UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

Programa de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento

EFEITOS DO ENVELHECIMENTO EM PARÂMETROS CARDIOVASCULARES E DE ESTRESSE OXIDATIVO EM RATAS SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DOS HORMÔNIOS

OVARIANOS: PAPEL DO TREINAMENTO FÍSICO

Danielle da Silva Dias

São Paulo 2012

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

Programa de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento

EFEITOS DO ENVELHECIMENTO EM PARÂMETROS CARDIOVASCULARES E DE ESTRESSE OXIDATIVO EM RATAS SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DOS HORMÔNIOS

OVARIANOS: PAPEL DO TREINAMENTO FÍSICO

Danielle da Silva Dias

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências do Envelhecimento.

Linha de Pesquisa: Aspectos biológicos e funcionais do envelhecimento.

Orientador: Prof. Dr. Bruno Rodrigues Co-Orientatora: Profa. Dra. Kátia De Angelis

São Paulo 2012

Dias, Danielle da Silva

D541e Efeitos do envelhecimento em parâmetros cardiovasculares e de estresse oxidativo em ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos: papel do treinamento físico / Danielle da SilvaDias. - São Paulo, 2012.

f.106 ;30 cm

Orientador:Bruno Rodrigues Co-Orientadora: Kátia De Angelis

Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, 2012.

1. Envelhecimento. 2. Estresse Oxidativo. 3. Menopausa – Aptidão física. I. Rodrigues, Bruno. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento. III. Título.

CDD – 616.1

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Universidade São Judas Tadeu

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais Valdeci Dias (in memoriam) e Maria da Trindade Silva.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus por ter me concedido trilhar o caminho percorrido até aqui.

À TODOS meus familiares, mas um agradecimento especial a minha mãe que me deu suporte e me suportou nas horas mais chatas e também engraçadas lá na cozinha de casa... só nós entenderemos...(risos). Obrigada por existir e nunca me deixar desanimar!

Ao meu irmão mais velho Michel, que sempre diz o que eu preciso ouvir, seja um conselho ou uma bronca e sempre está ao meu lado quando eu mais necessito.

Ao meu irmão Junior, meu chato preferido, não é de muitas palavras, mas seu sorriso maroto me encanta todos os dias!

Ao caçula mais reclamão da terra! Mas que faz tudo que eu peço, até etiquetas para eppendorfs. (risos). Obrigada lindos!

Ao meu Orientador Prof. Bruno Rodrigues que não teve escolhas, assumiu o papel de ¨pai de aluguel¨. Não deu para dizer não (risos)... Muito obrigada pelo pouco tempo que fui sua orientanda, mas que com certeza foi um prazer enorme.

À melhor co-orientadora do mundo! Profa Kátia De Angelis. A grande maestra e mentora de todo esse trabalho. Lembro que uma vez ela disse lá na graduação ainda: Alguém sabe o significado da palavra aluno? significa sem luz. Eu me pergunto, e o significado da palavra professora? significa aquele que ensina. E nesses 5 anos você me ensinou e como ensinou muito. Me ensinou que devemos amar o que fazemos, sempre sorrir, que chorar faz parte e que tudo dá certo no final! Muito obrigada Profa por ensinar essa aluna maluca aqui!

Aos amigos mais que especiais, que são verdadeiros irmãos e psicólogos, vocês deveriam investir nessa carreira (risos), só vocês na minha vidinha: Taise Teixeira, Tamiris Oliveira, Tamara Distassi, Tatiana Rezende e Nilton Santos. Sei que nossa amizade será eterna, eu sinto isso, muito obrigada à vocês. Vocês terão que me aguentar muitooo! Hahaha

Aos amigos do Acampamento Ranieri e da Associação Hebraica que me fazem ser criança por alguns dias, Neto Bezerra, Natalia Neves, Juliana Feitosa, Camilinha Kohatsu, Guilherme Rocha,

Aos Amigos e Colegas de Laboratório. Vamos ver se não me esqueço de ninguém... Nathalia Bernardes, a mais amada, fofa e querida do lab, Iris Sanches, minha co-co eterna em assuntos acadêmicos e pessoais, ah obrigada por me apresentar a técnica de pomodoro (como otimizar seu tempo no estudo) (risos), Janaina Brito a mais pentelha e autêntica. Espelho-me muito nas características de cada uma... obrigada pelas conversas, conselhos e amizade. Não poderia deixar de agradecer também à Michelle Sartori, Christiane Malfitano e Jaqueline Freire, Renata Palma, Morgana Busin e aos homens: Filipe Conti, Sebastião de Brito pelo “papo cabeça”, Romilson Nascimento, o papai mais babão, Alexandre Rocha, Guilherme Lemos, Hugo Garcia e Thayguara Falcão. Obrigada por compartilhar comigo os momentos de seriedade e os momentos não muitos sérios, momentos de TPM, esses foram muitos, mas que com toda certeza ficarão sempre na minha memória.

Ao Laboratório do Movimento Humano e aos alunos Leandro Yanase, Camilla Grans e Catarina Andrade.

Aos queridos professores do Mestrado: Marcelo de Almeida Buriti, Carla Witter, Ana Martha, Romeu Rodrigues, Marcos Luengo e Rogério Brandão. Obrigada pelo incentivo e ensinamentos.

Aos alunos da turma preferida do mestrado em ciências do envelhecimento, Sueli Vitorino, Gleice Branco, Nathaly Dahalib, Geovana Castrezano, Gleice 2, Elisabete Montovão, Hisabel, Kilze Malaquias, Débora Luise, Renatta e Carlos Treff pelos momentos mais divertidos, interessantes, prazerosos e saborosos vividos naquelas salas, só nós para sabermos o que foram esses momentos.. obrigada.

Aos funcionários da Universidade São Judas Tadeu, André , Graça e também a Fátima do centro de pesquisa que é um amorzinho e sempre me ajudou em muitas coisas. Um agradecimento especial a bioterista mais legal e mais linda, Maria Leide ¨a Leidoca¨ que cuida dos ratinhos e ratinhas com todo amor e carinho do mundo, mas de mim nem tanto...(risos). Minhas ratas também agradecem. Obrigada Leidoca!

Ao Laboratório de Hipertensão experimental do Incor e a Profa Maria Cláudia Irigoyen que não tenho palavras para demonstrar toda a admiração que sinto, meus olhos disseram tudo lá em Winston-Salem (risos). Sou eternamente Grata.

Espero que eu tenha lembrado todos. Enfim, muito, muito obrigada à todos vocês que diretamente ou indiretamente estiveram e fizeram parte desse projeto. (choro)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Peso corporal inicial e final dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias

(VOS)... Pg 22 Tabela 2 Velocidade máxima no teste de esforço inicial e final dos grupos de ratas

adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas

sedentárias (VOS)... Pg 23 Tabela 3 Pressão arterial sistólica (PAS), Pressão arterial Diastólica (PAD),

Pressão arterial média (PAM) e Frequência cardíaca (FC) de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas

sedentárias (VOS)... Pg 27 Tabela 4 Sensibilidade dos pressorreceptores pela Resposta taquicárdica e

Resposta bradicárdica dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias

controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS)... Pg 28 Tabela 5 Lipoperoxidação de membranas avaliada pelas substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido cardíaco dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas

sedentárias (VOS)... Pg 30 Tabela 6 Concentração da catalase (CAT), atividade da superóxido dismutase

(SOD) e da glutationa peroxidase (GPx) no tecido cardíaco dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas

ooforectomizadas sedentárias (VOS)... Pg 31 Tabela 7 Lipoperoxidação por substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS) no tecido renal dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias

Tabela 8 Concentração da catalase (CAT) e atividade da superóxido dismutase (SOD) e da glutationa peroxidase (GPx) no tecido renal dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas

ooforectomizadas sedentárias (VOS)... Pg 32 Tabela 9 Lipoperoxidação de membranas avaliada pelas substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido muscular (gastrocnêmio) dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e

velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS)... Pg 33 Tabela 10 Concentração da catalase (CAT) e atividade da superóxido dismutase

(SOD) e da glutationa peroxidase (GPx) no tecido muscular dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas

ooforectomizadas sedentárias (VOS)... Pg 34 Tabela 11 Velocidade máxima no teste de esforço inicial e final dos grupos de ratas

velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e ratas velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 36 Tabela 12 Pressão arterial sistólica (PAS), Pressão arterial Diastólica (PAD),

Pressão arterial média (PAM) e Frequência cardíaca (FC) dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e ratas velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 38 Tabela 13 Sensibilidade dos pressorreceptores para as respostas taquicárdicas e

respostas bradicárdicas dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas

sedentárias (VOS) e ratas velhas ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 40 Tabela 14 Lipoperoxidação por Quiluminescência (QL) e pelas substâncias

reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido cardíaco dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 42 Tabela 15 _{Concentração da Catalase (CAT) e atividade da Superóxido dismutase}

(SOD) e da Glutationa Peroxidase (GPx)no tecido cardíaco dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT)...

