PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
FATORES QUE INTERFEREM NAS CONCENTRAÇÕES DE SAPONINAS EM BRAQUIÁRIAS E INTOXICAÇÃO
EXPERIMENTAL EM BOVINOS
Flávia Gontijo de Lima Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Clorinda Soares Fioravanti
GOIÂNIA 2012
FLÁVIA GONTIJO DE LIMA
FATORES QUE INTERFEREM NAS CONCENTRAÇÕES DE SAPONINAS EM BRAQUIÁRIAS E INTOXICAÇÃO EXPERIMENTAL
EM BOVINOS
Tese apresentada para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientador:
Prof.ª Dr.ª Maria Clorinda Soares Fioravanti – UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo – UFG Prof.ª Dr.ª Eliane Sayuri Miyagi Okada – UFG
GOIÂNIA 2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) GPT/BC/UFG
L732f
Lima, Flávia Gontijo de.
Fatores que interferem nas concentrações de saponinas em braquiárias e intoxicação experimental em bovinos [manuscrito] / Flávia Gontijo de Lima. - 2012.
77 f.
Orientador: Prof.a Dr.a Maria Clorinda Soares Fioravanti;
Coorientadores: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo, Prof.a Dr.a Eliane Sayuri Miyagi Okada.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, 2012.
Bibliografia.
1. Brachiaria brizantha – Fotossensibilização hepatógena – Bovino. 2. Brachiaria decumbens – Fotossensibilização hepatógena – Bovino. 3. Feno como ração. I. Título.
CDU: 636.2:636.085
À Carol, Daniela, Diogo, Neryssa e Victor
AGRADECIMENTOS
Às instituições os profissionais envolvidos neste projeto, Universidade Federal de Goiás - Escola de Veterinária e Zootecnia, Instituto Biológico – Núcleo de Produtos Naturais, United States Department of Agriculture - Poisonous Plant Research Laboratory.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo incentivo financeiro ao projeto e bolsa de pesquisa. E à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de doutorado sanduíche.
Aos meus pais Paulo Sinésio de Lima e Maria C. do Amaral de Lima, e minha irmã Poliana Amaral de Lima, por me darem suporte e compreender minha ausência constante.
À minha orientadora, Profª. Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti, pelo exemplo de dedicação à pesquisa científica, confiança, bons momentos compartilhados e ensinamentos.
Aos meus co-orientadores Eugênio Gonçalves de Araújo e Eliane Sayuri Miyagi Okada por toda a ajuda na interpretação de resultados.
Aos alunos de iniciação científica Carolina dos Santos Ribeiro, Daniela Cardoso, Diogo Di Francescantonio Andrade, Neryssa Alencar de Oliveira, Victor Yunes Guimarães pela dedicação irrestrita a este projeto e pela amizade. E aos alunos voluntários, sem os quais não seria possível a realização deste trabalho.
Ao Marlon Alves de Pádua Filho por compartilhar conosco seus melhores anos de vida.
À equipe do Instituto Biológico de São Paulo, Dra. Mitsue Haraguchi, Dra. Daiane Hansen, Luma Garcia e Ana Luiza Araújo pelos conhecimentos em química e bons momentos compartilhados. E à Renata Mazaro e Costa por me receber em sua casa durante o estágio em São Paulo.
Ao Prof. Dr. Franklin Riet-Correa pelo apoio por meio do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia para o Controle das Intoxicações por
Plantas (INCT) e por ter tornado possível à realização do doutorado sanduíche.
À toda a equipe do Poisonous Plant Research Laboratory, Logan, Utah, EUA, em especial Dr. Jim A. Pfister e Dr. Stephen T. Lee por terem sido além que orientadores grandes amigos.
À família de Utah, Heloisa Rutigliano, Marcus Brasileiro, Cacilda Rego, os Neales, Veronica Caldeo, Jane Li e Jonna van Opstal pelos maravilhosos momentos que passamos juntos.
Ao Danilo Lemos e Lívia Mendonça Pascoal, pela amizade nos melhores momentos, e nos de crise também. E Núbia Graciana Salerno pela ajuda na reta final.
Aos colegas de pós-graduação pela partilha das lutas, conquistas e alegrias, em especial Gustavo Lage Costa, Marcos Fernando Oliveira e Costa, Hilari Wanderley Hidasi, Júlia Miranda Moraes, Mariana Batista Rodrigues Faleiro e Marlos Castanheira.
À banca de qualificação Drª. Maria Clorinda Soares Fioravanti, Eugênio Gonçalves de Araújo, Eliane Sayuri Miyagi Okada, Renata Mazaro e Costa e Daiane Hansen pelas contribuições à redação final.
Aos animais meu respeito e admiração, colaboradores passivos e indispensáveis.
À Deus por ajudar a tornar tudo isso possível.
Obrigada.
