Procedimentos Analíticos
Gerais em Toxicologia
Gerais em Toxicologia
Profa. Verônica Rodrigues
• FARMACÊUTICA INDUSTRIAL - UFRJ• MESTRE EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - UFRJ • EX-DOCENTE - UNIPLI
• EX-PERITA LEGISTA - TOXICOLOGISTA - PCERJ
CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA
Análises Toxicológicas Forenses:
• Cadeia de custódia :
• Quem manuseou a amostra ou aliquota? • Quando tal manuseio ocorreu?
• Onde a amostra ou a aliquota foi obtida? • Considerações sobre a amostra:
O que coletar?
- Seleção da matriz biológica adequada:
conhecimentos da toxicocinética do analito
CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA
conhecimentos da toxicocinética do analito
concentração média do analito no material
amostrado
Ex.: Intoxicação por paraquat → pulmão
Quanto coletar?
- representatividade da amostra → técnica analítica
- quantidades de alíquotas: prova e contra-prova
Coleta e Preparo da Amostra
(toxicologia forense, exames de doping)
Onde coletar?
- uso de recipientes adequados que não contaminem as
Coleta e Preparo da Amostra
Fonte: Society of Forensic Toxicology, AAFS, 2002
Ao abrigo:
- luz (fotodegradação)
- calor (degradação térmica)
Estocagem e Conservação da Amostra
- calor (degradação térmica)
•refrigeração (~ 4 ºC)
•
congelamento
Adição de conservantes
- antimicrobianos (fluoreto de sódio) - anticoagulantes (heparina)
Estocagem e Conservação da Amostra
- antioxidantes (ácido ascórbico)
Inviolabilidade da amostra
- Autenticidade da amostra (laudo pericial) - Adulteração intencional ou acidental
Seleção de Amostras Biológicas
Seleção de Amostras Biológicas
Cuidados Gerais
1. Autenticidade
Garantia de que uma amostra de material biológico
pertence a uma dado indivíduo depende de fatores como:
Seleção de Amostras Biológicas
como:
- processo de coleta
- identificação da amostra
- adoção de critérios de inviolabilidade - transporte e armazenamento adequados
Algumas amostras precisam de cuidados especiais
para que a autenticidade da mesma possa ser garantida, como no caso da urina.
Garantia de cadeia de
custódia segura
Cuidados Gerais
2. Amostra de Tempo Anterior ao Uso
Importante garantir que o indivíduo não trará consigo
uma amostra autêntica (por exemplo, de urina) previamente coletada, mas em momento anterior ao uso da droga.
Seleção de Amostras Biológicas
da droga.
3. Adulteração
Representada pela adição de produtos químicos à amostra coletada.
Qualquer produto adicionado à amostra pode interferir
na análise enzimática e/ou cromatográfica.
Cuidados Gerais
4. Seleção Adequada da Amostra
Importante selecionar a amostra em função do local
onde o analito poderá ser encontrado
Amostras como sangue, urina, e tecidos são bastante
Seleção de Amostras Biológicas
Amostras como sangue, urina, e tecidos são bastante
usadas em análises toxicológicas.
Atualmente, amostras alternativas estão sendo
utilizadas em análises toxicológicas.
Exemplos incluem a saliva, para análise de drogas no
local de trabalho e em casos de suspeita de delitos ao volante; o cabelo, que pode ser usado para avaliar o histórico de uso de drogas.
Cuidados Gerais
5. Critérios de Conformidade da Amostra
Todos os critérios de conformidade da amostra para exame devem ser satisfeitos de modo a garantir a autenticidade da amostra e dar maior probabilidade de detecção ao teste.
Seleção de Amostras Biológicas
amostra e dar maior probabilidade de detecção ao teste.
Amostras coletadas sem supervisão, com indícios de adição de produtos químicos e que não foram aprovadas pelos testes de conformidade (pH, aspecto, densidade, creatinina, uréia, etc para urina, por exemplo) devem receber o laudo de “NÃO CONFORMIDADE”, independente da análise ter sido ou não realizada, ou de resultado positivo ou negativo. Informar no laudo o limite de detecção do método.
Urina
Urina
A coleta da urina requer cuidados em função do
constrangimento que a coleta pode causar ao periciado.
A privacidade requerida para a coleta da urina →
Amostras Biológicas Convencionais
A privacidade requerida para a coleta da urina →
Coleta de Urina Coleta de UrinaColeta de Urina Coleta de Urina
Critérios de Segurança
Atenção no momento da coleta
Avaliação da temperatura da amostra imediatamente após a coleta
Amostras Biológicas Convencionais
Obs.: esse critério pode ser falho.
