1909 ( A P I C O M P L E X A : T O X O P L A S M A T I N A E ) DE G A L I N H A S N A T U R A L M E N T E I N F E C T A D A S
CATHIA MARIA SERRA PEIXOTO
I N S T I T U T O DE B I O L O G I A
C U R S O DE P Ó S - G R A D U A Ç Ã O EM M E D I C I N A V E T E R I N Á R I A P A R A S I T O L O G I A V E T E R I N Á R I A
ISOLAMENTO DO Toxoplasma gondii NICOLLE & MANCEAUX, 1909 ( A P I C O M P L E X A : T O X O P L A S M A T I N A E ) DE G A L I N H A S
N A T U R A L M E N T E I N F E C T A D A S
CATHIA MARIA SERRA PEIXOTO
SOB A O R I E N T A Ç Ã O DO P R O F E S S O R C A R L O S W I L S O N G O M E S L O P E S
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências em Medi-cina Veterinária - Parasitolo-gia V e t e r i n á r i a
I T A G U A Í , RIO D E J A N E I R O S E T E M B R O , 1990
C A R L O S W I L S O N G O M E S L O P E S
P A U L O C E S A R F I G U E I R E D O
G I L B E R T O G A R C I A B O T E L H O
I S O L A M E N T O DO
Toxoplasma gondii
N I C O L L E & M A N C E A U X , 1909 (APICOMPLEXA: T O X O P L A S M A T I N A E ) DE G A L I N H A SN A T U R A L M E N T E I N F E C T A D A S
A U T O R
CATHIA MARIA SERRA PEIXOTO
Ao Paulo e à Ana Lydia, por terem compreendido, com amor e carinho, os momentos que não esti-ve p r e s e n t e .
Aos meus pais e irmãos pelo apoio e incentivo.
Agradeço a todos aqueles que contribuíram para a rea-lização deste trabalho, especialmente aos professores:
- CARLOS WILSON GOMES LOPES, Professor Adjunto do
Ins-tituto de Biologia - Parasitologia Veterinária da Universidade F e d e r a l R u r a l do Rio de J a n e i r o .
- PAULO CÉSAR FIGUEIREDO, Professor Adjunto do Depar-tamento de Patologia e Clínica Veterinária da Faculdade de Ve-t e r i n á r i a da U n i v e r s i d a d e F e d e r a l F l u m i n e n s e .
- PAULO FERNANDO DE VARGAS PEIXOTO, Professor Adjunto do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria.
- WILSON JACINTO SILVA DE SOUZA, Membro da Comissão de Orientação, Pesquisador do Departamento de Protozoologia da
F u n d a ç ã o I n s t i t u t o O s w a l d o Cruz.
Agradeço também à TERESA CRISTINA BERGAMO DO BOMFIM, colega do Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Pa-r a s i t o l o g i a V e t e Pa-r i n á Pa-r i a .
Cathia Maria Serra Peixoto, filha de Manoel Alves Ser-ra e Ida Barrientos SerSer-ra, casada, bSer-rasileiSer-ra, natuSer-ral do Esta-do Esta-do Rio de Janeiro, onde nasceu em 14 de maio de 1963.
Em 1981 ingressou na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Itaguaí, RJ, obtendo o diploma de médi-co veterinário em 25.08.1985 e inscrita no Conselho Regional de Medicina Veterinária do Estado do Rio de Janeiro (CRMV -5, Nº 3.343) em 26.06.1986.
Estagiária do Setor de Anatomia Patológica da Unidade de Apoio ao Programa Nacional de Pesquisa em Saúde
Animal-EMBRAPA - Itaguaí (1984-1985).
Estagiária no Institut für Veterinär Pathologie der Justus-Liebig Universität, Giessen, República Federal da Ale-manha, no período de 15.10.1985 a 15.06.1986.
Bolsista do CNPq, em nível de Aperfeiçoamento Profis-sional, durante o ano de 1987, sob orientação do Professor Car-los Wilson Gomes Lopes, do Departamento de Parasitologia
Vete-r i n á Vete-r i a da UFRRJ.
Ingressou em 1988 no Curso de Pós-Graduação em Medici-na Veterinária - Parasitologia Veterinária da UFRRJ, ao nível de M e s t r a d o .
Página
1. I N T R O D U Ç Ã O 2. R E V I S Ã O D E L I T E R A T U R A 2.1. H i s t ó r i c o 2.2. C l a s s i f i c a ç ã o 2.3. Aspectos biológicos 2 . 3 . 1 . C i c l o " E n t e r o e p i t e l i a l " 2 . 3 . 2 . C i c l o " E x t r a - i n t e s t i n a l " 2 . 3 . 3 . E s p o r u l a ç ã o 2.4. A s p e c t o s m o r f o l ó g i c o s 2.5. R e s i s t ê n c i a d a s f o r m a s i n f e c t a n t e s 2.6. M o d o s d e t r a n s m i s s ã o 2 7 • • D i a g n ó s t i c o l a b o r a t o r i a l 2.8. T o x o p l a s m o s e n o h o m e m e n o s a n i m a i s d o m é s t i c o s 2.9. T o x o p l a s m o s e e m g a l i n h a s 2.9.1. Ocorrência da doença 2.9.2. Toxoplasmose experimental 2.9.3. Sintomatologia e lesões 1 3 3 4 5 6 7 8 8 10 11 13 15 17 17 19 2323 25 26 28 29 31 31 31 32 32 32 33 33 33 34 35 35 37 38 38 38 39 2 . 9 . 3 . 1 . I n f e c ç ã o n a t u r a l 2 . 9 . 3 . 2 . I n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l 2 . 9 . 4 . D i a g n ó s t i c o l a b o r a t o r i a l 2 . 9 . 5 . I m p o r t â n c i a d a s g a l i n h a s c o m o h o s p e d e i - r o s i n t e r m e d i á r i o s 2.10. T o x o p l a s m o s e e m c a m u n d o n g o s 3. M A T E R I A L E M É T O D O S 3.1. o b t e n ç ã o d o s a n i m a i s 3 . 1 . 1 . O r i g e m d a s a v e s 3 . 1 . 2 . O r i g e m d o s c a m u n d o n g o s 3.2. P a r a s i t e m i a d a s a v e s 3 . 3 . N e c r o p s i a d a s a v e s 3 . 3 . 1 . E x a m e do c é r e b r o 3 . 3 . 2 . C o l e t a e p r o c e s s a m e n t o d e ó r g ã o s p a r a o i s o l a m e n t o 3.4. I n o c u l a ç ã o e m c a m u n d o n g o s 3 . 4 . 1 . P e s q u i s a d o
Toxoplasma gondii
n o s c a m u n - d o n g o s 3.5. M a n u t e n ç ã o d oToxoplasma gondii
3.6. M e n s u r a ç ã o 3.7. F o t o m i c r o g r a f i a 4. R E S U L T A D O S 4.1. N e c r o p s i a d a s a v e s c é r e b r o d 4.2. E x a m e d o as a v e s 4.3. D e t e c ç ã o d a p a r a s i t e m i aga-P á g i n a 39 41 41 44 44 53 54 69 73 79 80 linhas n a t u r a l m e n t e i n f e c t a d a s 4.5. D i a g n ó s t i c o de t o x o p l a s m o s e nos c a m u n d o n g o s ino- c u l a d o s com s u s p e n s ã o de ó r g ã o s de g a l i n h a s na- r u r a l m e n t e i n f e c t a d a s 4.5.1. S i n t o m a t o l o g i a dos c a m u n d o n g o s 4.5.2. N e c r o p s i a dos c a m u n d o n g o s 4.5.3. P r e s e n ç a de f o r m a s e v o l u t i v a s (cistos) do Toxoplasma gondii no cérebro dos ca-m u n d o n g o s
4.5.4. P r e s e n ç a de f o r m a s e v o l u t i v a s ( t a q u i z o í - tas) do Toxoplasma gondii no pulmão dos c a m u n d o n g o s
4.5.5. E x a m e h i s t o l ó g i c o dos c a m u n d o n g o s
4.6. Manutenção do Toxoplasma gondii em laboratório a t r a v é s de p a s s a g e n s e m c a m u n d o n g o s
5. D I S C U S S Ã O 6. C O N C L U S Õ E S
40
42
45 P á g i n a TABELA 1. Demonstração do parasitismo tecidual pelo
To-xoplasma gondii,
em g a l i n h a s n a t u r a l m e n t e in- fectadas, verificado, indiretamente, através de i n o c u l a ç ã o em c a m u n d o n g o sT A B E L A 2. N ú m e r o e p e r c e n t u a l de i s o l a m e n t o s do
Toxo-
plasma gondii
nas g a l i n h a s e x a m i n a d a s e nas g a l i n h a s p o s i t i v a sT A B E L A 3. N ú m e r o de dias, após a i n o c u l a ç ã o , e m que o- c o r r e u a m o r t e dos c a m u n d o n g o s , nos q u a i s foi p o s s í v e l o i s o l a m e n t o do
Toxoplasma gon-
diiTABELA 4. Presença de cistos e de taquizoítas do
To-xoplasma gondii
em 22 c a m u n d o n g o s i n o c u - lados c o m ó r g ã o s de g a l i n h a s n a t u r a l m e n t e i n f e c t a d a s P á g i n a 46 T A B E L A 5. D i m e n s õ e s de c i s t o s doToxoplasma gondii,
em esfregaços de cérebro de camundongos inoculados com órgãos de galinhasnatural-m e n t e i n f e c t a d a s 51
T A B E L A 6. D i m e n s õ e s dos t a q u i z o í t a s e x t r a c e l u l a r e s do
Toxoplasma gondii,
em impressões de
pul-m ã o de c a pul-m u n d o n g o s i n o c u l a d o s c o pul-m ó r g ã o sde g a l i n h a s n a t u r a l m e n t e i n f e c t a d a s 61
