REPERCUSSÕES DO CONSUMO DE DIETA
HIPERCOLESTEROLÊMICA E DA RESTRIÇÃO DE SONO SOBRE
PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS MACHOS TRATADOS
DURANTE A MATURAÇÃO SEXUAL
Santos 2012
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências junto ao
Programa de Pós-Graduação
REPERCUSSÕES DO CONSUMO DE DIETA
HIPERCOLESTEROLÊMICA E DA RESTRIÇÃO DE SONO SOBRE
PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS MACHOS TRATADOS
DURANTE A MATURAÇÃO SEXUAL
Santos 2012
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências junto ao
Programa de Pós-Graduação
Interdisciplinar em Ciências da Saúde Orientador: Dr. Odair Aguiar Junior
iii
REPERCUSSÕES DO CONSUMO DE DIETA HIPERCOLESTEROLÊMICA E DA RESTRIÇÃO DE SONO SOBRE PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS
MACHOS TRATADOS DURANTE A MATURAÇÃO SEXUAL
Presidente da banca: Prof. Dr. Odair Aguiar Júnior
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.ª Claudia Cristina Alves Pereira Prof. Dr. Jair Ribeiro Chagas
Prof. Dr. Wellerson Rodrigo Scarano
iv
DEPARTAMENTO DE BIOCIÊNCIAS
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Odair Aguiar Júnior
v
Dedico este trabalho aos meus pais Romilson e Neuma e à minha irmã
Camila, responsáveis por toda a inspiração, motivação e incentivos para
realizar todos os projetos da minha vida
vi
A Deus por todos os dias da minha vida e pelas oportunidades
oferecidas
Aos meus pais por me apoiarem sempre em todas as minhas escolhas,
pela paciência, esforço, por serem meus maiores e melhores exemplos e pelo
amor incondicional
À minha irmã Camila pela disposição e interesse em escutar e
acompanhar cada etapa do meu trabalho e pelo acolhimento em sua casa
toda vez que precisei
Ao meu namorado Rafael pelo apoio, carinho, respeito,
companheirismo e amor que foram muito importantes durante toda esta
jornada
Ao meu eterno amigo, mestre e orientador, Dr. Odair Aguiar Jr, por
ter acreditado em mim, pela oportunidade e por todo o apoio que foram
imprescindíveis para a realização deste trabalho. Muito obrigada por tudo
que me ensinou e saiba que, para mim, professores são eternos!
vii
para este trabalho
Aos colegas do Grupo de Reprodução Vanessa Cardoso, Leonardo
Parreira e Cinthia Nascimento pela assistência em muitos momentos
importantes não somente no laboratório, mas em sala de aula e fora dela
À Prof. Dra. Monica Levy Andersen, do Departamento de
Psicobiologia UNIFESP – Vila Clementino pela paciência, atenção, apoio
e por ter dado condições para realização de diversos experimentos e por
acreditar na minha pesquisa
À colega e pós doutoranda Tathiana Alvarenga pela preciosa ajuda
nos meus experimentos, por me passar tanta segurança nos momentos mais
delicados e pelo exemplo de dedicação e amizade que sempre foi para mim.
Tathi, sua participação foi essencial para o meu trabalho
À Msc. Neuli Tenório por ensinar e dar suporte no preparo da dieta
dos animais
viii
realização de alguns experimentos
A todos os colegas alunos dos Laboratórios de Biologia Molecular e
Biologia do Estresse da UNIFESP – Baixada Santista e dos
Laboratórios do Departamento de Psicobiologia da UNIFESP – Vila
Clementino, pela ajuda em muitas etapas dos meus experimentos, em
especial para o Wederley Januário, Juliana Carvalho e Flávia Egydio
Aos técnicos de laboratório da UNIFESP – Baixada Santista
especialmente Gleidinaldo, Sidney, José Simões e Cristiane pela ajuda em
diversos momentos que precisei
Ao estatístico Fábio pela enorme paciência em me explicar e pelo
ótimo trabalho feito em meus dados
A todos os professores da pós-graduação pelas aulas maravilhosas e
tanto conhecimento transmitido e, com certeza, aprendido por mim
ix
nos momentos burocráticos
À Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP) pelas dosagens
Enfim, a todos que de alguma forma estiveram envolvidos com esse
trabalho e que permitiram assim sua concretização
x
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
principalmente ao Programa de Apoio a Planos de Reestruturação e
Expansão das Universidades Federais (Reuni) por financiar meus estudos
durante esses dois anos, permitindo dedicação exclusiva de minha parte à
realização desta pesquisa e à minha formação. Muito obrigada.
xi
“A ciência é conhecimento organizado. A sabedoria é vida organizada.”
(Immanuel Kant)
xii
Figura 1. Bicamada lipídica 8
Figura 2. Estrutura molecular do colesterol 9
Figura 3. Delineamento experimental... 38
Figura 4. Dieta padrão e dieta hipercolesterolêmica... 39
Figura 5. Tanque de restrição de sono... 41
Figura 6. Câmara de Neubauer... 44
Figura 7. Gráfico do consumo alimentar 54 Figura 8. Gráfico do peso corporal... 55
Figura 9. Gráfico do peso corporal final... 56
Figura 10. Gráfico do ganho de peso... 57
Figura 11. Gráfico do número de espermatozoides no testículo... 60
Figura 12. Gráfico da produção diária de espermatozoides... 61
Figura 13. Gráfico do número de espermatozoides cabeça-corpo do epidídimo... 62
Figura 14. Gráfico da porcentagem de espermatozoides normais... 63
Figura 15. Gráfico da porcentagem de espermatozoides com cabeças soltas... 64
Figura 16. Morfologia da cabeça dos espermatozoides... 65
Figura 17. Anormalidades na cauda dos espermatozoides... 65
Figura 18. Análise histopatológica testicular... 66
Figura 19. Gráfico da altura do epitélio seminífero... 68
Figura 20. Gráfico do diâmetro dos túbulos seminíferos... 68
xiii
Figura 23. Gráfico dos níveis séricos de VLDL... 71
Figura 24. Gráfico dos níveis séricos de triacilglicerol... 71
Figura 25. Gráfico dos níveis séricos de testosterona... 73
Figura 26. Gráfico dos níveis séricos de progesterona... 73
xiv
Tabela 1. Peso corporal inicial, final, ganho de peso e pesos absolutos e relativos dos
órgãos... 59
Tabela 2. Parâmetros espermáticos testiculares e epididimais... 62
Tabela 3. Análises morfológicas testiculares... 67
Tabela 4. Parâmetros bioquímicos sanguíneos... 72
Tabela 5. Dosagens hormonais... 74
xv
ABC A1... Transportador ATP-binding cassete A1 ABP... Proteína ligante de andrógeno
ACTH... Hormônio adrenocorticotrófico APO... Apolipoproteína
CAT... Catalase
CRH... Hormônio liberador de corticotropina CRSD... Circadian rhythm sleep disorders CTRL... Controle
hCG... gonadotropina coriônica humana DHC... Dieta hipercolesterolêmica
DHT... Diidrotestosterona
ERO... Espécie reativa de oxigênio FSH... Hormônio folículo estimulante GH... Hormônio do crescimento
GnRH... Hormônio liberador de gonadotropina GPx... Glutationa peroxidase
GSH... Glutationa reduzida
HDL... Lipoproteína de alta densidade
HMG-CoA redutase. Enzima 3-Hidroxi-3-Metilglutaril Coenzima A redutase HPA... Hipotálamo – Hipófise – Adrenal
xvi IGS... Índice gonadossomático IMC... Índice de massa corporal
LDL... Lipoproteína de baixa densidade LH... Hormônio luteinizante
MDA... Malondialdeído NREM... Sono não REM
OMS... Organização Mundial da Saúde PDE... Produção diária de espermatozoides PS... Privação de sono
REM... Rapid eye movement RS... Restrição de sono SOD... Superóxido dismutase
SR-Bi... Receptor Scavenger classe B tipo I StAR... Proteína steroidogenic acute regulatory VLDL... Lipoproteína de baixíssima densidade
xvii