Cultura
o girino é o peixinho do sapo o silêncio é o começo do papo
o bigode é a antena do gato o cavalo é pasto do carrapato
o cabrito é o cordeiro da cabra o pescoço é a barriga da cobra o leitão é um porquinho mais novo
a galinha é um pouquinho do ovo
o desejo é o começo do corpo engordar é a tarefa do porco a cegonha é a girafa do ganso o cachorro é um lobo mais manso
o escuro é a metade da zebra as raízes são as veias da seiva o camelo é um cavalo sem sede
tartaruga por dentro é parede
o potrinho é o bezerro da égua a batalha é o começo da trégua papagaio é um dragão miniatura
bactérias num meio é cultura
Arnaldo Antunes
(Álbum “Nome”, Arnaldo Antunes, BMG, 1993)
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 - RETROSPECTIVA DE ESTUDOS SOBRE
FOTOSSENSIBILIZAÇÃO HEPATÓGENA DECORRENTE DA
INTOXICAÇÃO PELO Pithomyces chartarum E Brachiaria NO BRASIL ... 1
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Estudos a partir de 1975 ... 4
1.2 Estudos a partir de 1980 ... 5
1.3 Estudos a partir de 1990 ... 6
1.4 Estudos a partir de 2000 ... 8
1.5 Estudos a partir de 2010 ... 10
REFERÊNCIAS ... 11
CAPÍTULO 2 - CLIMATE AND PLANT AGE AFFECT THE LEVELS OF STEROIDAL SAPONIN AND Pithomyces chartarum SPORES IN Brachiaria GRASS ... 19
Introduction ... 20
Materials and Methods ... 21
Spore counting ... 22
Extraction and isolation of saponin ... 22
Extraction of saponin ... 22
HPLC/ELSD ... 22
Determination of meteorological parameters ... 23
Statistical Analysis ... 23
Results ... 24
Discussion ... 28
Conclusions ... 31
References ... 31
CAPÍTULO 3 - LEVELS OF STEROIDAL SAPONINS ARE RELATED TO AGE AND FIBERS IN Brachiaria GRASS ... 36
1. Introduction ... 37
2. Materials and methods ... 39
2.1 Saponin extraction ... 40
2.2 HPLC-ESI-MS ... 40
2.3 ADF and NDF ... 41
2.4 Statistical Analysis ... 41
3. Results ... 41
4. Discussion ... 42
5. Conclusion ... 45
References ... 45
CAPÍTULO 4 - ENSILING AND HAYMAKING DECREASE THE LEVELS OF STEROIDAL SAPONIN IN Brachiaria GRASS ... 50
1. Introduction ... 51
2. Materials and Methods ... 52
2.1. Silage making ... 52
2.2. Haymaking ... 53
2.3 Plant preparation ... 53
2.4 Extraction ... 53
2.5 HPLC-ESI-MS ... 54
3. Results ... 54
4. Discussion ... 55
5. Conclusion ... 56
References ... 57
CAPÍTULO 5 - EFFECTS OF Brachiaria brizantha HAY CONTAINING STEROIDAL SAPONIN IN CALVES ... 61
Introduction ... 62
Material and methods ... 63
Results ... 65
Discussion ... 67
Conclusion ... 69
References ... 69
CAPÍTULO 6 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 76
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
FIGURA 1 – Saponina dicotomina (Saponin A), saponina B (Saponin B) e protodioscina (Saponin C). ... 3 FIGURA 2 – Bezerro da raça holandesa mantido em pastagem de B.
brizantha apresentando fotossensibilização hepatógena aguda ... 6
CAPÍTULO 2
Figure 1 - Average saponin concentration (%) in Brachiaria brizantha and Brachiaria decumbens ... 25 Figure 2 – Average spore counts (P. chartarum) in Brachiaria brizantha and Brachiaria decumbens ... 26
CAPÍTULO 3
Figure 1 - LC chromatogram of the Brachiaria brizantha MeOH extract sample. By comparing the retention time (tR) and ESI-MS data, protodioscin presented tR 1.56 min and [M+H]+ at m/z 1031, whereas saponin B presented tR 1.89 min and [M+H]+ at m/z 855 ... 49
CAPÍTULO 4
Figure 1 - Average of protodioscin levels in Brachiaria silage (g kg-1) ... 60 Figure 2 - Average of protodioscin levels in Brachiaria decumbens hay (g kg-1) ... 60
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
TABLE 1 - Saponin average concentration (%) and spore counts (P.
chartarum) in Brachiaria brizantha (BB) and Brachiaria decumbens (BD), shown by day of harvest after planting (day 0). ... 25 TABLE 2 – Weather variables average per period ... 27 TABLE 3 – Pearson correlation between weather variables, saponin and spores... 27
CAPÍTULO 3
Table 1 - Average and standard deviation of protodioscin, saponin B, ADF and NDF (g kg-1), in Brachiaria brizantha and Brachiaria decumbens, shown by day of harvest after planting ... 49 Table 2 - Pearson correlation between protodioscin, saponin B, ADF and NDF ... 49
CAPÍTULO 5
TABLE 1 – Average (A) and standard deviations (SD) of AST, ALP, GGT, conjugated bilirubin (CB), unconjugated bilirubin (UB), total bilirubin (TB), glucose, total cholesterol, total protein, albumin, alpha 1, alpha2, beta and gamma globulins, albumin / globulin (A/G), urea and creatinine, of BG and SCG over the periods analyzed ... 74
RESUMO
As espécies de Brachiaria são cultivadas em todo o mundo em climas tropicais e subtropicais. É a principal fonte de volumoso para ruminantes e a gramínea mais importante economicamente para o Brasil. Esta gramínea é palatável, oferece forragem de boa qualidade nutritiva e bom desempenho animal. No entanto, também pode ser hepatotóxica, causando fotossensibilização no rebanho. Os primeiros estudos no Brasil começaram em 1975, quando surtos da doença foram atribuídos à micotoxina esporidesmina do fungo Pithomyces chartarum.