T A B E L A 7. R e s u l t a d o s o b t i d o s a t r a v é s das p a s s a g e n s de
Toxoplasma gondii
em c a m u n d o n g o s ino- c u l a d o s por v i a s u b c u t â n e a a p a r t i r do h o m o g e n e i z a d o de c é r e b r o , pulmão, f í g a d o e b a ç o dos c a m u n d o n g o s 280 e 283, os q u a i s f o r a m i n o c u l a d o s c o m s u s p e n s ã o de c é r e b r o e c o r a ç ã o , r e s p e c t i v a m e n t e , da g a l i n h a nú- m e r o 15 72FIGURA 1. Fluxograma de cinco passagens do Toxoplasma gondii realizadas em camundongos a partir do h o m o g e n e i z a d o de c é r e b r o , p u l m ã o , f í g a d o e baço, p r o v e n i e n t e s dos c a m u n d o n g o s de n ú m e - ros 280 e 283, os q u a i s f o r a m i n o c u l a d o s c o m c é r e b r o e c o r a ç ã o , r e s p e c t i v a m e n t e , da g a l i - nha de n ú m e r o 15 P á g i n a 36
FIGURA 2. Diagrama de isolamentos do Toxoplasma gondii em c a m u n d o n g o s i n o c u l a d o s c o m ó r g ã o s de ga-
linhas n a t u r a l m e n t e i n f e c t a d a s 43
FIGURA 3. Cisto de Toxoplasma gondii em exame a fresco
P á g i n a F I G U R A 4. F i g u r a a n t e r i o r em m a i o r a u m e n t o p a r a visuali-
zação da p a r e d e c í s t i c a e dos b r a d i z o í t a s . E- xame a fresco, 1000 X
F I G U R A 5. C i s t o s de
Toxoplasma gondii,
com dif
e r e n t e s ta-manhos, em esfregaço de cérebro de camundon-go. Giemsa, 100 XFIGURA 6. Cisto de Toxoplasma gondii em esfregaço de c é r e b r o de c a m u n d o n g o . Giemsa, 1000 X
F I G U R A 7. T a q u i z o í t a de
Toxoplasma gondii em
i m p r e s s ã o de p u l m ã o de c a m u n d o n g o . N o t a r n ú c l e o de p o - s i ç ã o central. Giemsa, 1000 XF I G U R A 8. T a q u i z o í t a s de
Toxoplasma gondii,
livres, em i m p r e s s ã o de p u l m ã o de c a m u n d o n g o . N o t a r nú- cleo de p o s i ç ã o subterminal. Giemsa, 1000 XF I G U R A 9. T a q u i z o í t a s de
Toxoplasma gondii,
l i v r e s e a- g l o m e r a d o s . I m p r e s s ã o de p u l m ã o de c a m u n d o n - go. Giemsa, 1000 XF I G U R A 10. T a q u i z o í t a de
Toxoplasma gondii
a p r e s e n t a n d o as e x t r e m i d a d e s a r r e d o n d a d a s e o n ú c l e o m e n o s corado. Impressão de pulmão de camundongo. Gi-emsa, 1000 X 49 50 52 55 56 57 58F I G U R A 11. M a c r ó f a g o a p r e s e n t a n d o f o r m a s i n t r a c e l u l a - res do
Toxoplasma gondii.
Impressão de pul-mão de c a m u n d o n g o . Giemsa, 1000 XP á g i n a
59
FIGURA 12. Cisto de
Toxoplasma gondii.
Impressão dep u l m ã o de c a m u n d o n g o . Giemsa, 1000 X 60
F I G U R A 13. C i s t o de
Toxoplasma gondii
em c é r e b r o de c a m u n d o n g o s . N o t a r a u s ê n c i a de r e a ç ã o in-f l a m a t ó r i a ao r e d o r do cisto. H.E., 400 X 63
FIGURA 14. Dois cistos de
Toxoplasma gondii
,
no inte-rior dos q u a i s se o b s e r v a m b r a d i z o í t a s com g r â n u l o s P.A.S. p o s i t i v o s . C é r e b r o de ca-m u n d o n g o . P.A.S., 1000 X 64
F I G U R A 15. P n e u m o n i a i n t e r s t i c i a l com a p r e s e n ç a de várias formas do
Toxoplasma gondii
.
Pulmãode c a m u n d o n g o . H.E., 100 X 65
FIGURA 16. Endozoítas de
Toxoplasma gondii
,
vistos no citoplasma de uma célula da paredeFIGURA 17. Estrutura semelhante a um cisto de Toxoplas-ma gondii em pulmão de camundongo. H.E., 400X
P á g i n a
67
FIGURA 18. Estrutura semelhante a um cisto de
Toxoplas-ma g o n d i i
c o n t e n d o o r g a n i s m o s com a l g u n s grâ- nulos P.A.S. positivos. Pulmão decamundon-go. P.A.S., 1000 X 68
FIGURA 19. Fluxograma de passagens do Toxoplasma gondii em c a m u n d o n g o s e r e s p e c t i v o s dias da m o r t e dos roedores inoculados por via subcutânea com h o m o g e n e i z a d o s de órgãos. A s u s p e n s ã o o- r i g i n a l foi p r o v e n i e n t e dos c a m u n d o n g o s 280 e 283, os q u a i s f o r a m a n t e r i o r m e n t e i n o c u l a - dos com o c é r e b r o e o c o r a ç ã o , respectivamen-
Vinte galinhas foram obtidas no Distrito de Seropédi-ca, Município de Itaguaí, localizado no Estado do Rio de Janei-to. Este D i s t r i t o está l o c a l i z a d o em t e r r a s b a i x a s da área me- t r o p o l i t a n a da C i d a d e do Rio de Janeiro, onde se o b s e r v a m al- gumas características rurais, como a criação de galinhas em quintais. Amostras de cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, ovário-oviduto e músculo peitoral dessas aves foram ino-culadas subcutaneamente em camundongos. Toxoplasma gondii foi isolado de 30% dos corações, 20% dos cérebros, 5% dos baços e 5% dos o v á r i o - o v i d u t o s das g a l i n h a s e x a m i n a d a s .
A maioria dos camundongos, nos quais obteve-se o iso-lamento, a p r e s e n t o u s i n t o m a t o l o g i a , m o r r e n d o entre o 12º e o 21º dias pós-inoculação (DPI). À necropsia, o órgão mais afeta-do foi o pulmão. C i s t o s foram o b s e r v a d o s no c é r e b r o d e s s e s ani- mais após o 13º DPI. Taquizoítas foram vistos no pulmão dos ca-mundongos mortos naturalmente a partir do 12º DPI; foram ainda observados no pulmão dos camundongos no 30º DPI. No exame
his-tológico, observou-se, como lesão constante, pneumonia inters-ticial difusa, geralmente, associada à presença do parasito. O isolamento do T. gondii em 30% das galinhas exami-nadas sugere, indiretamente, uma importante contaminação do meio ambiente com oocistos, procedentes de fezes de gatos na-turalmente infectados.
Twenty adult chickens were obtained at District of Seropédica, Municipality of Itaguaí in the State of Rio de Janeiro. This District is localized within the lowlands of the Metropolitan region of the City of Rio de Janeiro with some rural characteristics. The chickens were raised in contact with soil in backyards. Specimens of brain, heart, lung, liver, spleen, kidney, ovary-oviduct and pectoral striated muscle were inoculated, subcutaneously, into mice. Toxoplasma gondii was isolated in 30% of hearts, 20% of brains, 5% of spleens and 5% of ovary-oviducts of e x a m i n a t e d chickens.
The majority of mice, in which the isolation was successful, had symptomatology, and died between postinocula-tion day (PID) 12 and 21. At necropsy, lung was the most affected organ. Cysts were found in their brains after PID 13. Tachyzoites were found in the lungs of mice that died naturally, after PID 12; and were also found at PID
30. Difuse interstitial pneumonia was a constant lesion and usually it was associated with the presence of the parasite. The isolation of T. gondii in 30% of examinated chickens suggest, indirectly, an important contamination of the environment with oocysts eliminated in feces of n a t u r a l l y i n f e c t e d cats.
A literatura sobre o Toxoplasma gondii Nicolle & Man-ceaux, 1909, é uma das mais vastas do mundo e remonta ao iní-cio do século XX, e a doença, toxoplasmose, tem sido considera-da como uma i m p o r t a n t e z o o n o s e de c a r á t e r c o s m o p o l i t a .
Na maioria das espécies infectadas pelo T. gondii, es-te protozoário dificilmenes-te es-tem causado doença clínica. No en-tanto, a toxoplasmose tem sido uma constante preocupação, em função da gravidade das lesões que pode provocar nas primoin-fecções em fêmeas gestantes e, também, da grande capacidade que possui o parasito de se multiplicar em pacientes imunossupri-midos.