O consumo de dietas ricas em colesterol e a redução no tempo de sono têm sido condições prevalentes na sociedade moderna, principalmente entre os jovens. Tais fatores podem ser responsáveis por alterações em padrões reprodutivos prejudicando a fertilidade masculina. Objetivo: Este estudo visou avaliar a influência do consumo de dieta hipercolesterolêmica e restrição de sono, atuando separadamente e em conjunto, em parâmetros reprodutivos de ratos machos tratados durante o processo de maturação sexual. Métodos: Utilizaram-se 27 Wistar machos com 21 dias de idade divididos em quatro grupos: controle (CTRL), dieta hipercolesterolêmica (DHC), restrição de sono 7 dias (6 horas/dia) (RS) e dieta hipercolesterolêmica e restrição de sono (DHC+RS). Resultados: O peso corporal final e o ganho de peso foram significativamente menores no grupo DHC+RS e houve aumento significativo nos pesos relativos do testículo e epidídimo nos grupos RS e DHC+RS. A produção diária de espermatozoides (PDE), o número de espermaozoides no testículo e a quantidade de espermatozoides com morfologia normal sofreram queda em todos os grupos tratados. O número de espermatozoides na porção cabeça-corpo do epidídimo sofreu queda em ambos os grupos de consumiram a dieta. Não foram encontradas alterações histopatológicas nos testículos de nenhum dos grupos, porém, o diâmetro dos túbulos no grupo DHC foi menor assim como a altura do epitélio seminífero nos grupos DHC e RS. A atividade da enzima catalase nos testículo dos grupos DHC e RS mostrou-se aumentada. As concentrações de colesterol total e LDL foram significativamente maiores em ambos os grupos que consumiram a dieta hipercolesterolêmica enquanto o grupo somente restrito de sono apresentou queda no colesterol total. Os níveis de HDL aumentaram no grupo DHC+RS e os de VLDL, triacilglicerol e progesterona apresentaram queda em ambos os grupos restritos de sono, independentemente da dieta. Conclusões: Estes resultados demonstram que além das mudanças no perfil lipídico já esperadas encontradas nos grupos hipercolesterolêmicos como o aumento nas concentrações de colesterol total e LDL, a RS também foi capaz de causar modificações nesse perfil e ambas as condições desencadearam estresse oxidativo nos testículos revelado através da mudança na atividade da enzima antioxidante catalase. Além disso, ficou demonstrado que as condições de restrição de sono e hipercolesterolemia tanto associadas como separadamente são prejudiciais à função reprodutiva masculina, especialmente para a produção de espermatozoides pelos testículos e morfologia espermática. Estas alterações podem não ter sido consequência de mudanças androgênicas, já que as concentrações de testosterona sérica não se modificaram, podendo ter sido resultado do estresse oxidativo nos grupos DHC e RS e de alterações em vias ainda desconhecidas prejudicadas pela interação entre altas doses de colesterol e horas diminuídas de sono.
xviii
Dedicatória... v
Agradecimentos... vi
Epígrafe... xi
Lista de figuras... xii
Lista de tabelas... xiv
Lista de abreviaturas e símbolos... xv
Resumo... xvii 1. INTRODUÇÃO... 1 1.1. Objetivo geral... 2 1.2. Objetivos específicos... 2 2. REVISÃO DA LITERATURA... 3 2.1. A espermatogênese... 3
2.2. O colesterol e a hipercolesterolemia no contexto da reprodução masculina... 7
2.2.1. O papel biológico do colesterol... 7
2.2.2. O excesso do colesterol e a reprodução masculina... 13
2.2.3. O estresse oxidativo induzido pela hipercolesterolemia e suas repercussões em parâmetros reprodutivos... 18
2.3. O sono: características gerais, papel fisiológico e consequências de sua privação e/ou restrição... 23
2.3.1. Sono e estresse... 29
2.4. Maturação sexual, puberdade e reprodução: efeito de substâncias e condições adversas... 31
xix
3.2. Desenho experimental e grupos... 37
3.3. Protocolos... 38
3.3.1. Dieta padrão... 38
3.3.2. Dieta hipercolesterolêmica... 38
3.3.3. Restrição de sono... 40
3.4. Avaliação dos parâmetros reprodutivos... 42
3.4.1. Determinação do peso absoluto e relativo dos órgãos... 42
3.4.2. Índice gonadossomático (IGS)... 42
3.4.3. Cálculo da produção diária de espermatozoides... 43
3.4.4. Contagem e estimativa do tempo de trânsito no epidídimo... 46
3.4.5. Morfologia espermática... 48
3.4.6. Análise histopatológica testicular... 48
3.4.7. Análise hitomorfométrica testicular... 50
3.4.7.1. Diâmetro tubular a altura do epitélio seminífero... 50
3.4.7.2. Relação túbulo x interstício... 50
3.5. Análise dos parâmetros bioquímicos sanguíneos... 51
3.5.1. Dosagem de colesterol e triacilglicerol... 51
3.5.2. Dosagem hormonal... 51
3.6. Avaliação de enzima antioxidante testicular... 52
3.6.1. Determinação da atividade da catalase (CAT) ... 52
xx 4. RESULTADOS... 54 5. DISCUSSÃO... 76 6. CONCLUSÕES... 99 7. ANEXO... 100 8. REFERÊNCIAS... 102 Abstract Apêndices
O estilo de vida da sociedade moderna compreende fatores de risco a diversos componentes da saúde, incluindo a função reprodutiva. Dentre os fatores de risco é crescente o sedentarismo, aumento na carga horária de trabalho, tabagismo, festas noturnas, luz artificial, álcool e fast food. Desse modo, cada vez mais estão se experimentando situações de restrição de sono e dietas que podem causar dislipidemias. Esses hábitos ganham grande destaque entre adolescentes e jovens, se tornando um grande risco já que, como destacaram os estudos de Stoker
et al. (2000a), este é um período muito importante para os mamíferos caracterizado
por mudanças morfológicas e endócrinas.
Este estudo visou mimetizar, em modelos experimentais, as condições de restrição de sono e consumo de dietas hipercolesterolêmicas vivenciadas pelos jovens-adultos de nossa sociedade, observando as implicações sobre seus parâmetros reprodutivos.
É importante ressaltar também que, embora já existam dados na literatura investigando separadamente os efeitos da restrição de sono e dislipidemias sobre a reprodução masculina em modelos experimentais adultos, pouco se investigou sobre as consequências dos dois fatores associados durante as fases que antecedem a maturidade sexual.
1.1. Objetivo Geral
Avaliar a influência do consumo de dieta hipercolesterolêmica e restrição de sono, atuando separadamente e em conjunto, em parâmetros reprodutivos de ratos machos tratados durante o processo de maturação sexual.
1.2. Objetivos Específicos
1. Avaliar alterações nos parâmetros biométricos tais como peso corporal e peso dos órgãos do sistema reprodutor (testículos, epidídimos, vesículas seminais e próstata).
2. Avaliar alterações no epitélio seminífero através de análises histopatológicas e histomorfométricas.
3. Avaliar a fisiologia testicular e epididimária, estimando a produção espermática diária, o tempo de trânsito espermático pelo epidídimo e a quantidade armazenada neste último.
4. Verificar alterações no perfil dos hormônios sexuais progesterona e testosterona nas diferentes condições experimentais.
5. Verificar as consequências dos tratamentos na qualidade dos espermatozoides, aferida pela sua morfologia.
2. REVISÃO DA LITERATURA
De acordo com dados de 2002 da Organização Mundial da Saúde (OMS), a infertilidade afeta cerca de 15% dos casais em idade reprodutiva em todo o mundo, valores estes maiores do que os encontrados durante o início dos anos 60 que, segundo Saradha & Mathur (2006) estavam em torno de 7 a 8%. De todos os casos de infertilidade, 50% devem-se aos fatores masculinos associados ou não à infertilidade feminina. No Brasil estima-se que 1 em cada 6 casais tenha problemas de infertilidade (BADALOTTI, 2010).
