UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

CICLO 2021-II

SIMULACIÓN DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA MEDIANTE EL SOFTWARE SNAPGENE

BIOTECNOLOGIA

HEBERT HERNAN SOTO GONZALES FECHA: 29/10/21

ELABORADO POR:

 ALE ESPINOZA KATLHEEN EMPERATRIZ

ILO

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Contenido

1. INTRODUCCION ... 3 2. OBJETIVOS ... 3 2.1. Objetivo General: ... 3 2.2. Objetivos Específicos: ... 3 3. MARCO TEORICO ... 4 3.1. Electroforesis ... 4

3.2. Software Snap Gene ... 4

3.3. Centro Nacional para la Investigación Biotecnológica (NCBI) ... 4

3.4. Gel de Agarosa ... 5

3.5. GEN 16S ... 5

3.6. ADN Y ARN ... 6

3.7. Secuenciación del ADN ... 6

4. METODOLOGIA ... 6

5. RESULTADOS ... 10

6. CONCLUSION ... 10

7. CUESTIONARIO ... 11

a) Indique diferencias entre ADN y ARN. ... 11

b) ¿Qué es el SnapGene y como nos serviría en ingeniería ambiental? ... 12

c) ¿Qué es el gen 16s y para que tipos de microorganismos sería útil? ... 13

d) ¿Describir El Proceso De Electroforesis Para ADN? ... 14

e) ¿Qué Es La Agarosa? ... 15

f) ¿Qué Es Un Marcador De Peso Molecular, Cuáles Son Sus Tipos? ... 15

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1. INTRODUCCION

La electroforesis en geles de agarosa, también llamada poliacrilamida es una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos. La electroforesis puede separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, poder visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos que se encuentra en una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones. Existen programas como el SnapGene que ayudan a simular estos procesos, para poder conocer anticipadamente los resultados de la manipulación que se realicen. El SnapGene proporciona una forma sencilla y segura de planificar, visualizar y documentar los procedimientos diarios de biología molecular.

En el presente informe realizaremos una simulación de electrofotesis en geles de agarosa, usando el software SnapGene para asi poder adquirir conocimientos del proceso.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General:

 Realizar una simulación de electroforesis en gel de agarosa mediante SnapGene Software.

2.2. Objetivos Específicos:

 Adquirir conocimiento acerca del manejo del software SnapGene y sus diversas funciones para realizar simulación de electroforesis.

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3. MARCO TEORICO

3.1. Electroforesis

La electroforesis es una técnica muy utilizada en los laboratorios, esta consiste en la separación de las moléculas de ADN y ARN por tamaño y mediante corriente eléctrica.

Esta técnica tiene una amplia variedad de usos prácticos, pruebas de diagnóstico clínico, como la medicina forense para la identificación de personas, el proyecto del genoma humano, la investigación de proteínas y de mutaciones genéticas.

3.2. Software Snap Gene

SnapGene Es un software de clonación que ayudas en planear y simulando manipulaciones de ADN. SnapGene hace que sus manipulaciones de ADN sean fáciles de visualizar y simular, y le advierte de los errores antes de que sucedan. Cada manipulación de ADN en SnapGene se registra automáticamente, por lo que puede ver exactamente lo que hizo y recuperar las secuencias de construcciones ancestrales.

SnapGene genera automáticamente un registro de cada edición de secuencia y procedimiento de clonación, por lo que no perderá la pista de cómo se hizo una construcción, incluso después de que un miembro del laboratorio se vaya.

3.3. Centro Nacional para la Investigación Biotecnológica (NCBI)

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3.4. Gel de Agarosa

La agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se obtiene disolviendo la agarosa en un buffer de TAE o TBE y se funde usando un microondas, hasta obtener una solución homogénea y transparente. La disolución se vacía en un molde y se coloca un peine (el peine forma unos pozos donde se depositan las muestras).

Se deja enfriar para polimerizar para formar una matriz porosa variando el tamaño del poro según la concentración de agarosa contenida en la disolución. Además, la migración de los fragmentos de ADN variará dependiendo del tamaño, conformación molecular (lineal, circular, superenrollado), concentración de la agarosa en el gel, voltaje, dirección del campo eléctrico, presencia de colorantes añadidos que se intercalan en el ADN (como el bromuro de etidio y SYBR-green) y de la composición del buffer en el gel.

3.5. GEN 16S

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3.6. ADN Y ARN

Tanto el ADN como el ARN están formados por ácidos nucleicos y contienen información genética.