Em relação aos animais domésticos, principalmente em
ovinos e caprinos, o T. gondii pode acarretar prejuízo
econô-mico como agente etiológico de abortos que ocorrem sob a forma de surtos.
Apesar da elucidação do ciclo biológico do T. gondii, estabelecendo os felídeos como únicos hospedeiros
definiti-vos, outros aspectos na epidemiologia deste parasito necessi-tam ser e s c l a r e c i d o s .
Existem indicações de que o solo ao redor das mora-dias constituem locais favoráveis para a persistência de oo-cistos viáveis (infectantes) do
T. gondii,
mesmo durante a es-tação seca, persistência esta atribuída à concentração de ga-tos na vizinhança. Estas áreas podem funcionar como importan-te fonimportan-te de i n f e c ç ã o p a r a a n i m a i s , i n c l u s i v e o homem.A importância epidemiológica das chamadas galinhas de quintal ( Gallus gallus , decorre de seu constante contato com o solo, tornando-se assim, em áreas de risco, propensas a se infectarem com oocistos esporulados infectantes e/ou com hospedeiros mecânicos dos mesmos. Deste modo, poder-se-ia es-timar a contaminação do solo com oocistos procedentes das fe-zes de felinos infectados, através do isolamento do T. gondii de ó r g ã o s de g a l i n h a s .
O presente trabalho teve como objetivos isolar o T. gondii de galinhas naturalmente infectadas, verificar, nestas aves, a distribuição deste protozoário em diferentes órgãos e estudar a patogenicidade, para camundongos, das amostras de
T. gondii
isoladas.2.1. Histórico
O Toxoplasma gondii foi descrito pela primeira vez, si-multaneamente, por NICOLLE & MANCEAUX (1908 e 1909) em um roe-dor norte-africano da espécie Ctenodactylus gondi na Tunísia e por S P L E N D O R E (1908 e 1909) em c o e l h o s no Brasil.
MELLO (1910) descreveu a toxoplasmose no cão; porém com relação ao homem, o primeiro caso foi descrito somente em 1923 por Janku conforme KEAN
et al.
(1978). A seguir WOLF & CO-WEN (1937) puderam relatar com detalhes clínico - patológicos a toxoplasmose congênita. Já WOLF et al. (1939 e 1940) consegui-ram, pela primeira vez, transmitir experimentalmente para ani-maiso T. gondii
proveniente de um caso humano. A caracteriza-ção da doença atingindo adultos foi documentada por PINKERTON & WEINMAN (1940). Em 1941, SABIN assinalou a presença doT.
gon-dii
como agente etiológico da encefalite em crianças; a toxo-plasmose ganglionar em humanos só foi reconhecida por SIIM em1952.
Com o advento de testes intradérmicos e sorológicos, em especial o teste do corante (SABIN & FELDMAN, 1948),
pôde-se ter idéia da prevalência do T. gondii em humanos e animais.
Dessa forma, verificou-se que as infecções no ser humano geral-mente são assintomáticas e que este protozoário está amplamen-te distribuído na natureza, afetando mamíferos e aves (FELD-MAN, 1982).
2.2. Classificação
Até o presente momento, o Comitê da Sociedade de Pro-tozoologistas em relação à Sistemática e Evolução (LEVINE et. al., 1980) tem situado o gênero Toxoplasma como pertencente ao filo Apicomplexa Levine, 1970; classe Sporozoa Leuckart, 1879; subclasse Coccidia Leuckart, 1879; ordem Eucoccidia Léger & Du-boscc, 1910; subordem E i m e r i i n a Léger, 1911.
LEVINE (1973a) classificou o gênero Toxoplasma em uma família isolada Toxoplasmatidae Biocca, 1956 e, posteriormente, (LEVINE, 1973b) na família Sarcocystidae Poche, 1913. FRENKEL (1974) situou-o novamente na família Toxoplasmatidae. No entan-to, FRENKEL (1977) reconsiderou, reconhecendo-o como pertencen-te à subfamília Toxoplasmatinae Biocca, 1965 na família Sarco-cystidae.
Em 1977, LEVINE, após revisão das principais caracte-rísticas do Toxoplasma, descreveu-o como um gênero da família Eimeriidae Minchin, 1903, onde também propôs 7 espécies de
To-xoplasma, sendo T. gondii e T. hammondii (syn. Hammondia hammon-dii, FRENKEL & DUBEY, 1975) as únicas espécies cujos ciclos de vida foram estudados. As outras cinco espécies propostas (T. alencari, T. brumpti, T. colubri, T. ranae e T. serpai) têm si-do encontradas em répteis e anfíbios, porém, consideradas por DU-BEY (1977) como espécies de posição taxonômica incerta, devido ao desconhecimento de suas estruturas celulares e ciclos bioló-gicos.
2.3. Aspectos biológicos
O T. gondii é um parasita homoxeno ou heteroxeno. Seu ciclo biológico completo só pode ser observado no hospedeiro de-finitivo, ou seja, em um felídeo. Contudo, cerca de 200 espé-cies de animais entre mamíferos e aves podem ser considerados h o s p e d e i r o s i n t e r m e d i á r i o s (LEVINE, 1977).
Os três estádios infectantes deste protozoário são: os taquizoítas (formas de multiplicação rápida, também chamadas t r o f o z o í t a s ou endozoítas) , os b r a d i z o í t a s (formas de m u l t i p l i - cação lenta, t a m b é m c o n h e c i d a s como cistozoítas) em c i s t o s te- ciduais e os esporozoítas em oocistos esporulados (DUBEY, 1986c).
À e x c e ç ã o da e s p o r u l a ç ã o q u e a c o n t e c e no m e i o a m b i e n - te, observa-se no ciclo de vida do T. gondii, a presença de dois c i c l o s distintos: um ciclo " e n t e r o e p i t e l i a l " , que o c o r r e em fe- linos, levando à formação de gametas e oocistos, e um ciclo "ex-t r a - i n "ex-t e s "ex-t i n a l ou "ex-t e c i d u a l " , que o c o r r e nos h o s p e d e i r o s i n "ex-t e r - m e d i á r i o s e t a m b é m em f e l i n o s (FRENKEL, 1973).
2.3.1. Ciclo "Enteroepitelial"
DUBEY & FRENKEL (1972) realizaram minucioso estudo so-bre o ciclo do T. gondii em gatos, após a inoculação oral de cis-tos. Embora o ciclo assexuado no epitélio intestinal do gato possa ser iniciado através de taquizoítas e esporozoítas, so-mente o ciclo induzido com bradizoítas tem sido melhor estuda-do. Estes mesmos autores associaram ao ciclo "enteroepitelial" cinco novas fases de multiplicação, denominadas como "tipos" A, B, C, D e E. O conceito de um "tipo" baseia-se na sua estrutu-ra, no seu tempo limitado de ocorrência no intestino do gato e no seu modo de divisão. A gametogonia, com consequente formação de oocistos, foi também estudada. A origem dos gametócitos não foi determinada, provavelmente os merozoítas, provenientes dos m e r o n t e s t i p o s D e E, s e j a m os r e s p o n s á v e i s por ela.
Posteriormente, DUBEY (1979) conseguiu demonstrar nova-mente as fases acima citadas, utilizando, além da cepa do primei-ro estudo, uma outra cepa do T. gondii. Este autor, pprimei-ropôs que estudos in vitro sejam realizados, utilizando cultura de epité-lio intestinal de felídeo infectada com T. gondii para comple-to e s c l a r e c i m e n t o dos e s t á d i o s e v o l u t i v o s .
Os períodos pré-patentes e patentes variam dependendo da forma infectante adquirida pelo hospedeiro definitivo (DUBEY et al., 1970a; WALLACE, 1973a). Assim sendo, o período pré-patente após a ingestão de cistos contendo bradizoítas foi de 4 a 5 dias, após a ingestão de taquizoítas foi de 5 a 19 dias e após a ingestão de oocistos esporulados foi de 21 a 49 dias.
Os respectivos períodos de patência após a ingestão das estru-turas referidas foram: 9 a 20 dias, 2 a 12 dias e 5 a 8 dias
(WALLACE, 1973a).
Observações de campo e dados experimentais sugerem que, apesar da possibilidade do gato se infectar e completar o ciclo a partir da ingestão de oocistos, o modo de transmissão ao gato, com a participação de hospedeiros intermediários, con-tendo taquizoítas ou bradizoítas, pode ser o mais comum na natu-reza (WALLACE, 1973a e 1973b).
2.3.2. Ciclo "Extra-Intestinal"
No ciclo completo nos hospedeiros não-felídeos de-senvolvem-se inicialmente taquizoítas, que possuem a capacidade de parasitar vários tipos celulares cmo fibroblastos, las reticulares, hepatócitos, pneumócitos, neurônios e célu-las do músculo cardíaco; estas formas são observadas durante a infecção aguda (FRENKEL, 1973). MANWELL (1941) e WOLFSON (1941) demonstraram o T. gondii em eritrócito de aves. Entre-tanto, os cistos são observados na infecção crônica, comumte no cérebro, coração e músculo esquelético, podendo, no en-tanto, a p a r e c e r em q u a l q u e r ó r g ã o (FRENKEL, 1973).