Análise de uréia e creatinina (SAMSHA – Substance Abuse and
Mental Health Administration) - Creatinina ≥ 5mg/mL
- Densidade da urina entre 1001 ≤ d ≤ 1020
Importante: a adição de cloreto de sódio aumenta a densidade da amostra e pode interferir na triagem por ensaio enzimático.
Coleta de Urina
Cuidados Gerais
Diluição da Amostra
Adição intencional x ingestão de grandes
quantidades de água
O excesso de água provoca uma queda na
Amostras Biológicas Convencionais
O excesso de água provoca uma queda na
concentração da urina e pode afetar a detecção na fase de triagem.
Como contornar o problema da diluição? Avaliação da
creatinina urinária e densidade.
Valores médios: - creatinina: 20-40 mg/dL - densidade: 1003 - 1010
(varia entre os autores)
Cuidados Gerais
Diluição da Amostra - continuação
SAMSHA – amostras diluídas
- creatinina: < 20 mg/dL
Amostras Biológicas Convencionais
- creatinina: < 20 mg/dL - densidade: < 1003
Em casos de não conformidade com os parâmetros
estabelecidos, recomenda-se a coleta de uma
segunda amostra para exame (se possível)
Table 1
Common Adulterants
ADULTERANTS ASSAYS AFFECTED DETECTION MEANS Water (DILUTION) All Creatinine, Specific Gravity
Adulterantes e Ensaios para Detecção dos Mesmos em Urina
Amostras Biológicas Convencionais
Ammonia All Odor, pH
Bleach All, esp. THC Odor
Glutaraldehyde (URINEAID) All, esp. THC Bizarre data
Soap/Detergent All, esp. THC Bizarre data, foams, odor Nitrite (KLEAR) THC Specific Test
Chromate (URINE LUCK) THC Specific Test
Peroxidase (STEALTH) THC Test under consideration Comment: There are dipsticks available which allow for adulterant testing at the collection site. This has advantage of early detection of unstable adulterants like bleach and STEALTH which can degrade and are harder to detect in the lab.
Sangue
Sangue
Sangue e seus derivados são amostras de especial
importância nas análises toxicológicas
Dentre os derivados do sangue, o soro possui como
Amostras Biológicas Convencionais
Dentre os derivados do sangue, o soro possui como
vantagem o fato de que nenhum aditivo (anticoagulante) foi adicionado à amostra, mantendo sua composição inalterada.
Em indivíduos vivos, os efeitos fisiológicos da maioria dos
fármacos possuem correlação direta com suas
concentrações sanguíneas.
Atenção em sangue coletados post-mortem
Sangue
Sangue Post
Post-
-Mortem
Mortem
A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva a
alterações na concentração sérica de drogas. após a morte. Isso é chamado de redistribuição post-mortem
Amostras Biológicas Convencionais
Ocorre principalmente por difusão da droga do sangue para
sítios vizinhos, (tecidos e órgãos), como de conteúdo do estômago.
Este processo é particularmente importante para fármacos
com alta em liposolubilidade.
O sangue coletado do fundo do coração e outros sítios
Sangue post-mortem - observações:
- punção das veias subclávia (braço) e/ou femoral (perna)
Amostras Biológicas Convencionais
(perna)
- cuidados com a viscosidade do sangue - cuidado com a descontaminação do local
- atenção no transporte e manuseio – lise das hemácias
A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva a
alterações na concentração sérica de drogas. após a morte. Isso é chamado de redistribuição post-mortem
Exemplos de fármacos particularmente sujeitos à
Amostras Biológicas Convencionais
redistribuição post-mortem: • fenotiazinas • dextropropoxifeno • propranolol • metadona • antidepressivos tricíclicos. • amfetamines • barbitúricos • cocaína • cloroquina • digoxina
Coleta de sangue post-mortem
Cabelo
Cabelo
Um Breve Histórico
Os primeiros trabalhos sobre a utilização de cabelo
como amostra para exame toxicológico surgiram a partir de 1857 – indivíduo morto há 11 anos, vítima de
Amostras Biológicas Não-Convencionais
partir de 1857 – indivíduo morto há 11 anos, vítima de intoxicação por arsênico.
Cerca de 100 mais tarde ocorreu a detecção do
fenobarbital em pêlos de cobaia após exposição oral ao medicamento.