Tabela 16 Lipoperoxidação por Quiluminescência (QL) e pelas substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido renal dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e ratas velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 43 Tabela 17 Concentração da Catalase (CAT) e atividade da Superóxido dismutase

(SOD) e da Glutationa Peroxidase (GPx) no tecido renal dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 44 Tabela 18 Lipoperoxidação por Quiluminescência (QL) e pelas substâncias

reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido muscular dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e ratas velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 45 Tabela 19 Concentração da Catalase (CAT) e atividade da Superóxido dismutase

(SOD) e da Glutationa Peroxidase (GPx) no tecido muscular dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas

LISTA DE FIGURAS E QUADROS

Figura 1 Foto mostrando ratos submetidos a protocolo de treinamento físico em

esteira ergométrica na USJT... Pg 13 Figura 2 Aparelhos utilizados para determinação dos níveis de glicemia e

triglicérides sanguíneos... Pg 14 Figura 3 À esquerda: posição anátomo-cirúrgica da canulação de artéria e veia

femoral. No centro e à direita: o feixe vásculo nervoso, composto pela veia femoral esquerda, artéria femoral esquerda e nervo femoral

esquerdo; esquema da canulação... Pg 15 Figura 4 Fotografia mostrando o sistema de registro de pressão arterial. Pg 16

Figura 5

Registro da pressão arterial e freqüência cardíaca antes e após a administração de drogas vasoativas, onde se observa a resposta reflexa

dos pressoreceptores... Pg 17 Figura 6 Peso corporal inicial e final dos grupos de ratas adultas controles

sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; # p<0,05 vs. OS; ¥ p<0,05 vs. Peso corporal

inicial... Pg 23 Figura 7 Velocidade máxima no teste de esforço inicial e final dos grupos de ratas

adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; # p<0,05 vs. OS; ¥ p<0,05 vs. TE

inicial... Pg 24 Figura 8 Glicemia dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas

ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e

velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS)... Pg 25 Figura 9 Triglicérides sanguíneos dos grupos de ratas adultas controles sedentárias

(CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) p<0,05 vs.

Figura 10 Pressão arterial média (PAM) dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS).

p<0,05 vs. CS; † p<0,05 vs. VC... Pg 27 Figura 11 Sensibilidade dos pressorreceptores avaliadas pelas respostas

taquicárdicas dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; #

p<0,05 vs. OS... Pg 28 Figura 12 Sensibilidade dos pressorreceptores avaliadas pelas respostas

bradicárdicas dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC), velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; #

p<0,05 vs. OS... Pg 29 Figura 13 Substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) do tecido cardíaco

dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; # p<0,05 vs.

OS... Pg 30 Figura 14 Substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) do tecido renal dos

grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; # p<0,05 vs.

OS... Pg 32 Figura 15 Figura 15: Substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) do

tecido muscular dos grupos de ratas adultas controles sedentárias (CS), adultas ooforectomizadas sedentárias (OS), velhas sedentárias controles (VC) e velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS). p<0,05 vs. CS; #

p<0,05 vs. OS... Pg 33 Figura 16 Peso corporal inicial e final dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas

sedentárias (VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 35 Figura 17 Velocidade máxima no teste de esforço inicial e final dos grupos de ratas

velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas ooforectomizadas

Figura 18 Glicemia dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS)

e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT)... Pg 37 Figura 19 Triglicérides sanguíneos dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas

sedentárias (VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT). p<0,05 vs. VOS...

Pg 37 Figura 20 Pressão arterial média (PAM dos grupos de ratas velhas

ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas

(VOT). p<0,05 vs. VOS... Pg 39

Figura 21

Frequência cardíaca (bpm) dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT). p<0,05

vs. VOS... Pg 39 Figura 22 Sensibilidade dos pressorreceptores avaliadas pelas respostas

taquicárdicas dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias

(VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT). p<0,05 vs. VOS... Pg 40 Figura 23 Sensibilidade dos pressorreceptores avaliadas pelas respostas

bradicárdicas dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias

(VOS) e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT). p<0,05 vs. VOS... Pg 41 Figura 24 Substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido cardíaco

dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT). p<0,05 vs. VOS... Pg 42 Figura 25 Substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido renal dos

grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas

ooforectomizadas treinadas (VOT). p<0,05 vs. VOS... Pg 44 Figura 26 Substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico (TBARS) no tecido muscular

dos grupos de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS) e velhas

LISTA DE ABREVIATURAS

CAT: Catalase

CS: adultas Controles Sedentárias

DCV: Doença Cardiovascular

DTNB: Ácido Ditionitrobenzóico ERO: Espécies Reativas de Oxigênio EPM: Erro Padrão da Média

EPM: Erro padrão da média FC: Frequência cardíaca

GPx: Glutationa Peroxidase

OS: Adultas Ooforectomizadas sedentárias OT: Adultas Ooforectomizadas treinadas PA: Pressão arterial

PAD: Pressão arterial diastólica PAM: Pressão arterial média PAS: Pressão arterial sistólica

