Sysmex Educational Enhancement & Development

Porque necessitamos de uma contagem diferencial de leucócitos?

Os leucócitos são compostos por várias subpopulações com funções biológicas diferentes. A contagem de leucócitos (WBC) por si só não é muito informativa na avaliação do estado de saúde de um indivíduo. A presença de WBC normais não significa que tudo está bem. Tendo isto em conta, é prática comum fornecer a denominada contagem diferencial de WBC.

O diferencial normal de WBC divide os leucócitos em 5 subpopulações principais, nomeadamente:

n Linfócitos n Monócitos n Neutrófilos n Eosinófilos n Basófilos

O método tradicional de diferenciação dos leucócitos é a avaliação microscópica manual. Esta requer a preparação de um esfregaço sanguíneo fino que é, depois, secado ao ar e corado com corante de tipo Romanowsky. O primeiro método de referência para a contagem diferencial de WBC, foi publicado pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) em 1984. Este estabelecia que quatro operadores realizassem cada um uma contagem diferencial de 200 células, em dois esfregaços diferentes colhidos do mesmo tubo de amostra e a determinação da média das quatro contagens. Reconhecendo-se que este método não é prático, as recomendações actuais do CLSI reduziram o número de operadores para dois. No entanto, a maioria dos laboratórios está demasiado ocupada para seguir este

procedimento moroso, consequentemente, na prática, as contagens diferenciais derivam geralmente de um único operador que realiza uma contagem de 100 células num único esfregaço. A contagem diferencial foi originalmente representada apenas em termos relativos, nomeadamente a contagem percentual, mas actualmente é aceite que as contagens absolutas são mais informativas. As populações de leucócitos são, por isso, comunicadas rotineiramente em contagens absolutas (x 109/L), assim como em contagens percentuais (%) da contagem de leucócitos total. Com os avanços na tecnologia, a diferenciação dos

leucócitos tornou-se possível nos analisadores automáticos. A vantagem principal advinda deste desenvolvimento foi a velocidade e o aumento da exactidão. Em contraste com a contagem manual de 100 células, os analisadores automáticos contam uma média de cerca de 15.000 células por amostra.

Contagens diferenciais automáticas de leucócitos Os analisadores hematológicos automáticos com a capacidade de diferenciar leucócitos estão agora largamente disponíveis nos laboratórios hematológicos de rotina. Estes analisadores são geralmente classificados como analisadores diferenciais de 3 partes ou 5 partes. a) Analisadores diferenciais de 3 partes

Os analisadores hematológicos automáticos com

funcionalidade de diferenciação de 3 partes baseiam-se na tecnologia de impedância para contar e separar leucócitos com base no tamanho. Os eritrócitos são lisados utilizando reagentes químicos, enquanto os leucócitos permanecem intactos. A tecnologia de impedância envolve um fluxo de células em suspensão a passar por uma pequena abertura na qual é aplicada uma corrente eléctrica. Cada célula que passa altera a impedância eléctrica e pode, assim, ser Hematologia básica

O objectivo deste boletim informativo é fornecer uma visão geral dos benefícios de mudar de um analisador de hematologia diferencial de 3 partes para um de 5 partes

Sysmex Educational

Enhancement & Development

Melhoramento e Desenvolvimento Educacional da Sysmex

SEED-África Boletim Informativo | No 5 | Junho de 2010

contada. O grau de alteração está em proporção directa ao tamanho da célula. O princípio da focagem hidrodinâmica aumenta ainda mais a exactidão, assegurando que as células passam pela abertura em fila única e eliminando falsas estimativas de tamanho se, por exemplo, 2 células passarem juntas.

Figura 1. Princípio de impedância com focagem hidrodinâmica. São identificados três grupos distintos com base no tamanho das células:

n Células grandes ou granulócitos n Células pequenas ou linfócitos

n Células médias ou monócitos ou células “do meio”. Os analisadores diferenciais de 3 partes Sysmex, nomeadamente o POCH-100i e o KX-21N, são mais avançados que outros sistemas uma vez que podem identificar neutrófilos como um grupo distinto com base na constituição química dos reagentes.

Estudos que compararam a exactidão de contagens diferenciais automáticas de 3 partes com o método de referência preliminar de contagem manual de 800 células, revelaram que apesar de a precisão ser excelente, a exactidão é menos boa. Isto acontece especialmente em amostras anómalas nas quais as contagens celulares relativas e a aparência morfológica das células podem ficar alteradas. Enquanto a análise automática foi um avanço significativo, é geralmente aceite que a criação de apenas um diferencial de 3 partes para amostras patológicas não é ideal.

