UFRRJ
INSTITUTO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
TESE DE DOUTORADO
MODULAÇÃO DA MICROBIOTA COLÔNICA E SANIDADE
DE LACTENTES: FATORES PRÉBIÓTICOS DE LEITE E DE
VIRULÊNCIA DE MICRORGANISMOS
GERALDO DOS SANTOS OLIVEIRA
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA
DE ALIMENTOS
MODULAÇÃO DA MICROBIOTA COLÔNICA E SANIDADE DE
LACTENTES: FATORES PRÉBIÓTICOS DE LEITE E DE
VIRULÊNCIA DE MICRORGANISMOS
GERALDO DOS SANTOS OLIVEIRA
Sob a Orientação da Professora Drª
Rosa Helena Luchese
Co-orientação do Professor Dr.
Francisco de Assis Baroni
Tese submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Doutor em Ciências, no
Programa de Pós-Graduação em
Ciência
e
Tecnologia
de
Alimentos.
Área
de
concentração em Ciência de
Alimentos.
Seropédica, RJ
Agosto de 2011
649.33 O48m T
Oliveira, Geraldo dos Santos, Modulação da microbiota colônica e sanidade de lactentes: fatores prébióticos de leite e de virulência de microrganismos / Geraldo dos Santos Oliveira – 2011.
107 f.: il.
Orientador: Rosa Helena Luchese
.
Tese (doutorado) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Inclui bibliografia.
1. Amamentação - Teses. 2. Leite humano - Composição – Teses. 3. Leite - Bacteriologia - Teses. 4.
Lactobacilo – Teses. 5.
Bifidobacterium – Teses. I. Luchese, Rosa Helena, 1957-. II. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Curso de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos. III.
Título.
“Esperei confiantemente pelo Senhor; Ele se inclinou para mim e me ouviu quando clamei por socorro. Tirou-me de um poço de perdição, dum tremedal de lama; colocou-me os pés sobre uma rocha e me firmou os passos”. SALMOS 40:1-2
À minha esposa Maria Aparecida e a Minha filha Èrika pelo apoio e dedicação.
AGRADECIMENTOS • A Deus.
• À minha orientadora Professora Rosa Helena Luchese pela dedicação e paciência. • Ao Professor Francisco de Assis Baroni pelo apoio.
• Aos funcionários do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, em especial a Técnica Dina.
• Á servidora Jocerlan Quintilhana do Laboratório de Patologia Clínica do Instituto Fernandes Figueira.
• Ao estudante de Engenharia e Tecnologia de Alimentos André Fioravante Guerra. • Um agradecimento especial ao estagiário Rodrigo Batista dos Santos pela dedicação
com que me ajudou nesta jornada.
• À estudante de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Antonella Mollo.
• Ao Corpo Docente do Curso de Doutorado em Tecnologia e Engenharia de Alimentos. • E a todos que direta e indiretamente contribuiram para a realização deste trabalho.
RESUMO GERAL
OLIVEIRA, Geraldo dos Santos. Modulação da microbiota colônica e sanidade de latentes: Fatores prebióticos de leite e de virulênica de microrganismos 2011. 109 p. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos). Instituto de Tecnologia, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2011.
A microbiota do intestino desempenha papel importante na saúde humana propiciando barreira à colonização de patógenos (exclusão competitiva), por exercer funções metabólicas importantes, e por estimular o sistema imune. Bifidobacterium e Lactobacillus são os dois gêneros mais importantes para a manutenção da saúde. A microbiota intestinal poderá ser qualitativa e quantitativamente alterada pelo tipo de alimento ingerido, chamada modulação nutricional, e pelo uso de anti-inflamatórios, laxantes e antimicrobianos. O objetivo do trabalho foi avaliar a composição e evolução da microbiota intestinal de crianças recém nascidas e relacionar ao tipo de amamentação, de parto, com a presença de Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Escherichia coli e fungos, além da determinação de aeróbios e anaeróbios totais. Foi avaliada a influencia da alimentação e do tipo de parto em 68 neonatos com idade entre sete e 21 dias. Verificou-se influência do tipo de parto nas contagens de lactobacilos, que foram maiores naqueles nascidos de parto normal. Contagens de lactobacilos em lactentes alimentados com leite em pó modificado (LPM) e leite do peito (LM) e nascidos de parto normal foram significativamente superiores (p<0,05) aquelas dos nascidos de parto cesariano, sugerindo uma possibilidade de transferência da microbiota da mãe para a criança. As contagens de lactobacilos estiveram abaixo do nível de detecção do método (1x102 UFC/g) em 44% dos indivíduos alimentados com leite do banco de leite humano (BLH) e nascidas de parto normal e em 81% daquelas nascidas de parto cesáreo. Leveduras foram encontradas em todas as amostras, independentemente do tipo de parto ou aleitamento em números que variaram de 1x105 a 1x1011. Candida albicans (30%) e C.
parapsilosis (28%) predominaram em ambos os tipos de parto independemente do tipo de
aleitamento com excessão da microbiota de lactentes que receberam LPM nascidos de parto normal, quando predominou a levedura do gênero Trichosporon sp. Não foi observada influencia significativa do tipo de parto, nas contagens da microbiota anaeróbica. Outro objetivo do trabalho foi detectar a presença e identificar a microbiota fúngica de leite humano e de sítios anatômicos em mulheres e lactentes. A virulência das linhagens de levedura encontradas foi avaliada através de testes de determinação da atividade proteolítica. De 64 amostras avaliadas, 81% foram positivas para a presença de fungos, com prevalência de
Candida albicans (73%) seguida de Candida parapsilosis (15,4%). Perfis semelhantes aos
verificados no total de amostras foram encontrados no leite, nas mamas e na cavidade oral, concluindo-se que existe a possibilidade da transferência da infecção cutânea da mãe para o lactante com o leite ingerido. A virulência das espécies de Candida isoladas, foi determinada pelo teste de produção de proteases sendo que 100% foram fortemente positivas, indicando alto grau de infectividade. Posteriormente, investigou-se a presença de genes de virulência de
E. coli enteropatogenica (EPEC) e enteroagregativa (EAEC) em 39 isolados de amostras
fecais e de swabs retais dos recém nascidos através das técnicas de polimerase chain reaction (PCR) multiplex e pulsed field gel eletrophoresis (PFGE). Os alvos selecionados para EPEC foram os genes que codificam a adesina intimina (eae), fator de aderência (plasmídeo EAF) e
fímbria “bundle forming pillus” (bpf). Os genes alvo para EAEC foram o plasmídeo de aderência agregativa (pAA) e regulon (AggR). Foram identificados dois alvos de virulência para EAEC em uma das amostras (2,6%) de neonatos alimentados com leite em pó modificado preparado em lactário. Conclui-se que além do tipo de parto e aleitamento um outro determinante importante da colonização do intestino de lactentes sejam as condições higiênicas no preparo da alimentação e nos cuidados com o neonato devendo ser tomadas medidas corretivas relacionadas às condições de manipulação dos leites destinados as crianças, além de priorizar a alimentação com leite do peito especialmente nos primeiros dias de vida quando ocorre a secreção do colostro rico em anticorpos e fagócitos.