Na revisão de Carlsen et al. (1992), feita a partir do levantamento de 61 publicações médicas num período de 52 anos (1938 – 1990), a compilação de dados sobre a qualidade do sêmen de homens saudáveis revelou uma diminuição significativa do volume seminal de 3,4 mL para 2,75 mL e uma queda na média da contagem espermática de 113x106 espermatozoides/mL para 66x106 espermatozoides/mL em 1990. Este declínio na quantidade e qualidade espermáticas, impulsionado por diversos fatores, podem ter sido os responsáveis pelos prejuízos na fertilidade masculina observados ao longo desses anos.
2.1. A Espermatogênese
A formação dos gametas masculinos, os espermatozoides, ocorre a partir dos processos de divisão e diferenciação das células germinativas conhecidos como espermatogênese. Trata-se de um processo biológico muito complexo e bem
organizado que acontece nos testículos, mais especificamente nos túbulos seminíferos, de todos os mamíferos e seu sucesso depende de inúmeros fatores tais como transformações morfológicas e manutenção dos níveis hormonais (AMANN, 1981).
No epitélio dos túbulos seminíferos estão presentes duas linhagens celulares: a linhagem germinativa, cujas células são denominadas espermatogônias, espermatócitos (primários e secundários) e espermátides, e linhagem somática, representada pelas células de Sertoli. As células de Sertoli têm vários papéis importantes na espermatogênese, pois além de darem suporte físico e nutrirem as células germinativas, participam da fagocitose de células em processo de apoptose e de restos de citoplasma liberados no decorrer da produção dos espermatozoides (HOLSTEIN et al., 2003). Além disso, produzem substâncias endócrinas e parácrinas que regulam o processo espermatogênico (HESS & FRANÇA, 2008), a exemplo da inibina, glicoproteína que inibe a secreção de FSH, da ativina que tem um efeito contrário à inibina e da proteína ligante de andrógeno (ABP), que por ter grande afinidade com a testosterona e a diidrotestosterona, é capaz de manter as concentrações intratesticulares de andrógenos mais altas (HESS & FRANÇA, 2008). Adicionalmente as junções celulares de oclusão e junções gap entre as células de Sertoli são responsáveis por uma de suas mais importantes funções, a formação da barreira hematotesticular que divide o epitélio seminífero em dois compartimentos: basal, que inclui as espermatogônias e os espermatócitos primários (pré-leptótenos e leptótenos) e adluminal, que abriga os espermatócitos primários (zigótenos em diante), secundários e as espermátides (HOLSTEIN et al., 2003), fornecendo às células germinativas mais diferenciadas um ambiente especializado e protegido contra
substâncias tóxicas, xenobióticos, grandes moléculas hidrofílicas e anticorpos (BART et
al. 2002).
A espermatogênese pode ser divida em três fases: a fase proliferativa, onde as espermatogônias sofrem numerosas mitoses formando uma população de células que irão se dividir e diferenciar posteriormente. Esta etapa é seguida pela fase meiótica, composta por células originadas dessas sucessivas divisões, sendo os espermatócitos, que são chamados de primários durante a meiose I e de secundários após entrarem em meiose II. Por fim, a espermatogênese entra em sua última fase, a fase de diferenciação ou espermiogênese, quando as espermátides passam por diversas modificações morfofuncionais até se tornarem espermatozoides que serão lançados na luz dos túbulos seminíferos (RUSSELL et al., 1990).
Para que todo o processo espermatogênico ocorra é necessário um controle endócrino e parácrino que envolve o eixo hipotálamo-hipófise-gônada (HPG), as células de Sertoli e as de Leydig, estas últimas presentes no compartimento intersticial dos testículos. O hipotálamo secreta de maneira pulsátil gonadotropinas (GnRH) que estimulam a hipófise a liberar o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio folículo estimulante (FSH), cujas atuações têm fundamental importância na espermatogênese (SARADHA & MATHUR, 2006). O primeiro age sobre receptores de membrana presentes nas células de Leydig que, por sua vez, sintetizam e liberam andrógenos, principalmente a testosterona, para o meio intratesticular e para a corrente sanguínea. A ação da testosterona vai além de determinar as características sexuais secundárias, pois sua presença no epitélio seminífero é essencial para a regulação da espermatogênese. Quando sua quantidade circulante está alta, ela atua sobre a hipófise e o hipotálamo, diminuindo a produção de LH e GnRH através do mecanismo
de feedback negativo (HOLSTEIN et al., 2003). O FSH, por sua vez, age sobre as células de Sertoli e faz com que elas regulem a espermatogênese, produzindo proteína ligante de andrógeno (ABP) que mantém a testosterona concentrada na região dos túbulos seminíferos e secretando a inibina que suprime a produção do FSH por
feedback negativo (RUSSELL et al., 1990).
Por se tratar de um processo tão intrincado, a espermatogênese é suscetível a inúmeras alterações causadas por uma variedade de fatores que podem levar á infertilidade masculina. Impulsionados pela industrialização global dos últimos 50 anos, diversos trabalhos clínicos e experimentais têm sido realizados sobre os riscos oferecidos à saúde reprodutiva masculina por certas substâncias presentes em pesticidas, solventes, químicos industriais e contaminantes ambientais. Tais pesquisas puderam ligar tal exposição à queda nos índices de fertilidade demonstrados por aumento na porcentagem de espermatozoides com anormalidades, diminuição na contagem espermática e outros danos à espermatogênese (SILVA et al., 2011; ACHARYA et al., 2008; SARADHA &MATHUR, 2006; TAN et al., 2003; OLIVA et al., 2001).
Além dos agentes ambientais, existem outros fatores responsáveis por afetarem a fertilidade masculina tais como uso de medicamentos para hipertensão, antidepressivos, alguns tipos de antibióticos e quimioterápicos (PASQUALOTTO et al., 2004), além da presença de doenças relacionadas ao trato reprodutor masculino, destacando-se o câncer testicular, o criptorquidismo e a hispospádia que, segundo estudos de Toppari et al. (1996), têm aumentado sua incidência nos últimos 50 anos. É importante ressaltar também que muitas condições intimamente ligadas ao estilo de vida moderno, tais como o tabagismo, o uso crônico ou excessivo de álcool, o uso de
drogas ilícitas, de anabolizantes, sedentarismo, estresse, exposição à poluição e substâncias químicas, diminuição nas horas de sono e consumo de dietas hiper calóricas podem levar ao aparecimento de doenças cardiovasculares, hipertensão, diabetes, obesidade, aumento nos níveis de colesterol, trazendo muitos prejuízos à fertilidade masculina por interferir na espermatogênese, espermiogênese, motilidade espermática e regulação hormonal (SHARPE & FRANKS, 2002; KUMAR et al., 2009).
2.2. O colesterol e a hipercolesterolemia no contexto da reprodução masculina
2.2.1. O papel biológico do colesterol
O colesterol está presente no organismo de todos os mamíferos, sendo uma molécula central em sua fisiologia. Dentre suas funções destaca-se o seu papel na membrana plasmática das células, onde fica inserido entre os fosfolipídios da bicamada (fig. 1) e estabelece a permeabilidade e a fluidez, além de auxiliar na formação de uma barreira entre o meio intracelular e extracelular (BROWN & GOLDSTEIN, 1986). Ele ainda é base para a formação de oxiesteróides, ácidos biliares indispensáveis na absorção de lipídios da dieta ficando armazenados na vesícula biliar, além da vitamina D (PAPADOPOULOS, 2005) e hormônios esteróides como os mineralocorticóides, glicocorticóides, andrógenos, estrógenos e progesterona (MILLER & AUCHUS, 2011).