Son moléculas relativamente sencillas, pero determinan en gran parte las características que nos diferencian como especie y, hasta cierto punto, como individuos. La organización básica de los nucleótidos que los componen determina la formación de proteínas.

Sin embargo, existen unas diferencias que hacen que ambos sean necesarios. Al menos, en organismos con cierto nivel de complejidad. En concreto, su composición, aunque parecida, es distinta. Esto provoca que cumplan funciones también diferentes.

3.7. Secuenciación del ADN

La secuenciación de ADN es el proceso que determina la secuencia de bases de los nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN. Hoy en día, con el equipo y los materiales adecuados, secuenciar un fragmento pequeño de ADN es relativamente sencillo.

Secuenciar un genoma completo (todo el ADN de un organismo) sigue siendo una tarea compleja. El proceso requiere romper el ADN del genoma en muchos pedazos más pequeños, secuenciar dichos pedazos y ensamblar las secuencias en una única y larga "secuencia consenso". Sin embargo, gracias a nuevos métodos que se han desarrollado en las últimas dos décadas, ahora secuenciar un genoma es mucho más rápido y menos costoso de lo que resultó en el Proyecto Genoma Humano.

4. METODOLOGIA

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 A continuación, se procede a descargar cada una de las secuencias mencionadas en el cuadro anterior, gracias al código de acceso con el que se cuenta.

 Se coloca el código de la secuencia en el buscador del NCBI, al hallar la descripción de la bacteria procedemos a descargar su composición en formato FASTA, para poder importarlo al SnapGene.

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 Procedemos a trabajar con el software SnapGene, seleccionamos la opción Open, luego Open Files, seleccionamos las secuencias guardadas de manera ordenada e insertamos.

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 Luego de haber seleccionado la simulación de agarosa nos lleva a una nueva ventana, donde podemos apreciar el rango de PCR y demás características. Lo siguientes es agregar las demás secuencias.

 Seleccionamos a 16 lanes y la aplicaremos a 1.0 % de agarosa.

 Adjuntamos las secuencias restantes seleccionando los lanes que se encuentran en la parte superior, luego en Choose DNA Sequences y abrimos la secuencia que sigue.

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5. RESULTADOS

La práctica se pudo realizar de manera eficiente, gracias a los comandos básicos aprendidos del software en clase. El programa contaba con una interfaz intuitiva en la que el software nos permite la visualización de secuencias de ADN, luego de una posterior anotación de secuencias, la edición de las mismas secuencias, la clonación, la visualización de proteínas y nucleótidos.

Podemos observar que todas las moléculas de ADN, con las que se ha trabajado, tienen la misma cantidad de carga por masa.

Debido a esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño. La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros.

También podemos determinar el tamaño absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a una escala estándar de fragmentos de tamaño conocido.

6. CONCLUSION

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7. CUESTIONARIO

a) Indique diferencias entre ADN y ARN.

COMPARACION ADN ARN

Nombre completo Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico

Función

el ADN se replica y almacena información genética. Es un plano de toda la información genética contenida en un organismo.

El ARN convierte la

información genética contenida en el ADN a un formato que se utiliza para construir proteínas y luego la traslada a las fábricas de proteínas ribosómicas.

Estructura

El ADN consta de dos hebras, dispuestas en una doble hélice. Estas hebras están formadas por subunidades llamadas nucleótidos. Cada nucleótido contiene un fosfato, una molécula de azúcar de 5

carbonos y una base

nitrogenada.

El ARN solo tiene una hebra, pero al igual que el ADN, está formado por nucleótidos. Las hebras de ARN son más cortas que las de ADN. El ARN a veces forma una estructura secundaria de doble hélice, pero solo de forma intermitente.

Longitud

El ADN es un polímero mucho más largo que el ARN. Un cromosoma, por ejemplo, es una molécula de ADN única y larga, que tendría varios centímetros de longitud cuando se desenmarañara.

Las moléculas de ARN son de longitud variable, pero mucho más cortas que los polímeros de ADN largos. Una molécula de ARN grande puede tener solo unos pocos miles de pares de bases de largo.

Azúcar

El azúcar en el ADN es desoxirribosa, que contiene un grupo hidroxilo menos que la ribosa del ARN.

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Bases

Las bases en el ADN son adenina 'A', timina 'T', guanina 'G' y citosina 'C'.