A parede dos cistos isola os bradizoítas dos tecidos do hospedeiro, impedindo a reação inflamatória (FRENKEL, 1956). Desta maneira, os cistos intactos provavelmente não causam ne-nhum prejuízo ao hospedeiro, podendo persistir por toda a vida
O ciclo extra-intestinal também ocorre no gato, simul-taneamente ao ciclo que se passa no intestino. Assim, os teci-dos extra-intestinais do gato podem ser parasitateci-dos por taqui-z o í t a s e mais tarde por c i s t o s (DUBEY & F R E N K E L , 1972).
2.3.3. Esporulação
Os oocistos são as formas eliminadas nas fezes dos fe-lídeos (FRENKEL et al., 1970; DUBEY et al., 1970b, MILLER et al., 1972), ainda imaturos e não infectantes. A esporulação ocorre dentro de um período de 1 a 4 dias, a temperatura ambien-te e sob condições ae r ó b i c a s . D e n t r o de cada o o c i s t o i n f e c t a n - te formam-se 2 esporocistos, cada qual contendo 4 esporozoítas
(DUBEY et
al.,
1970c). Adicionalmente, DUBEY & FRENKEL (1973) observaram que, em camundongos experimentalmente infectados com oocistos esporulados, alguns desses passaram através do intes-tino sem que ocorresse a excistação e deste modo eram eliminados nas f e z e s a i n d a i n f e c t a n t e s .2.4. Aspectos morfológicos
O taquizoíta do T. gondii mede cerca de 2 x 6 um e ge-ralmente possuia forma de meia-lua, com a extremidade anterior a f i l a d a e a e x t r e m i d a d e p o s t e r i o r a r r e d o n d a d a , e s t a n d o o nú- cleo s i t u a d o u s u a l m e n t e p r ó x i m o à e x t r e m i d a d e p o s t e r i o r ou cen- tralmente. O taquizoíta torna-se ovóide após a penetração na célula do hospedeiro e esta isola-o, através da formação de um
vacúolo parasitóforo (DUBEY, 1977).
Com o auxilio da microscopia eletrônica pôde-se veri-ficar na estrutura dos taquizoítas do T. gondii a presença de uma película, anel polar, conóide, roptrias, micronemas, mito- côndrias, microtúbulos subpeliculares, retículo endoplasmáti-co rugoso, aparelho de Golgi, microporo, ribossomas e um nú- cleo bem definido (SCHOLTYSECK & PIEKARSKI, 1965; SHEFFIELD & MELTON, 1968).
Pseudocistos, grupos, clones ou colônias terminais, são denominações dadas à célula hospedeira contendo numero-sos taquizoítas (DUBEY, 1977).
O cisto é constituído por uma membrana argirofílica que envolve vários bradizoítas, geralmente são subesféricos ou tomam a forma da célula hospedeira. O tamanho dos cistos é va-riável; os jovens podem medir 5 um, possuindo somente 4 bradi-zoítas; enquanto, os cistos mais velhos podem ter um diâmetro de até 100 um e conter centenas de organismos. Estruturalmen-te, os bradizoítas diferem pouco dos taquizoítas; os primeiros geralmente possuem o núcleo situado perto da extremidade poste-rior, enquanto, nos taquizoítas, o núcleo é visto mais central-mente (DUBEY, 1977). Entretanto, DUBEY & FRENKEL (1976) obser-varam que, durante a divisão, tanto os taquizoítas como os dizoítas, apresentaram o núcleo localizado centralmente. Os bra-dizoítas contêm vários grânulos de glicogênio, os quais são ra- ros ou ausentes nos taquizoítas (DUBEY, 1977).
Os oocistos não esporulados são subesféricos a esféri-cos e medem cerca de 10 x 12 um; enquanto que os oocistos
es-porulados são subesféricos a elipsoidais, medindo cerca de 11 x 12,5 um (DUBEY et al., 1970a; DUBEY 1973 e 1976). Os esporocis-tos são elipsoidais, medindo cerca de 6 x 8,5 um e os esporozoí-tas são alongados, curvando-se dentro de cada esporocisto e me-d i n me-d o c e r c a me-de 2 x 8 um q u a n me-d o l i v r e s (DUBEY et al., 1970a).
2.5. Resistência das formas infectantes
A dessecação, o etanol a 70% e os desinfetantes comu-mentes usados, eliminam facilmente os taquizoítas. Os cistos são destruídos quando se cozinha a carne a temperaturas superiores
a 60°C; já o congelamento não é um método tão eficiente para a eliminação dos cistos (FRENKEL, 1973). DUBEY (1974) verificou que os cistos tornavam-se não infectantes após o congelamento a -20°C por 4 horas ou mais, embora já se tenha assinalado a sobrevivência de cistos ao congelamento, como ocorrido com a ce-pa Aldrin que foi recuperada do cérebro e da musculatura após o congelamento a -20°C por 16 dias (DUBEY & FRENKEL, 1973). Os bradizoítas presentes nos cistos são muito mais resistentes à digestão enzimática do que os taquizoítas (JACOBS et al., 1960). Os oocistos são altamente resistentes e podem permane-cer infectantes por mais de um ano (YILMAZ & HOPKINS, 1972; FRENKEL et al., 1975). São resistentes aos ácidos e álcalis e à maior parte dos desinfetantes. Porém, são sensíveis à amônia, à dessecação e à temperatura de 55°C por 30 minutos (DUBEY et al., 1970b).
2.6. Modos de transmissão
Os três principais modos de transmissão do T. gondii são: a transmissão congênita (transplancetária), a transmissão pelo c a r n i v o r i s m o e a t r a n s m i s s ã o f e c a l - o r a l (DUBEY, 1986d).
A transmissão transplacentária humana foi a primeira a ser reconhecida (WOLF & COWEN, 1937). Posteriormente, esta foi observada por BEVERLEY (1959) ocorrendo em sucessivas gera-ções de c a m u n d o n g o s .
A descoberta por JACOBS et al. (1960) de que os cistos possuíam organismos mais resistentes ã digestão péptica do que os taquizoítas, deu suporte à hipótese, já existente na época, da transmissão através do carnivorismo. Esta, então, pôde ser demonstrada quando DESMONTS et al. (1965) compararam as taxas de infecção por Toxoplasma em crianças, antes e após serem inter-nadas em um hospital, onde carne crua era utilizada terapeutica-mente.
A transmissão fecal, que explica a infecção de her-bívoros e vegetarianos, começou a ser esclarecida a partir das observações de HUTCHISON (1965), que demonstrou infectividade nas fezes de um gato, o qual havia ingerido camundongos cronica-mente infectados com o T. gondii. Inicialmente foi proposto que o T. gondii, nas fezes do gato, estaria protegido dentro dos ovos do Toxocara cati e, assim, este nematóide o transmitiria (HUTCHISON, 1967). No entanto, a hipótese desta associação mos-trou-se ser apenas circunstancial (FRENKEL et al., 1969). Em 1970, diversos autores demonstraram a presença de oocistos de
T. gondii nas fezes de gato, caracterizando assim, este
pro-tozoário como um coccídeo (FRENKEL et al., 1970; HUTCHISON
et al., 1970; SHEFFIELD & MELTON, 1970; WEILAND & KÜHN, 1970).
Apesar de bem menos provável, existe ainda a possibi-lidade do Toxoplasma ser transmitido através da ingestão de leite não pasteurizado, da ingestão de ovos, de transfusão de sangue, de transplantes de órgãos e de acidentes de labora-tório (FRENKEL, 1973).
O crescente consumo de leite de cabras, principalmen-te para crianças, pode principalmen-ter alguma importância em saúde públi-ca, já que este leite geralmente é consumido sem pasteuriza-ção (DUBEY et al., 1980; DUBEY, 1986d) .
Com relação à participação de hospedeiros-transporte na transmissão do T. gondii, tem-se demonstrado experimental-mente que moscas (WALLACE, 1971), baratas (WALLACE, 1972 e 1973b; CHINCHILLA & RUIZ, 1976) e minhocas (FRENKEL et al., 1975) foram capazes de transportar oocistos deste protozoá-rio. Além disso, certas espécies de aves que servem como hos-pedeiros intermediários do T. gondii alimentam-se de minhocas (MARKUS, 1974) e estas por sua vez facilitam a disseminação dos oocistos pelo solo (RUIZ & FRENKEL, 1980).
2.7. Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial faz-se necessário para confirmação definitiva da toxoplasmose, uma vez que esta doença apresenta uma sintomatologia não específica, podendo ser confundida com várias outras enfermidades. Além dis-so, a infecção pode ser oligossintomática ou ainda assin-tomática.
O isolamento do T. gondii em animais de laboratório é um método seletivo, sendo o camundongo albino, o animal de escolha, devido a sua alta susceptibilidade à infecção pelo T. g o n d i i (KAMEI et al., 1976).
O teste da intradermoreação (FRENKEL, 1948) é de pouco valor no diagnóstico de casos individuais, mas pode ser útil em inquéritos epidemiológicos e no diagnósti-co de casos de toxoplasmose crônica (SIIM et al., 1963).
O teste do corante de SABIN & FELDMAN (1948) ain-da hoje merece destaque, principalmente por ser um dos testes mais específicos para a toxoplasmose. Entretanto, há a necessidade de se utilizar o parasito vivo (DUBEY, 1977).