Fig. 1 – Esquema da bicamada lipídica da membrana celular com colesterol inserido
A estrutura básica da molécula de colesterol (fig. 2) contém uma porção polar, formada pelo grupo hidroxila (OH) que fica em contato com o meio aquoso, unida aos núcleos esteróis que ficam no interior da bicamada (BROWN & GOLDSTEIN, 1986). O colesterol presente no organismo pode ser obtido a partir de duas fontes: através da síntese endógena ou por meio da dieta. A contribuição de cada uma dessas fontes para o colesterol total segue a proporção de 70:30, respectivamente (GRUNDY, 1983). Segundo Hu et al. (2010), toda célula nucleada tem a capacidade de sintetizar novo colesterol a partir da conversão da Acetil-CoA por meio de complexas etapas enzimáticas. Uma das etapas principais é a formação do mevalonato a partir de 3 moléculas de Acetil-CoA, reação que é catalisada pela enzima 3-Hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A redutase (HMG-CoA redutase). Em seguida ele é convertido em esqualeno, que após sofrer ciclização e ganhar O2 se transforma em lanosterol. Um
conjunto de 20 reações que consomem mais 20 moléculas de O2, envolvendo
desmetilações e reduções em ligações duplas convertem o lanosterol em colesterol. Segundo Rudney & Sexton (1986) a síntese de novo colesterol ocorre em diferentes tecidos do organismo e de maneira distinta entre os animais. Em ratos, por exemplo, a
maior parte do colesterol é formada no fígado (51%) e o restante em tecidos não hepáticos com destaque para o intestino delgado e músculos. Em células esteroidogênicas esta síntese é controlada por hormônios tróficos (HU et al., 2010).
Fig. 2 – Estrutura molecular do colesterol
O colesterol obtido a partir dos alimentos é primeiramente transportado do intestino para o fígado, de onde é distribuído para todo o organismo (IKONEN, 2008). Os enterócitos absorvem triacilglicerol e colesterol e os incorporam a uma lipoproteína chamada quilomícron, cuja porção protéica principal é formada por apopoproteína B (APO B). Os triacilglicerol são hidrolisados ao longo da circulação e novas alipoproteínas são adicionadas, como a APO E, gerando os remanescentes dos quilomícrons que são captados pelos hepatócitos e, a partir deles, os lipídios serão preparados para serem lançados na circulação e alcançarem todas as células (IKONEN, 2008).
Para que o fígado consiga secretar o colesterol insolúvel em água na circulação, ele é esterificado em cadeias longas de ácidos graxos e alocado dentro de
núcleos hidrofóbicos nas lipoproteínas plasmáticas (BROWN & GOLDSTEIN, 1976). A estrutura das lipoproteínas compreende, portanto, uma monocamada superficial de fosfolipídios, colesterol não esterificado e apoproteínas de diferentes tipos, envolvendo ésteres de colesterol e triacilglicerol (BROWN & GOLDSTEIN, 1976). Os principais tipos de lipoproteínas foram descritos por trabalhos realizados entre 1950 e 1960 e são classificados de acordo com sua densidade: lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), densidade baixa intermediária (IDL), baixa densidade (LDL) e alta densidade (HDL) (ONCLEY, 1956; FREDRICKSON, 1974). O fígado é responsável pela síntese da VLDL composta 50% por triacilglicerol, 20% colesterol, 20% fosfolipídios e 10% proteína APO B100 ele sintetiza também o HDL que tem baixa quantidade de triacilglicerol e alta taxa de proteína APO A1. A LDL é formada na circulação a parir da VLDL (IKONEN, 2008). Nos seres humanos, a LDL é a lipoproteína mais abundante e é a principal fornecedora de colesterol para as células periféricas, enquanto em ratos o HDL é a lipoproteína em destaque no plasma
Os níveis de colesterol sérico e celular devem ser controlados para evitar acúmulo de colesterol nos tecidos (IKONEN, 2008). Quando os tecidos extra-hepáticos apresentam excesso de colesterol, os transportadores ABC A1 e ABC G1 presentes na membrana celular transferem colesterol e fosfolipídios intracelulares para APO A1 ligadas a eles formando uma nova lipoproteína HDL e contribuindo para a diminuição nas concentrações lipídicas celulares (IKONEN, 2008). Este novo HDL presente na corrente sanguínea vai participar da manutenção dos níveis plasmáticos de HDL e do transporte reverso, responsável pela retirada do colesterol de tecidos periféricos e transporte dele até o fígado (BROWN & GOLDSTEIN, 1976). Segundo Ikonen (2008), o HDL é seletivamente removido do sangue pelo receptor de membrana
SR-BI dos hepatócitos onde será excretado na bile, tanto na forma de esterol livre como convertido em ácidos biliares, podendo voltar ao intestino delgado e ser reabsorvido ou excretado nas fezes. No entanto, se o HDL for captado seletivamente por receptores SR-BI de células esteroidogênicas, os ésteres de colesterol presentes em seu interior serão utilizados por elas para a produção de hormônios esteróides (HU et al., 2010). Em ratos, SR-BI são expressos na glândula adrenal, células de Leydig e fígado, onde também são capazes de absorver seletivamente ésteres de colesterol HDL (SAEZ, et
al., 2011).
As células também conseguem aumentar suas concentrações de colesterol não só através da síntese de novo colesterol, já citada anteriormente, como a partir do seu influxo, absorvendo os ésteres de colesterol das lipoproteínas plasmáticas (IKONEN, 2008). Esta absorção acontece por receptores de LDL (LDLr), capazes de se ligarem a remanescentes de quilomícrons, VLDL, LDL e apoproteínas dos tipos B e E (IKONEN, 2008). Em células responsáveis por sintetizar hormônios esteróides, como nas células adrenais e as células de Leydig, esta via de absorção de colesterol, juntamente com a síntese de novo, são utilizadas para garantir substrato constante para a esteroidogênese (HU et al., 2010).
O colesterol, como já citado, é o precursor de todos os hormônios esteróides do organismo e 80% do colesterol utilizado na síntese hormonal é advindo da dieta. A esteroidogênese é um processo mediado por enzimas e controlado por hormônios, através do qual o colesterol é convertido em esteróides nas células do córtex da adrenal e nas células de Leydig testiculares (MILLER & AUCHUS, 2011). A primeira etapa desse processo envolve a passagem do colesterol da matriz mitocondrial externa para a interna, realizada através da proteína StAR (steroidogenic acute
regulatory protein). Na membrana interna da mitocôndria o colesterol é clivado pela enzima P450scc, transformando-se em pregnolona que deixa a mitocôndria e pode dar origem a todos os hormônios esteróides (HU et al., 2010). Nas células de Leydig, a conversão do colesterol em pregnolona para formar a testosterona só ocorre a partir de estímulos do hormônio luteinizante (LH), sendo que em roedores essas células sintetizam novo colesterol e armazenam ésteres para manterem níveis suficientes de substrato requeridos para a esteroidogênese (ROBERTSON et al., 2005). Em alguns tecidos como próstata e genitália externa, há metabolização da testosterona em outra forma ativa, a diidrotestosterona (DHT), e em áreas periféricas como fígado, pele e tecido adiposo a conversão da testosterona por enzimas aromatases produz 80% do estradiol masculino, sendo que em roedores, 25% do estrogênio circulante é formado nos testículos (PAPADOPOULOS, 2005).
O colesterol participa do processo de maturação espermática no epidídimo, bem como da capacitação e reação acrossômica já no trato reprodutor feminino (YAMAMOTO et al., 1999). Durante o trânsito dos espermatozoides pelo epidídimo, na maioria dos mamíferos, ocorrem modificações bioquímicas nos esteróis e ácidos graxos que influenciam diretamente a arquitetura e dinâmica da membrana plasmática, aumentando a proporção de ácidos graxos insaturados que contribuem para sua fluidez (SAEZ et al., 2011). Estas mudanças na dinâmica estrutural da membrana plasmática espermática durante sua passagem pelo epidídimo estão associadas ao efluxo do colesterol que é realizado por transportadores ABCA1 e é maior na região da cabeça dos espermatozoides do que na cauda (SAEZ et al., 2011). Já está demonstrado, através de microscopia de fluorescência, que a fluidez da membrana na região acrossômica é de 3 a 4 vezes maior que em outras áreas sendo
ainda aumentada durante a maturação no epidídimo (SAEZ et al., 2011). A composição da membrana dos espermatozoides, desde a sua produção nos testículos até o armazenamento no epidídimo, é essencial na sua futura passagem pelo trato genital feminino e toda a mudança causada pelo efluxo do colesterol na membrana desencadeia vias de transdução de sinais que regulam o processo de capacitação e permitem que a fertilização ocorra (SAEZ et al., 2011). Por esses motivos, a função reprodutiva masculina é sensível a perturbações na homeostase do colesterol, fato comprovado por estudos com alguns modelos experimentais (javali, coelho e frango) que demonstram que a modificação na ingestão de ácidos graxos pode modificar a composição da membrana espermática (SAEZ et al., 2011).
