanjean, 1989;
Tjernberg & Ursing, 1989), A. genoespécie 14BJ (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 15BJ (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 16 - previamente Alcaligenes haemolyticus (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 17 (Bouvet & Jeanjean, 1989) e A. genoespécie 15TU (Tjernberg & Ursing, 1989). Recentemente, quatro genoespécies de importância clínica tiveram a sua nomeclatura definida e validada, sendo classificadas em A. pittii (A. genoespécie 3), A. nosocomialis (A. genoespécie 13TU), A. bereziniae (A. genoespécie 10) e A. guillouiae (A.
genoespécie 11) (Nemec et al., 2010; Nemec et al., 2011), como mostrado na Tabela 01. Além disso, ainda existem pelo menos 21 cepas de Acinetobacter spp. que não foram incluídas em nenhuma espécie ou genoespécie descritas até o momento (Towner, 2009), tornando ainda mais diverso e complexo esse grupo de micro-organismos.
Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii e A.
nosocomialis apresentam características fenotípicas muito similares, e por isso, foi proposto que tais espécies fossem referidas como um único grupo em 1991, o chamado “complexo A.
calcoaceticus-baumannii” (Gerner-Smidt et al., 1991). Esta classificação foi defendida como forma de facilitar e simplificar a identificação desses micro-organismos, aliada à necessidade
“questionável” de uma identificação mais criteriosa pelos laboratórios de rotina em microbiologia das diferentes espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter. Desde então, tais espécies tem sido referenciadas pelos laboratórios de rotina e por muitos estudos epidemiológicos publicados em todo o mundo pelo nome “genérico” (Lin et al., 1998; l-Tawfiq & Al-Tawfiq & Mohandhas, 2007; Park et al., 2012). A praticidade do uso do termo “complexo A. calcoaceticus-baumannii” é
inegável, uma vez que a diferenciação precisa desses micro-organismos por provas bioquímicas (Bouvet & Grimont, 1986) é difícil e trabalhosa, o que a torna inviável na rotina laboratorial, o mesmo não se justifica nas publicações médicas-científicas. Sendo assim, cabe aos relatos de infecções causadas pelos membros do complexo A. calcoaceticus-baumannii, a responsabilidade em descrever e caracterizar as demais espécies do complexo (Towner, 2009), sempre que essas forem identificadas, já que as mesmas acabam sendo ofuscadas pela espécie mais importante e prevalente do grupo, A. baumannii. A partir dessas informações será possível uma melhor compreensão a respeito da epidemiologia desses micro-organismos como patógenos hospitalares.
2.2 - Identificação das Espécies Pertencentes ao Gênero Acinetobacter
Devido à complexidade e heterogeneidade das espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter, nenhum esquema de identificação foi ainda proposto que incorpore tanto a praticidade e a confiabilidade exigida pela rotina laboratorial, como a abrangência que se espera para um grupo tão dinâmico (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Sendo assim, a diferenciação das espécies dentro do gênero Acinetobacter acaba sendo frequentemente problemática (Nowak &
Kur, 1996). Esse fator limitante é um sério obstáculo no conhecimento sobre a biologia, patogenicidade ou ecologia dessas espécies por parte dos microbiologistas e clínicos. Uma identificação incorreta pode ter, muitas vezes, consequências diretas no diagnóstico, tratamento e controle de infecções causadas por esses micro-organismos.
Até o momento poucos métodos foram validados para uma identificação eficaz da maioria das espécies, genoespécies e demais cepas sem classificação pertencentes ao gênero Acinetobacter e, apesar dos avanços na identificação rápida de bactérias com base na sequência de DNA, a técnica de hibridização DNA-DNA ainda é considerada a técnica padrão- ouro para avaliar taxonomicamente esses micro-organismos (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Nessa
metodologia, genomas inteiros são comparados, e a semelhança é estimada através da percentagem de ligação relativa ou pelas diferenças na estabilidade térmica dos híbridos.