Os testes de fixação de complemento, de hemaglutina-ção indireta, de imunofluorescência indireta, entre outros, e mais recentemente, provas imunoenzimáticas, auxiliam não só no diagnóstico da toxoplasmose (APT, 1988), mas permitem também que levantamentos epidemiológicos sejam realizados (SOUZA,
1986).
Recentemente, DUBEY & THULLIEZ (1989) obtiveram resul-tados satisfatórios para o diagnóstico sorológico de toxoplas-mose em gatos, utilizando o teste de aglutinação. Anticorpos
IgA contra o antígeno P-30 do
T. gondii,
em testesimunoenzi-máticos, têm sido usados como marcadores para o diagnóstico da toxoplasmose humana congénita e aguda (DECOSTER et al., 1988).
O resultado de um soro com títulos baixos de anticor-pos pode indicar apenas uma infecção toxoplásmica passada; às vezes, é necessário novo exame para que o diagnóstico de uma
infecção aguda seja confirmado
ou
descartado. Neste últimoca-so, o título de anticorpos permanece estável. Igualmente, en-contra-se certa dificuldade na avaliação sorológica com re-lação à toxoplasmose ocular, na qual, mesmo um baixo título de
anticorpos anti-
Toxoplasma
não exclui a possibilidade dereti-nocoroidite em atividade (DUBEY, 1977).
Atenção especial deve ser dada a resultados negativos em exames sorológicos de gatos, já que, durante o período de eliminação de oocistos, os gatos, geralmente, não costumam de-senvolver anticorpos (DUBEY & FRENKEL, 1972).
O diagnóstico também pode ser realizado através da visualização do parasito, com estruturas típicas, em impres-sões de órgãos coradas pelo Giemsa (DUBEY, 1977).
BEVERLEY (1976) estudando as alterações histológicas causadas pelo T. gondii em animais, relata que apesar das le-sões serem bastante sugestivas, o diagnóstico definitivo de toxoplasmose somente poderá ser feito com a visualização do parasito nos tecidos. No exame histológico, os cistos, quando corados pela hematoxilina-eosina, podem ser facilmente vis-tos. Os grânulos de glicogênio dos bradizoítas coram-se for-temente com o ácido periódico de Schiff (PAS), enquanto que a membrana dos cistos cora-se bem pela prata. Ao contrário dos cistos, os taquizoítas não têm propriedades tintoriais especi-ficas, sendo mais difíceis de serem visualizados (DUBEY, 1977).
Atualmente, através da técnica de peroxidade anti-pe-roxidase, é possível visualizar-se o T. gondii e seus resí-duos antigênicos em cortes histológicos fixados em formalina. Esta técnica apresenta uma positividade bem maior do que a ob-tida em cortes histológicos corados através da hematoxilina-eosina, podendo-se reconhecer o parasito mesmo em tecidos em decomposição (UGGLA et al., 1987; GUSTAFSSON et al., 1988).
2.8. Toxoplasmose no homem e nos animais domésticos
As manifestações clínicas da toxoplasmose no homem podem ser resultado de uma infecção congênita ou adquirida.
De acordo com BEVERLEY (1974), a infecção congênita somente ocorre quando a mulher se infecta pela primeira vez
le-sões no feto, tais como retinocoroidite, hidrocefalia e calci-ficação intracerebral. Por outro lado, a linfoadenopatia cons-titui a manifestação clínica mais comum na toxoplasmose adqui-rida, podendo ocorrer complicações ocasionais por envolvimen-to de outros órgãos como pulmão, coração, fígado, musculatura esquelética ou cérebro (BEVERLEY, 1974).
A imunossupressão é um fator importante especialmen-te quando se trata de toxoplasmose. Pacienespecialmen-tes com linfomas, síndrome de imunodeficiência adquirida ou aqueles sujeitos a transplantes de órgãos ou sujeitos à quimioterapia imunossu-pressora podem manifestar infecção aguda, sendo que esta, ge-ralmente, afeta o sistema nervoso central (FELDMAN, 1982; FREN-KEL, 1986).
Em diversos países,
o T. gondii
tem sido a causa deabortos, mumificação, natimortos e morte neonatal em ovinos (BLEWETT & WATSON, 1984; DUBEY et al., 1986b). O sistema
repro-dutivo das cabras também pode ser afetado pelo
T. gondii,
acar-retando os mesmos distúrbios que ocorrem nos ovinos (NURSE &
LENGHAUS, 1986). Tanto ovelhas (DUBEY et al., 1986b), como
ca-bras (DUBEY et al., 1986a), apresentam lesões necróticas nos cotilédones da placenta, características da toxoplasmose. O re-conhecimento desta lesão é importante no diagnóstico de aborto
nestas espécies, já que
o T. gondii é
difícil de serobserva-do entre as células degeneradas observa-do hospedeiro (DUBEY, 1987), sendo, às vezes, necessário o emprego de técnicas especiais pa-ra visualizá-lo (UGGLA et al., 1987).
um agente causador de abortos ou doença clínica (DUBEY, 1986b). A infecção pós-natal parece ser a mais comum na espé-cie suína e geralmente se manifesta subclinicamente. Casos es-porádicos de toxoplasmose fatal em leitões têm sido reportados
(DUBEY, 1986a).
Entre os cães, a toxoplasmose é mais severa em ani-mais jovens (DUBEY, 1977). CAMPBELL et al. (1955) descreveram a s s o c i a ç ã o do T. gondii com o v í r u s da cinomose.
Nos gatos, a toxoplasmose congênita, apesar de rara, já foi confirmada (DUBEY & JOHNSTONE, 1982). A toxoplasmose clí-nica n e s t e s a n i m a i s é t a m b é m de b a i x a o c o r r ê n c i a (DUBEY, 1986c), apresentando-se a pneumonia como a mais importante alteração
(MEIER et al., 1957). Embora o parasito se multiplique no in-testino desses animais, raramente observa-se diarréia (DUBEY, 1977).
Organismos semelhantes ao T. gondii têm sido observa- dos em equinos com encefalomielite (CUSICK et al., 1974; DUBEY et al., 1974; DORR et al., 1984). No entanto, d e v i d o às diferen- ças e s t r u t u r a i s e ao fato de não se ter isolado o p r o t o z o á r i o de t e c i d o s dos e q u i n o s afetados, este o r g a n i s m o p a r e c e ser ou-
tro protozoário que não
o T. gondii
(DUBEY et al., 1974).2.9. Toxoplasmose em galinhas
2.9.1. Ocorrência da doença
A primeira descrição da toxoplasmose espontânea em ga-linhas foi feita na Alemanha, por HEPDING (1939), em uma
gali-nha com neurolinfomatose e retinocoroidite "necrotizante"; o parasito foi encontrado no exame histológico da retina. SPARA-PANI (1950), na Itália, descreve uma doença em galinhas com algumas evidências de ter sido ocasionada pelo T. gondii. Na Suíça, FANKAUSER (1951) relata um caso de uma galinha que a-presentou lesão cerebral pelo T. gondii
,
com grande número de parasitos livres e intracelulares. BORN (1951), na Alemanha, suspeitando de um possível envolvimento de galinhas na infec-ção do homem por Toxoplasma,
encontrou positividade nas dilui-ções de 1:25 e 1:100, em duas de três galinhas por ele pesqui-sadas, utilizando o teste do corante. SCHULTE (1954), também na Alemanha, observou encefalite por Toxoplasma em galinhas.O primeiro isolamento do T. gondii de casos espontâ-neos em galinhas foi realizado na Noruega, por ERICHSEN & HAR-BOE (1953) em um surto envolvendo uma pequena criação de gali-nhas White Leghorn. Logo a seguir, NOBREGA et al. (1954), em nota prévia, descreveram, no Brasil, uma epizootia de toxoplas-mose afetando 600 frangos New-Hamphishire, de 2-3 meses de ida-de. Em 1955, NOBREGA et al. descreveram este surto detalhada-mente, s e n d o q u e a m o r t a l i d a d e nos a n i m a i s foi de 50%.
Na Dinamarca, BIERING-SORENSEN (1956), baseando-se na morfologia, demonstrou a presença do T. gondii em 35 galinhas provenientes de 21 criações. Em 6 destas criações, o parasito foi detectado sorologicamente e/ou por inoculação de órgãos das aves em camundongos, por via intraperitoneal. GIBSON & EYLES (1957) conseguiram isolar
o
T. gondii do cérebro de diversos animais, inclusive de 3 de 7 galinhas pesquisadas nasproximi-dades de uma residência, onde havia ocorrido um caso humano de toxoplasmose congênita. Na Iugoslávia, SIMITCH et al. (1961a) isolaram 2 cepas de T. gondii
de 786 galinhas examinadas.
Alguns autores encontraram, com certa freqüência, o T
.
gondiiparasitando os ovários e os ovidutos de galinhas natural-
m e n t e i n f e c t a d a s ( B I E R I N G - S O R E N S E N , 1956; J A C O B S et al., 1962). F O S T E R et al. (1969) o b s e r v a r a m que em g a l i n h a s i n f e c - t a d a s e s p o n t a n e a m e n t e , o cérebro, o c o r a ç ã o e o o v á r i o - o v i d u t o foram os órgãos dos quais mais frequentemente se obteve o isola-mento do T. gondii
, ratificando os achados de McCULLOCH et al.
(1966) (citados por F O S T E R et al., 1969).