GENERAL ABSTRACT
OLIVEIRA, Geraldo dos Santos. Potential prebiotic of human milk compared to milk powder modified in the modulation of colonic microbiota and sanity in infants. 2011. 109 f. Thesis (Doctor in Food Science and Technology). Institute of Technology, Department of Food Technology, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2011. The gut microbiota plays an important role in providing human health barrier to colonization of pathogens (competitive exclusion), to exert important metabolic functions and stimulate the immune system. Lactobacillus and Bifidobacterium are the two most important genera for the maintenance of health. The intestinal microbiota may be qualitatively and quantitatively altered by the type of food eaten, called nutritional modulation, and the use of anti-inflammatory drugs, laxatives and antibiotics. The main objective of this study was to determine the influence of either type of feeding and delivery on both composition and evolution of the gut microbiota of Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. Candida spp.
Clostidium spp., Escherichia coli, fungi and total aerobic and anaerobic, in infants. The
influence of diet and type of delivery in 68 neonates aged between seven and 21 days was evaluated. It was found that the type of delivery influence counts of lactobacilli, which were higher in those born vaginally. Counts of lactobacilli in infants fed LPM and LM and born vaginally were significantly higher (p <0.05) than those born by caesarean, suggesting a possibility of transference of the micro biota from mother to child. Lactobacilli counts were below the detection level of the method (1x102 CFU/g) in 44% of individuals fed with BLH’s milk, born vaginally and in 81% of those born caesarean section. Yeasts were found in all samples, regardless of type of delivery or feeding in numbers ranging from 1x105 to 1x1011.
Candida albicans (30%) and C. parapsilosis (28%) were predominant in both types of
delivery, independently of type of feeding with the exception of the micro biota of infants who were born vaginally and were fed with LPM, when prevailed the yeast of the genus
Trichosporon sp. There was no significant influence of type of delivery, in counts of
anaerobic microbiota. Another objective was to detect the presence and identify the fungal microbiota of human milk and anatomical sites in women and infants. Eighty-one per cent of 64 samples were positive for the presence of fungi, with a prevalence of Candida albicans (73%) followed by Candida parapsilosis (15.4%). Similar profiles to those observed in the total samples were found in milk, breast and oral cavity, suggesting a relationship between the skin infection of the mother and the infant with the milk ingested. The virulence of Candida species isolated was determined by testing the production of proteases and 100% were strongly positive, indicating a high degree of infectivity. Afterwards, it was investigated by means of PCR and PFGE, the occurrence of E.coli enterophatogenic (EPEC) e enteraggregative (EAEC) virulence genes in 39 E. coli isolates from new-born children faecal samples and rectal swabs. The targets selected for EPEC were the genes encoding for intimin adherence protein (eae), adherence factor (EAF) plasmid, fimbriae bundle forming pili (bpf). The genes target for EAEC were the plasmid for aggregative adherence (pAA) and its regulon (AggR). Both EAEC virulence targets were identified in one of the samples (2,6%) in neonates fed with milk formula, prepared by the maternity personnel. It is concluded that besides the type of delivery and breast-feeding, another important determinant of colonization of the intestine of infants are the hygienic conditions in food preparation and in new-born cares. It should be taken corrective actions related to the conditions of manipulation of milk
for children, and prioritize the supply of breast milk especially in the first days of life when the secretion of colostrum is rich in antibodies and phagocytes.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 1
Justificativa ... 2
Resultados e Impactos Esperados ... 3
Analise de Risco e Benefício ... 3
OBJETIVOS ... 4
Objetivo Geral ... 4
Objetivos Específicos ... 4
CAPÍTULO I CONTAMINAÇAO FÚNGICA NO LEITE HUMANO e em sítios anatômicos de lactantes e lactentes ... 5
RESUMO ... 6 ABSTRACT ... 7 1. INTRODUÇÃO ... 8 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 9 2.1. O Gênero Candida ... 9 2.2. Proteinase ... 10 2.3. Fosfolipase ... 11 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 12 3.1. Coleta de Amostras ... 12
3.2. Exame Microscopico Direto e Por Cultivo ... 12
3.3. Análises de Virulência ... 12
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 14
4.1. Exame Microscópico Direto ... 14
4.2. Identificação e Prevalência de Espécies Fúngicas ... 14
4.3. Produção de Proteinase ... 17
5. CONCLUSÕES ... 19
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 20
CAPÍTULO II MODULAÇÃO DA MICROBIOTA COLÔNICA E SANIDADE DE LACTENTES ... 26
RESUMO ... 27
ABSTRACT ... 28
1. INTRODUÇÃO ... 29
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 31
2.1. Composição da Microbiota Intestinal e Importância para a Manutenção da Saúde . 31 2.2. Probióticos ... 34
2.3. Prebióticos ... 35
2.4. Fatores que Influenciam na Modulação da Microbiota Colônica... 36
2.5. Alimentação com Leite Materno ... 37
2.6. Tipo de Parto ... 40
2.7. Uso de Medicamentos ... 41
2.8. Outros Fatores ... 41
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 42
3.1. Seleção de Indivíduos Lactentes e Amostragem ... 42
3.2. Atendimento ao Código de Ética ... 42
3.4. Coleta e Preparo das Amostras ... 43
3.5. Métodos de Cultivo ... 43