QL: Quimiluminescência

SBR: Sensibilidade barorreflexa SOD: Superóxido Dismutase

t-BOOH: Hidroperóxido de Tert-Butil

TBARS: Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

VC: Velhas controles sedentárias VOS: Velhas ooforectomizadas

RESUMO

O envelhecimento e a privação dos hormônios ovarianos são associados com aumento do risco cardiovascular. Por outro lado o treinamento físico aeróbio tem sido recomendado na prevenção e tratamento de várias condições fisiopatológicas. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do envelhecimento em parâmetros cardiovasculares e de estresse oxidativo em ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos, bem como o papel do treinamento físico nesta condição. Foram utilizadas 16 ratas adultas e 24 ratas velhas Wistar divididas em 5 grupos (n=8 em cada grupo): adultas controle (CS); adultas ooforectomizadas sedentárias (OS); velhas sedentárias controle (VC); velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS); e velhas ooforectomizadas treinadas (VOT). A ooforectomia foi realizada pela retirada bilateral dos ovários. O treinamento foi realizado em esteira rolante durante 8 semanas. A pressão arterial (PA) e a frequência cardíaca (FC) foram avaliadas pelo registro direto da PA através de um sistema de aquisição de dados.A sensibilidade barorreflexa (SBR) foi avaliada pelas respostas taquicárdicas (RT) e bradicárdicas (RB). O perfil oxidativo foi avaliado pela medidas de lipoperoxidação por Quiluminescência iniciada por tbooh (QL) e pelas substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e pela determinação das enzimas antioxidades catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidades (GPx) nos tecidos ventricular (VE), muscular e renal. O peso corporal foi maior nas ratas velhas (VC e VOS) e nas adultas ooforectomizadas (OS) em relação ao grupo CS. Observou-se aumento da capacidade física no grupo VOT em relação ao grupo VOS. Os triglicérides sanguíneos foram maiores nos grupos VC e VOS quando comparado ao grupo CS e o grupo VOT apresentou valores reduzidos desse parâmetro em comparação ao grupo VOS. O envelhecimento induziu aumento da PA diastólica. Houve aumento da PAM no grupo OS (124±1,3 mmHg) em relação ao grupos CS (110±2,8mmHg). O grupo VOS (130±5,05 mmHg) apresentou valores maiores quando comparado aos grupos CS e VC (116±2,5 mmHg), no entanto, o grupo VOT (112±2,7 mmHg) diminuiu os valores de PAM quando comparado ao grupo VOS. Não houve diferença na FC entre os grupos sedentários, todavia o treinamento físico promoveu bradicardia de repouso (VOT: 344±3,8 vs. VOS: 384±10,7 bpm). A SBR estava atenuada nos grupos OS e VC em relação ao grupo CS. Nas RB e RT houve um prejuízo adicional no grupo VOS (0,68±0,06 e -1,07±0,12 bpm/mmHg) quando comparado ao grupo OS (-1,10±0,11 e -2,09±0,19 bpm/mmHg). O grupo VOT (-1,49±0,14 e -3,16±0,35 bpm/mmHg) apresentou atenuação do prejuízo nas respostas RB e RT em relação ao grupo VOS. O TBARS no VE foi maior no grupo OS (3,92±1,19 µmol/mg proteína) comparado com os grupos CS (2,88±1,13 µmol/mg proteína), VC (2,15±0,56 µmol/mg proteína) e VOS (2,33±0,40 µmol/mg proteína). A CAT no VE estava reduzida no grupo OS quando comparado ao CS e a GPx estava reduzida no grupo VOS em relação aos grupos OS e VC. O grupo VOT reduziu os valores de TBARS e de QL (VOT: 1666 ±223 vs. VOS: 2080±223 cps/mg proteína), além de aumentar a CAT no VE. No tecido renal o TBARS estava aumentado nos grupos OS (3,04±0,13 µmol/mg proteína) e VOS (2,81±0,08 µmol/mg proteína) quando comparado com o grupo CS (1,69±0,09 µmol/mg proteína) e VC (2,30±0,07 µmol/mg proteína). A CAT estava reduzida após a ooforectomia nos grupos OS e VOS em relação aos grupos CS e VC. O grupo VOS apresentou redução da SOD quando comparado com o grupo OS. O grupo VOT apresentou redução no TBARS renal quando comparado ao grupo VOS. O treinamento físico induziu aumento dos valores das enzimas CAT, SOD e GPx em relação ao grupo VOS no tecido renal. No tecido muscular, o grupo OS (5,64±0,74 µmol/mg proteína) e VOS (3,52±0,35 µmol/mg proteína) apresentaram aumento do TBARS quando comparado ao seus grupos controles (CS: 2,35±0,27 e VC: 1,88±0,25 µmol/mg proteína). A GPx estava diminuída no grupo OS e VOS em relação aos grupos CS e VC. A QL e o TBARS estavam reduzidos e a GPx aumentada no tecido muscular do grupo VOT em

induziu prejuízo metabólico, na capacidade física e cardiovascular, associado à redução da SBR e aumento da lipoperoxidação em tecido renal. A privação dos hormônios ovarianos em ratas promoveu prejuízo cardiovascular e na SBR (exacerbados pelo envelhecimento), acompanhadas de aumento da lipoperoxidação de membranas e de uma forma geral prejuízo nas enzimas antioxidantes nos tecidos cardíaco, renal e muscular. Entretanto, o achado mais importante do presente estudo foi o efeito benéfico do treinamento físico nas ratas velhas submetidas à privação dos hormônios ovarianos, evidenciado por melhora cardiovascular associada a aumento da SBR, redução da lipoperoxidação de membranas e aumento das enzimas antioxidantes nos tecidos avaliados.

ABSTRACT

Aging and ovarian hormone deprivation are associated with increased cardiovascular risk. On the other hand, the aerobic exercise training has been recommended in the prevention and treatment of various pathophysiological conditions. In this sense, the objective of this study was to investigate the effects of aging on cardiovascular and oxidative stress parameters in female rats submitted to ovarian hormone deprivation, as well as the role of exercise training in this condition. Sixteen adult female Wistar rats and 24 aged Wistar rats were divided into five groups (n = 8 in each group): adult control (CS), ovariectomized sedentary (OS), aged sedentary control (VC), aged ovariectomized sedentary (VOS) and aged ovariectomized trained (VOT). Ovariectomy was performed by bilateral ovaries removal. The exercise training was performed on a treadmill for 8 weeks. Blood pressure (BP) and heart rate (HR) were evaluated by recording direct through a PA system for data acquisition. The baroreflex sensitivity (SBR) was evaluated by tachycardic (RT) and bradycardic (RB) responses. The oxidative profile was evaluated by measurement of lipid peroxidation (chemiluminecencia initiated by tbooh (CL) and by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and determination of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidases (GPx) antioxidades enzymes in ventricular (LV), muscle and renal tissues. Body weight was higher in aged rats (VC and VOS) and in ovariectomized (OS) as compared to CS group. The physical capacity was increased in VOT group compared to the VOS group. Blood triglycerides were higher in VC and VOS groups when compared to CS group; and VOT group showed reduced values of this parameter compared to the VOS group. The diastolic AP was increased by aging. There was a mean AP (MAP) increase in the OS group (124 ± 1.3 mmHg) compared to CS group (110 ± 2.8 mmHg). The VOS group (130 ± 5.05 mmHg) had higher MAP values compared to the CS and VC group (116 ± 2.5 mmHg), however, the VOT group (112 ± 2.7 mmHg) reduced this values when compared to VOS group. There was no difference in HR among sedentary groups, however physical training induced resting bradycardia (VOT: 344 ± 3.8 vs. VOS: 384 ± 10.7 bpm). The SBR was attenuated in the OS and VC groups compared the CS group. There were an additional loss in The BR and the TR in the VOS group (-0.68 ± 0.06 and -1.07 ± 0.12 bpm/mmHg) compared to OS group (-1.10 ± 0, 11 and -2.09 ± 0.19 bpm/mmHg). The VOT group (-1.49 ± 0.14 and -3.16 ± 0.35 bpm/mmHg) showed attenuation of these impaired responses in relation to the VOS group. The TBARS in LV was higher in the OS group (3.92 ± 1.19 µmol/mg protein) compared with the CS group (2.88 ± 1.13 µmol/mg protein), VC (2.15 ± 0.56 µmol/mg protein) and VOS (2.33 ± 0.40 µmol/mg protein). The CAT in LV was reduced in the OS when compared to CS group and the GPx was reduced in the VOS group in relation to OS and VC groups. The VOT rats reduced TBARS and QL (VOT: 1666 ± 223 vs. VOS: 2080 ± 223 cps/mg protein), and increased CAT in LV. In the renal tissue, the TBARS was increased in OS groups (3.04 ± 0.13 µmol/mg protein) and VOS groups (2.81 ± 0.08 µmol/mg protein) when compared to the CS group (1.69 ± 0.09 µmol/mg protein) and VC (2.30 ± 0.07 µmol/mg protein). The CAT was reduced after ovariectomy in the OS and VOS groups compared to CS and VC groups. The VOS group presented a reduction in SOD compared to SO group. The VOT group showed a reduction in renal TBARS when compared to VOS. Physical training induced an increase in the levels of CAT, SOD and GPx in relation to the VOS group in renal tissue. In muscle tissue, the SO group (5.64 ± 0, 74 µmol/mg protein) and VOS (3.52 ± 0.35 µmol/mg protein) showed an increase in TBARS when compared with their control groups (CS: 2.35 ± 0.27 and VC: 1.88 ± 0.25 µmol/mg protein). The GPx was decreased in the VOS and OS group when compared to CS and VC groups. QL and TBARS were reduced and GPx were increased in muscle tissue in VOT group compared to VOS group. In conclusion, these findings demonstrate that the aging in rats induced metabolic, physical capacity and cardiovascular impairments associated with reduced BRS and increased lipid peroxidation in renal tissue. The ovarian hormones deprivation in rats promoted cardiovascular and SBR impairments (exacerbated by aging), accompanied by increased membrane lipid peroxidation

most important finding of this study was the beneficial effects of exercise training in aged rats submitted to ovarian hormone deprivation, demonstrated by cardiovascular improvement associated with SBR increase, reduction in membrane lipid peroxidation and increase in antioxidant enzymes in studied tissues.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E QUADROS LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVATURAS RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO... 1