El ARN comparte adenina 'A', guanina 'G' y citosina 'C' con el ADN, pero contiene uracilo 'U' en lugar de timina. Paredes de bases  pareja de adenina y timina AT  par de citosina y guanina CG  pareja de adenina y uracilo AU

 par de citosina y guanina CG

Ubicación

El ADN se encuentra en el núcleo, con una pequeña cantidad de ADN también presente en las mitocondrias.

El ARN se forma en el nucleolo y luego se mueve a regiones especializadas del citoplasma según el tipo de ARN formado.

Reactividad

Debido a su azúcar

desoxirribosa, que contiene un grupo hidroxilo que contiene menos oxígeno, el ADN es una molécula más estable que el ARN, que es útil para una molécula que tiene la tarea de mantener segura la información genética.

El ARN, que contiene un azúcar ribosa, es más reactivo que el ADN y no es estable en condiciones alcalinas. Las ranuras helicoidales más grandes del ARN significan que es más fácil de atacar por las enzimas.

Sensibilidad Ultravioleta UV

El ADN es vulnerable al daño de la luz ultravioleta.

El ARN es más resistente al daño de la luz ultravioleta que el ADN.

b) ¿Qué es el SnapGene y como nos serviría en ingeniería ambiental?

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de clonación y PCR. Las herramientas de visualización clave de SnapGene le permite hacer mapas de ADN y diseñar cebadores.

En el ámbito de la ingeniería ambiental sería útil en cultivos modificados, la simulación de producción o clonación de microorganismos con potencial de remediación o la reducción de daños hacia los insectos, contribuir a unas prácticas agrícolas más sostenibles y a la conservación de recursos naturales, incluida la biodiversidad.

c) ¿Qué es el gen 16s y para que tipos de microorganismos sería útil?

El ARNr 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S. Como cualquier secuencia nucleotídica de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega y adquiere una estructura secundaria que se caracteriza por tener segmentos de doble cadena que permiten la formación de asas y hélices. Esta molécula ha sido reconocida como un poderoso marcador universal debido a que se encuentra en todos los organismos conocidos. Su estructura parece mantenerse por largos periodos de tiempo y, como su función no ha cambiado, los cambios en la secuencia probablemente son aleatorios. En su contraparte eucariota, el ARNr 18S, las mutaciones son adquiridas lentamente, y es posible obtener información acerca de todos los organismos en una escala evolutiva. Sin embargo, los ARNr poseen suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos, y es posible diferenciar especies, cepas o variedades. Además, el tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1500 nucleótidos) minimiza las fluctuaciones estadísticas, y la conservación de su estructura secundaria favorece el alineamiento preciso durante la comparación de secuenciasFuente especificada no válida..

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El uso de los iniciadores universales ha favorecido la detección y análisis de secuencias; sin embargo, algunos autores señalan la deficiencia que tienen para detectar un número considerable de especies bacterianas no cultivadas provenientes de muestras medioambientalesFuente especificada no válida.Fuente especificada no válida..

El gen 16S rRNA se utiliza para estudios filogenéticos ya que su secuencia está altamente conservada entre las distintas especies de bacterias y arqueas. Algunas arqueas hipertermófilas contienen intrones en el gen 16S rRNA que se localizan en regiones altamente conservadas y que pueden influir en la hibridación con partidores "universales".

d) ¿Describir El Proceso De Electroforesis Para ADN?

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pone una molécula cargada en un entorno así, las moléculas negativas van a la carga positiva, y viceversa. Al analizar las proteínas en un gel, en una de estas cajas, por lo general se toma la proteína completa para ver lo grande que es. Cuanto más corta, más migran en el gel, de modo que las proteínas pequeñas terminará en la parte inferior del gel, porque han ido más lejos, y las más grandes terminarán quedándose en la parte superior. En el caso del ADN, el ADN es una molécula muy larga, así que no se puede hacer un gel de una molécula entera de ADN de una célula. Es tan grande que nunca se metería en el gel, así que lo que hacen los científicos es cortar el ADN con cosas como las enzimas de restricción, que cortan el ADN en pedazos más manejables, y entonces esas piezas, dependiendo de lo grande que sean, migran más o menos por el gel y terminan más arriba o más abajo.

e) ¿Qué Es La Agarosa?