3.5.1. Enumeração de diferentes populações bacterianas por contagem em placas ... 43
3.5.2. Determinação de leveduras por cultivo ... 44
3.6. Confirmação da Identidade dos Diferentes Grupos Microbianos Avaliados ... 44
3.6.1. Gênero Bifidobacterium ... 44
3.6.1.1. Pesquisa da enzimafrutose-6-fosfato fosfocetolase (F6PPK) em Bifidobacterium ... 44
3.6.2. Gênero Lactobacillus ... 44
3.6.3. Escherichia coli ... 44
3.6.4. Gênero Bacteroides ... 44
3.6.5. Gênero Clostridium ... 45
3.6.6. Identificação das leveduras ... 45
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 46
4.1. Evolução da Microbiota de Lactentes ... 46
4.2. Prevalência de Grupos Microbianos e Influência do tipo de Aleitamento ... 52
5. CONCLUSÕES ... 60
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61
CAPÍTULO III IDENTIFICAÇÃO DE ALVOS DE VIRULÊNCIA EM LINHAGENS DE E. coli ... 69 RESUMO ... 70 ABSTRACT ... 71 1. INTRODUÇÃO ... 72 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 73 2.1. Métodos Moleculares ... 73
2.2. Caracterização Genotípica de E. coli Patogênicas... 75
2.2.1. E. coli Enteropatogênica (EPEC) ... 76
2.2.1.1. Principais fatores de virulência ... 76
2.2.2. E. coli Enteroagregativa (EAEC) ... 78
2.2.2.1. Principais fatores de virulência ... 79
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 81
3.1. Coleta de Amostras ... 81
3.2. Isolamento por Semeadura em Placas ... 81
3.3. Extração do DNA ... 81
3.4. Procedimento de PCR ... 81
3.4.1. Oligonucleotídeos iniciadores (“primers”) ... 81
3.4.2. Execuçaõ do PCR - Condições do “mix” e programas de amplificação ... 82
3.5. Teste de Aderência ... 86
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 89
5. CONCLUSÕES ... 92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 93
INTRODUÇÃO GERAL
Em ecologia o conjunto de microrganismos que habitam um ecossistema, como bactérias, fungos, e alguns protozoários que geralmente tem funções importantes na composição da matéria orgânica e, portanto na reciclagem dos nutrientes, denomina-se microbiota. Em medicina humana ou veterinária, pode-se considerar microbiota normal ou residente a população microbiana associada de forma estável com a pele e mucosas do hospedeiro, que permanece residente ao longo da vida, após o nascimento. As partes do corpo expostas ao ambiente externo, como a pele e mucosas, que em condições fetais são estereis, rapidamente sofrem colonização por diversos microrganismos e estes se distribuem quali e quantitativamente e de maneira não uniforme, compondo assim, a microbiota normal, que permanece se desenvolvendo sucessivamente no individuo ate o fim da sua vida (BRUM, 2006). Assim cada região habitada do organismo possui uma microbiota com características próprias.
O trato gastrintestinal do recém nascido é estéril ao nascer, sendo rapidamente colonizado por microrganismos do meio ambiente ou de sua mãe. A contaminação com bactérias comensais e outros microrganismos derivaria da vagina, intestino e pele da mãe ou do ambiente e ocorreria logo após o nascimento. Alguns autores encontraram semelhança entre a microbiota vaginal e a microbiota do recém nato. (BRANDT et al, 2008).
No desenvolvimento da microbiota intestinal, vários fatores podem exercer efeito regulador na colonização e na formação do sistema imune adaptativo. A chamada microbiota autóctone ou saprófita depende do tipo de alimento ingerido, se há amamentação com leite materno ou com leite em pó modificado e também dos alimentos líquidos e sólidos que são introduzidos na dieta. O tipo de parto (vaginal ou cesariana) também influencia.
A microbiota intestinal poderá ser qualitativa e quantitativamente alterada pelo uso de antinflamatórios, laxantes e antibióticos. Estes últimos poderão erradicar microrganismos susceptíveis e estimular a proliferação de oportunistas com Klebsiella spp, Enterobacter spp,
Pseudomonas spp, algumas espécies de Clostridium spp e Candida spp.
Durante a amamentação, os bebês recebem fatores bifidogênicos através do leite humano, funcionando estes como prébioticos e, portanto, favorecendo o estabelecimento da microbiota intestinal constituída por bactérias bífidas nestes primeiros meses de vida, respondendo por 95% da microbiota total (FOX e FLYNN, l992). Estas bifidobactérias inibiriam o crescimento de espécies de Candida na biota intestinal do recém nascido. O estabelecimento da microbiota ocorre em dois estágios, sendo o primeiro por contaminação a partir da mãe ou do meio ambiente. A sucessiva colonização dos diferentes habitats bifidogênicos do neonato seria o segundo estágio, de acordo com Milkelsaar e Mandar (l993). A modulação nutricional durante o desenvolvimento neonatal, afeta, a longo prazo, a imunocompetência do individuo. A microbiota do intestino pode ser considerada um sistema adaptável metabolicamente e rapidamente renovável, à medida que novos alimentos são introduzidos na dieta. As bactérias comensais são importantes barreiras de defesa da mucosa intestinal e impedem a colonização por microrganismos patogênicos, e quando isso ocorre, estes são rapidamente eliminados. Fruto oligossacarideos (FOS) e Galacto Oligossacerideos (GOS) são prebióticos cujas atividades bifidogenicas tem sido comprovada em adultos. Recentemente tem sido desenvolvida nova fórmula infantil para se reproduzir o efeito prebiótico do leite humano. Em duas experiências consecutivas, foi demonstrado que a suplementação alimentar de fórmulas infantis com uma mistura de GOS e FOS modificou a
2 biota fecal de bebês, incluindo os prematuros, estimulando o crescimento de bifidobacterias. Contudo nos bebês não-prematuros, o efeito bifidogênico desta mistura prebiótica dependeu da dose, mas também teve um crescimento significante no número de lactobacilos (MORO e ARSLANOGLU, 2005).