1.1.Envelhecimento e doença cardiovascular... 1

1.2.Doença cardiovascular e menopausa... 4

1.3. Treinamento Físico e doença cardiovascular... ₅

2. OBJETIVOS... 9 2.1. Objetivo Geral... 9 2.2. Objetivos Específicos... 9 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 10 3.1 Animais e Grupos... 10 3.2 Sequência Experimental... 11 3.3 Ooforectomia Bilateral... 12

3.4 Teste de Esforço Máximo... 12

3.5 Treinamento Físico... 13

3.6 Determinação dos Níveis de Glicose e Triglicérides Sanguíneos... 13

3.7 Avaliações Hemodinâmicas Sistêmicas... 14

3.7.1. Canulação... 14

3.7.2 Registro de Pressão Arterial e Frequência Cardíaca... 15

3.8 Eutanásia dos Animais... 18

3.9 Estresse Oxidativo e Enzimas Oxidantes... 18

3.10 Análise dos Dados ... 21

4. RESULTADOS ... 22 4.1 Protocolo 1... 4.1.1 Peso Corporal... 22 4.1.2. Capacidade Física... 23 4.1.3 Avaliações Metabólicas... 24 4.1.3.1 Glicemia... 24 4.1.3.2 Triglicerídeos... 25 4.1.4 Avaliações Cardiovasculares... 26

4.1.4.1. Pressão Arterial e Frequência Cardíaca... 26

4.1.4.2 Avaliação da Sensibilidade dos Pressorreceptores... 28

4.1.5 Avaliações de Estresse Oxidativo... 29

4.2 Protocolo 2... 35 4.2.1. Peso Corporal... 35 4.2.2 Capacidade Física... 35 4.2.3 Avaliações Metabólicas... 36 4.2.3.1 Glicemia... 36 4.2.3.2 Triglicerídeos... 37 4.2.4 Avaliações Cardiovasculares... 38

4.2.4.1. Pressão Arterial e Frequência Cardíaca... 38

4.2.4.2 Avaliação da Sensibilidade dos Pressorreceptores... 40

5. DISCUSSÃO ... ₄₇ 5.1. Protocolo 1... ₄₇ 5.2. Protocolo 2... ₅₄ 6. CONCLUSÕES... 66 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 67 8. ANEXOS... 85

1. INTRODUÇÃO

1.1 Envelhecimento e doença cardiovascular

O envelhecimento populacional e a longevidade são crescentes tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento. Esse aumento pode ser, em parte, explicado pela diminuição da mortalidade e consequentemente o aumento da expectativa de vida, além da diminuição na taxa de fecundidade (PAPALÉO NETTO,1996).

No Brasil, o aumento no número de idosos (PAPALÉO NETTO,1996) é acompanhado pelo aumento significativo da prevalência de doenças crônicas, dentre elas as DCV que são a primeira causa de morte entre os sexos em todas as regiões do país (TIMERMAN et al., 2001; BRANDÃO et al., 2003). Em relatório mais recente da American Heart Association foi observado em mais de 80 milhões de americanos que uma pessoa em cada três possuía algum tipo de doença cardiovascular (DCV), sendo esta responsável por quase 900 mil mortes (ROSAMOND et al., 2008).Além disso, essas doenças que normalmente perduram por alguns anos, requerem expressiva utilização dos serviços de saúde, acarretando em um maior gasto com a saúde pública (VERAS, 2003;PAIXÃO Jr.& REICHENHEIM, 2005).

A maior incidência de DCV em idosos provavelmente está associado ao processo de envelhecimento, porque neste período o sistema cardiovascular sofre uma série de alterações tais como diminuição do desempenho cardíaco, da distensibilidade da aorta e das grandes artérias, hipertrofia e dilatação do ventrículo esquerdo e disfunção dos mecanismos neuro-humorais de controle cardiovascular, fatores que em conjunto estão normalmente associados ao desenvolvimento de hipertensão, doença coronariana e insuficiência cardíaca (NETTO, 2004; IRIGOYEN et al., 2000; WICHI et al., 2009; MOSTARDA, et al., 2009).

Estudos vêm demonstrando que a hiperatividade do sistema nervoso simpático aumenta o risco cardiovascular, ao passo que uma função vagal preservada ou aumentada tem sido considerada um fator de proteção cardiovascular (TASK FORCE, 1996; KLEIGER et al., 1987). Vários trabalhos experimentais e clínicos têm evidenciado que a disautonomia está presente em uma série

de doenças, tais como, a hipertensão arterial, a insuficiência cardíaca, o diabetes e a síndrome metabólica (IRIGOYEN & KRIEGER, 1998; ZANCHETTI & MANCIA, 1991; LA ROVERE et al., 1998; EWING et al., 1980; VINIK et al., 2003; DE ANGELIS et al., 2004; FARAH et al., 2007).No envelhecimento, estudos têm demonstrado redução na atividade parassimpática para o nodo sino-atrial aumento na atividade simpática para o coração e para o sistema vascular, além de disfunção do barorreflexo (MARK, 1995; ECKBERG,1971; WERNER et al., 1995).

Em nosso grupo, temos evidenciado a importância das alterações no controle autonômico no desenvolvimento das disfunções cardiovasculares relacionadas ao desenvolvimento das DCV em ratos machos hipertensos, com insuficiência cardíaca, diabéticos ou velhos (DE ANGELIS et al., 2006; BERTAGNOLLI et al., 2008; RABELO et al., 2001; DALL´AGO et al., 2007; DE ANGELIS et al., 2001; WERNER, et al. 1995; DE ANGELIS et al, 1997). Dessa forma, considerando a relação entre disautonomia e DCV tanto em estudos clínicos quanto experimentais, intervenções no sentido de detectar, prevenir e/ou atenuar a disfunção autonômica cardiovascular tem sido vistas como novas e/ou importantes estratégias no manejo das DCVs (LA ROVERE et al., 2002).

Além disto, o declínio nas funções fisiológicas que levam à morbidade e mortalidade no envelhecimento tem sido também associado com aumento no estresse oxidativo (AMES, 1993, ASGHAR et al., 2007; SONG et al., 2009). As espécies reativas de oxigênio (ERO) são substâncias que apresentam alta reatividade para outras biomoléculas, principalmente lipídios e proteínas das membranas celulares e para o DNA. Todas as células aeróbias possuem mecanismos para combater os efeitos agressivos das ERO, que incluem as enzimas superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx) e o sistema não enzimático (DORMANDY, 1978; SIES, 1986).As ERO promovem estresse oxidativo quando as defesas antioxidantes da célula são insuficientes para deter a produção pró-oxidante (NORDMANN, 1994).

Um número crescente de trabalhos tem demonstrado o papel fundamental do estresse oxidativo na patogênese das DCVs (CAI& HARRISON, 2000). A geração de ERO em maiores

quantidades causa uma diminuição do óxido nítrico (NO) biodisponível, o que induz prejuízo na função endotelial e cardíaca (PANZA et al., 1990). O NO pode ser destruído pelo radical superóxido e protegido por mecanismos antioxidantes como a enzima SOD (RUBANYI & VANHOUTE, 1986; GRYGLEWSKI et al., 1986). A disfunção da vasodilatação dependente do endotélio, associadas ao aumento do estresse oxidativo, particularmente com a maior produção do radical superóxido, tem sido observada em pacientes com hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes, fumantes, e até mesmo no processo fisiológico do envelhecimento (BERRY et al., 2001; CAI & HARRISON, 2000; ORIEN et al., 1999).