2.9.2. Toxoplasmose experimental
D i v e r s o s a u t o r e s d e m o n s t r a r a m a i n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l em g a l i n h a s . C A R I N I (1909) foi o p r i m e i r o a i n o c u l a r g a l i n h a s com Toxoplasma
, com a cepa de coelho obtida por SPLENDORE (1908).
P o s t e r i o r m e n t e , c e p a s de Toxoplasma,
i s o l a d a s de d i v e r s o s h o s - p e d e i r o s , f o r a m i n o c u l a d a s , por d i f e r e n t e s vias, em g a l i n h a s de várias faixas etárias (LAVERAN & MARULLAZ, 1913; LEVADITI et al., 1929; WOLF et al., 1940; NOBREGA & REIS, 1942; MANWELL et al., 1945; RUCHMAN & JOHANSMANN, 1948; JACOBS & JONES, 1950; MAN-WELL & DROBECK, 1951; GEISSLER, 1952). Nos experimentos realiza-dos por e s t e s autores, v e r i f i c o u - s e uma d i f e r e n ç a de s e n s i b i l i - dade conforme a idade da ave e a via de inoculação empregada. Desta maneira, a maioria das cepas, quando inoculadas por via intracerebral em aves com menos de duas semanas de idade,geral-mente, causava a morte das aves. Mesmo quando utilizada outra v i a de i n o c u l a ç ã o , as aves d e s t a f a i x a etária, p o r v e z e s , m o r - riam. A l g u n s a n i m a i s a d u l t o s a p r e s e n t a v a m p a r a l i s i a após i n o c u - lação i n t r a c e r e b r a l ; t o d a v i a , não a p r e s e n t a v a m s i n t o m a s c l í n i - cos, q u a n d o o u t r a s v i a s de i n o c u l a ç ã o e r a m u t i l i z a d a s . A p e n a s G E I S S L E R (1952) d e s c r e v e u d e s e n v o l v i m e n t o de s i n t o m a s n e r v o s o s e m o r t e de aves a d u l t a s , a p ó s i n o c u l a ç ã o i n t r a p e r i t o n e a l .
Através das vias intraperitoneal, oral e cloacal, GEIS-SLER (1955) infectou galinhas empregando cepas procedentes de um caso de t o x o p l a s m o s e de uma c r i a n ç a (cepa "BK") e de um lei- tão (cepa "UH"), v e r i f i c a n d o que as aves m a i s j o v e n s a p r e s e n t a - vam s i n t o m a s e l e s õ e s m a i s p r o n u n c i a d o s .
S I M I T C H et al. (1961b) inoculando, por v i a oral, g a l i n h a s de diversas idades com taquizoítas e cistos de cepas considera-das como de b a i x a v i r u l ê n c i a , v e r i f i c a r a m s i n t o m a s de t o x o p l a s - mose somente com as formas císticas do T. gondii, sendo estes o b s e r v a d o s em 71,4% das aves de 1 dia e 40% das aves de 3 dias; as aves de 24 dias e de 82 d i a s f o r a m r e s i s t e n t e s .
K U L A S I R I (1965), r e v i s a n d o a l i t e r a t u r a , c o n s t a t o u que a m a i o r i a dos autores, em seus e x p e r i m e n t o s , u t i l i z o u c e p a s do
T. gondii
v i r u l e n t a s que, ao s e r e m i n o c u l a d a s por v i a i n t r a c e - r e b r a l em g a l i n h a s , a p r e s e n t a r a m um c o m p o r t a m e n t o a n ô m a l o , m a - t a n d o as aves r a p i d a m e n t e .A c e r c a da p a r a s i t e m i a nas g a l i n h a s , e s t u d o s f o r a m r e a - lizados por JACOBS & JONES (1950); HARBOE & ERICHSEN (1955); JO-NES et al. (1959); KINJO (1961) e JACOBS & MELTON (1966). Todos esses a u t o r e s o b s e r v a r a m que a p a r a s i t e m i a a p a r e c i a r a p i d a m e n -
te, mas que, apenas ocasionalmente, persistia por mais de 2 se-manas, mesmo quando se empregavam inóculos variando de 105 a
108 t a q u i z o í t a s de T. gondii
.
HARBOE & ERICHSEN 1954) compararam duas cepas do To-xoplasma, inoculando-as em galinhas. Uma das cepas (cepa "Ch") foi isolada de um surto ocorrido em galinhas (ERICHSEN & HAR-BOE, 1953); a outra (cepa R-H), era procedente de um caso huma-no (SABIN, 1941). Os achados anátomo-patológicos encontrados foram duvidosos, sendo que nenhuma das galinhas apresentou uma doença sistêmica semelhante àquela encontrada nas aves natural-mente infectadas. Para aves de um dia, a cepa "Ch" pareceu ter virulência um pouco mais acentuada do que a cepa RH. Em rela-ção às aves adultas, nenhuma diferença entre as duas cepas pô-de ser constatada.
NOBREGA et al. (1955) também não obtiveram sucesso quando tentaram reproduzir, em frangos, a doença ocorrida es-p o n t a n e a m e n t e .
Não foi verificado nenhum efeito em relação à suscep-tibilidade e à distribuição do parasito em experimentos com ga-linhas deficientes em vitaminas (JONES et al., 1959; KULASIRI & PRASAD, 1961). Da mesma forma, nenhum resultado foi consegui-do quanconsegui-do tentaram modificar a susceptibilidade das aves atra-vés de i n o c u l a ç ã o com c o r t i s o n a (JONES et al., 1959).
BICKFORD & SAUNDERS (1966) discutiram sobre a
possibi-lidade do T. gondii estar associado com outros agentes
etioló-gicos para p r o d u z i r d o e n ç a grave em galinhas.
imunoló-gica de g a l i n h a s à i n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l com Toxoplasma.
JONES et al. (1959) observaram que o T. gondii desapa-r e c i a dos t e c i d o s das g a l i n h a s , i n c l u s i v e dos m ú s c u l o s , e m cedesapa-r- ca de 4 s e m a n a s p ó s - i n f e c ç ã o .
Apesar de demonstrar a tendência que as galinhas têm de eliminarem o T. gondii de seus tecidos infectados, KINJO (1961 observou que, em alguns casos, o mesmo permaneceu por períodos relativamente longos sem causar sintomas aparentes. Es-te autor também responsabiliza a idade das aves como um impor-tante fator de influência na susceptibilidade das galinhas ao
T . g o n d i i.
Os trabalhos de KULASIRI & PRASAD (1961) e KULASIRI 1965), utilizando cepas avirulentas do Toxoplasma mostraram que os parasitas permaneceram no cérebro das galinhas por até um mês. Baseando-se também em dados experimentais, JACOBS & MELTON (1966) e BICKFORD & SAUNDERS (1966) constataram a presença de T. g o n d i i nos t e c i d o s de g a l i n h a s , por p e r í o d o s p r o l o n g a d o s .
A p ó s i n o c u l a r e m g a l i n h a s por v i a i n t r a p e r i t o n e a l , oral e subcutânea, BOCH et al. (1966) conseguiram isolar o T. gondii com m a i o r f r e q u ê n c i a do c é r e b r o (91%) e do c o r a ç ã o (79%). B I A N - CIFIORI et al. ( 1986), apesar de terem isolado o T. gondii de v á r i o s ó r g ã o s de g a l i n h a s i n f e c t a d a s com o o c i s t o s , 7 a 15 dias p ó s - i n o c u l a ç ã o , q u a n d o t e n t a r a m o i s o l a m e n t o 40 dias p ó s - i n o c u - lação, este só foi p o s s í v e l do c é r e b r o e do coração.
2.9.3. Sintomatologia e lesões
2.9.3.1. Infecção natural
No surto descrito por ERICHSEN & HARBOE (1953), a doen-ça a p r e s e n t a v a - s e de e v o l u ç ã o v a r i á v e l , a l g u m a s aves m o r r i a m sem qualquer sintomatologia, outras, todavia, ficavam até um mês d o e n t e s . Os s i n t o m a s não f o r a m c a r a c t e r í s t i c o s , e x c e t o ce- gueira ocasional. No exame histológico, o
T. gondii
foi encon-trado no coração, cérebro, pulmão, fígado, pró-ventrículo e no i n t e s t i n o d e l g a d o . As lesões a s s o c i a d a s c o m a p r e s e n ç a do p a r a - sito foram pericardite serosa, miocardite focal ou difusa, ence-falite focal " n e c r o t i z a n t e " , h e p a t i t e " n e c r o t i z a n t e " , p n e u m o n i a " n e c r o t i z a n t e " e g a s t r o e n t e r i t e u l c e r a t i v a . Um três casos, ob- servou-se coroidite difusa, mas sem a presença do protozoário.NOBREGA et al. (1955) relataram uma evolução de 4-5 dias. Os s i n t o m a s de t r i s t e z a , a r r e p i a m e n t o , asas caídas, o l h o s f e c h a d o s e fezes e s b r a n q u i ç a d a s t a m b é m não f o r a m c o n s i d e r a d o s c a r a c t e r í s t i c o s . C o n j u n t i v i t e u n i l a t e r a l intensa, não a s s o c i a - da à p r e s e n ç a do p a r a s i t o , foi o b s e r v a d a e m um frango. Os a c h a - dos de n e c r o p s i a mais i m p o r t a n t e s f o r a m f í g a d o e b a ç o a u m e n t a - dos de volume, os q u a i s a p r e s e n t a v a m n ó d u l o s b r a n c o - a m a r e l a d o s variáveis em número e tamanho e pulmão com extensas áreas de c o n g e s t ã o e c o n s o l i d a ç ã o . A o e x a m e h i s t o l ó g i c o o b s e r v a r a m p n e u - monia associada à presença de
Toxoplasma
no interior decélu-las mononucleares; pericardite e miocardite com moderada quanti-dade de p a r a s i t a s e n t r e as fibras e l e s õ e s n e c r ó t i c o - i n f l a m a t ó -
rias no fígado e no baço, com os parasitas apresentando-se iso-lados ou em grupos. Foi possível o isolamento do T. gondii do fígado, baço e pulmão. No cérebro não foram observadas lesões, com exceção de um caso com focos de necrose sem reação inflama-tória. Histologicamente, também não foi possível visualizar o parasito. Entretanto, pôde-se isolar o mesmo do cérebro de dois animais mortos após a fase aguda da doença e, igualmente, do cé-rebro de 23 animais sobreviventes, 4 a 6 meses após o surto. BIERING-SORENSEN (1956) considerou a necrose do quias-ma óptico como sendo uquias-ma lesão característica de toxoplasmose em g a l i n h a s .