O gênero Candida, levedura comensal na pele e mucosas humana e dos animais vertebrados, vem sendo objeto de estudo com relação à classificação taxonômica, virulência e quanto ao seu papel na doença cutânea e sistêmica. A presença de algumas espécies de
Candida spp está relacionada ao abandono da amamentação e a quadros de diarréia
apresentados por crianças internadas e alimentadas com leite materno e leite em pó modificado, sobretudo em pacientes imunodeprimidos.
Justificativa
As bifidobactérias influenciam positivamente a saúde do lactente, inibindo patógenos e estimulando o sistema imune. O leite materno é um alimento funcional por possuir fatores bifidogênicos constituídos de glicopeptídeos e oligossacarídeos, capazes de estimular a predominância de bactérias bífidas no trato intestinal nos primeiros meses de vida. Desta forma, o fator bífidus do leite humano é considerado como prébiótico e as bifidobactérias consideradas probióticos.
O conhecimento adequado dos tipos de microrganismos, assim como os eventos que influenciam a seqüência da colonização, poderá fornecer subsídios para a modulação da microbiota intestinal, quando houver a necessidade de melhorar as funções protetoras que exercem.
Os métodos clássicos usados para isolamento e identificação da microbiota intestinal são complexos e requerem muito tempo e habilidade do analista. Além disso, muitos microrganismos não são cultiváveis, o que dificulta o estudo da evolução destas populações. Entretanto o trabalho do microbiologista tem sido facilitado com o emprego de técnicas moleculares como as baseadas na caracterização dos genes 16S rRNA. O sequenciamento dos produtos re-amplificados pelo PCR diretamente de bandas já separadas permite a identificação em gênero ou espécie.
Contudo, fica claro que não existe uma única técnica apropriada para estudos da ecologia microbiana intestinal. Desta forma, muitos meios de cultivo, assim como PCR primers e sondas específicas para diferentes gêneros e espécies, tem sido desenvolvidos. A quantificação das espécies requer o uso de técnicas de hibridização (MANGIN et al., 2002) ou PCR em tempo real (MATSUKI et al., 2004).
O conhecimento adequado dos tipos de microrganismos, assim como os eventos que influenciam a ordem de colonização, poderão oportunizar a modulação da microbiota colônica quando a modulação for necessária para evitar distúrbios decorrentes do desequilíbrio desta microbiota.
Visando avaliar a influência de alguns determinantes na modulação da microbiota colônica de lactentes, foram coletadas amostras fecais de neonatos alimentados com leite do banco de leite, leite em pó modificado e leite do peito para identificação e quantificaçãos dos principais grupos microbianos presentes. Também foi estudada a microbiota fúngica de sítios anatômicos e de leite humano ordenhado, além da identificação de genes de virulência de E.
coli EPEC e EAEC em amostras fecais e de swabs retais de neonatos através de técnica de
3 Resultados e Impactos Esperados
- Propiciar o entendimento do papel da amamentação na colonização e evolução da microbiota intestinal.
- Determinação do impacto do tipo de alimentação dos lactentes e do tipo de parto na modulação da microbiota colônica destas crianças, especialmente no que se refere a presença de microrganismos considerados probióticos.
- Estudar a prevalência de diferentes espécies de leveduras no material fecal, sítios anatômicos e leite humano, visando estabelecer métodos de controle das infecções oportunistas, sobretudo por Candida spp. e E. coli.
- O estabelecimento de como ocorre a colonização em recém nascido por fungos permitindo determinar a(s) possível(is) fonte de colonização das crianças que estão sendo amamentas ou internadas em UTI-neonatal.
Analise de Risco e Benefício
É importante salientar que não há riscos para as populações a ser estudada, pois o material a ser amostrado são fezes de lactentes e as amostras de pele são coletadas por ¨”swab”, sendo inteiramente inócuo. O benefício será o entendimento dos fatores, e especialmente da alimentação, como profilático e preventivo na manutenção da saúde.
4 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Estudar o papel do tipo de aleitamento e tipo de parto na colonização e evolução da microbiota intestinal de lactentes assim como estudar a prevalência de diferentes espécies de leveduras no material fecal, sítios anatômicos e leite humano, e espécies virulentas de E. coli, visando estabelecer métodos de controle das infecções oportunistas.
Objetivos Específicos
Determinar e quantificar a presença de Bifidobacterium spp., Bacteroides spp.,
Lactobacillus spp., Clostridium spp., Escherichia coli e fungos, além de bactérias aeróbias e
anaeróbias nas fezes de lactentes em domicílios e acompanhados pelo Banco de Leite Humano do Instituto Fernandes Figueira (IFF, Fiocruz), além de maternidades localizadas na zona oeste (Rocha Faria) e Seropédica.
Identificar as espécies de leveduras e determinar a virulência das linhagens de
Candida spp. isoladas.
Relacionar o tipo de alimentação (leite humano ordenhado do banco de leite, leite do peito e em pó modificado) o tipo de parto e o uso de medicamentos, na modulação da microbiota intestinal dos lactentes.
Determinar o perfil da colonização cutânea e de trato gastrintestinal e leite humano, com espécies fungicas nos lactentes.
Identificar alvos de virulência de isolados de E. coli do material fecal e “swabs” retais de lactentes.
5
CAPÍTULO I
CONTAMINAÇAO FÚNGICA NO LEITE HUMANO E EM SÍTIOS
ANATÔMICOS DE LACTANTES E LACTENTES
6 RESUMO
Infecções, bacterianas e/ou fúngicas podem levar ao quadro conhecido por mastite, que é relacionado com uma das principais causas de abandono precoce de amamentação. Microrganismos potencialmente patogênicos como leveduras do gênero Candida, quando em número elevado no intestino são responsáveis por casos de disbiose. Nesta pesquisa objetivou-se detectar a presença e identificar a microbiota fúngica de leite humano e de sítios anatômicos em mulheres e crianças atendidas pelo Banco de leite Humano do Instituto Fernandes Figueiras da FIOCRUZ. A virulência das linhagens de levedura encontradas foi avaliada através de testes de determinação da atividade proteolítica. De 64 amostras avaliadas, 81% foram positivas para a presença de fungos, com prevalência de Candida albicans (73%) seguida de Candida parapsilosis (15,4%). Perfis semelhantes aos verificados no total de amostras foram encontrados no leite, nas mamas e na cavidade oral. Observou-se que exista uma relação da infecção cutânea da mãe e do lactante com o leite ingerido. A virulência das espécies de Candida isoladas, foi determinada pelo teste de produção de proteases sendo que 100% mostraram-se fortemente positivas, indicando alto grau de infectividade. Conclui-se que a alta incidência de C. albicans nas mamas, cavidade oral de lactentes e no leite, é um fator de risco à sanidade dos lactentes.