É importante destacar que em trabalhos de nosso grupo a redução do estresse oxidativo e o aumento das enzimas antioxidantes foram correlacionados com melhora em parâmetros cardiovasculares e autonômicos, como a sensibilidade dos pressorreceptores, em ratos machos com insuficiência cardíaca, hipertensos ou velhos (DE ANGELIS et al., 1997; RABELO et al., 2001; BERTAGNOLI et al., 2006). Mais recentemente, em função do aumento da prevalência de DCV no sexo feminino (NATIONAL CENTER FOR HEALTH STATISTICS, 1997; MOSCA et al., 2007) temos estudado o papel do sistema nervoso autônomo no controle cardiovascular em ratas fêmeas adultas saudáveis (BRITO et al., 2008;SANCHES et al., 2009) e submetidas à privação dos hormônios ovarianos (IRIGOYEN et al., 2005; SOUZA et al., 2007; HEEREN et al., 2009; FLUES et al., 2010; FLORES et al., 2010). Resultados do nosso grupo sugerem a importância da função autonômica no manejo do risco cardiovascular no sexo feminino, bem como o estresse oxidativo como um possível mecanismo associado às disfunções cardiovasculares no sexo feminino. Todavia, são escassos na literatura estudos da regulação cardiovascular em ratas fêmeas velhas, principalmente após a privação dos hormônios ovarianos.

1.2 Doença cardiovascular na menopausa

Na faixa etária dos 45 a 64 anos, a morte devido às doenças cardiovasculares é maior em homens do que em mulheres. Porém, após os 65 anos, a mortalidade das mulheres por doenças cardiovasculares ultrapassa à dos homens em até 22% (NATIONAL CENTER FOR HEALTH STATISTICS, 1997). Neste contexto, desde 1984, a doença cardiovascular no sexo feminino se tornou mais evidente quando comparada ao sexo masculino, observando-se em ambos os sexos um aumento exponencialmente com o avanço da idade (EVANGELISTA&MCLAUGHLIN, 2009).

Essa diferença em mortalidade cardiovascular entre os sexos pode ser devida a diversos fatores, entre eles diferenças na modulação autonômica cardiovascular. Estudos clínicos e experimentais parecem concordar que o sexo feminino, antes da privação dos hormônios ovarianos, possui maior predomínio vagal e maior sensibilidade dos pressorreceptores e, portanto, maior proteção cardiovascular em relação ao sexo masculino (KUO et al., 1999; HUIKURIet al., 1996; GREGOIRE et al., 1996; LEINWAND, 2003). Entretanto, é importante enfatizar que essa proteção autonômica cardiovascular apresentada pelo sexo feminino é atenuada após a privação dos hormônios ovarianos (KUO et al., 1999). Considerando esses achados, pode–se supor que a disautonomia cardiovascular esteja relacionada à equivalência nas taxas de eventos cardiovasculares entre os sexos após o advento da menopausa (BRENNER, 1988; NCEP, 2001; SINAGRA & CONTI, 2007). Deve-se enfatizar ainda que no climatério é comum se observar na mulher, além de aumentado risco de doenças cardiovasculares, redução na capacidade de exercício, na força muscular e na massa óssea, aumento do peso corporal e da prevalência de diabetes (SOWERS &LA PIETRA, 1995).

Considerando que a taxa de mortalidade devido a doenças cardiovasculares aumentou de 10 para 25% nos anos 60 e 70 em mulheres (CASTANHO et al., 2001) é eminente a necessidade da busca de alternativas terapêuticas para a prevenção e o tratamento da doença cardiovascular na mulher. Neste sentido, vale destacar que apesar não existir um modelo considerado ideal de menopausa em ratos, já que ratas velhas (>18 meses) se mantém ciclando, a maior parte dos

investigadores têm usado ratas fêmeas adultas jovens (6-12 semanas) que são submetidas à retirada bilateral dos ovários (ooforectomia) avaliando os efeitos da privação dos hormônios ovarianos de 3 a 5 semanas após o procedimento cirúrgico (MOIEN-AFSJHARI et al., 2003). Em nosso grupo, demonstramos que as ratas com aproximadamente 9-10 semanas de vida submetidas à ooforectomia apresentavam, após 9 semanas de acompanhamento (18 semanas de vida), aumento do peso corporal, da pressão arterial e redução da sensibilidade dos pressoreceptores. Essas alterações cardiovasculares foram correlacionadas ao aumento do estresse oxidativo (desbalanço entre a produção de radicais livres e as defesas antioxidantes) no coração (IRIGOYEN et al., 2005; SOUZA et al., 2007). Todavia, esse modelo de avaliação dos efeitos da ooforectomia ao utilizar ratas adultas não permite avaliar os efeitos do envelhecimento presentes na mulher na menopausa. Assim, no presente projeto propomos a avaliação dos efeitos da privação dos hormônios ovarianos não só em ratas adultas, mas também em ratas velhas, o que permitirá uma melhor compreensão dos efeitos do envelhecimento, da menopausa e de sua associação no aumento do risco cardiovascular no sexo feminino. Além disto, cabe lembrar que atualmente os efeitos de proteção cardiovascular através da terapia hormonal são controversos (WRITING GROUP FOR THE WOMEN`S INITIATIVE INVESTIGATORS, 1996). Em contrapartida, os benefícios obtidos através da atividade física regular vêm cada vez mais reforçando a importância desta abordagem na prevenção e no tratamento de doenças (PEDERSEN & SALTIN, 2006; MOSCA et al., 2007).

1.3 Treinamento físico e doença cardiovascular

O sedentarismo tem sido demonstrado como um importante fator de risco cardiovascular na sociedade moderna, sendo no Estado de São Paulo mais prevalente (69%) do que o fumo (38%), a hipertensão (22%), a obesidade (18%) e o alcoolismo (8%) (REGO et al., 1990). Neste aspecto, a inatividade física, que é mais prevalente entre as mulheres após a menopausa (SOWERS &LA PIETRA, 1995), duplica o risco de doença coronariana, efeito esse similar em magnitude ao do tabagismo e hipertensão (NIEMAN, 1999).

As alterações morfológicas e funcionais no sistema cardiovascular, no equilíbrio glicêmico e no controle autonômico com o avanço da idade resultam em diminuição da capacidade de realizar atividade física com o avanço da idade tanto em homens quanto em mulheres (HOSSACK et al., 1982). Dessa forma, a recomendação de exercício tem sido sugerido para promoção da saúde e prevenção de doenças, tanto para adultos com a idade entre 50-64 quanto para adultos com mais de 65 anos que apresentam alguma doença crônico degenerativa ou limitações funcionais (NELSON et al., 2007).

De uma forma geral, o exercício físico induz vários benefícios, tais como: aprimoramento na função cardiovascular e respiratória, redução nos fatores de risco para doença arterial coronariana (DAC), redução na morbimortalidade, melhora na aptidão física geral, diminuição da ansiedade e depressão. Somado a isso, o treinamento físico pode proporcionar sensações de bem-estar, melhora do desempenho nas atividades laborativas, além de ser utilizado na reabilitação física e metabólica (ALMEIDA, 2007; ACSM, 2003).

Há evidências de que os efeitos agudos ou crônicos do exercício físico trazem benefícios cardiovasculares, metabólicos, autonômicos e psicológicos, fato esse que tem levado muitos investigadores a sugeri-lo como uma conduta não farmacológica importante na prevenção e no tratamento da hipertensão arterial, mesmo em diferentes situações associadas, como na insuficiência cardíaca, no diabetes, na resistência à insulina e na obesidade (ACSM, 2003; FORJAZ et al., 2003; IRIGOYEN et al., 2003; RONDOM & BRUM, 2003; WILLIAMS et al., 2002; MACDONALD et al., 2000; GORDON et al., 1997; TIPTON, 1991; WALLBERG et al., 1988; JENNINGS et al., 1986).