Na década de 1960 e 1970, a análise do cabelo foi
impulsionada pelo desenvolvimento da espectroscopia de absorção atômica (análise de metais pesados).
Um Breve Histórico
1979 – Primeiro trabalho publicado sobre detecção de
drogas em cabelo humano
Técnica de radioimunoensaio para detecção de opiáceos em
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Na década de 1980 – o desenvolvimento da CG/EM
permitiu um crescimento nas pesquisas de substâncias orgânicas em cabelos.
para detecção de opiáceos em amostras de usuários de heroína
Pesquisa envolvendo cocaína, canabinóides e anfetaminas
Vantagens da Técnica
Maior janela de detecção (semanas ou meses), contra
2-4 dias para a maioria das drogas na urina e sangue.
Para fins práticos, os dois testes se complementam.
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Para fins práticos, os dois testes se complementam.
Urina e sangue: fornecem informações a curto prazo
sobre o uso de drogas por parte de um indivíduo, enquanto histórias de longo prazo são acessíveis através da análise do cabelo.
A análise do cabelo pode fazer a distinção entre o uso
Biologia do Cabelo
Cabelo é um produto de órgãos diferenciados na pele dos
mamíferos. Ela difere em indivíduos apenas em quantidade, cor e textura.
Amostras Biológicas Não-Convencionais
O cabelo é basicamente proteínas (65-95%, basicamente de queratina), juntamente com a água (15-35%) e lipídios (1-9%). O conteúdo mineral do cabelo varia de 0,25% a 0,95%.
O número total de folículos pilosos em adultos é estimada
em cerca de 5 milhões, com um milhão encontrado na cabeça. Os folículos pilosos são implantados no epitélio da epiderme da pele, aproximadamente 3-4 mm abaixo da superfície da pele.
Secção longitudinal do folículo piloso
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Crescimento capilar
Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos,
alternando períodos de crescimento e de quiescência.
1 - Fase anágena: o cabelo é produzido durante 4 a 8 anos
(cabelos da cabeça) e 12 meses (cabelo não-cabeça) com
Amostras Biológicas Não-Convencionais
(cabelos da cabeça) e 12 meses (cabelo não-cabeça) com uma taxa de aproximadamente 0.22–0.52 mm / dia ou 0.6– 1.42 cem / mês para cabelos da cabeça (taxa de crescimento depende do tipo de cabelo e localização anatômica).
2 - Fase catágena: o folículo entra em um período de
transição de cerca de duas semanas, durante o qual deixa de divisão celular e do folículo começa a degenerar.
Crescimento capilar
3 - Fase telógena: período de descanso ou repouso,
de cerca de 10 semanas, durante o qual o eixo do cabelo pára de crescer completamente e crescimento do cabelo começa a desligar.
Amostras Biológicas Não-Convencionais
do cabelo começa a desligar.
No couro cabeludo de um adulto, aproximadamente
85% dos cabelos está na fase de crescimento e os restantes 15% estão em uma fase de descansando.
Fases do Crescimento Capilar
Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo
Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos, alternando períodos de crescimento e de quiescência.
As drogas podem ser incorporadas no cabelo através de 3 mecanismos:
Amostras Biológicas Não-Convencionais
3 mecanismos:
• a partir do sangue, durante a formação do cabelo
• a partir de suor e sebo
• a partir do ambiente externo
O cabelo é muito poroso e pode aumentar sua massa em
até 18% a partir da absorção de líquidos. Assim, medicamentos podem ser transferidas facilmente para o cabelo através do suor.
Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Estabilidade de Drogas em Cabelo
O mecanismo exato pelo qual os produtos químicos estão ligados no cabelo não é totalmente conhecido.
1 - Ligação à melanina
2 - Ligação de drogas com os grupos sulfidrilas dos
Amostras Biológicas Não-Convencionais
2 - Ligação de drogas com os grupos sulfidrilas dos aminoácidos presentes no cabelo.
Estudos in vitro demonstraram que fármacos podem
permanecer quimicamente estáveis por vários meses.
A meia vida da cocaína no cabelo foi determinda em
Procedimentos para Coleta de Amostras
Procedimentos de coleta para a análise do cabelo para
as drogas não foram padronizados.
Na maioria dos estudos publicados, as amostras são
Amostras Biológicas Não-Convencionais
obtidas a partir de locais aleatórios no couro cabeludo.