SIIM et al. (1963) descreveram aspectos clínicos e pa-tológicos da toxoplasmose em galinhas. Os casos clínicos, geral-mente fatais, são caracterizados por sintomas nervosos. Estes autores, dividiram a toxoplasmose em galinhas, com base nos a-chados anátomo-patológicos encontrados, em duas formas: a forma cerebral (ocular) e a forma visceral. Ao exame macroscópico, a primeira apresenta caracteristicamente uma necrose basal do me-sencéfalo, sem a visualização de alterações em outros órgãos. Retinocoroidite é comumente observada. Entretanto, as lesões nos outros locais só podem ser vistas microscopicamente. Já na forma v i s c e r a l , as a l t e r a ç õ e s nas v í s c e r a s são v i s í v e i s m a c r o s - c o p i c a m e n t e ; o s i s t e m a n e r v o s o c e n t r a l t a m b é m p o d e e s t a r a f e t a - do, p o r é m as l e s õ e s s o m e n t e são o b s e r v a d a s ao m i c r o s c ó p i o .
2.3.9.2. Infecção experimental
HARBOE & ERICHSEN (1954), inoculando galinhas de dife-rentes idades através de diversas vias (intradérmica e/ou sub-cutânea, intraperitoneal, intracerebral e intravenosa) verifi-caram que várias aves não mostraram sintomas nem lesões. As únicas alterações encontradas foram: infiltrados perivascula-res no cérebro de algumas aves inoculadas pelas diversas vias; reação inflamatória no local da inoculação intradérmica; pneu-monite "necrotizante" acompanhada ou não da presença do parasi-to em algumas aves, após inoculação subcutânea; e necrose fo-cal do fígado em duas galinhas, uma inoculada por via subcutâ-nea e o u t r a i n o c u l a d a por via i n t r a p e r i t o n e a l .
Nas galinhas inoculadas por GEISSLER (1955), a sinto-matologia foi predominantemente nervosa e, à necropsia, obser-vou-se discreta congestão do fígado, pequenos infartos no fí-gado e b a ç o e e n t e r i t e h e m o r r á g i c a .
BICKFORD & SAUNDERS (1966) inocularam 3 grupos de pin-tos de 1 dia. O grupo I foi inoculado por via intracranial, o grupo II por via intracranial e intramuscular e o grupo III por via intramuscular. Sintomas nervosos, com rápida evolução para morte, foram vistos em mais de 50% das galinhas, nos dois primeiros grupos; meningoencefalite grave acompanhada da pre-sença do T. gondii e necrose focal do fígado foram observa-das nestas aves. As aves sobreviventes destes dois grupos (I e II) não mostraram sintomas durante 3 meses, no entanto, pô-de-se verificar lesões no cérebro e no fígado e o T. gondii foi
visualizado no cérebro dessas aves. As aves do grupo III não mostraram sintomatologia, mas apresentaram lesões quando exa-minadas 3 meses após a inoculação. Lesões no coração foram ob-servadas macroscopicamente em algumas aves. Histologicamente, foram observadas lesões no cérebro, coração, fígado, pâncreas e testículos. No cérebro, o T. gondii
foi visto na maioria dos
casos; no miocárdio, pâncreas e testículo foi observado em ape-nas algumas aves e no fígado estava ausente. A infiltração ce-lular nos testículos, associada a grande número de parasitas, foi acentuada, restando apenas poucos túbulos seminíferos dege-nerados.Morte dos embriões e mal formações congênitas foram observadas após a inoculação de T. gondii
em galinhas
poedei-ras (CABALLERO-SERVÍN, 1974).2.9.4. Diagnóstico laboratorial
Vários foram os autores que realizaram investigações sorológicas em galinhas, seja com aves infectadas espontanea-mente ou experimentalespontanea-mente. A maioria deles utilizou o teste do corante de SABIN & FELDMAN e/ou o teste de fixação de com-p l e m e n t o .
Com o teste de SABIN & FELDMAN, os resultados foram negativos ou positivos em baixas diluições (ERICHSEN & HARBOE, 1953; VOLLBRECHTSHAUSEN, 1954; NOBREGA et al., 1955; BIERING & SORENSEN, 1956; JONES et al., 1959; BICKFORD & SAUNDERS, 1966; FOSTER et al., 1969; MILLER et al., 1972).
Ao contrário do observado normalmente no soro de ou-tros animais com toxoplasmose, soros de galinhas infectadas, na-turalmente ou experimentaimente, não reagiram no teste de fixa-ção do complemento (ERICHSEN & HARBOE, 1955; NOBREGA et al., 1955; BIERING-SORENSEN, 1956). Por outro lado, HARBOE & REENAS (1957) demonstraram, em galinhas com toxoplasmose, a existência de anticorpos específicos, mas incapazes de formar um complexo antígeno-anticorpo, com atividade de fixar o complemento. Obser-varam que o soro de galinhas infectadas experimentalmente foi positivo no teste de inibição da fixação de complemento, en-quanto no teste de corante e no teste de fixação do complemen-to f o r a m n e g a t i v o s .
Os resultados obtidos por BOCH et al. (1966) com o tes-te de imunofluorescência assim como os obtidos por FRENKEL (1981), com o teste de hemaglutinação indireta, não foram sa-t i s f a sa-t ó r i o s .
Recentemente, com o teste de ELISA-IgG, BIANCIFIORI et al. (1986) obtiveram resultados positlvos em galinhas inocula-das com o o c i s t o s e s p o r u l a d o s do T o x o p l a s m a.
O diagnóstico através de soro-conversão em camundongos ou pela identificação do parasito em esfregaços ou exame histo-lógico em camundongos inoculados com suspensão de tecidos das aves suspeitas têm sido os métodos indiretos mais eficazes na v e r i f i c a ç ã o da t o x o p l a s m o s e em g a l i n h a s , já que os t e s t e s s o r o -
lógicos convencionais não são indicadores sensíveis e até certo p o n t o c o n f i á v e i s q u a n d o se t r a t a de aves, p o d e n d o l e v a r à fal- sas conclusões (FRENKEL, 1981). Este fato é exemplificado no
es-tudo epidemiológico realizado em Costa Rica por RUIZ & FRENKEL (1980), no qual foi possível isolar-se o T. gondii de 54% das galinhas estudadas, sendo que os soros de todas estas aves a-p r e s e n t a r a m - s e n e g a t i v o s ao t e s t e do corante.
2.9.5. Importância das galinhas como hospedeiros intermediários
Como anteriormente citado, surtos de toxoplasmose fo-ram relatados em diversos países, entretanto, a toxoplasmose em galinhas parece ser de rara manifestação clínica (BICKFORD & SAUNDERS, 1966). Por outro lado, isso não exclui a possibili-dade delas abrigarem o parasito, já que tem sido reportada a p e r s i s t ê n c i a do m e s m o em g a l i n h a s a p a r e n t e m e n t e s a u d á v e i s (FOS- TER et al., 1969).
Alguns autores aventam a possibilidade de que ovos de galinhas possam ser infectantes (SPARAPANI, 1950; GEISSLER, 1955; KINJO, 1961). JONES et al. (1959) consideram apenas como um achado ocasional a presença do Toxoplasma em ovos de gali-nha s.
BIANCIFIORI et al. (1986) não conseguiram isolar o parasito de 720 ovos embrionados provenientes de galinhas ino-culadas com oocistos infectantes. Da mesma forma, BOCH et al. (1966) após examinarem 2214 ovos provenientes de galinhas in-fectadas com taquizoítas e cistos, não conseguiram isolar o T. gondii.
verifica-ram que os gatos domésticos não têm mostrado indícios de caça-rem galinhas e desta forma, estas não desempenhariam nenhum
papel natural na transmissão do T. gondii
.