O treinamento físico pode provocar alterações cardiovasculares e autonômicas importantes, tais como bradicardia de repouso (NEGRÃO et al., 1992; DE ANGELIS et al., 1997, 1999, 2004; KATONA et al., 1982; FRICK, 1967), redução da pressão arterial (PA) em indivíduos idosos (HASKELL, 2007)e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) (SILVA et al., 1997; BERTAGNOLLI et al., 2006), melhora da sensibilidade dos pressoreceptores em sujeitos

normotensos (MC`DONALD et al., 1993; BARNEY et al., 1988, DE ANGELIS et al., 2004; NEGRÃO et al., 1992; BEDFORD & TIPTON, 1987) e em ratos SHR e diabéticos (SILVA et al., 1997; BERTAGNOLLI et al., 2006; HARTHMANN et al., 2007). Além disto, estudos demonstraram adaptações das enzimas antioxidantes e redução do estresse oxidativo em resposta ao treinamento físico (JI & FU, 1992; MARGARATIS et al., 1997; VENDITTI & DI MEO, 1997; DE ANGELIS et al., 1997; IRIGOYEN et al., 2005; BERTAGNOLLI et al., 2006).

Apesar dos vários trabalhos evidenciando os benefícios do treinamento físico, a maioria desses estudos foram realizados em amostras do sexo masculino. Em estudos mais recentes tem sido demonstrado que treinamento físico aeróbio pode induzir melhora no perfil metabólico e lipídico, reduzir a inflamação e as moléculas de adesão (WEGGE et al., 2004) e aumentar a variabilidade da frequência cardíaca (VFC) (JURCA et al., 2004) em mulheres menopausadas (ASIKAINEN et al., 2004), bem como melhorar a resposta da insulina estimulada pelo teste de tolerância a glicose em ratas ooforectomizadas (LATOUR et al., 2001). Um trabalho de nosso laboratório evidenciou que o treinamento físico aeróbio em um modelo experimental de menopausa em ratas adultas (~18 semanas de idade) induziu aumento da capacidade aeróbia, redução do peso corporal, da PA e da FC de repouso e melhora na sensibilidade dos pressorreceptores associada à redução no estresse oxidativo e ao aumento nas defesas antioxidantes no tecido cardíaco (IRIGOYEN et al., 2005). Melhora cardiovascular também foi observada em camundongas knockout para o receptor LDL-colesterol ooforectomizadas após treinamento físico (HERREN et al., 2009), em ratas ooforectomizadas treinadas e submetidas à terapia de reposição de estradiol (FLUES et al. 2010), ratas infartadas treinadas (FLORES et al., 2010) ou em ratas diabéticas ooforectomizadas (SOUZA et al., 2007), sendo que neste último estudo observamos redução da mortalidade após o período de treinamento físico.

Considerando o importante papel da disautonomia como fator de risco de doença cardiovascular, bem como o possível envolvimento do estresse oxidativo nesta disfunção, intervenções que reduzam o estresse oxidativo e/ou melhorem a função autonômica tem sido

vistas como potenciais estratégias no manejo do risco cardiovascular. Vale lembrar que o treinamento físico dinâmico aeróbio em situações fisiológicas e fisiopatológicas em modelos animais (ratos machos e mais recentemente em fêmeas ooforectomizadas) melhora a regulação autonômica cardiovascular, possivelmente por redução do estresse oxidativo (DE ANGELIS et al, 1997, IRIGOYEN et al, 2005, BERTAGNOLLI et al., 2006). Todavia, deve-se considerar que a maior parte dos trabalhos publicados na literatura com relação aos efeitos autonômicos do treinamento físico em animais e humanos, assim como todos os nossos estudos citados acima, foi realizada em amostras do sexo masculino, normalmente em idade reprodutiva. Além disto, conforme comentado anteriormente os estudos publicados pelos diferentes grupos de pesquisa submeteram ratas à cirurgia de ooforectomia com idade em torno de 2-3 meses, ficando a dúvida se a privação dos hormônios ovarianos em ratas velhas (com mais de 18 meses) induziria efeitos semelhantes, ou se o processo natural de envelhecimento agravaria as disfunções decorrentes da ooforectomia. Neste sentido, o presente projeto visa avaliar os efeitos do envelhecimento em parâmetros cardiovasculares e de estresse oxidativo em ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos, bem como o papel do treinamento físico nesta condição.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O objetivo geral do presente estudo foi investigar os efeitos do envelhecimento em parâmetros cardiovasculares e de estresse oxidativo em ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos, bem como o papel do treinamento físico nesta condição.

2.2 Objetivos Específicos

Os objetivos específicos do presente estudo foram avaliar:

1) os efeitos da privação dos hormônios ovarianos em ratas adultas e em ratas velhas na pressão arterial, na frequência cardíaca, na sensibilidade dos pressorreceptores e em parâmetros de estresse oxidativo (protocolo 1).

2) os efeitos do treinamento físico em ratas velhas submetidas à privação dos hormônios ovarianos na pressão arterial, na frequência cardíaca, na sensibilidade dos pressorreceptores e em parâmetros de estresse oxidativo (protocolo 2).

3. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade São Judas Tadeu sob parecer A003/2010 (Anexo 1).

3.1 AMOSTRA

Foram utilizadas 16 ratas Wistar com 3 meses de idade (adultas) e 24 ratas Wistar com aproximadamente 18 meses(velhas) no início do protocolo, provenientes do biotério da Universidade São Judas Tadeu. Os animais foram mantidos em gaiolas, contendo no máximo 4 animais em cada uma, em ambiente com temperatura controlada (220 - 240C) e com luz controlada em ciclo de 12 horas (claro – escuro, invertido). Água e comida foram oferecidas de modo irrestrito, sendo que a dieta foi normoprotêica (12% de proteínas).

Para cumprir os objetivos propostos, este trabalho foi dividido em 2 protocolos.

PROTOCOLO 1

Para avaliar os efeitos da privação dos hormônios ovarianos em ratas adultas e em ratas velhas na pressão arterial, na frequência cardíaca, na sensibilidade dos pressorreceptores e em parâmetros de estresse oxidativo foram comparados os seguintes grupos (n=8 em cada grupo):

 Grupo de ratas adultas controle (CS): ratas com 3 meses de idade no início do protocolo que foram acompanhadas durante 9 semanas.

 Grupo de ratas velhas sedentárias controle (VC): ratas com 18 meses de idade no início do protocolo que foram acompanhadas durante 9 semanas.

 Grupo de ratas adultas ooforectomizadas sedentárias (OS): ratas com 3 meses de idade no início do protocolo que foramsubmetidas a ooforectomia e acompanhadas durante 9 semanas.

 Grupo de velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS): ratas com 18 meses de idade no início do protocolo que foramsubmetidas a ooforectomia e acompanhadas durante 9 semanas.

PROTOCOLO 2

Para investigar os efeitos do treinamento físico aeróbio em ratas velhas submetidas à privação dos hormônios ovarianos na pressão arterial, na frequência cardíaca, na sensibilidade dos pressorreceptores e em parâmetros de estresse oxidativo, foram avaliados os seguintes grupos (n=8 em cada grupo):

 Grupo de ratas velhas ooforectomizadas sedentárias (VOS): ratas com 18 meses de idade no início do protocolo que foram submetidas a ooforectomia e acompanhadas durante 9 semanas.  Grupo de ratas velhas ooforectomizadas treinadas (VOT): ratas com 18 meses de idade no início

do protocolo que foram submetidas a ooforectomia e após uma semana foram submetidas a treinamento físico em esteira ergométrica rolante durante 8 semanas.