7 ABSTRACT
Bacterial or fungal infections can lead to a clinical case of mastite, one of the main causes of precocious abandonment of breast-feeding. Microorganisms potentially pathogenic as yeast of the genera Candida, when in high number in the intestine can led to cases of dysbiosis. This research aimed to detect and to identify fungi in human milk and anatomical sites of women and children that receive attendance at Human Milk Bank of the Institute Fernandes Figueiras, FIOCRUZ. The virulence of the isolated yeast strains was evaluated through proteolytic activity tests. Eighty-one percent of 64 samples were positive for the presence of fungi, with prevalence of Candida albicans (73%) followed of Candida parapsilosis (15.4%). Similar profiles had been found in milk, in the breasts and in the mouth cavity, suggesting a relation of mother and children cutaneous infections and the ingested milk. The virulence of the isolated Candida species was determined by the proteolytic activity test. All the isolates (100%) were strong positive, indicating high degree of infectivity. It is concluded that the high incidence of C. albicans in the breasts, mouth cavity and in milk is a risk factor the health of the lactents.
8 1. INTRODUÇÃO
Infecções cutâneas e de mucosas causadas por espécies de fungos, como as dermatofitoses e dermatomicose são bastante comuns. Aquelas causadas por espécies do gênero Candida nas mamas das nutrizes tendem a ser manifestar como lesão eritematosa e pruriginosa no sulco inframamário, levando ao quadro conhecido por mastite. Esta é uma das principais causas de abandono precoce de amamentação, com conseqüências nefastas a saúde do lactente incluindo sua exposição a fungos patogênicos.
Diversas espécies de Candida são naturalmente encontradas vivendo como comensais no organismo de indivíduos com sistema imunológico competente, numa proporção de 47 % na cavidade oral, 34 % na região retal e 23 % na cavidade vaginal, sem causar infecções aos seus hospedeiros, ainda que por vezes sejam detectadas em número elevado (ODDS, 1994; Pereira, 2002). A espécie isolada com mais freqüência do trato gastrointestinal é C. albicans, seguida por C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. kefyr, C. guilliermondii, C. lusitaneae,
C. dubliniensis e C. glabrata (MURRAY, 1999; BORG-VON ZEPELIN et al., 1993;
SULLIVAN et al., 1999; VARGAS et al., 2000). Microrganismos potencialmente patogênicos como leveduras do gênero Candida também podem estar presente em número elevado em caso de disbiose intestinal.
A produção das enzimas aspartil proteinase (Sap) por espécies de Candida, assim como a produção de fosfolipase está correlacionada com a habilidade de aderência ao tecido do hospedeiro (RUCHEL, 1992; BENNETT et al., 1998; GHANNOUM, 2000; HANNULA et al., 2000; BEIN et al., 2002, Alvares, et al, 2007.) e a adesão às proteínas da matriz celular (GUSTAFSON et al., 1991, GOES, 2009. TRONCHIN et al., 1991). Pela formação de tubo germinativo, podem aumentar o potencial de virulência nas infecções em mucosas e na pele e na disseminação endovenosa (KRETSCHMAR et al., 1999).
Tendo em vista a importância da alimentação com leite humano, nesta pesquisa objetivou-se identificar detectar e identificar a microbiota fúngica de leite humano e de sítios anatômicos de mulheres e crianças atendidas pelo banco de leite humano do Instituto Fernandes Figueiras da FIOCRUZ.
9 2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O Gênero Candida
O gênero Candida, levedura comensal na pele humana e dos animais vertebrados, vem sendo objeto de estudo com relação à classificação taxonômica e virulência e quando ao seu papel na doença cutânea e sistêmica. Espécies de Cândida spp estão relacionadas ao abandono da amamentação e quadros de diarréia apresentados por crianças internadas e alimentadas com leite materno e leite em pó modificado, sobretudo em pacientes imunodeprimidos.
As décadas de 1980 e 1990 caracterizaram-se por um aumento do número de mães decididas a amamentar. Apesar disso, na prática um número significativo destas param de amamentar logo após o parto. Entre as várias razões para essa interrupção, pode ser citada a fissura da região mamilo-aréola, com dor e vermelhidão mamilar, conseqüência da C.
albicans(MACDONALD, 1995).
A infecção mamilar é um problema que está crescendo na lactação, sendo que a causada por fungos (candidíase mamilar) ainda é pouco estudada e elucidada. A C. albicans, um fungo comensal encontrado freqüentemente na vagina e no trato gastrointestinal de seres humanos, tem sido responsabilizada por infecção superficial e localizada das mamas em mulheres lactantes, apresentando fissuras e dor, sendo característica da infecção pela levedura e podendo ser a principal causa de abandono prematuro da lactação. C. albicans é a principal espécie do gênero associada à candidíase, mas outras também são relatadas, como por exemplo: Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis,
Candida kefir e Candida guilliermondii (FISHER E COOK, 2001).
Segundo Amir et al. (1991; 1996), as formas clínicas podem ser: mucosa, cutânea e sistêmica. Na candidíase mucosa, os tecidos mais atingidos são os da boca e da vagina; na cutânea, as áreas intertriginosas da pele das mãos, as virilhas e as axilas são comprometidas; na sistêmica, a infecção pode atingir diversos órgãos, causando candidíase pulmonar, endocardite, nefrite e fungemia. Dependendo da localização, a candidíase pode se manifestar de diferentes formas. Os achados clínicos na candidíase oral são bastante variáveis, podendo ser observados desde quadros localizados até formas extensas.