La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que son extraídos de las algas de los género Gellidium y Gracillaria. La agarosa es un polisacárido constituido por unidades repetidas de una molécula llamada agarobiosa. Este material se extrae en general de las algas marinas y es frecuentemente usada en biología molecular para la separación de moléculas, especialmente ADN por electroforesis (Rochas & Lahaye, 1989). Su uso más extendido es para edificar geles que permitan dividir moléculas de ADN por medio de electroforesis, además de ser usada para fijar moléculas a su composición como anticuerpos, antígenos y enzimas. Por igual se usa para el cultivo celular y en microbiología. Otros usos menos extendidos son la implementación de dichos geles como matrices en la compostura de tejidos afectados. (Wikipedia, 2018)

Ejemplo de uso: cuanto mayor es la concentración de agarosa en un gel, mayor será la energía necesaria para fundir el gel (Magdeldin, 2012).

f) ¿Qué Es Un Marcador De Peso Molecular, Cuáles Son Sus Tipos?

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inequívocamente con un rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariable.

TIPOS DE MARCADOR DE PESO MOLECULAR  Marcadores morfológicos

Son los caracteres de un individuo que se expresan en un ambiente específico y que el hombre identifica con un objetivo determinado.

 Marcadores moleculares

Corresponden a cualquier gen cuya expresión permite un efecto cuantificable u observable.

 Marcadores bioquímicos

Incluyen a las proteínas y las isoenzimas o aloenzimas y constituyen la primera generación de marcadores moleculares.

 Marcadores de ADN

Constituyen la nueva generación de marcadores moleculares y solucionaron el problema de la carencia de marcadores que tenían las isoenzimas, pues son capaces de generar una cantidad virtualmente infinita de marcadores.

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de la tecnología del DNA recombinante han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades. El número de técnicas descritas es cada vez más numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3 categorías: RFLP, MAAP y STS.

PCR (reacción en cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las técnicas esenciales para la preparación de huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por sí sola. La reacción básica de la PCR comienza con la desnaturalización del DNA molde para separar las cadenas, continúa con el alineamiento de un par de oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la polimerización para sintetizar un nuevo DNA entre los dos oligonucleótidos. RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción).

Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los ?pequeños? derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular.

MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación)

Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar:

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individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella dactilar característica.

 AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): La idea es similar a la de la RAPD, desarrollándose a la vez que ésta, aunque se cambia el diseño de los oligonucleótidos y el tipo de PCR. Los oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia (poco específicos) que permite la polimerización de una batería de fragmentos característicos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar (visualizar) específicamente las bandas anteriores.Existe una variación denominada DAF (Huellas dactilares por amplificación de DNA) que utiliza oligonucleótidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difíciles de interpretar.

 AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Esta técnica se desarrolló en 1995 y combina el uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR.

 STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las secuencias conocidas, únicas dentro del genoma, para amplificarlas por PCR. El polimorfismo se suele encontrar fácilmente cuando lo que se amplifican son intrones en lugar de exones. La ventaja principal es la velocidad con la que se pueden realizar los análisis una vez que las parejas de oligonucleótidos se han establecido claramente. Por tanto se combinan la rapidez de la RAPD con la especificidad de la RFLP.

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que consiste en mono-, di-, tri- y tetranucleótidos repetidos en tándem. Este DNA, que es muy polimórfico, se ha utilizado como marcador molecular cuando la secuencia del motivo repetido se clona y secuencia para usarla en el análisis de poblaciones. De esta manera se han estudiado con éxito numerosos árboles, aunque en algunos se ha visto que los microsatélites son menos variables de lo que se esperaba.

 EST (Sitios etiquetados por la expresión), descrita en 1991. Su particularidad proviene del hecho que los oligonucleótidos se han deducido a partir de cDNA parcial o completamente secuenciado. Curiosamente el polimorfismo sólo se observa claramente cuando los fragmentos amplificados se cortan con enzimas de restricción, lo que hace que el método sea realmente costoso en tiempo y dinero.

 CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada), descrita en 1993. Los fragmentos amplificados se someten a una restricción enzimática y se migra en un gel de agarosa. Las variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar cambios finos en una zona específica.

 SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas), descrita en 1993. Esta técnica aprovecha que las RAPD proporcionan principalmente fragmentos de DNA altamente repetido. Estos fragmentos de RAPD se clonan y secuencian para elaborar oligonucleótidos específicos. Aunque permite el desarrollo rápido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo obtenido es bastante bajo.

 D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/térmico), descrita en 1987. Analiza el polimorfismo a través de la estabilidad, a distintas condiciones Desnaturalizantes o Temperaturas, del DNA amplificado. Su principal problema reside en las dificultades técnicas para manetener estables las condiciones experimentales.

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distintas conformaciones son detectables como un cambio de movilidad en geles de poliacrilamida no desnaturalizante.

8. BIBLIOGRAFIA

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