2.2.2. O excesso de colesterol e a reprodução masculina
Uma das principais formas de contato do organismo com o meio externo é a alimentação, via fundamental de captação de nutrientes essenciais a homeostase. Entretanto, os nutrientes adquiridos exercem inúmeras funções em diversos tecidos, muitas destas ainda desconhecidas.
Segundo Dâmaso et al. (2003), as mudanças no estilo de vida das últimas décadas têm levado ao consumo de dietas com quantidades desnecessárias de gorduras e calorias. Por serem altamente palatáveis, a procura por esses alimentos cresce a cada dia e, associado à grande oferta e ao acesso fácil, a situação se agrava ainda mais entre crianças e adolescentes que acabam por adquirir maus hábitos alimentares desde cedo, podendo mantê-los por toda a vida, se tornando mais susceptíveis à obesidade e hipercolesterolemia. Há uma gama de evidências indicando
que os costumes atuais da população ocidental, como o consumo de grandes quantidades de gordura saturada, o tabagismo e o sedentarismo, podem aumentar os riscos de doenças cardiovasculares pelo aumento principalmente do colesterol e triacilglicerol sanguíneos (WOOD et al., 2001).
A hipercolesterolemia hoje é um problema enfrentado por muitas sociedades e já é uma preocupação para muitos profissionais da saúde. Ela não está associada somente à obesidade e ao aumento no risco de doenças cardiovasculares, relações estas mostradas extensamente pela literatura, mas existe também uma série de estudos experimentais e clínicos que demonstraram uma ligação entre esses altos níveis de colesterol, induzidos ou não por dietas especiais, e distúrbios na reprodução masculina (PADRÓN, 1989; PUROHIT & DARADKA, 1999; DOBS et al., 2000; SHALABY et al., 2004; MENDIOLA et al., 2009).
Estudos experimentais com ratos têm sido utilizados por diversos autores para avaliar vários efeitos adversos de compostos exógenos, inclusive do colesterol em excesso, sobre as funções reprodutivas de machos (GUPTA & DIXIT, 1988; PUROHIT & DARADKA, 1999; TANAKA et al., 2001; SHALABY et al., 2004; PYTLOWANCIV et al., 2009). No caso da hipercolesterolemia, muitos trabalhos ressaltam a dificuldade em aumentar os níveis séricos de colesterol em ratos, havendo necessidade de suplementar ácidos biliares, como o ácido cólico, à dieta de colesterol. Beher et al. (1963) testaram em ratos, camundongos e outros modelos experimentais dietas exclusivamente contendo colesterol ou uma associação deste com diversos tipos de sais biliares e observaram que os ratos que se alimentaram da ração suplementada somente com 1% de colesterol não desenvolviam hipercolesterolemia após 3 semanas. Porém, quando adicionado 0,5% de ácido cólico esses animais aumentavam
significativamente seus níveis séricos de colesterol. Posteriormente, Story et al. (1974) corroboraram esses achados e provaram que o ácido cólico é muito efetivo na promoção da absorção de colesterol pelos ratos utilizando por duas semanas uma dieta de 0,5% de colesterol com 0,5% de ácido cólico. Atualmente, este protocolo é amplamente adotado em estudos que visam induzir a hipercolesterolemia e aterosclerose em modelos experimentais (TANAKA et al., 2001; MANZONI et al., 2005; KWOK et al., 2010; THIRUCHENDURAN et al., 2010).
Alterações na reprodução em ratos machos devido aos altos níveis sanguíneos de colesterol já foram demonstradas em algumas pesquisas onde vários tipos de dieta hipercolesterolêmica foram administradas durante um período superior a 50 dias que corresponde ao tempo do processo espermatogênico completo como no trabalho de Bataineh & Nusier (2005) e no estudo clássico de Gupta & Dixit (1988) em que a adição de colesterol na dieta de ratos e coelhos durante 120 dias resultou em prejuízos na função testicular desses animais, apresentando uma diminuição na população celular de espermatócitos secundários e espermátides e nas dimensões dos núcleos das células de Leydig.
Em outro estudo utilizando ratos tratados por 61 dias com uma dieta rica em colesterol (400mg/Kg) e gordura (5%), Purohit & Daradka (1999) observaram um bloqueio da espermatogênese no estágio de espermatócitos primários, com redução no número de espermatócitos secundários e espermátides, além de células de Leydig degeneradas, túbulos seminíferos atrofiados, diminuição na altura do epitélio e no número de espermatozoides no lúmen da cauda do epidídimo, diminuição na motilidade e densidade espermática. Relação inversa entre níveis de testosterona e a concentração plasmática de colesterol e triacilglicerol também foi observada. Em 2001,
Tanaka et al. corroboraram os achados desses autores, percebendo também uma relação negativa entre níveis de colesterol e testosterona, além de significativa diminuição no peso da próstata ventral em ratos tratados por 28 dias com dieta contendo 2% de colesterol e 0,5% de ácido cólico.
Shalaby et al. (2004) também atentaram para evidências de que altos níveis plasmáticos de colesterol e/ou triacilglicerol induzidos pela dieta em ratos estão associados a profundas modificações em parâmetros reprodutivos tais como baixa qualidade do sêmen, redução do índice de fertilidade, decréscimo do peso testicular e da porcentagem de espermatozoides viáveis, aliados a um acréscimo na contagem de anormalidades espermáticas. Em termos de histopatologia testicular, Shalaby et al. (2004) encontraram túbulos atrofiados e degenerados, com a espermatogênese bloqueada e consequente redução da fertilidade.
Confirmando tais dados, Bataineh & Nusier (2005) encontraram, em ratos alimentados por 60 dias com dieta enriquecida por colesterol, uma redução em diversos parâmetros tais como motilidade, densidade espermática na cauda do epidídimo e no testículo, altura do epitélio do epidídimo e vesícula seminal, diâmetro dos túbulos seminíferos e núcleos das células de Leydig, número de espermatócitos e espermátides, número de fêmeas fecundadas, níveis de testosterona e FSH, além de um aumento no número de células de Leydig degeneradas.
A hipercolesterolemia induzida em ratos não só é capaz de alterar a fertilidade em nível celular, mas também pode modificar o comportamento sexual, como comprova o trabalho de Demir et al. (2010) onde ratos alimentados com dieta suplementada por 1% de colesterol durante 2 semanas tiveram sua função erétil
significativamente danificada comparando-se às respostas do grupo controle, aspecto que influencia diretamente a reprodução masculina.
Em termos de modelos experimentais não só os ratos foram adotados nesse tipo de estudo, mas os coelhos também foram utilizados por alguns autores. Yamamoto et al. (1999) alimentaram coelhos com uma dieta suplementada com colesterol e obtiveram como resultado um aumento significativo nas concentrações séricas de colesterol, queda na concentração, morfologia e motilidade espermática além de afetar o processo de maturação e capacitação dos espermatozóides e a função secretora das células de Leydig e Sertoli, esses últimos resultados puderam ser comprovados após a utilização dos espermatozóides em técnicas de fertilização in vitro onde os animais hipercolesterolêmicos alcançaram baixos números de oócitos fertilizados normalmente. Lancellotti et al. (2010) corroboraram esses resultados e observaram aumento nos níveis plasmáticos de colesterol, redução no volume seminal, motilidade e morfologia além de outros efeitos adversos do colesterol sobre a capacitação espermática e a reação acrossômica em coelhos hipercolesterolêmicos.