As lesões, conhecidas no Brasil pela denominação popular de sapinho, são mais comuns em recém-nascidos que ainda não colonizaram sua orofaringe, que por isso possui um pH baixo, condição que facilita a colonização da cavidade oral. Clinicamente inicia-se por pequenos pontos esbranquiçados na mucosa que rapidamente se tornam confluentes, para formar pseudomembranas de coloração esbranquiçada, aderidas à mucosa sobre um fundo eritematoso, que pode ser visto quando são removidas. As localizações mais comuns na cavidade oral são as mucosas que revestem bochechas, ponta da língua e palato mole. Entretanto, numa forma mais extensa, pode ser observada uma invasão maciça, com extenso comprometimento da cavidade oral, dificultando muitas vezes a deglutição, sendo esta entidade mais observada em recém-nascidos de mães portadoras de candidíase vulvovaginal (GROHMANN, 1993).
Além dos fatores inerentes do hospedeiro, tem sido postulado que existem diferenças nas patogenicidade de isolados de Candida (DELGADO E AGUIRRE, 1997). Características múltiplas de C. albicans tem sido proposta como fatores de virulência que capacitam o organismo a causar infecções hematogênicas disseminadas em hospedeiro susceptíveis. Estes prováveis fatores de virulência incluem germinação, aderência às células do hospedeiro e secreção de exoenzimas (CUTLER, 1991).
10 Ghannoum e Abu-Elteen (1990) propuseram um modelo de infecção no hospedeiro. A seguência seria iniciada pela aderência de Candida as células epiteliais da pele e das mucosas, seguida da multiplicação das leveduras com formação posterior de tubo germinativo e filamentos. A adesividade seria aumentada pela germinação das leveduras e inibida pela presença de imunoglobulina A secretora (STENDERUP, 1990). A produção de enzimas que se segue, permitiria a penetração da levedura nas células ocasionando resposta inflamatória, com dano nos tecidos subjacentes. Dependendo do estado imunológico no hospedeiro e da habilidade do microrganismo, a colonização, inicialmente superficial, pode se disseminar. Desta forma, o primeiro degrau no desenvolvimento da candidíase sistêmica é a colonização do trato gastrointestinal e genitourinário, da orofaringe, da pele e das mucosas em geral. A
Candida pode, então, seguir três caminhos: invasão abrupta de numerosos microrganismos
através da mucosa intacta, invasão através de solução de continuidade das mucosas colonizadas ou invasão vascular direta através de cateter (PFALLER et al, 1987).
A função das enzimas extracelulares microbianas na patogênese de muitas doenças bacterianas do homem tem servido como paradigma pelo quais muitos pesquisadores têm descoberto particularidades da virulência das leveduras (CUTLER, 1991). A produção de proteinases e fosfolipases é um dos fatores de virulência mais estudados do gênero Candida. Vários pesquisadores têm demonstrado que amostras de C. albicans produzem enzimas proteolíticas e fosfolipases independente do sítio do hospedeiro e das condições clínicas de onde foram isolados (OLIVEIRA, 1993; SILVEIRA et al, 1993).
2.2. Proteinase
Entre os fatores de virulência de leveduras do gênero Candida, a enzima com atividade proteolítica tem atraído a atenção de muitos pesquisadores desde a comprovação da sua produção pela primeira vez por Staib em 1965.
A purificação dessa enzima permitiu classificá-la como uma aspartil proteinase (Sap) de peso molecular entre 42 e 45 kDa, cuja atividade se da em pH ácido (2,0 a 4,0) e que possui uma especificidade de substrato bastante ampla, incluindo queratina, colágeno, albumina, hemoglobina, cadeia pesada de imunoglobulinas e proteínas de matriz extracelular (RUCLEL et al, 1982). As proteinases podem ser estudadas em meios de cultivo contendo albumina bovina como única fonte de nitrogênio, verificando-se apenas diferenças quantitativas entre as espécies do gênero Candida. Atualmente, foram seqüenciados 10 genes (SAP1-10) que codificam a produção desta enzima (HUBE e NAGLIK, 2001).
A demonstração de uma substância microbiana no paciente e/ou de uma resposta induzida em um hospedeiro é preliminar e crucial na avaliação de um fator de virulência. Portanto, esforços particulares foram direcionados para demonstrar as Saps em soro e tecidos humanos durante uma infecção por Candida (DE BERNARDIS et al., 2001).
Evidenciou-se que as enzimas Saps são realmente produzidas “in vitro”, uma vez que a secreção da proteinase foi detectada através da técnica de imunofluorescência em tecidos dos hospedeiros infectados, e elevados títulos de anticorpos, anti-Sap foram encontrados em pacientes com candidíase disseminada (RUCHEL et al., 1983, 1988; RAY et al., 1988).
Vários trabalhos documentaram a correlação entre os níveis de secreção de Sap e a virulência de diferentes cepas (RUCHEL, 1983, 1992).
Kwon-Chung et al (1985) e Hube (1996) mostraram que mutantes deficientes na secreção de proteinase determinavam uma baixa mortalidade em camundongos quando comparados com as cepas parentais.
A secreção da Sap tem sido correlacionada com a habilidade de aderência ao tecido do hospedeiro. Ghannoum e Abu Elteen (1986) demonstraram que isolados altamente proteolíticos de C. albicans aderiam-se rapidamente ao epitélio bucal de humanos.
11 Borg; Ruchel (1988) observaram que amostras de C. albicans sorotipo A produzem mais proteinases que amostras do sorotipo B, sendo infrequente o envolvimento dessa última em patologias sistêmicas.
Oliveira et al. (1998), em estudos com amostras de C. albicans isoladas da mucosa bucal em pacientes com câncer, verificaram um alto nível de produção de proteinase pelas mesmas, exibindo valores semelhantes entre as várias linhagens.
Ruchel et al (1990) trataram camundongos infectados com C. albicans com pepstatina A, que é um inibidor das proteinases aspárticas, e verificaram que esta produziu um bom efeito protetor para os animais. Kretschmar et al. (1999), investigaram 50 amostras de C.
albicans em modelos murinos tratados com pepstatina A. Foi observado também que houve
uma redução na atividade da proteinase, indicando que esta enzima contribui na virulência do microrganismo.