Entretanto, vários surtos foram relatados em rebanhos consumindo pastagens de Brachiaria sem níveis detectáveis de esporos, e nestes casos, a doença foi atribuída a compostos tóxicos, tais como saponinas esteróides, presentes na planta. Os objetivos do presente estudo foram avaliar: (a) os fatores que afetam as concentrações de saponina esteróide e esporos do fungo P. chartarum em Brachiaria brizantha (BB) e Brachiaria decumbens (BD); (b) a influência da idade da planta nas concentrações de saponinas esteróides em BB e BD, e a correlação entre protodioscina, saponina B e fibras; (c) o efeito da ensilagem ou fenação sobre as concentrações de saponina esteróide em BB e BD; (d) e também os efeitos do feno de BB contendo saponina esteróide em bezerros. As saponinas detectadas em BB e BD foram protodioscina, saponina B e a sapogenina diosgenina. A concentração de protodioscina foi maior em plantas jovens durante o início do crescimento, além disso, BD apresentou quantidade mais elevada de protodioscina que a BB. As concentrações de protodioscina foram moderadamente influenciadas pelas variáveis climáticas, as duas principais variáveis foram insolação máxima e precipitação total acumulada. As plantas velhas tiveram uma maior contagem de esporos do fungo P. chartarum do que as plantas jovens. As contagens de esporos não diferiram em BB e BD. A contagem de esporos foi influenciada pela precipitação máxima e evaporação média (tanque classe A). A concentração de protodioscina mostrou uma forte correlação negativa com as fibras (FDA e FDN). As concentrações de saponin B em BB foram constantes ao longo dos períodos analisados, e a BD esteve aumentada em plantas velhas. A saponin B não se correlacionou com fibras e apresentou correlação positiva moderada com protodioscina. As amostras de BB e BD ensiladas não apresentaram concentrações detectáveis de saponina protodioscina após 24 dias de ensilagem. Além disso, na BD a concentração de protodioscina diminuiu 36% durante os primeiros três dias após a fenação e depois se manteve constante. A alimentação de bezerros com feno de BB contendo 0,86% de protodioscina durante 84 dias não causou quaisquer sinais clínicos e alterações macroscópicas de disfunção hepática em bezerros. As alterações microscópicas encontradas foram: infiltração de células mononucleares inflamatórias, degenerações macrovacuolares e necrose de coagulação. Certamente, em um grau muito menor de gravidade, todos estes achados foram compatíveis com a intoxicação por Brachiaria.
Palavras-chave: Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, feno, fotossensibilização hepatógena, idade da planta, silagem
ABSTRACT
Factors affecting the levels of saponin in Brachiaria and experimental intoxicating in cattle
Brachiaria species are cultivated worldwide in tropical and subtropical climates. It is the main forage source for ruminants and the most economically-important grass in Brazil. This grass is palatable to livestock, provides nutritious forage quality and good animal performance. However, it can also be hepatotoxic, causing hepatogenous photosensitization in livestock. The first studies in Brazil began in 1975, when outbreaks of this disease were attributed to the mycotoxin sporidesmin, from Pithomyces chartarum fungus. However, several outbreaks were reported in livestock grazing Brachiaria pastures with no detectable spores of P. chartarum, and in these cases the disease was attributed to poisonous compounds, such as steroidal saponins, in the plant. The objectives of the present study were to evaluate: (a) the factors that affect the levels of steroidal saponin and Pithomyces chartarum spores in Brachiaria brizantha (BB) and Brachiaria decumbens (BD); (b) the influence of plant age in the levels of steroidal saponins in BB and BD, and the correlation between saponin protodioscin, saponin B and fibers; (c) the effect of ensiling or haymaking on concentrations of steroidal saponins in BB and BD; (d) and also the effects of BB hay containing steroidal saponin in calves. The saponins detected in BB and BD were protodioscin, saponin B and sapogenin diosgenin. The level of protodioscin was higher in immature plants during early growth; furthermore, BD had a higher amount of protodioscin than found in BB. The level of protodioscin was moderately influenced by climatic variables; the two main variables were the maximum sunshine duration and total cumulative precipitation. Older plants had a higher spore counting than younger plants. P. chartarum spore counts did not differ in BB and BD. Spore counting was influenced by maximum precipitation and average evaporation (Class A pan). Protodioscin concentration showed a strong negative correlation with fibers (ADF and NDF). Saponin B concentrations of BB were constant over periods and BD had increased in old plants. Saponin B was not correlated to fibers and had positive moderate correlation with protodioscin. Samples of BB and BD ensiled had no detectable levels of the saponin protodioscin after 24 days of ensiling. In addition, in BD the concentration of protodioscin decreased 36% over the first three days after haymaking and then remained constant. The BB hay containing 0.86% of protodioscin did not cause any clinical signs and macroscopic alterations of hepatic dysfunction in calves. The microscopic alterations were mononuclear inflammatory cell infiltration, macrovacuolar degenerations and coagulative necrosis. Certainly, in a much lower degree of severity, all these findings were compatible with poisoning by Brachiaria.
Keywords: Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, hay, hepatogenous photosensitization, plant age, silage
PELO Pithomyces chartarum E Brachiaria NO BRASIL
1 INTRODUÇÃO
O termo fotossensibilização é descrito como a sensibilidade exagerada da pele a luz solar, induzida pela presença de um agente fotodinâmico. O tipo mais comum de fotossensibilização em bovinos é a hepatógena, sendo as plantas tóxicas e as micotoxinas os principais agentes envolvidos nos casos espontâneos descritos no Brasil (TOKARNIA et al., 2000). Algumas espécies do gênero Brachiaria como a B. brizantha, B. humidicola e, especialmente, B. decumbens têm sido apontadas como causadoras de fotossensibilização hepatógena em bovinos, ovinos, caprinos, bubalinos e equinos (RIET-CORREA et al., 2011a).
A extensa utilização do capim Brachiaria na alimentação de animais no Brasil, e em outros países tropicais, é justificada pelas inúmeras vantagens que esta gramínea possui quando comparada a outras espécies. Apresenta produtividade adequada em solos com baixa e média fertilidade, com produção de massa verde e tolerância a escassez de chuvas. É altamente agressiva na competição com a vegetação nativa, tem elevada disseminação por semeadura e persistência natural. Todas essas vantagens explicam a preferência dos pecuaristas por essa gramínea na alimentação de animais (MILES et al., 1996).
A intoxicação por Brachiaria, também classificada como fotossensibilização hepatógena (FH) ou eczema facial, tem como agentes etiológicos a micotoxina esporidesmina produzida pelo fungo Pithomyces chartarum e as saponinas esteróides, especificamente a protodioscina (BRUM et al., 2007; DiMENNA et al., 2009). Os animais intoxicados apresentam microscopicamente como principais alterações no fígado colangite, pericolangite, proliferação de ductos biliares e tecido fibroso (DRIEMEIER et al., 2002). É comum nestes casos a presença de macrófagos e células gigantes multinucleadas com citoplasma espumoso, localizadas principalmente na região periacinar. Essas mesmas células são observadas em fígados de animais aparentemente sadios alimentados com Brachiaria (FIORAVANTI, 1999).