A hipercolesterolemia também já se mostrou prejudicial à fertilidade em humanos, sendo que a relação entre altos níveis de colesterol e reprodução masculina prejudicada já foi apontada em alguns trabalhos. Padrón et al. (1989), por exemplo, investigaram a função testicular de homens com hiperlipoproteinemia e de homens com histórico de infertilidade (azoospérmicos, oligozoospérmicos e normozoospérmicos). A maioria dos pacientes com hiperlipoproteinemia apresentou alterações na motilidade, morfologia e viabilidade espermática, além de níveis elevados de estradiol. Nos pacientes inférteis puderam-se observar maiores níveis de colesterol total e triacilglicerol entre os azoospérmicos, quando comparados aos normais, e correlação
positiva entre os níveis de triacilglicerol e prolactina e negativa entre triacilglicerol e morfologia espermática normal. Os resultados desse estudo indicam, portanto, que altos níveis lipídicos exercem efeitos adversos diretamente sobre os testículos.
Mendiola et al. (2009) mostraram que entre os homens inférteis com baixa qualidade espermática a ingestão de alface, tomate e frutas era pequena e o consumo de iogurtes, batatas, produtos lácteos e carnes processadas era maior que no grupo controle com sêmen normal. Nesses últimos as quantidades consumidas de leite desnatado, mariscos, vegetais crus ou cozidos e frutas (pêssego e damasco) eram maiores. Com isso a pesquisa sugeriu que a qualidade do sêmen pode ser influenciada pela ingestão de alimentos, principalmente os ricos em gordura saturada.
Salgado et al. (2010), pesquisando alimentos funcionais eficazes no controle da lipidemia em ratos, evidenciaram a importância do consumo de alimentos capazes de reduzir ou controlar os níveis sanguíneos de colesterol e citaram dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística sobre o baixo consumo de cereais, grãos, vegetais e frutas em algumas regiões do Brasil e o aumento da ingestão de produtos animais e comidas processadas podendo este fato explicar o aumento em doenças degenerativas como obesidade, doenças cardiovasculares, hipertensão, dislipidemias associadas aos maus hábitos alimentares.
2.2.3. O estresse oxidativo induzido pela hipercolesterolemia e suas repercussões em parâmetros reprodutivos
Pesquisas recentes mostram que mudanças nos níveis lipídicos como a hipercolesterolemia são capazes de desencadear uma série de reações nas células
resultando na formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, por sua vez, podem desencadear o chamado estresse oxidativo (SUDHARHAR et al., 2006 e 2007; KWOK et al., 2010; THIRUCHENDURAN et al., 2010). As EROs são produtos normais no metabolismo celular geradas pelos processos de respiração ou fosforilação oxidativa que ocorrem nas mitocôndrias. O O2 sofre redução gerando H2O, energia e alguns
intermediários reativos como radicais superóxidos (O2•-), hidroxila (OH•), que é o radical
mais deletério ao organismo, e peróxido de hidrogênio (H2O2) (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997).
A formação das EROs nem sempre é deletéria e tem papel importante na defesa do corpo contra infecções (FERREIRA & MATSUBARA, 1997). Entretanto, quando há um desbalanço entre a produção de agentes oxidantes e a formação de agentes antioxidantes as EROs podem atacar proteínas, enzimas, carboidratos, DNA e lipídios, principalmente os presentes nas membranas celulares, gerando danos celulares (FERREIRA & MATSUBARA, 1997). As membranas são ricas em ácidos graxos poliinsaturados que são altamente susceptíveis ao ataque de radicais livres, especialmente hidroxila, e o resultado desta peroxidação lipídica é a perda de sua propriedade seletiva durante a troca iônica, além da formação do malondialdeído (MDA), produto citotóxico (FERREIRA & MATSUBARA, 1997; BARREIROS et al., 2006).
Os principais antioxidantes produzidos pelo organismo são os enzimáticos, como a glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido-dismutase (SOD), e os não enzimáticos, como a glutationa reduzida (GSH) (BARREIROS et al., 2006). Além disso, existem os advindos da dieta: α-tocoferol (vitamina E), ᵦ-caroteno (pró-vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e flavonóides
(BARREIROS et al., 2006). Atualmente existem inúmeras publicações que exploram substâncias com poder antioxidante presentes em alguns alimentos e que são capazes de prevenir ou combater os danos do estresse oxidativo. Como exemplo temos as sementes de uva (THIRUCHENDURAN et al., 2010), o arroz negro (SALGADO et al., 2010), a soja e o chá verde (SANTANA et al., 2008; YOKOZAWA et al., 2002).
Dados de Sudharhar et al. (2007) mostram claras evidências que uma dieta rica em colesterol é capaz de gerar o chamado estresse oxidativo lipêmico em muitos tecidos, principalmente no próprio fígado onde os danos foram confirmados pela histologia do órgão. Esses autores suplementaram a dieta de ratos com colesterol (4%) e ácido cólico (1%) durante 30 dias, observando uma diminuição na atividade antioxidante da SOD, CAT, GPx e GSH, além de um aumento na peroxidação lipídica hepática avaliada através da quantidade de MDA formado na reação do tecido com o ácido tiobarbitúrico, e consequente crescimento na produção de radicais livres, levando a um colapso no sistema de defesa contra oxidação devido à hipercolesterolemia. Sudharhar et al. investigaram, em 2006, os efeitos negativos da hipercolesterolemia induzida em ratos sobre o fígado e seu papel no desenvolvimento de estresse oxidativo lipêmico no organismo desses animais.
Experimentos feitos por Thiruchenduran et al. (2010) com dieta hipercolesterolêmica em ratos e seus efeitos sobre o tecido cardíaco implicaram em aumento nos níveis séricos de LDL e VLDL que, ao serem oxidados formam hidroperóxidos, espécies altamente reativas que podem desenvolver aterosclerose e iniciar um processo de peroxidação lipídica nas membranas celulares. Este estudo ainda apontou para uma queda nos níveis de antioxidantes (SOD, CAT, GPx e GSH) no miocárdio comprovando o estresse oxidativo causado pela dieta rica em colesterol.
A ingestão de altos níveis de colesterol é capaz de provocar estresse oxidativo e produção de radicais livres e EROs, que interferem em parâmetros reprodutivo. Em revisão, Saradha & Mathur (2006) destacaram a importância da descoberta nas últimas duas décadas, das EROs e do estresse oxidativo para os estudos da infertilidade masculina, pois a elevação nos níveis de EROs resulta em ataque aos ácidos graxos poliinsaturados, presentes em altas quantidades nos espermatozoides de mamíferos que, por isso, são muito susceptíveis a danos oxidativos, os quais diminuem a fluidez da membrana e o movimento da cauda levando à queda na motilidade. Além disso, esses autores alertam para o fato de que se as mitocôndrias forem atingidas e a disponibilidade energética for prejudicada a motilidade pode até ser impedida por completo. A presença de EROs inicia uma cascata de peroxidação lipídica nos lipídios da membrana espermática fazendo com que, além da perda de movimentos, os espermatozoides também percam sua capacidade de executar a reação acrossômica e penetrar no oócito (SARADHA & MATHUR, 2006). O estresse oxidativo foi ainda associado com danos no DNA em um trabalho com suspensão de células testiculares onde foi visto um aumento das anormalidades nas cabeças dos espermatozoides (KUMAR et al., 2002).
Tremellen (2008) em seu artigo de revisão sobre o estresse oxidativo na reprodução masculina lembrou que os espermatozóides e o plasma seminal são dotados de antioxidantes enzimáticos como a SOD e a CAT, responsáveis por inativar o ânion superóxido e peróxidos de hidrogênio. Trabalhos anteriores ainda confirmam uma ligação entre a deficiência de atividade da catalase no sêmen e infertilidade masculina (SANOCKA et al., 1997; MIESEL et al., 1997). A GPx também é uma enzima antioxidante cuja função é reduzir hidroperóxidos utilizando como doadora de elétrons a
glutationa podendo ser localizada no testículo, próstata, epidídimo, vesícula seminal, canal deferente plasma seminal e nos espermatozóides. Entre os antioxidantes não enzimáticos do sêmen estão o ácido ascórbico, α-tocoferol, glutationa, albumina, carotenóides e flavonóides que também agem neutralizando quimicamente os radicais livres. Os antioxidantes presentes no plasma seminal protegem os espermatozoides do ataque oxidativo, no entanto, durante a espermatogênese e a passagem pelo epidídimo os espermatozoides não estão em contato com o plasma seminal e devem contar apenas com a capacidade antioxidante desses órgãos para sua proteção, estando mais vulneráveis a danos oxidativos nestas etapas, principalmente quando há alguma inflamação no epidídimo ou infecção no trato genital.