3.2 SEQUÊNCIA EXPERIMENTAL

Os grupos experimentais seguiram a sequência experimental descrita no quadro abaixo

Quadro 1: Sequência experimental do projeto. Dia 1 Dia 2-6 Dia 7 Dia 8 e 36 Dia 74-75 Dia 75... Dia 76... Dia 77... Ooforectomia Bilateral X Adaptação à esteira X

Teste de esforço máximo X X

Início do Programa de

treinamento físico X

treinamento físico

Avaliações Hemodinâmicas

Sistêmicas X

Eutanásia X

Estresse e Enzimas Oxidativas X

3.3 OOFORECTOMIA BILATERAL

As ratas foram anestesiadas (i.p.) com cloridrato de cetamina (50mg/Kg, Ketalar, Parke-Davis) e cloridrato de xilazina (12mg/Kg, Rompum, Bayer) e colocados em decúbito dorsal para que se realize uma pequena incisão (1 cm) em paralelo com a linha do corpo na pele e na musculatura no terço inferior na região abdominal. Os ovários foram localizados e foi realizada a ligadura dos ovidutos, incluindo os vasos sangüíneos. Os ovidutos foram secionados e os ovários removidos. A musculatura e a pele foram suturadas e uma dose de antibiótico foi administrada (Benzetacil, 40 000 U/Kg, i.m) (LATOUR et al., 2001; IRIGOYEN et al., 2005).

3.4 TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO

Todos os animais estudados foram submetidos a um teste de esforço máximo em esteira ergométrica (após adaptação de no mínimo 5 dias a 0,3 km/h durante 10 minutos) no início, no meio e no final do programa de treinamento físico. Este teste serviu de base para prescrição do treinamento físico para os grupos treinados bem como pode evidenciar melhora na capacidade de exercício após o período de treinamento físico. O teste consistiu em colocar o animal correndo na esteira a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo esta carga incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até que o animal atingia a exaustão (BROOKS & WHITE, 1978; RODRIGUES et al., 2007). O tempo de teste e a velocidade da última carga foram anotados e serviram para fazer a média de capacidade de exercício de cada grupo.

3.5 TREINAMENTO FÍSICO

Os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de treinamento físico em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva durante 8 semanas (40-70% da velocidade máxima de corrida) 1 vez por dia, 5 dias por semana, conforme descrito no quadro abaixo (IRIGOYEN et al., 2005; SOUZA et al., 2007) (Quadro 2) (Figura 1). Além disto, estudo mostrou que existe correlação entre a velocidade do teste de esforço e o consumo de oxigênio para ratos machos (RODRIGUES et al., 2007).

Quadro 2: Exemplo de protocolo de treinamento físico Semana Duração (min) Velocidade (Km/h) 1ª 15 – 23 0,3 – 0,5 2ª 23 – 50 0,3 – 0,7 3ª 47 – 55 0,3 – 0,7 4ª 55 – 60 0,3 – 0,7 5ª 60 0,3 – 0,9 6ª 60 0,3 – 0,9 7ª 60 0,3 – 0,9 8ª 60 0,3 – 0,9

Figura 1: Foto mostrando ratos submetidos

a protocolo de treinamento físico em esteira ergométricanaUSJT.

3.6 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLICEMIA E TRIGLICÉRIDES SANGUÍNEOS.

Ao final do protocolo os animais foram submetidos a jejum de 4 horas e, após isto foi retirada uma gota de sangue da cauda para análise da glicemia pelo glicosímetro (Accucheck, Roche) e uma gota para medida dos triglicerídeos sanguíneos pelo aparelho Accutrend GTC, Roche (Figura 2).

Figura 2: Aparelhos utilizados para determinação dos níveis de glicemia e triglicérides sanguíneos

Identificação da Fase do Ciclo Estral

A caracterização de cada fase do ciclo será baseada na proporção de três tipos de células na secreção vaginal: epiteliais, corneificadas e leucócitos segundo Marcondes e colaboradores (2002). A secreção vaginal será coletada com uma pipeta plástica com 10µL de solução salina introduzida superficialmente na vagina da rata e será colocada em uma lâmina de vidro para a observação em um microscópio ótico. Tal procedimento será realizado nos grupos não ooforectomizados no dia das avaliações hemodinâmicas e do sacrifício dos animais a fim de garantir que tais procedimentos seja realizados nas fases não ovulatórias do ciclo estral das ratas.

3.7 AVALIAÇÕES HEMODINÂMICAS SISTÊMICAS

As cânulas foram confeccionadas com tubos de Policloreto de Vinila (Abbott) equivalente ao polietileno PE10 e PE50. Estas foram soldados por aquecimento e logo após, as cânulas foram preenchidas com solução fisiológica e mantidas ocluídas com pinos de aço inoxidável (DE ANGELIS et al.,1999; DE ANGELIS et al., 2000a; IRIGOYEN et al., 2005).

No dia anterior aos registros diretos de pressão arterial e freqüência cardíaca, os ratos foram anestesiados (i.p.) com cloridrato de cetamina (50mg/Kg, Ketalar, Parke-Davis) e cloridrato de xilazina (12mg/Kg, Rompum, Bayer) e colocados em decúbito dorsal. Foi realizada uma pequena incisão na região femoral para implantação de uma cânula no interior da aorta abdominal e na veia cava inferior, através da artéria e veia femoral esquerdas, para registro direto da pressão arterial e para administração de drogas, respectivamente. Após a correta e firme implantação das cânulas na artéria e na veia, as extremidades mais calibrosas das cânulas foram passadas subcutaneamente, exteriorizadas no dorso da região cervical e fixadas com fio de algodão na pele.(Figura 3).

Figura 3: À esquerda: posição anátomo-cirúrgica da canulação de artéria e veia femoral. No centro e à

direita: o feixe vásculo nervoso, composto pela veia femoral esquerda, artéria femoral esquerda e nervo femoral esquerdo; esquema da canulação.

Para realização das avaliações hemodinâmicas sistêmicas, a cânula arterial foi conectada a uma extensão de 20 cm (PE-50), permitindo livre movimentação do animal pela caixa, durante todo o período do experimento. Esta extensão foi conectada a um transdutor eletromagnético (Kent Instruments, EUA) que, por sua vez, estava conectado a um pré-amplificador (Stemtech, EUA). Sinais de pressão arterial foram gravados durante um período de 30 minutos em um microcomputador equipado com um sistema de aquisição de dados (Windaq, DATAQ Instruments, Akron, OH, EUA), permitindo análise dos pulsos de pressão, batimento-a-batimento, com uma freqüência de amostragem de 2000 Hz por canal, para estudo dos valores de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca. Os valores de freqüência cardíaca foram derivados do sinal pulsátil da pressão arterial.(Figura 4).

Figura 4: Fotografia mostrando o sistema de registro de pressão arterial.

A análise dos sinais de PA foi feita utilizando-se programa comercial associado ao sistema de aquisição. Este programa permite a detecção de máximos e mínimos da curva de pressão batimento-a-batimento, fornecendo os valores de PAS e PAD pela integral da área sob a curva no tempo. A FC foi determinada a partir do intervalo entre dois picos sistólicos. Os resultados foram apresentados em valores médios e desvios padrões dos períodos em que os dados foram analisados para PA e FC. As planilhas de

dados obtidas foram analisadas em programa comercial para análise (Excel 5.0), onde se calcularam a média e desvio padrão de PAM, PAS, PAD e FC para cada animal.

3.7.3 Avaliação da Sensibilidade dos Pressorreceptores

Após o registro da pressão arterial e da freqüência cardíaca, uma extensão de aproximadamente 20 cm (PE10) foi conectada na cânula venosa para posterior injeção de drogas vasoativas.

A fenilefrina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA), um potente estimulador 1 cuja ação predominante ocorre nas arteríolas periféricas causando

vasoconstrição, foi usada para provocar aumento da pressão arterial. Esse aumento da pressão arterial é seguido de bradicardia reflexa comandada pelos pressorreceptores.