Num indivíduo normal as 5 subpopulações principais situam-se entre os denominados limites absolutos e percentuais normais

No entanto, num indivívuo doente: na doença:

n As relações ficam distorcidas e, por isso, as contagens percentuais são desprovidas de significado na ausência de valores absolutos.

n As subpopulações podem aumentar, por exemplo, os eosinófilos podem aumentar em resposta a uma reacção alérgica.

n As subpopulações podem diminuir, por exemplo, os linfócitos ficam típica e progressivamente reduzidos numainfecção de VIH não tratada.

n As células imaturas que normalmente só são encontradas na medula óssea podem aparecer no sangue periférico, por exemplo, granulócitos imaturos em doentes com uma infecção grave.

n Podem aparecer células imaturas que são anormais, por exemplo, blastos em doentes com leucemia aguda. Um diferencial de 5 partes é muito mais informativo que um diferencial de 3 partes na identificação da causa de uma possível doença

b) Analisadores diferenciais de 5 partes Os analisadores diferenciais automáticos de 5 partes utilizam várias combinações de impedância volumétrica, energia electromagnética de alta frequência, técnicas de coloração ópticas e citoquímicas para a diferenciação dos WBC. A diferença principal relativamente à tecnologia Figura 2. Contagem diferencial com Sysmex de 3 partes. Neutrófilos

e linfócitos são identificados como populações distintas sendo os monócitos, eosinófilos e basófilos contados em conjunto como mistura de células.

Hematologia convencional

Neutrófilos

Linfócitos

Linfócitos

Mistos

Figura 3. Diagramas de dispersão de analisadores da classe X Sysmex.

a) Diagrama de dispersão diferencial: A fluorescência, que é uma medida do conteúdo de ARN/ADN das células, é representada no eixo Y e a complexidade celular ou a dispersão lateral representada no eixo X. b) Canal de WBC/basófilos – este canal, presente nos analisadores XT e XE, utiliza uma reacção química que mantém os basófilos intactos para os separar dos leucócitos remanescentes com base na dispersão em frente (eixo Y) e na dispersão lateral (eixo X)

Mas há mais nos analisadores diferenciais de 5 partes da Sysmex do que apenas o alargamento de uma contagem diferencial de 3 partes para uma de 5 partes. A resposta reside na tecnologia subjacente da citometria de fluxo. Então porque é que a citometria de fluxo com base na contagem diferencial dos leucócitos é superior às tecnologias diferenciais de 3 partes e de 5 partes da concorrência?

a) A avaliação é independente do tamanho da célula A citometria de fluxo diferencia os leucócitos com base no teor em ácido nucleico e na estrutura ou complexidade interna. A maior vantagem desta abordagem é que, ao contrário dos analisadores diferenciais de 3 e de 5 partes de outros fabricantes, a análise não se baseia no tamanho da célula. O facto de a diferenciação dos WBC ser independente do tamanho da célula é um benefício significativo porque:

n As alterações no tamanho da célula ocorrem com bastante rapidez logo que o sangue é colhido para dentro do tubo com EDTA, uma vez que este é um ambiente não-físico para as células sanguíneas, colocando-as sob stress metabólico que provoca depleção de glucose. Por sua vez, isto conduz a uma incapacidade de manter o equilíbrio do movimento na membrana celular, provocando edema celular e, por fim, desintegração.

n As contagens diferenciais baseiam-se no tamanho das células, tornando-as, por isso, pouco fiáveis num prazo de

3/4 SEED-África Boletim Informativo | No 5 | Junho de 2010

Melhoramento e Desenvolvimento Educacional da Sysmex

b) diferencial de 3 partes é que a identificação das células se

baseia numa análise bidimensional em vez de numa única célula.

Os analisadores da classe X Sysmex utilizam a citometria de fluxo para realizar a diferenciação de 5 partes. As subpopulações são separadas com base na complexidade celular ou na dispersão lateral e no sinal de fluorescência. A amostra é exposta a um corante fluorescente que se liga ao ARN e ao ADN intracelular. A intensidade do sinal fluorescente é proporcional ao conteúdo individual de ARN/ADN da célula. Além disso, a diferenciação é alcançada com um nível elevado de exactidão devido ao software do sistema de análise de agrupamentos adaptável (ACAS-adaptive cluster analysis system). Isto assegura que cada população celular forma um agrupamento explícito antes de todos os acontecimentos serem contados como pertencentes a esse subtipo celular. Em contraste, alguns outros sistemas utilizam o canal fixo que por vezes faz com que as células sejam contadas como fazendo parte de um grupo incorrecto, especialmente em amostras patológicas. A capacidade de os analisadores diferenciais de 5 partes enumerarem os tipos de células menos abundantes, nomeadamente os monócitos, os eosinófilos e os basófilos, separadamente em vez de na forma de uma população de células mistas é um desenvolvimento significativo. Conforme já foi aludido, os tipos individuais de leucócitos são variados na sua função e, por isso, as alterações da qualidade absoluta da população individual fornecem informação muito valiosa que possibilitam ao médico concentrar-se no diagnóstico clínico mais provável, assim como monitorizar a resposta ao tratamento.