Mendiola et al. (2009) compararam hábitos alimentares de pacientes normospérmicos e oligozoospérmicos (moderados a severos) e puderam perceber que o grupo controle (normospérmicos) consumia em maior quantidade alguns itens ricos em antioxidantes e micronutrientes tais como frutas, tomate, alface e legumes. Tais alimentos controlam a quantidade de EROs geradas fisiologicamente pelos espermatozoides, evitando o acúmulo, capaz de afetar a qualidade seminal. Eskenazi et
al. (2005) demonstraram a associação entre dieta rica em antioxidantes e números
elevados de espermatozoides e melhor motilidade espermática em homens saudáveis sugerindo-se que a qualidade seminal pode ser influenciada pelo consumo alimentar. Sabe-se ainda que o estresse oxidativo e a redução na atividade antioxidante estão relacionados negativamente com concentração, motilidade e morfologia espermáticas em homens inférteis (PASQUALOTTO et al., 2000).
A associação, já explicitada acima, entre hábitos alimentares e parâmetros reprodutivos levou Mendiola et al. (2009) a sugerirem que mais pesquisas
sejam feitas para avaliar os efeitos da má alimentação durante os períodos perinatais, infância e puberdade na reprodução e fertilidade masculina.
Foi com base nesse cenário que ao longo das últimas décadas foi se delineando uma grande preocupação, por parte das ciências médicas, com os hábitos alimentares atuais da população mundial e suas ligações com o desenvolvimento de diversas doenças, assim como seus riscos sobre a fertilidade (PADRÓN et al., 1989; HAMMOUD et al., 2006; MENDIOLA et al., 2009).
2.3. O sono: características gerais, papel fisiológico e consequências de sua privação e/ou restrição
O sono constitui um fenômeno biológico fundamental para a saúde mental, emocional e o bem-estar, tendo o organismo grande necessidade de manifestá-lo, à custa de alterações orgânicas marcantes e até mesmo morte após um período de privação prolongada (RECHTSCHAFFEN et al., 1989; LEIBOWITZ et al., 2006).
O sono é dividido em dois tipos, o sono REM (do inglês Rapid Eye Movements) caracterizado pelo movimento rápido dos olhos, ondas dessincronizadas e atonia muscular, além de ser o período em que ocorrem os sonhos (ASERINSKY & KLEITMAN, 1953; DEMENT & KLEITMAN, 1957) e o sono não-REM ou NREM onde há lentificação progressiva da atividade cortical e segue 4 estágios: estágio 1 com prevalência de ondas α de alta freqüência e baixa amplitude (sonolência), estágio 2 onde ocorrem os padrões de onda conhecidos como fusos e complexo K (sono “leve”), estágios 3 e 4 equivalem ao sono de ondas lentas propriamente dito, composto por ondas sincronizadas, grandes e lentas (sono profundo). Esses estágios ocorrem
normalmente em sequência começando pelos estágios 1 e 2 do sono NREM (70 a 100 minutos), seguidos pelos estágios 3 e 4 quando ocorrem episódios de sono REM. Este ciclo pode apresentar flutuações ao longo da noite, mas, geralmente, ocorrem em intervalos de 90 minutos intercalados por 4 a 6 períodos de sono REM por noite (ANDERSEN & BITTENCOURT, 2008).
Existem algumas diferenças entre o sono dos humanos, citado acima, e o sono em roedores. Timo-Iara et al. (1970) descrevem que a primeira diferença importante é que, por serem animais predados, o período predominante da ocorrência do sono nos roedores é durante o dia. Enquanto para os homens o tempo de sono ideal fica em torno de 8 horas, os ratos podem dormir até 13 horas. Apresentam os mesmos estágios de sono descritos anteriormente, porém, durante o sono REM não movimentam somente os olhos como também membros, cabeça e vibrissas e sempre ao final de cada ciclo têm um breve despertar (ANDERSEN & HOSHINO, 2008). Por isso seu sono é chamado de polifásico (TIMO-IARA, 1970).
Admite-se que o sono não-REM se relacione com a liberação de hormônios enquanto no sono REM há um aumento no fluxo sanguíneo cerebral e consolidação da memória sendo, portanto, a ocorrência integral de ambos os tipos, de fundamental importância para a manutenção de uma vida saudável (STICKGOLD, 2005). O sono depende de alguns hormônios para se estabelecer e enquanto se dorme muitos deles são liberados. A melatonina, por exemplo, é um hormônio liberado pela glândula pineal na ausência de estímulos de luz e precisa estar em altas concentrações para que o sono seja iniciado assim como o cortisol, liberado pela glândula adrenal, que está em seus níveis mais baixos pouco antes do sono e vai aumentando durante a noite, atingindo seu pico nas primeiras horas da manhã (ANDERSEN &
BITTENCOURT, 2008). Em ratos, no entanto, a corticosterona apresenta um padrão contrário, estando alta durante a noite e baixa durante o período claro (RUBIN et al., 1972). O hormônio do crescimento (GH) é liberado durante as primeiras horas de sono e está intimamente ligado aos estágios 3 e 4 do sono de ondas lentas. Nas crianças tem grande importância no ganho de altura e nos adultos exerce muitas outras funções metabólicas (ANDERSEN & BITTENCOURT, 2008).
Segundo Leibowitz et al.. (2006), a privação e a restrição de sono se tornaram prevalentes no mundo devido a uma demanda social cada vez mais acentuada pelo aumento na produtividade. Okawa & Uchiyama (2007) salientaram que distúrbios no ciclo vigília-sono, conhecidos como “circadian rhythym sleep disorders
(CRSD)”, afetam pessoas de todas as idades e tem início na infância e adolescência.
Para esses autores, o aumento no número de casos de CRSD, que contribuem para um atraso na hora de início do sono, deve-se a atividades cotidianas como assistir televisão, brincar com jogos eletrônicos, festas e trabalhos noturnos.
Para Leibowitz et al. (2006), uma vez que o sono é parte integrante da função dos organismos diurnos, o seu desarranjo tem um impacto dramático em múltiplos processos fisiológicos. Everson et al. (1995) salientaram que a privação de sono (PS) é capaz de desregular processos biológicos vitais, necessários para as habilidades cognitivas e saúde física, ressaltando que as mudanças fisiológicas acompanhadas por essa desregulação eram ainda em grande parte desconhecidas.
Segundo Banks & Dinges (2007), a PS total tem sido extensivamente investigada experimentalmente. Porém, os efeitos da privação parcial recebem menos atenção científica embora a restrição de sono (RS) seja a condição mais prevalente em condições médicas de distúrbio de sono e no estilo de vida dos seres humanos. A
privação parcial de sono pode ocorrer de três maneiras: fragmentação do sono, como ocorre na apnéia, perda de alguns estágios específicos, como durante o uso de algumas medicações, e a restrição de sono que é a redução nas horas de sono causando seu débito depois de certo tempo (BANKS & DINGES, 2007). Esta redução é capaz de causar mudanças na arquitetura do sono como mostram achados de trabalhos anteriores em que adultos saudáveis adormeceram mais rapidamente e tiveram diminuição do sono REM e estágio 2 do NREM ao passarem por uma restrição de 4 horas de sono durante algumas noites, porém, o sono de ondas lentas do NREM não mostrou mudanças significantes (BRUNNER et al., 1993; VAN DONGEN et al., 2003).