O nitroprussiato de sódio (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, UA), um potente vasodilatador tanto de arteríolas como de veias e cuja ação ocorre por meio da ativação da guanilato ciclase e aumento da síntese de 3’, 5’- guanosina monofosfato (GMP cíclico) na musculatura lisa de vasos e outros tecidos foi usado para provocar queda da pressão arterial. Essa queda é seguida por uma resposta taquicárdica reflexa comandada pelos pressorreceptores.

Após os animais terem permanecido em condições de repouso por 15 minutos, a sensibilidade dos pressoreceptores foi testada através da infusão de doses crescentes de fenilefrina e de nitroprussiato de sódio. Para avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores, o pico máximo ou mínimo da PAM foi reduzido dos valores de PAM do período controle. Da mesma forma, a variação máxima da FC foi reduzida dos valores de FC do período controle, imediatamente antes da infusão das drogas, para posterior quantificação das respostas. A sensibilidade barorreflexa foi avaliada pelo

índice calculado através divisão da variação da FC pela variação da PAM (DE ANGELIS et al., 1997; 1999; IRIGOYEN et al., 2005) (Figura 5).

Figura 5:Registro da pressão arterial e freqüência cardíaca antes e após a administração de drogas

vasoativas, onde se observa a resposta reflexa dos pressoreceptores.

3.8. EUTANÁSIA DOS ANIMAIS

No dia seguinte ao término das avaliações hemodinâmicas, os animais de ambos os grupos foram sacrificados por decapitação e os órgãos foram retirados e congelados Amostras de coração, rim e gastrocnêmio foram retiradas e utilizadas para analisar o estresse oxidativo e as enzimas oxidantes.

3.9. MEDIDAS DE ESTRESSE OXIDATIVO E ENZIMAS ANTIOXIDANTES Preparação dos Tecidos. O coração foi coletado e homogeneizado durante 30 segundos em um homogeneizador Ultra-Turrax, com KCl 1,15% e fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF), na concentração de 100mmol/L em isopropanol e na quantidade de 10 L/mL de KCl adicionado. Em seguida, os homogeneizados foram centrifugados

PA e FC basais Nitroprussiato de Sódio PA e FC PA e FC basais PA e FC Fenilefrina

por 10 minutos a 3000rpm, em centrífuga refrigerada entre 0 e 4°C (Eppendorf, 5804-R), e o sobrenadante foi congelado em freezer a -70°C para as dosagens (LLESUY et al., 1985).

Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) - Para que ocorra a reação, adicionou-se, a 0,25mL de homogeneizado, 0,75 mL de ácido tricloroacético (TCA) a 10%(P/V), que tem a função de desnaturar as proteínas presentes e acidificar o meio de reação. Essa mistura foi então agitada e centrifugada durante 3 minutos a 1000 g. Foi retirado 0,5mL do sobrenadante e a este foi adicionado 0,5mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,67% (P/V), que reagiu com os produtos da lipoperoxidação formando um composto de coloração rosada. A mistura foi incubada por 15 minutos a 100ºC e em seguida foi resfriada no gelo. Em seguida, foi realizada a leitura da absorbância a 535 nm em espectrofotômetro (BUEGE & AUST, 1978).

Medida de Lipoperoxidação (LPO): Quimiluminescência iniciada por t-BOOH (QL) - O método consiste em adicionar um hidroperóxido orgânico de origem sintética (o hidroperóxido de tert-butil – t-BOOH) ao homogeneizado de tecido, avaliando-se a capacidade de resposta produzida pela amostra. A quimiluminescência foi medida em um contador beta (TriCrab 2800TR, PerkinElmer) com o circuito de coincidência desconectado e utilizando o canal de trítio. As determinações foram realizadas em câmara escura, em frascos de vidro mantidos na penumbra para evitar a fosforescência ativada pela luz fluorescente. O meio de reação no qual foi realizado o ensaio consiste em 3,5 mL de uma solução tampão de fosfatos 20 mmol/L, contendo KCl 140 mmol/L (pH 7,4), à qual foram adicionado 0,5 mL de homogeneizado. Após esse momento, foi realizada uma leitura inicial, considerada como a emissão basal de luz pelo homogeneizado. O hidroperóxido de tert-butila foi usado na concentração de

400 mmol/L, dos quais foram adicionados 30 L no meio de reação para obter-se uma concentração final de 3 mmol/L. Foi medida a emissão de luz e desta foi descontada a emissão basal do homogeneizado para fins de cálculo (GONZALES-FLECHA et al., 1991).

Catalase (CAT)-A taxa de decomposição do peróxido de hidrogênio é diretamente proporcional à atividade da CAT. Desta forma, o consumo de H2O2 pode

ser utilizado como uma medida de atividade da enzima CAT. O ensaio consiste em medir a diminuição da absorbância a 240nm, comprimento de onda onde há a maior absorção pelo peróxido de hidrogênio, utilizando-se cubetas de quartzo. Para a realização das medidas foi usada uma solução tampão constituída de fosfatos a 50 mmol/L em pH 7,4. Foram adicionados 9 L deste tampão e 10 L de amostra de tecido na cubeta do espectrofotômetro, sendo esta mistura descontada contra um branco de tampão fosfato. A seguir foram adicionados 35 L de peróxido de hidrogênio (0,3 mol/L) e foi monitorada a diminuição da absorbância no espectrofotômetro (Biospectro) (BOVERIS & CHANCE, 1973).

Superóxido Dismutase (SOD)- A técnica utilizada está baseada na inibição da reação do radical superóxido com o piragalol. Uma vez que não se consegue determinar a concentração da enzima nem sua atividade em termos de substrato consumido por unidade de tempo, se utiliza a quantificação em unidades relativas. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima que inibe em 50% a velocidade de oxidação do detector. A oxidação do pirogalol leva à formação de um produto colorido, detectado espectrofotometricamente a 420 nm (Biospectro) durante 2 minutos. A atividade da SOD é determinada medindo-se a velocidade de formação do pirogalol oxidado. No meio de reação, foram utilizados 20 L de homogeneizado, 973 L de tampão Tris-Fosfato a 50 mmol/L (pH 8,2), 8 L de pirogalol a 24 mmol/L, 4 L de

CAT a 30 mol/L. Esta curva obtida foi utilizada como branco. Foi também feita uma curva padrão utilizando três concentrações distintas de SOD (0,25U, 0,5U e 1U), através da qual foi obtida a equação da reta para realização dos cálculos.

Glutationa Peroxidase (GPx) - Como a GPx catalisa a reação de hidroperóxidos com glutationa reduzida (GSH) para formar glutationa oxidada (GSSG) e o produto da redução do hidroperóxido, a atividade da enzima pode ser determinada medindo-se o consumo de NADPH na reação de redução acoplada à reação da GPx. A atividade da GPx foi medida em um espectrofotômetro (Biospectro). Foi monitorada a diminuição de absorbância do NADPH a 340 nm. Na cubeta do espectrofotômetro, foram adicionados 330 L de tampão, 50 L do homogeneizado (amostra), 500 L de NADPH, 10 L de azida sódica, 50 L de GSH e 10 L de GR. Foi registrada a absorbância por um período de aproximadamente 2 minutos, para obtenção da linha de base. Após esse momento, foram adicionados 50 L de hidroperóxido de tert-butila, e a diminuição da absorbância devida ao consumo de NADPH foi monitorada por mais 3 minutos (FLOHÉ & GUNZLER, 1984).

3.10 ANÁLISE DOS DADOS

Os resultados são apresentados como média erro padrão da média. O teste de análise de variância (ANOVA) dois caminhos foi devidamente aplicado para análise dos dados, seguido do post hoc de Student Newmann Keuls no protocolo 1. No protocolo 2 os dados foram comparados por ANOVA (peso corporal e TE) e pelo test t de Student. Valores de p<0,05 foram considerados significantes.