Contudo, observaramque pessoas freqüentemente dão vísceras e cabeça de galinhas a gatos e cães; assim, sob estas circunstâncias, mesmo filhotes de gatos poderiam adquirir a infecção deste hospedeiro inter-mediário. Estes autores observaram ainda que a taxa de infec-ção em galinhas aumentava de 23% naquelas pesando menos de 500 g, para 73% naquelas entre 500 e 1000 g, indicando a rápida ta-xa de aquisição da infecção, provavelmente do solo, no qual as aves constantemente procuram pelo alimento. No solo, existe a possibilidade das galinhas se infectarem com oocistos
esporula-dos de T. gondii e/ou através da ingestão de hospedeiros
mecâ-nicos d e s t e s oocistos.
2.10. Toxoplasmose em camundongos
A toxoplasmose em camundongos (Mus musculus) pode ser uma infecção aguda sintomática ou uma infecção crônica laten-te. Normalmente, as infecções agudas são sintomáticas nas duas primeiras semanas. A infecção crônica persiste, em geral, com a p r e s e n ç a de cistos no c é r e b r o (FRENKEL, 1975).
Os camundongos são os animais escolhidos para o
culti-vo do
Toxoplasma
em laboratório, devido à sua grandesuscepti-bilidade e ao fato de não estarem naturalmente infectados, quan-do criaquan-dos em laboratório com ração comercial livre de fezes de gato (DUBEY, 1977).
Estudos sobre a patogenicidade de cepas de Toxoplasma têm sido realizados em camundongos (DUBEY & FRENKEL, 1973; DU-BEY, 1980). Algumas cepas são uniformemente fatais, mesmo em baixas doses, para os camundongos, enquanto outras não causam doença aparente (BEVERLEY, 1976). Utilizando-se cepas virulen-tas facilmente obtêm-se taquizoívirulen-tas em camundongos, o que não ocorre com cepas avirulentas, as quais crescem lentamente, for-mando u s u a l m e n t e cistos cerebrais (DUBEY, 1977).
3.1. Obtenção dos animais
3.1.1. Origem das aves
Foi utilizado um total de vinte galinhas (Gallus gal-lus) que viviam livres, se alimentando ao solo, em contato com outros animais. Estas aves foram provenientes dos quilô-metros 42, 47 e 49 da antiga estrada Rio-São Paulo, localiza-da no Distrito de Seropédica, Município de Itaguaí, Estado do Rio de Janeiro. As aves foram adquiridas aleatoriamente e de d i v e r s a s criações.
Durante a aquisição das aves foi preenchida uma fi-cha, constando nesta, dados sobre o tipo de criação e de ali-mentação das aves, presença de gatos de estimação ou na vizi-nhança, presença de doença atual ou anterior na criação, núme-ro de aves na criação, condições habitacionais e dados adicio-nais.
3.1.2. Origem dos camundongos
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) albinos jo-vens de ambos os sexos. Estes animais foram procedentes do Bio-tério Central do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ, RJ). Na Esta-ção para Pesquisa Parasitológica W.O. Neitz, Universidade Fede-ral RuFede-ral do Rio de Janeiro, foram realizados os trabalhos de isolamento do T. gondii
em camundongos. Estes últimos foram
a-condicionados em caixas plásticas com água e ração1 ad libitum.3.2. Parasitemia das aves
De cada ave, retirou-se sangue da veia ulnar (veia da asa) com seringa contendo anticoagulante (EDTA 11%). O sangue to-tal, na quantidade de 1 ml, foi imediatamente inoculado subcuta-neamente em cada dois camundongos, no sentido de se verificar, in-d i r e t a m e n t e , a p a r a s i t e m i a nas aves.
3.3. Necropsia das aves
As a l t e r a ç õ e s m a c r o s c ó p i c a s , v e r i f i c a d a s em c a d a n e - cropsia, foram anotadas em fichas individuais. Posteriormente, r e a l i z o u - s e o e x a m e do c é r e b r o das a v e s e a c o l e t a e p r o c e s s a - m e n t o de ó r g ã o s p a r a o i s o l a m e n t o .
3.3.1. Exame do cérebro
De cada ave foram realizados, a partir de pequenos fragmentos de cada hemisfério cerebral, exames a fresco en-tre lâmina e lamínula e esfregaços para a pesquisa de cis-tos. Os esfregaços foram secos ao ar, fixados com álcool me-tílico por 3 minutos e corados pelo Giemsa por 30 minutos.
3.3.2. Coleta e processamento de órgãos para o isolamen-to
Para o isolamento do T. gondii foram coletados frag-mentos de cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, ová-rio-oviduto e músculo peitoral. Os fragmentos foram coloca-dos em placas de Petri e manticoloca-dos em geladeira a 4°C, até o momento do uso. Posteriormente, cada fragmento de órgão era isoladamente triturado em gral e pístilo estéreis, homogenei-zados em 10 ml de solução salina a 0,9% e filtrados através de g a z e e s t é r i l de 4 c a m a d a s .
3.4. Inoculação em camundongos
A suspensão de cada órgão, anteriormente citado, foi inoculada subcutaneamente em camundongos. Para cada
sus-2 Solução de Cloreto de Sódio a 0,9%, Darrow Laboratórios. Rio de J a n e i r o .
pensão de órgão foram utilizados dois camundongos, sendo que cada animal r e c e b e u 1 ml de inóculo.
Cada grupo de camundongos inoculados, num total de 18, correspondeu a uma galinha necropsiada. Dois outros camun-dongos foram utilizados, em c a d a grupo, como controles.
3.4.1. Pesquisa de Toxoplasma gondii nos camundongos
Cada animal foi observado durante um período de 30 dias pós-inoculação (DPI), anotando-se a sintomatologia e, em caso de morte neste período, foi realizada a necropsia e pes-quisa do protozoário. Esta última foi feita através dos se-guintes exames: exames a fresco e esfregaços de cérebro, con-forme descritos no item 3.3.1., objetivando, principalmente, a pesquisa de cistos e impressões de pulmão, realizadas princi-palmente com objetivo de visualizarem-se taquizoítas do T.
gon-dii
.
As impressões foram secas ao ar, fixadas com álcoolmetí-lico por 3 m i n u t o s e coradas p e l o G i e m s a por 30 m i n u t o s .
Todos os camundongos sobreviventes após o período de 30 DPI foram sacrificados, necropsiados e seus cérebros exami-nados para p e s q u i s a de cistos do p r o t o z o á r i o .
Para visualização do T. gondii
,
bem como das lesõessugestivas de toxoplasmose, fragmentos de cérebro, coração, pulmão, fígado, baço e rim dos camundongos que foram positi-vos em esfregaços e/ou impressões, foram coletados, fixados em formalina a 10%, incluídos em parafina, cortados em
mi-crótomo 3 e corados pela hematoxilina-eosina (HE). Alguns cor-tes histológicos foram corados pelo ácido periódico de Schiff
(PAS).
3.5. Manutenção do Toxoplasma gondii
No sentido de manter uma das amostras do T. gondii,
i-solada do cérebro e do coração de uma das galinhas (número 15), foi feito um h o m o g e n e i z a d o de cérebro, pulmão, fígado e baço (processados conforme o item 3.3.2.) dos camundongos nú-meros 280 e 283 e inoculado, por via subcutânea, na quantidade de 1 ml em cada dois camundongos e desta mesma forma, sucessi-vamente, em lotes de c a m u n d o n g o s c o n f o r m e F i g u r a 1.
3.6. Mensuração
As mensurações de cistos e taquizoítas foram feitas com auxílio de microscópio óptico Dialux 20 EB3 com ocular mi-crométrica SK-I5 Wild4. Os cistos foram medidos nos esfregaços e nos cortes histológicos de cérebro, enquanto que os taquizoí-tas foram m e d i d o s nas i m p r e s s õ e s de pulmão.
3 Leitz Wetzlar, R e p ú b l i c a F e d e r a l da A l e m a n h a . 4 W i l d Heerbrugg, Suíça.
F I G U R A 1. F l u x o g r a m a de cinco p a s s a g e n s do
Toxoplasma gondii
r e a l i z a d a s em c a m u n d o n g o s a partir do homogeneizado de cérebro, pulmão, fígado e baço, provenientes dos camundongos de números 280 e 283, os quais foram i n o c u l a d o s com c é r e b r o e coração, r e s p e c t i v a m e n t e , da galinha de número 15.3.7. Fotomicrografia
As estruturas identificadas como T. gondii foram foto-grafadas com o auxílio de uma câmara fotográfica Wild MPS 514, utilizando-se filme Panatomic -X FX 36-ISO 32/16º Kodak e fil-me Fujicolor de 35 mm, 100 ISO. A câmara se encontrava acopla-da a um microscópio Dialux 20 EB3. O tempo de exposição foi me-d i me-d o com f o t ô m e t r o a u t o m á t i c o W i l me-d M P S 554 .
4.1. N e c r o p s i a das aves
Todas as vinte aves adquiridas apresentavam-se aparen-temente sadias. Na necropsia observou-se apenas pequenas alte-rações tais como: presença de líquido seroso no saco pericár-dio (galinhas de números 8, 12, 16 e 17); avermelhamento da mu-cosa do duodeno (galinhas de números 3 e 12) e presença de helmintos intestinais em praticamente todas as aves, exceto as de n ú m e r o s 5, 6, 11 e 17.
4.2. Exame de cérebro das aves
Em nenhuma galinha foi possível evidenciar a presen-ça de cistos e taquizoítas do T. gondii no cérebro, através do exame direto, tanto pelo exame a fresco, como pelo esfrega-ço c o r a d o pelo Giemsa.