O P. chartarum (BERK & CURT) M.B. Ellis é um fungo saprófito amplamente presente em regiões tropicais, subtropicais e temperadas. É encontrado em folhas velhas e em decomposição de pastagens nativas, mas principalmente nas pastagens cultivadas. Muitos conídios (esporos) são produzidos sob condições ambientais favoráveis, como umidade relativa de 60%
e temperatura entre 18 e 27°C, e esees esporos podem conter a micotoxina esporidesmina (DI MENNA et al., 2009).
Os primeiros isolamentos do fungo decorrente de casos de eczema facial em ovinos datam de 1958 na Nova Zelândia (DiMENNA et al., 2009). No Brasil o primeiro relato de intoxicação de bovinos por Brachiaria ocorreu em 1975 (DOBEREINER et al., 1976) e desde então diversas pesquisas foram desenvolvidas na tentativa de elucidar o agente etiológico, patogenia, tratamentos possíveis e estratégias de manejo a fim de minimizarem os prejuízos decorrentes da doença nos rebanhos.
As saponinas são substâncias derivadas do metabolismo secundário das plantas, relacionados com o sistema de defesa e, apesar de não serem essenciais para a vida da planta produtora, garantem vantagens para sua sobrevivência no ecossistema a que pertence. São encontradas nos tecidos que são mais vulneráveis ao ataque fúngico, bacteriano ou predatório dos insetos, tais como folhas (REED et al., 2000). As saponinas são glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. Esse tipo de estrutura, possui uma parte com característica lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra parte hidrofílica (açúcares), o que determina sua propriedade de redução da tensão superficial da água e suas ações detergentes e emulsificantes (SCHENKEL et al., 2007).
As principais saponinas esteróides detectadas em Brachiaria foram a protodioscina e a saponina B, como descritas por LEE et al. (2011) na figura 1. A protodioscina possui massa molecular de 1048g/mol, fórmula C51H84O22, sendo descrita como (25R)-furost-5-ene-3β,22α,26-triol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl - (1→4) - [α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)] - β-D-glucopyranosyl 26-O-β -D- glucopyranoside. A saponina B, também denominada de Dioscorea gracilina Saponin A – Protobioside, possui massa molecular de 902g/mol, fórmula C45H74O18, sendo descrita como (25R)-furost-5-ene-3β,22α,26-triol 3-O-α-L-
rhamnopyranosyl -(1→2) - β-D-glucopyranosyl 26-O-β -D-glucopyranoside (AHMAD & BASHA, 2006; LEE et al., 2009).
FIGURA 1 – Saponina dicotomina (Saponin A), saponina B (Saponin B) e protodioscina (Saponin C).
Adaptado de LEE et al. (2009)
Em 1940, ROCHA E SILVA apresentou o estudo intitulado
“Fotossensibilização em bovinos: a ‘peste das queimadas’, doença causada pelo
‘Holocalyx glaziovii, Taub’” , que talvez tenha sido o primeito relato de FH em bovinos por intoxicação por gramíneas relatado no Brasil. Embora nesse estudo o autor tenha atribuído a doença à intoxicação por Holocalyx glaziovii, a descrição das lesões clínicas e histológicas são compatíveis com intoxicação por gramíneas tropicais, no caso capim Colonião (Panicum maximum) e capim Jaraguá (Hyparrhenia rufa). O primeiro relato de inxoticação de bovinos por Brachiaria data de 1975, conforme descrito a seguir.
1.1 Estudos a partir de 1975
O primeiro relato brasileiro de bovinos acometidos por FH em pastagens de B. decumbens foi documentado em 1975 no Estado de Goiás (DOBEREINER et al., 1976), despertando o interesse de pesquisadores e desencadeou uma serie de estudos nos anos seguintes. Em 1976, DOBEREINER et al. descreveram surtos de FH em bovinos jovens e ovinos de qualquer idade mantidos em pastagens jovens de B. decumbens cujas sementes eram de origem australiana.
No mesmo ano a doença foi descrita em bovinos jovens (bezerros recém-desmamados, de sete a dez meses), com maiores incidências de FH em pastagens de B. decumbens infestadas por esporos do fungo P. chartarum, sendo naquele momento associado aos relatos de eczema facial descritos na Austrália e Nova Zelândia (CAMARGO et al., 1976), uma vez que muitos surtos ocorriam em pastagens plantadas com sementes provenientes da Austrália (CINTRA et al., 1977).
Em 1976 foi confirmado por M. B. Ellis no Common-Wealth Mycological Institute, Inglaterra, a presença do P. chartarum em amostras de B. decumbens provenientes de São Paulo e Goiás, motivando a equipe da Seção de Micologia Fitopatológica do Instituto Biológico de São Paulo a intensificar seus estudos sobre este micro-organismo (MALAVOLTA et al., 1983).
Neste contexto, os pesquisadores do Instituto Biológico de São Paulo destacaram-se pelo pioneirismo nos relatos da doença e estudos do fungo P.
chartarum, divulgando comunicados e notas informativas para a comunidade científica (TEMPERINI & BARROS, 1977).
Nesta época a micotoxina esporidesmina foi indicada como principal agente etiológico da FH, mesmo não sendo identificada em testes químicos e biológicos. A possibilidade de compostos presentes na B. decumbens serem os responsáveis foi descartada e os estudos concentraram-se na investigação do fungo P. chartarum (ANDRADE et al., 1978). O uso de antifúngicos foi testado in vitro para o P. chartarum, cujos princípios que melhor impediram o crescimento do fungo foram benomil e tiabendazol (BRIGNANI NETO et al., 1979).
1.2 Estudos a partir de 1980
Os resultados de experimentos controlados e análises epidemiológicas tiveram destaque maior a partir de 1980, não somente relatos de casos como visto na década anterior.
O fungo P. chartarum foi encontrado amplamente distribuído no Brasil, especialmente em amostras de Brachiaria, mas também presente em outras plantas (MALAVOLTA et al., 1980). A condição mais adequada para seu desenvolvimento foi descrita como temperatura de 24°C e para esporulação 24°C a 27°C, sendo as folhas secas o melhor substrato para o desenvolvimento do fungo (MALAVOLTA et al., 1983).