Ruchel (1999) mostrou a importância da pepstatina A no aspecto terapêutico e, além disso, verificou outros substratos da proteinase em Candida, tais como a mucina, lactoferrina, lactoperoxidase, IgA, IgG e IgM.
2.3. Fosfolipase
As fosfolipases têm um papel essencial no processo de infecção fúngica, desfazendo a membrana celular e permitindo que a hifa penetre no itoplasma, facilitando a adesão do fungo às células do hospedeiro (SHIMIZU et al., 1996; STAIB et al. ,2000), devido a capacidade de degradação dos fosfolipídeos, que são as estruturas essenciais da maioria das biomembranas (MAGO & KHULLER, 1990).
Segundo GHANNOUM (2000), o processo de invasão da levedura às células do hospedeiro é iniciado pela deposição de blastoconídeos na membrana, que quase imediatamente começam a sofrer transformações celulares (NIEWWETH & KORTING, 2001). Alguns destes blastoconídeo desenvolvem hifas com alta atividade fosfolipásica em suas extremidades, quando em contato com a membrana celular do hospedeiro (BENNETT et al., 1998), estando este fator diretamente ligado a maior aderência da levedura ao epitélio bucal e vaginal (GHANNOUM, 2000). Estirpes de Candida spp produtoras de fosfolipases são capazes de produzir mais óbitos entre camundongos do que as deficientes na produção desta enzima, que se mostraram avirulentas (GHANNOUM, 2000).
12 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta de Amostras
Trinta e nove “swabs” foram coletadas de lactentes e de mães atendidos pelo banco de leite humano ordenhado do Instituto Fernandes Figueira (IFF). Dos lactentes, coletaram-se 18 amostras da cavidade oral, enquanto que das lactantes foram amostradas as mamas (mamilo e aureola) num total de 21.
Em adição, foram avaliadas 25 amostras de leite humano ordenhado, das quais 18 foram provenientes das mesmas mães e filhos das quais foram coletadas as amostras de mama e cavidade oral, sendo seis amostras de doadoras do banco de leite humano do IFF.
Só foram incluídos no estudo as lactantes e os recém nascidos cujos pais concordaram em participar através de consentimento livre e devidamente esclarecido, a despeito de alguma doença de base.
3.2. Exame Microscopico Direto e Por Cultivo
Inicialmente foi realizada análise microscópica direta do leite e do material proveniente dos “swabs” pelo método de Gram.
A seguir as amostras foram semeadas em meio Sabouraud e mycosel (Difco) e, após o crescimento, foram re-isoladas em meios especiais, agar batata dextrose (Difco) e Lacrimel, (SIDRIM e MOREIRA, 1999). Culturas suspeitas de Candida albicans foram semeadas em meio de arroz (Difco) para prova do tubo germinativo e formação de clamidoconidos. Além dos testes morfológicos os isolados de leveduras foram identificados através de testes bioquímicos com o auxílio do equipamento VITEK (Biomerieux) e por semeadura em crhomagar (Difco).
3.3. Análises de Virulência
Os isolados de leveduras foram testados para atividade de proteinase de acordo com Ruchel et al, (1982) e inoculando-se uma alçada de cada isolado no centro da placa de Petri contendo agar proteinase seguida de incubação a 36°C por quatro dias. A presença da enzima foi observada pela formação de um halo transparente devido à hidrólise da proteína ao redor da colônia A atividade enzimática (Pz) foi medida de acordo com Price et al., (1982) (Tabela 1), calculando-se a razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro do halo transparente de hidrólise.
Preparou-se Agar proteinase como descrito por Ruchel et al, (1982) mediante preparação do meio base contendo 18 g de agar-agar para 900mL de água destilada que foi esterilizado a 121°C/15min. Separadamente preparou-se meio contendo albumina solubilizando 11,7 g de YNB (Yeast Nitrogen Base), 2 g de albumina bovina e 0,1g de tiamina em 100 ml de água destilada. A seguir foi esterilizada por filtração em membrana Milipore® (0,22µm). O meio base foi resfriado 50ºC e misturado ao meio contendo albuminada e distribuido em placas estéreis.
13 Quadro 1: Interpretação da atividade enzimática (Price et al, 1982).
Pz ATIVIDADE ENZIMÁTICA CÓDIGO
= 1,0 Negativa 1
≥ 0,64 < 1,0 Positiva 2
14 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Exame Microscópico Direto
No exame microscópico direto foi revelado apenas 5,4% de positividade. No entanto, quando as amostras foram analisadas por cultivo, foram encontradas 52 (81%) contaminadas com fungos (Figura 1), concluindo-se que o exame microscópico direto não pode ser empregado como única forma de diagnóstico.
Exame Microscópico Direto
94,54 5,45 negativo positivo Cultivo 18,75 81,25 negativo positivo
Figura 1: Porcentagem de amostras positivas para a presença de fungos pelo exame microscópico direto e por cultivo
4.2. Identificação e Prevalência de Espécies Fúngicas
O percentual das diferentes espécies encontradas no total de amostras contaminadas com fungos é mostrado na Figura 2. Candida albicans seguida de Cândida parapsilosis prevaleceram no total de amostras positivas. De maneira similar, em infecções urinárias e fungemias também foi observado que C. albicans foi a espécie mais comumente isolada, seguida de C. parapsilosis (NUCCI et al.1998, COLOMBO et al.1999, RODRIGUEZ-TUDELA e CUENCA-ESTRELLA 1999, CRUMP e COLLIGNON 2000, PFALLER et al. 2001). Entretanto, alguns trabalhos indicam C. glabrata como a segunda espécie mais isolada em casos de fungemia (PFALLER et al. 2001, GERMAIN et al. 2001).
Krcmery et al. (2000) verificaram em um período de 10 anos que, embora C. albicans permaneça como a espécie mais frequentemente isolada, houve aumento de outras espécies de
Candida de 0% em 1991 para 46,3% em 1998. C. albicans representou 61,6% de todas as
fungemias seguidas de C. parapsilosis (9,9%). C. krusei (5,8%), C. tropicalis (4,1%), C.
glabrata (3,2%), C. guilliermondii (1,2%), C. lusitaniae (0,9%). Na presente pesquisa, foram
encontrados, 73% de C. albicans, 15,4% de C. parapsilosis e 5,8% de C. tropicalis, sendo que fungos filamentosos do gênero Aspergillus representaram a terceira espécie fungica de maior incidência (7,7%).