24 horas. Em contraste, os analisadores da classe X Sysmex produzem uma contagem diferencial fiável em amostras até 48 horas pós-colheita.

b) Identificação de células imaturas Outro benefício igualmente importante é que a citometria de fluxo possibilita a identificação de células imaturas por estas terem um teor de ácido nucleico mais elevado, comparativamente com as células maduras. Isto possibilitou a criação de uma contagem diferencial de 6 partes através da adição de granulócitos imaturos (IG-immature granulocytes). A contagem de IG inclui promielócitos, mielócitos e metamielócitos mas não blastos. A presença de granulócitos imaturos é sempre patológica, com a excepção do período pós-parto imediato e do recém-nascido com menos de 3 dias de idade. A precisão da contagem de IG automática é muito melhor que a microscopia manual, tornando-a ideal para a monitorização em série de doentes, eliminando, assim, a contagem manual trabalhosa.

c) Sistema de indicadores extenso para a identificação de células anormais

Outra vantagem fundamental dos analisadores diferenciais de 5 partes da classe X relativamente aos analisadores diferenciais de 3 partes é um sistema de indicadores sofisticado que possibilita a identificação qualitativa de células imaturas e anormais. Os analisadores diferenciais de 3 partes também possuem um sistema de indicadores, mas este é menos informativo uma vez que se baseia totalmente notamanho anormal das células.

Ainda existe necessidade da contagem diferencial manual?

A microscopia manual continuará a ter um papel decisivo na confirmação da presença de populações celulares anormais que a análise automática identificou como suspeita e que assinalou para a atenção do operador. O objectivo da avaliação manual não é verificar a contagem celular diferencial mas sim confirmar a presença de populações celulares anormais e registar características morfológicas dignas de atenção. A contagem manual nunca será tão precisa como a contagem automática devido ao facto de o número de células contadas ser muito mais baixo. Do mesmo modo, a análise automática nunca será capaz de identiticar com exactidão todas as variantes de células anormais possíveis. O inverso, contudo, é que se o analisador não tiver assinalado uma amostra como suspeita de conter uma anomalia, será extremamente improvável que a avaliação manual acrescente qualquer valor adicional. A fim de obter um verdadeiro benefício da avaliação microscópica manual, os indivíduos têm de ser altamente qualificados e terem a experiência necessária. Neste contexto, o analisador diferencial de 5 partes, ao reduzir drasticamente a necessidade de realizar uma contagem diferencial manual e direccionar o técnico avaliador para a procura da patologia específica (em virtude dos indicadores gerados), contribui para uma maior rentabilidade do tempo laboratorial e dos custos, uma vez que esses indivíduos são um recurso escasso.

Então porque escolher um analisador 5PD da Sysmex?

Se os laboratórios tencionam apenas avaliar os parâmetros básicos, tais como hemoglobina, contagem de plaquetas e contagem de leucócitos, que é a prática habitual, não existe qualquer benefício em investir num analisador diferencial de 5 partes. Os analisadores diferenciais de 3 partes são, em geral, mais rentáveis que os analisadores diferenciais de 5 partes mas estes últimos são, contudo, indubitavelmente superiores na análise de pessoas doentes pelos seguintes motivos:

n Identificação de subpopulações de leucócitos n Melhoria da capacidade de detectar células anormais n Sistema de indicadores superior

n Parâmetros adicionais com utilidade clínica que são capazes de muito mais que fornecer apenas uma contagem diferencial mais completa.

Figura 4. Diagrama de dispersão diferencial da Sysmex

apresentando as posições em que existe probabilidade de encontrar populações celulares anormais.

5/5 SEED-África Boletim Informativo | No 5 | Junho de 2010

Melhoramento e Desenvolvimento Educacional da Sysmex

Conclusão

Na condição de que a informação criada por um analisador diferencial de 5 partes mais sofisticado é partilhada com os médicos para informar as suas decisões para a gestão dos doentes e que, por isso, beneficia os doentes, o analisador diferencial de 5 partes é definitivamente tão rentável se não mais que o analisador diferencial de 3 partes. A redução do tempo necessário para a microscopia manual de amostras processadas num analisador diferencial de 5 partes comparativamente a um analisador diferencial de 3 partes soma-se ao benefício global a ganhar pelo laboratório. Em geral, as características e os parâmetros de medição disponíveis nos diferentes analisadores hematológicos tornam-se mais avançados em paralelo com o aumento da produtividade. Isto coloca, geralmente, as características mais avançadas, incluindo a capacidade diferencial de 5 partes, fora do alcance dos laboratórios mais pequenos. A Sysmex reconheceu esta limitação e preencheu a lacuna através da introdução do analisador da série XS. Este foi concebido para os mesmos laboratórios com uma produtividade relativamente baixa como o KX-21N, mas fornece análises superiores, especialmente de amostras patológicas conforme descrito neste boletim informativo. “Os analisadores da classe X são muito mais que apenas contadores de células – o foco mudou para a identificação de características qualitativas subtis a fim de distinguir entre condições normais e patológicas.”

Compilado por Dr.ª Marion Münster

Figura 5. Porque um analisador diferencial de 5 partes Sysmex é

superior aos analisadores diferenciais de 3 partes.

Informação limitada Especificidade limitada

Informação extensa Especificidade máxima

3PD

Não é só a contagem diferencial!! 5PD

Análise unidimensional Análise multidimensional Complexidade celular Conteúdo de ADN/ARN Conteúdo celular

Tamanho das células mas nunca em isolamento