Bezerros lactantes (15 a 40 dias de idade) também foram descritos com FH, levando a suspeitar que estes animais houvessem se intoxicado por meio do leite de vacas mantidas em pastagem de B. decumbens com altas contagens de esporos (165.000 esporos/grama de pastagem), sugerindo que a esporidesmina poderia ser eliminada no leite (FAGLIARI & PASSIPIERI, 1983;
FAGLIARI, 1989).
A presença do fungo foi investigada em 17 forrageiras, em que todas apresentaram esporos do P. chartarum. Em B. decumbens importada diretamente da Austrália os esporos estavam presentes em 53,19% das amostras e na B.
decumbens de origem nacional em 48,96%. A maior ocorrência do fungo deu-se no outono e foi encontrado em maior número nas folhas basais do que nas folhas superiores, medianas ou haste, sugerindo que o manejo intensivo da pastagem, sem o acúmulo de folhas velhas e secas, reduziria as condições ideais para o desenvolvimento do fungo (RUSSOMANO et al.,1985).
A ocorrência de eczema facial em ovinos foi relatada no estado de São Paulo, em que os animais pastejavam B. decumbens e B. ruziziensis apresentaram sinais característicos de FH. A análise micótica e micotoxicológica detectarama presença do fungo P. chartarum e o mesmo foi produtor de esporidesmina, sendo esse surto atribuíno à esporidesminotoxicose (PURCHIO et al., 1988).
1.3 Estudos a partir de 1990
Em 1990 a tese intitulada “Estudo epidemiológico, clínico e laboratorial da intoxicação natural de bovinos pela micotoxina esporidesmina” (FAGLIARI, 1990) foi um estudo pioneiro na classificação da FH, que dividiu as intoxicações em quatro formas: subclínica, aguda (Figura 2), crônica moderada e crônica grave.
FIGURA 2 – Bezerro da raça holandesa mantido em pastagem de B. brizantha apresentando fotossensibilização hepatógena aguda (GUIMARÃES et al., 2008)
Estudos que quantificaram os prejuízos causados pela FH nos rebanhos verificaram que bovinos jovens, de sete a 12 meses, foram os mais acometidos pela doença. Nessa faixa etária a prevalência da doença foi de 10% a 18%, levando à morte 25% a 30% dos animais, independente do sexo. Na faixa etária de bezerros lactantes a prevalência da doença foi de 7% (FAGLIARI, 1991a). Em outro estudo a FH foi identificada nas categorias subclínica, crônica moderada e crônica grave, ocasionando ao final de um ano perdas de peso de 2,52%, 28,01% e 39,28% respectivamente. Esta forma de classificação baseou-se no monitoramento do quadro clínico, histopatológico e aumento de
gamaglutamiltransferase (FAGLIARI, 1991b).
As principais alterações histopatológicas descritas no fígado de animais com a forma subclínica e aguda da doença, assim como em animais que se recuperaram da lesão de pele, foram a proliferação de células dos ductos biliares, pericolangite, proliferação conjuntiva portal, colestase intra-hepática, vacuolização de hepatócitos, necrose de hepatócitos e megalocitose (ALESSI et al., 1994).
A forma subclínica foi considerada de caráter endêmico e a de diagnóstico mais complexo, devido à ausência de indícios clínicos visíveis. Diante deste questionamento, estudos específicos foram conduzidos, cujos resultados evidenciaram que a forma subclínica teve incidência de 64% dos bovinos estudados e os principais achados histopatológicos foram colangiohepatite e reação inflamatória granulomatosa zonal, caracterizada pelo acúmulo de macrófagos espumosos (FIORAVANTI, 1999).
Em avaliações de fígados e linfonodos de bovinos, a presença de macrófagos espumosos foi considerada a alteração mais expressiva em animais que ingeriam Brachiaria (DRIEMEIR et al., 1998; DRIEMEIR et al.,1999).
Na região Centro-Oeste, a avaliação de ovinos que apresentavam FH evidenciou colangiopatia associada a cristais em animais mantidos em pastagens de B. decumbens (LEMOS et al., 1996). Estes estudos foram os primeiros no Brasil a atribuírem surtos de FH à ação tóxica da B. decumbens e não à esporidesminotoxicose, pois de 30 culturas de P. chartarum analisadas, apenas uma demonstrou ser produtora de esporidesmina (COLLIN et al., 1998).
Fundamentados pelos estudos realizados até este momento, pesquisadores brasileiros enviaram amostras de P. chartarum do Brasil para o AgResearch, Ruakua Agricultural Centre, na Nova Zelândia, que foram avaliadas em parceria com esta instituição. Os resultados demonstraram que as cepas do Brasil são menos patogênicas que as da Oceania (COLLIN et al., 1998).
A década de 1990 foi marcada por duas linhas distintas no estudo da FH no Brasil. Enquanto alguns grupos de pesquisadores julgavam ser a esporidesmina a etiologia da enfermidade, outros grupos indicavam que a própria Brachiaria possuiria princípios ativos tóxicos.
1.4 Estudos a partir de 2000
Diante das evidências de toxicidade da Brachiaria, pesquisadores induziram a colangiohepatite em cordeiros a partir de extratos de B. decumbens, assim como identificaram saponinas e sapogeninas nesta gramínea (CRUZ et al., 2000; CRUZ et al., 2001; PIRES et al., 2002).
DRIEMEIER et al. (2002) também atribuíram às propriedades tóxicas da B. decumbens a formação de macrófagos espumosos e cristais nos ductos biliares de ovinos.