15 Figura 2: Percentual de espécies fúngicas em leite humano, cavidade oral de lactentes e nas
mamas das lactantes, totalizando 52 positivas para fungos.
Perfis semelhantes aos verificados no total de amostras foram encontrados individualmente, no leite (Figura 3), nas mamas e na cavidade oral (Figura 4), sugerindo uma transferência da infecção das mamas das lactantes para o leite e, consequentemente para os lactentes.
Segundo Contreras et al. (1994), C. albicans representou 40% dos isolamentos (23,3% em crianças saudáveis e 82,4% naquelas com candidiase bucal) de 124 crianças acompanhadas longitudinalmente, dos 15 dias de vida até os 16 meses. Assim, a combinação destas duas características de C. albicans, alta incidência e longa permanência, podem comprometer severamente a sanidade de lactentes.
16
Figura 3: Percentual de espécies fúngicas nas mamas das nutrizes em leite humano e na cavidade oral de lactentes.
17 Tortora et al. (2000) afirmaram que a microbiota da mucosa da boca usualmente suprime o crescimento de fungos como C. albicans. Diferentemente, neste estudo todas as amostras da cavidade oral foram positivas para fungos com predominância de C. albicans (83,3%). Entretanto na cavidade oral não foram encontradas as leveduras C. tropicalis, T.
pululans presentes no leite.
Almeida (1996) observou a ocorrência de bolores e leveduras em 69,4% das amostras de leite humano coletadas no Instituto Fernandes Figueira, com contagens na ordem de 106 UFC/ml. Após efetuar modificações na técnica de coleta e repetir as contagens este autor verificou redução na incidência desses microorganismos para 16,7% das amostras e contagens inferiores a 3,0 x 102 UFC/ml.
Embora muitos membros desse gênero sejam encontrados intraoralmente (C.
tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii), eventualmente causam doença, sendo
a candidose bucal provocada mais freqüentemente por C. albicans considerada a mais patogênica (BUDTZ-JÖRGENSEN, 1990; NEVILLE et al., 1995; NISENGARD e NEWMAN, 1997).
A alta incidência de C. albicans nas mamas, cavidade oral de lactentes e no leite é uma fator de risco a sanidade dos lactentes. O gênero Candida, levedura comensal na pele humana e dos animais vertebrados, vem sendo estudado recentemente em várias reformulações a respeito de sua classificação, taxonomia e virulência e com relação ao seu papel na doença cutânea e sistêmica. Espécies de Candida spp, estão relacionadas ao abandono da amamentação e quadros de diarréia apresentados por crianças internadas e alimentadas com leite materno e leite maternizado, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Em adição leveduras do gênero Candida são consideradas potencialmente patogênicas estando presente em número elevado em caso de disbiose intestinal.
4.3. Produção de Proteinase
Um dos fatores de virulência do gênero Candida mais estudado, é a produção de enzimas extracelulares como proteinases ácidas e fosfolipases, uma vez que exercem importante papel na patogênese. A virulência das espécies de Candida foi determinada pelo teste de produção de proteinase ácida, sendo observado que 100% foram fortemente positivas, indicando alto grau de infectividade (Figura 4). Foram testados 18 isolados de C. albicans sendo seis das mamas, seis da cavidade oral e seis do leite, que apresentaram atividade enzimática (Pz) média e desvio padrão de 0.37±0.06, 0.42±0.11 e 0.35±0.10, respectivamente. De maneira similar, três isolados de C. parapsilosis respectivamente de mama, cavidade oral e leite apresentaram Pz de 0.54, 0.38 e 0.45, também classificados como fortemente positivas para produção de proteases. Um isolado de leite de C. tropicalis foi igualmente fortemente positivo para o teste de proteinase (Pz 0.37).
18 Figura 4: Produção de protease
Em estudos realizados por Ruchel et al., (1982, 1983) e Macdonald (1984), demonstraram que atividades distintas de proteinases podem ser apresentadas por diferentes linhagens de C. albicans e diferentes espécies de Candida. Também foi observado que existe uma tendência de correspondência entre quantificação de proteinases e ordem de virulência de espécies (C. albicans > C.tropicalis > C.parapsilosis > C. krusei > C. glabrata > C.
guilliermondii). Diferentemente, nos resultados aqui apresentados todas as leveduras isoladas
independentemente da espécie foram fortemente proteolíticas. Concluiu-se que os isolados de
Candida spp, independentemente de serem da espécie C. albicans podem ser considerados
potencialmente patogênicos.
Resultados semelhantes foram relatados por Penha (2000) que observaram em isolados de C. albicans de pacientes da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, 100% fortemente positivos. Entretanto Candido et al. (2000) relataram atividade proteolítica em 66,7% de C. albicans isoladas da mucosa bucal de pacientes da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto.
Holmstrup e Samaranayake (1990) relataram que o desequilíbrio da microbiota bucal e a imaturidade dos mecanismos de defesa são responsáveis pela suscetibilidade aumentada a candidiase durante o período neonatal. Dependendo do estado imunológico do hospedeiro, a colonização por Candida, inicialmente superficial, pode se disseminar. A infecção por espécies do gênero Candida, segundo Ghannoum, (2000), começaria pela aderência da levedura às células da pele e das mucosas e seguiria com a multiplicação celular, formando posteriormente tubo germinativo e hifas que produziriam proteinases e fosfolipases, permitindo a sua penetração e a conseqüente resposta inflamatória.
19 5. CONCLUSÕES
• Candida albicans seguida de C. parapsilosis prevaleceram em todas as amostras e apresentaram-se, potencialmente virulentas.
• Existe uma relação de transferência infecção das mamas das lactantes para o leite e, consequentemente para os lactentes, indicando que o aspecto com cuidados de higiene é fundamental quando da entrega da alimentação ao recém nascido, seja através da amamentação por fórmulas, leite humano ordenhado ou ao peito.
20 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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