Leemnburg et al. (2010) monitoraram ratos durante os 5 dias em que eram permitidos dormir apenas 4 horas e também comprovaram mudanças na composição do sono durante as 4 horas de janela havendo diminuição na latência do primeiro episódio de sono NREM com aumento de 30% na duração desses episódios, queda de 50% nos micro despertares, comuns entre esses animais e sono REM mais consolidado. Esses autores concluíram que a regulação homeostática do sono foi preservada sobre condições de restrição crônica.
Inúmeros estudos indicam as mais variadas consequências da restrição de sono ao organismo incluindo aumento no risco de eventos e morbidades cardiovasculares, redução na tolerância à glicose, aumento na pressão sanguínea, diminuição no estado de alerta e no desempenho cognitivo (EVERSON et al., 1995; VAN DONGEN et al. 2003; SPIEGEL et al., 2004a LÓPEZ-GARCÍA et al., 2008). Van Dongen et al. (2003) mostram que esta diminuição no estado de alerta e que déficits cognitivos foram equivalentes entre homens restritos a 4-6 horas de sono por 14 noites
consecutivas e homens privados até 2 noites de sono, mostrando que danos fisiológicos também acontecem com o acúmulo no débito de sono ao longo do tempo. O sistema endócrino também é prejudicado após restrição crônica de sono através do aumento nos níveis de cortisol à noite, atraso do seu pico pela manhã, atraso na liberação de melatonina e no pico de GH (BANKS & DINGES, 2007).
Existem ainda evidências epidemiológicas que a redução na duração do sono está associada a maiores índices de massa corporal (IMC) influenciando na obesidade (LÓPEZ-GARCÍA et al., 2008; GANGWISCH et al., 2010; NISHIURA & HASHIMOTO, 2010). Spiegel et al. (2004a) estudaram 11 homens saudáveis durante 6 dias em que dormiram apenas 4 horas por noite e verificaram uma queda no níveis de leptina, importante hormônio que regula o balanço energético do organismo. Em outro estudo, Spiegel et al. (2004b) observaram um aumento na fome, no apetite e nos níveis de grelina, peptídeo que estimula o apetite, de 12 homens saudáveis após 2 noites seguidas dormindo apenas 4 horas. Essas alterações na regulação dos hormônios ligados ao apetite e à saciedade provocadas pela restrição de sono podem levar a ganho de peso e consequente obesidade.
Alterações nos padrões do sono ainda podem ser associadas a mudanças nos níveis de colesterol, como demonstraram Andersen et al. (2004a) quando analisaram alguns parâmetros sanguíneos de ratos jovens submetidos à PS por 96 horas, revelando altos níveis de HDL e LDL, baixas concentrações de VLDL e triacilglicerol e aumentado no consumo alimentar durante a PS acompanhado de queda de peso. D’Almeida et al. (2008) utilizando o mesmo protocolo em ratos observaram que após 96 horas de PS houve um aumento no colesterol total e na fração LDL e uma diminuição nos níveis de VLDL e triacilglicerol em comparação com o grupo controle.
Quando os autores uniram a PS por 96 horas ao consumo de uma dieta hiperlipídica previamente fornecida aos animais durante 65 dias, o colesterol total e as frações LDL e HDL mostraram-se aumentados enquanto os níveis de VLDL e triacilglicerol foram menores em relação ao grupo controle.
O sono também tem um papel biológico na reprodução já que participa da liberação de LH, FSH, prolactina, progesterona e testosterona. A secreção das gonadotropinas é pulsátil durante a noite, mas o LH apresenta aumento durante o sono REM que coincide com a liberação de testosterona. Segundo Evans et al. (1971), há uma queda nos níveis de testosterona no início do sono e um pico no primeiro episódio de sono REM quando podem ocorrer períodos de excitação e ereção peniana. A concentração se encontra alta também no início da manhã. Axelsson et al. (2005) comprovaram ainda que mesmo em condições reversas de sono, homens jovens saudáveis que dormiram durante o dia tiveram os mesmos níveis aumentados de testosterona durante o sono que os homens que dormiram a mesma quantidade de tempo durante a noite.
Andersen et al. (2005b) aplicaram um protocolo de PS por 96 horas aliada à dieta hiperlipídica tentando, em um dos raros trabalhos encontrados na literatura, associar ambos os fatores com comportamento sexual de ratos machos. Seus resultados mostraram que mesmo após de uma injeção de cocaína, cuja ação estimulante potencializa os reflexos genitais, ratos privados de sono e alimentados com dieta hiperlipídica diminuíram a frequência de ereções penianas e apresentaram queda nos níveis de testosterona e aumento na progesterona.
Outros trabalhos de Andersen et al. mostraram ligação entre desregulações no sono e mudanças no comportamento sexual de animais e seres
humanos. Andersen et al. (2010) examinaram a prevalência de queixas de disfunção erétil em 467 homens com idade entre 20 e 80 anos, da cidade de São Paulo. Os resultados mostraram que uma diminuição no tempo de sono REM e a fragmentação do sono tiveram efeitos significativos como fatores de risco para queixas de disfunção erétil, obesidade, baixo nível de testosterona e alto índice de apnéia obstrutiva.
Alvarenga et al. (2009) examinaram o comportamento sexual de ratos machos adultos submetidos, de maneira combinada ou separada, à restrição alimentar e PS de 96 horas. Os resultados mostraram que a perda do sono fez piorar o desempenho e a motivação para o início do comportamento sexual, afetando as respostas sexuais desses animais, reveladas pela diminuição da taxa copulatória e dos níveis de testosterona.
Goh & Tong (2010) observaram que em homens que relataram dormir menos de 4 horas ou entre 4 e 6 horas por noite os níveis de testosterona se apresentaram mais baixos do que naqueles que tinham mais de 6 horas de sono. Segundo esses autores, a queda desse importante hormônio andrógeno pode levar a consequências negativas sobre parâmetros sexuais nesses homens, interferindo em sua fertilidade.
2.3.1 Sono e estresse
Um dos principais sistemas neuroendócrinos envolvidos na resposta ao estresse é o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Um estímulo estressor percebido pelos sentidos e avaliado no cérebro induz a liberação do hormônio liberador de corticotropina (CRH) pelo hipotálamo. Este estimula a liberação do hormônio
adrenocorticotrófico (ACTH) pela hipófise e, posteriormente este hormônio estimula o córtex da glândula adrenal a liberar glicocorticóides sendo o cortisol o glicocorticóide mais comum nos seres humanos e a corticosterona em ratos (KUDIELKA & KIRSCHBAUM, 2005). Juntos, os hormônios do eixo HPA cumprem uma variedade de funções que levam o organismo a se adaptar aos desafios do ambiente, porém, se o estímulo estressor for muito longo, estes mesmos hormônios podem causar danos aos sistemas. Já foi extensamente relatado que a privação de sono pode levar a ativação do eixo HPA, um dos principais sistemas neuroendócrinos envolvidos na resposta ao estresse, elevando as concentrações plasmáticas de glicocorticóides tanto em humanos quanto ratos (COENEN & VAN LUIJTELAAR, 1985; MEERLO et al., 2002 e 2008; ANDERSEN et al., 2004b e 2005a; NOVATI et al., 2008).
Análises incluindo a PS como uma modalidade de estresse foram realizadas por Andersen et al. (2004b), que detectaram que a PS por 96 horas, dentre outras quatro modalidades utilizadas (natação forçada, choque nas patas, frio e imobilização) foi a que mais exerceu influência no aumento dos níveis de corticosterona plasmáticos e causou também decréscimo dos níveis de testosterona.
Não só o estresse da PS mostrou efeitos sobre o eixo HPA, a RS também foi qualificada como um agente estressor por Meerlo et al. (2002) que testaram dois protocolos de privação de sono em ratos, um com PS durante 48 horas e outro restringindo o sono para 4 horas por dia, durante 8 dias. Os resultados mostraram um aumento nos níveis de ACTH e corticosterona ao final da PS e no fim de cada 20 horas de restrição de sono, cujos valores eram restabelecidos após o sono de recuperação de 4 horas. Por isso, alterações no eixo HPA aparecem gradualmente sob condições de PS e após a redução repetida nas horas de sono (MEERLO et al., 2002).