Em continuidade ao estudo dos macrófagos espumosos, diversas pesquisas foram desenvolvidas a partir de amostras de fígado e linfonodos de bovinos (GOMAR, 2002). Dr.a Fioravanti desenvolveu junto à Harvard Medical School, no ano de 2000, estudos sobre a caracterização imunohistológica de macrófagos espumosos em fígado de bovinos. Os macrófagos mostraram comportamento diferente frente aos marcadores utilizados. As células de Kupffer, os macrófagos do espaço porta, os macrófagos espumosos isolados ou agrupados, bem como as células gigantes mostraram-se fortemente positivas para o CD68. Todas essas células, exceto os macrófagos perivasculares do espaço porta, foram negativas para o CD14, caracterizando a heterogeneidade dessas células (FIORAVANTI et al., 2001). Estudos adicionais evidenciaram grandes quantidades de imunoglobulinas G e M nos ductos biliares, sugerindo que os animais encontravam-se sob estimulação antigênica (FIORAVANTI, 2000).
FAGLIARI et al. (2003a) em estudo com 280 bezerros recém- desmamados mantidos em pastagens de B. decumbens, verificaram que 64,64%
dos animais apresentaram FH, dos quais 47,52% possuíam a forma subclínica, 35,91% clínica moderada e 26,57% a forma grave da doença. Concluindo que independente do agente etiológico envolvido, saponina ou esporidesmina, deveria se evitar que bezerros jovens pastejassem em B. decumbens, e o fornecimento regular de zinco para animais poderia diminuir o percentual de mortalidade e minimizar a gravidade da doença (FAGLIARI et al., 2003b).
A partir do ano de 2002, intensificaram-se as pesquisas sobre a detecção e quantificação de saponinas esteróides em Brachiaria spp. Os estudos novamente concentraram-se no Instituto Biológico de São Paulo, sob
coordenação da Dr.a Mitsue Haraguchi, em parceria com diversas instituições de ensino e pesquisa.
A protodioscina foi identificada como a principal saponina esteróide presente em Brachiaria, sendo atribuído a este composto surtos de FH (BRUM et al., 2007). Diversos surtos foram relatados em pastagens com baixas contagens ou até mesmo ausentes de esporos, reforçando a teoria da toxicidade da Brachiaria (MENDONÇA et al., 2008; SILVEIRA et al., 2009).
Em 2008 foi criado o “Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia para o Controle das Intoxicações por Plantas” (INCT) pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), cujos principais objetivos foram desenvolver técnicas de controle das intoxicações por plantas em animais de produção e estudar as intoxicações por plantas das regiões Nordeste, Centro- Oeste e Norte, com atenção especial para as intoxicações por Brachiaria.
Com a criação do INCT e as parcerias nacionais e internacionais por ele geradas, no ano de 2009, em João Pessoa-PB, foi realizado o “8th International Symposium on Poisonous Plants”, reunindo assim, os principais estudiosos sobre o tema. O evento foi dividido em seções, e na seção “Fígado” foram apresentados estudos sobre intoxicações por Brachiaria.
Os primeiros estudos direcionados para a fisiologia da saponina na Brachiaria foram publicados a partir de 2009. BRUM et al. (2009), encontraram maiores valores de saponina em plantas senescentes e MOREIRA et al. (2009) relacionaram o teor de saponina com fatores climáticos, como temperatura e umidade.
Em tentativa de estabelecer um modelo experimental para estudo da intoxicação por Brachiaria, LIMA (2009) avaliou ovinos naïves alimentados com feno de Brachiaria brizantha contendo 0,86% de protodioscina durante 93 dias. As únicas alterações bioquímicas sugestivas de lesão hepática foram elevação dos valores de gamaglutamiltransferase e diminuição de colesterol total, nenhum animal apresentou alteração macroscópica no fígado e a análise microscópica revelou hepatócitos preservados e presença de infiltrados celulares mononucleares multifocais no parênquima hepático e também no espaço porta, caracterizando-se leve colangite. Entretanto, este não foi um modelo ideal para avaliação de intoxicação por Brachiaria, pois os animais não apresentadram
lesões significativas e o grupo controle, alimentado com cana-de-açúcar, apresentaou os mesmos padrões de lesão.
A primeira década do século XXI também foi marcada pela publicação de dois livros de referência no estudo de plantas tóxicas, com capítulos exclusivos sobre FH, sendo eles: “Plantas Tóxicas do Brasil” (TOKARNIA, 2000) e a terceira edição do livro “Doenças de Ruminantes e Equídeos” (RIET-CORREA et al., 2007).
1.5 Estudos a partir de 2010
Em um levantamento epidemiológico, SOUZA et al. (2010), encontraram índices de morbidade de 0,2% a 0,5% e letalidade de 44,4% a 100%
em bovinos intoxicados por Brachiaria. Em estudo com bubalinos mantidos em pastagem de Brachiaria, RIET-CORREA et al. (2010) relataram que apesar da ausência de sinais clínicos, ocorreram extensas lesões no fígado, principalmente com o acúmulo de macrófagos espumosos.
No ano de 2011 foi publicado o livro referente ao “8th International Symposium on Poisonous Plants”, contando com capítulos sobre intoxicações por Brachiaria no Brasil e identificação e quantificação de saponinas esteróides (RIET-CORREA et al., 2011b). Este livro evidenciou que a tendência das pesquisas no Brasil se dedicaríam ao estudo das propriedades tóxicas da Brachiaria nos próximos anos, por meio da avaliação das saponinas esteróides e não mais ao estudo do fungo P. chartarum.
A saponina protodioscina foi a principal saponina detectada em B.
brizantha e B. decumbens, entretanto em B. humidicola sua concentração foi baixa ou ausente (LEE et al., 2011). As plantas jovens possuíam teores maiores de protodioscina que as plantas velhas, fato que pode estar associado à defesa da planta, uma vez que as plantas jovens são mais vulneráveis ao ataque de predadores (FERREIRA et al., 2011).
A dose tóxica de protodioscina para ruminantes ainda não foi estabelecida, mas é sabido que animais jovens ou não adaptados às pastagens de Brachiaria, independente da dose, são mais susceptíveis à intoxicação
(CASTRO et al., 2011).