Embora a técnica de hibridização DNA-DNA tenha um grande valor na taxonomia bacteriana, por exemplo, a classificação taxonômica atual de Acinetobacter é baseada principalmente na similaridade DNA-DNA, esta técnica também apresenta desvantagens (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Primeiramente, diferentes resultados podem ser obtidos (Grimont et al., 1980), quando se utiliza um dos cinco diferentes protocolos descritos para o gênero Acinetobacter (Bouvet &
Grimont, 1986; Tjernberg & Ursing, 1989; Nemec et al., 2001; Carr et al., 2003; Nemec et al., 2003). Outra desvantagem é o fato da hibridização DNA-DNA ser muito laboriosa e exigir mão de obra altamente qualificada, sendo, portanto, realizada somente em um número restrito de laboratórios de taxonomia bacteriana (Dijkshoorn & Nemec, 2008).
Idealmente, para se avaliar uma nova espécie de um determinado gênero, o DNA da mesma deve ser comparado aos DNAs de todas as espécies pertencente àquele gênero específico. Os representantes das novas espécies têm de ser hibridados reciprocamente aos pares. Devido as dificuldades da técnica de hibridização DNA-DNA, as novas linhagens somente foram testadas para essa metodologia após terem apresentado uma similaridade interespécie maior que 97% para o gene 16S rDNA (Stackebrandt & Goebel, 1994). Recentemente, essa regra foi alterada, mudando o ponto de corte para uma faixa de similaridade de 98,7% a 99%
(Stackebrandt & Evers, 2002). Embora a hibridização DNA-DNA seja um método crucial para a classificação atual das espécies dentro do gênero Acinetobacter, devido à sua complexidade metodológica e do grande número de grupos de hibridização dentro do gênero, essa metodologia dificilmente pode ser considerada como uma opção para o delineamento de novas espécies adicionais, e muito menos como um método para identificação de espécies (Stackebrandt et al., 2002).
Embora vários estudos tenham objetivado a criação de esquemas de identificação confiáveis baseados na homologia de DNA (Ibrahim et al., 1997; Rainey et al., 1994), nas características fenotípicas (Gerner-Smidt et al., 1991), no perfil de proteínas da membrana externa (Ino & Nishimura, 1989) e na comparação do envelope celular (Alexander et al., 1984), todos estes métodos produziram resultados inconsistentes. Inicialmente, Bouvet e Grimont (1986) propuseram um sistema de 25 provas bioquímicas para identificar as primeiras 12 genoespécies descritas. Posteriormente, esse sistema foi melhorado através da inclusão de novas genoespécies, todos previamente identificados e confirmados pela técnica de hibridização DNA-DNA (Gerner-Smidt et al., 1991). Infelizmente, mesmo este sistema não é capaz de separar as espécies estreitamente relacionadas do complexo A. calcoaceticus-baumannii (Gerner-Smidt et al., 1991). As características fenotípicas expressas pelas diferentes espécies de Acinetobacter spp. são influenciadas pelas condições nas quais elas são cultivadas (Gerner-Smidt et al., 1991).
Isso se deve ao fato de que os membros desse gênero apresentam uma grande quantidade de genes dedicados às vias catabólicas conhecida como “arquipélago de diversidade catabólica”
que leva à adaptação à maioria dos substratos (Barbe et al., 2004). Desse modo, o uso de auxanogramas, bateria de provas bioquímicas que tem como princípio a assimilação de fonte de carbono e nitrogênio, tem uma utilidade limitada na diferenciação das espécies de Acinetobacter spp. (La Scola et al., 2006).
Embora, o padrão ouro para a identificação da grande maioria das espécies bacterianas tem sido o sequenciamento do gene codificador da porção 16S do rRNA, tal metodologia também não é confiável para a identificação de Acinetobacter spp., devido a baixa natureza polimórfica verificada nesse gene entre as genoespécies estreitamente relacionadas dentro do gênero Acinetobacter (Ibrahim et al., 1997; La Scola et al., 2006). Devido a isso, identificações errôneas podem ocorrer, como descrito por La Scola e colaboradores (2001) onde isolados de A.
baumannii foram identificados como A. calcoaceticus usando o gene 16S rRNA (La Scola et al.,