A partir do ano de 2010, estudos estão sendo desenvolvidos nas áreas de fisiologia vegetal, fatores ambientais e métodos de quantificação irão ajudar a elucidar o comportamento das saponinas na Brachiaria, assim como estudos em biologia molecular poderão identificar os mecanismos de ação das saponinas no rúmen e fígado e pesquisas em genética irão contribuir com o desenvolvimento de raças de animais resistentes à intoxicação por Brachiaria, buscando a diminuição dos prejuízos causados por esta gramínea à pecuária.
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CAPÍTULO 2† - CLIMATE AND PLANT AGE AFFECT THE LEVELS OF STEROIDAL SAPONIN AND Pithomyces chartarum SPORES IN Brachiaria GRASS
† Capítulo editado de acordo com as normas da Revista International Journal of
Poisonous Plant Research
Abstract
Brachiaria species are cultivated worldwide in tropical and subtropical climates as the main forage source for ruminants. Numerous tropical and warm- season grasses cause hepatogenous photosensitization, among them several species of Brachiaria. Steroidal saponins present in these plants may be responsible for the liver damage. However, sporidesmin and other hepatotoxic mycotoxins are likely to produce synergistic effects, which could explain the sporadic incidence of poisoning. The objective of this study was to evaluate the relation between steroidal saponin (measured by HPLC/ELSD), Pithomyces chartarum spores present in plots of Brachiaria, and the possible influence of meteorological factors on saponin and spores levels. The saponin detected in B.
brizantha and B. decumbens was protodioscin. The saponin concentration was higher in immature plants during early growth; further, B. decumbens had a higher amount of saponin than found in B. brizantha. The level of saponin concentration was moderately influenced by climatic variables; the two main variables were the maximum sunshine duration and total cumulative precipitation. P. chartarum spore count was higher in older plants and did not differ between B. brizantha and B.
decumbens. Spore counting was influenced by maximum precipitation and average evaporation (Class A pan).
Keywords: protodioscin, sporidesmin, tropical grasses
CLIMA E IDADE DA PLANTA INFLUENCIAM AS CONCENTRAÇÕES DE SAPONINA ESTERÓIDE E CONTAGEM DE ESPOROS DO Pithomyces
chartarum EM GRAMÍNEA Brachiaria
Resumo
As espécies de Brachiaria são cultivadas mundialmente em regiões de clima tropical e subtropical como a principal forragem para ruminantes. Diversas gramíneas tropicais e de clima temperado causam fotossensibilização hepatógena, incluindo várias espécies de Brachiaria. As saponinas esteróides presentes nestas plantas podem ser responsáveis pela lesão hepática.
Entretanto, esporidesmina e outras micotoxinas hepatotóxicas estão relacionadas
com produção de efeitos sinérgicos, o que poderia explicar a incidência esporádica da intoxicação. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre saponina esteróide (quantificada por HPLC/ELSD), contagem de esporos de Pithomyces chartarum presentes em canteiros de Brachiaria, e a possível influencia de fatores meteorológicos sobre a concentração de saponina e esporos.
A saponina detectada em B. brizantha e B. decumbens foi a protodioscina. A concentração de saponina foi alta em plantas imaturas durante a fase inicial de crescimento; assim como B. decumbens possui níveis de saponina mais elevados do que os encontrados em B. brizantha. Os níveis de saponina foram moderadamente influenciados pelas variáveis climáticas; as duas principais variáveis foram insolação máxima e precipitação total cumulativa. A contagem de esporos de P. chartarum foi maior em plantas velhas e não diferenciou entre B.
brizantha e B. decumbens. A contagem de esporos foi influenciada pela precipitação máxima e evaporação média (tanque classe A).
Palavras-chave: esporidesmina, gramínea tropical, protodioscina
Introduction
Brachiaria species are cultivated worldwide in tropical and subtropical climates due to their high productivity, and these grasses are critical for meat and milk production in many countries as the main forage source for ruminants (Milles et al., 1996).
The extraordinary reliance on Brachiaria in Brazil, as in other tropical countries, is justified by the advantages that this grass has over other species.
Brachiaria spp. provide excellent yields of green matter in soils with low and medium fertility, they are very drought tolerant, resistant to pests, and are well adapted to acidic and poor soils. It is not only a valuable plant for erosion control as a ground cover, but also tolerates heavy grazing. Moreover, it has the ability to adapt to different environments; it has a high aggressiveness that competes with the native vegetation and the seeds have a natural high resistivity which allows these plants to establish in, and dominate, native vegetation (Dias-Filho, 2000;
Argel et al., 2007; Hare et al., 2009).
Pithomyces chartarum (Berk & Curt) M. B. Ellis is a broad-based saprophytic fungus found in tropical, subtropical and temperate regions. It is mostly found in dead plant material in native pastures, mostly in the cultivated ones. Many conidia (spores) are produced under favorable environmental conditions, and contain the hepatotoxic sporidesmin, that can cause hepatogenous photosensitization. Experimental reproduction of the fungus
indicates that most of the samples (isolates) from Australia and New Zealand produce sporidesmin (Di Menna et al., 2009).
Saponins are substances found in at least 400 plant species, many of which are used as food or supplements in ruminant nutrition. Saponins have beneficial effects as growth promoters, but sometimes are toxic to ruminants. Saponins are derivatives of secondary plant metabolism, related to the plant defense system, and are mainly found in tissues that are most vulnerable to fungal or bacterial attack or insect predation (Wina et al., 2005). Brachiaria species and other plants (Panicum spp., Tribulus terrestris and Narthecium ossifragum) contain steroidal saponins, which are associated with deposition of crystalloid material in the biliary system, cholangitis, and hepatogenous photosensitization (Driemeier et al., 2002;
Brum et al., 2007; Fagliari et al., 2007; Uhlig et al., 2007; Botha et al., 2008; Badiei et al., 2009; Lee et al., 2009; Assumaidaee et al., 2010; Saturnino et al., 2010).
The objective of this study was to evaluate the relation between steroidal saponins and Pithomyces chartarum spores present in plots of Brachiaria, and the possible influence of meteorological aspects of the environment on saponins and spores.
Materials and methods
Twenty-four plots measuring 3x4m were planted, twelve with B. decumbens cv. Basilisk and the other twelve with B. brizantha cv. Marandu, at the Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil (16°36’11,35”S 49°16’06,50”W; elevation 770m). Each plot had 14 lines of plants; the outside lines were not harvested, and 2 inside lines were harvested at each sample period.
Nitrogen fertilization was applied after an initial soil analysis. Nitrogen was applied evenly to all plots at one of 3 levels (0, 50, 100 kg/hectare), 30 days after planted.
Plant development was followed up for 12 months. The plants were sampled on the 60th, 120th, 180th, 240th, 300th and 360th day, after planting, to determine spore concentration and saponin concentration during this period.
Plants were clipped near ground level (5cm) and the green material was collected to determine the quantity of spores and saponin concentration. Although
the total plant was collected, the leaves and stems were subsequently separated and the analysis was only done on leaf material.
Spore counting
The morphologic identification of the fungal spores from Pithomyces chartarum was based on Dingley´s (1962) description. The technique used for spore counting was adapted from Di Menna & Bailey (1973). Leaves were cut into 2-cm pieces. Sixty grams of fresh grass were mixed by hand in 600ml of water.
After one minute of agitation, spores were counted using a microscope counting chamber (hemocytometer). The quantities of spores counted in a 2mm³ are multiplied by 5000 which is equal quantity of spores in 1g of pasture.
Extraction and isolation of saponin
The leaves of B. decumbens and B. brizantha were dried at room temperature and ground in the Wiley mill (3mm). The dried material was stored in airtight bags and analyzed around 6 months after each sampling.
Extraction of saponin
Dried powdered leaf samples were processed in duplicate. Each sample (1g) was extracted three times in 50% acetonitrile and water (v/v) using volumes of 8mL, 5mL and 3mL, under ultrasonic agitation agitator for 30 min, 30min and 20 min, respectively. Next, the extracts were transferred to a test tube and centrifuged for 30 minutes at 5000 rpm at 13ºC. The extracted solution was completed to 10mL to analyses at HPLC/ELSD (high-performance liquid chromatography/evaporative light scattering).
HPLC/ELSD
Saponin was quantified using a modification of the technique of Ganzera et al. (2001). The analysis was done with a Shimadzu HPLC, model LC-10AD coupled to the detector; the evaporative light scattering from Shimadzu model ELSD-LTs was used for quantitative analysis of protodioscin. The column used was a Shim-Pack CLC-ODS (4.6 x150mm, 5.0 µm) using a gradient system with
acetonitrile (B) / water (A), starting at 20% B, 5 min, 35% B, 12.5min, 20% B, 5min, flow 1mL/min, the injection volume was 10 µL, using a 10 µL loop.
Determination of meteorological parameters
Meteorological dates refer to the daily averages of each period (interval of 60 days). Data was acquired in Goiânia, Goiás, Brazil, from December 2007 to December 2008 and provided by the meteorological station of the Federal University of Goiás, about 1km away from the plots.
Twenty-five variables were analyzed: the mean, maximum and minimum of sunshine duration (Campbell-Stokes sunshine recorder), solar radiation, relative humidity, maximum temperature, minimum temperature, evaporation (class A pan), evaporation (Piche evaporimeter) and precipitation (mean, maximum, cumulative/period and total cumulative). The equipment and measurements used adhered to the international standard (WMO, 2008).
Statistical analysis
Data for spores were tested for normality, and were not evenly distributed.
The evaluation of the spores and saponin concentration between groups were assessed using the Mann-Whitney test, with a significance level of 5% (Sampaio, 2007). For the analysis within groups at each level of nitrogen the Kruskal-Wallis test was used. The correlation between spore counts, saponin concentration, and meteorological parameters was examined using Pearson's correlation and multiple regression.
Correlation analysis and multiple regression procedures with influence diagnostics (e.g., residuals, examining outliers, and leverage) were used in SAS (2007) to determine their relationships. After this initial analysis, a stepwise multiple regression was used in an exploratory analysis to screen independent variables, followed by a hierarchical multiple regression with 2 variables introduced in a specific order for the final regression equations. Multi-co-linearity is loosely defined as a regression model in which two or more predictor variables are highly correlated; this greatly inflates the R2 value. The Variance Inflation Factor (VIF) is a common method for detecting multi-co-linearity; VIF (the reciprocal of the tolerance) was examined for each model, and models with VIF > 4 were discarded
(Belsley et al., 1980). A VIF of this magnitude indicates that the variance of the estimated coefficient is > 4 times larger than it would be if the predictors were not correlated. The condition index was also used as another indicator of co-linearity;
a condition index > 30 suggests that some variables are highly correlated, and the model should be refit (Yu, 2000). The variables were discarded with a condition index > 15. Additionally, co-linearity was diagnosed by recognizing variables that had large proportions of variance (0.50 or more) that corresponded to large condition indices.
The best models were defined as those that had a high R2, were significant at p < 0.05, and had a relatively small value of Mallow’s Cp statistic, where Cp was approximately equal to the number of terms in the model. Cp tends to find the best subset of the model that includes only the important predictors of the dependent variable. The data were not compared r2 between periods and species because the variances of some of the independent variables were not equal.
Because the purpose of this study was to determine if there was a relationship between the weather and concentrations of saponin and the spore counts, there was no cross validation attempted in this study to forecast levels of saponin and spore count in other populations of plants.
Results
The saponin detected in B. brizantha and B. decumbens was protodioscin.
The level of nitrogen fertilization did not influence (p > 0.10) the amount of spores or saponin concentration. For this reason the results were grouped by species of Brachiaria, independent of the level of fertilization (Table 1 and Figure 1).
The level of saponin detected in B. decumbens was higher (p <0.05) than in B. brizantha at all time periods. Both of the Brachiaria species had the highest average concentration of saponin during the first sampling period at 60 days (p
<0.05), then decreased around 70% at 120 days and the lowest level was observed at 300 days.