O cabelo é melhor coletadas de área na parte de trás
da cabeça, chamado de vértice posterior.
vértice posterior da cabeça
Procedimentos para Coleta de Amostras
Fios de cabelo são cortados o mais próximo possível
do couro cabeludo, e sua localização no couro cabeludo é anotado.
Depois de coletados, amostras de cabelo podem ser
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Depois de coletados, amostras de cabelo podem ser
armazenadas à temperatura ambiente em papel de alumínio, um envelope ou um tubo de plástico.
O tamanho da amostra varia consideravelmente entre
os laboratórios e depende da droga para ser analisado e da metodologia de teste a ser aplicada.
Exemplo: 100 mg de cabelo são recomendados para análise do fentanil ou buprenorfina.
Análise Toxicológica
1 - Processo inicial de descontaminação (lavagem) para a maioria dos métodos
Soluções ácidas diluídas,
soluções alcoólicas, detergentes
Amostras Biológicas Não-Convencionais
2 – Pulverização da amostra e digestão
soluções alcoólicas, detergentes ou mesmos solventes orgânicos
Condições variáveis de tempo e temperatura
química ácida química alcalina enzimática
Análise Toxicológica
3 – Extração com solvente orgânico (ex: metanol) 4 – Análise por CG/EM
Imunoensaios podem ser utilizados
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Imunoensaios podem ser utilizados
Considerações importantes: - método deve ser sensível
- detecção da forma
inalterada
(na urina, são os
metabólitos)
1- Análise dos resíduos de extração
2- Suspensão do resíduo com solução tampão
Análise Toxicológica de Drogas em Cabelo
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Saliva
Saliva
Definições
A saliva é o produto da secreção das glândulas
salivares presentes na boca.
Amostras Biológicas Não-Convencionais
salivares presentes na boca.
No entanto, os fluidos encontrados na cavidade oral
são uma mistura de saliva, predominantemente, com
pequenas quantidades de fluido gengival, restos
celulares e de sangue.
Saliva
Saliva
Definições
Em 1993, o encontro do New York Academy of
Sciences definiu:
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Sciences definiu:
- saliva: palavra por secreções glandulares coletados diretamente as glândulas salivares (geralmente as parótidas);
- fluido oral: o fluido recolhido na cavidade bucal ou pela expectoração.
Um Breve Histórico
A passagem de fármacos da corrente sanguínea para a
saliva já havia sido sugerida desde a segunda metade da década de 1960.
A utilização da matriz biológica só veio a aumentar
Amostras Biológicas Não-Convencionais
significativamente na última década: - estudos farmacocinéticos - monitorização terapêutica
- verificação do uso de substâncias ilícitas
(Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira. 2008. )
Importante na vigilância de motoristas sobre o uso de
Anatomia e Fisiologia da Saliva
As glândulas salivares humanas produzem entre 0,5 e
1,5 L de saliva por dia.
Durante o repouso, mais saliva misturada é fornecido
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Durante o repouso, mais saliva misturada é fornecido
pelas glândulas submandibular (70%), com uma menor quantidade das glândulas parótidas (25%) e o restante das glândulas sublinguais (5%)
A saliva é composta por 99% de água, 0,3% de
Anatomia das Glândulas Salivares
Vantagens e Desvantagens
Vantagens:
- facilidade de obtenção
- coleta assistida (dificulta adulterações)
Amostras Biológicas Não-Convencionais
- coleta sem constrangimentos - coleta não-invasiva
- É possível traçar paralelos com a concentração sanguínea!
Útil em estudos
farmacocinéticos e análises forenses
Vantagens e Desvantagens
Desvantagens:
- detecção do fármaco livre no plasma
curta janela de detecção!
Amostras Biológicas Não-Convencionais
- amostras em pequenas quantidades
- estados patológicos e emocionais podem inibir a
secreção salivar, diminuindo ainda mais a
disponibilidade do material
- solubilidade adequada e forma não-ionizada no plasma.
Aspectos Farmacocinéticos
A maioria dos xenobióticos chega à saliva por difusão
simples através das membranas celulares que compõem os túbulos salivares.
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Para que os xenobióticos cheguem à saliva é
necessário:
- que estejam na forma livre
- que estejam na forma não-ionizada - que possuam solubilidade adequada
Aspectos Farmacocinéticos
pH da saliva mais ácido que pH do sangue
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Acúmulo na saliva de bases fracas
Compostos ionizados não retornam ao plasma
Coleta de Amostra
A maior vantagem da saliva é a possibilidade de que a
amostra pode ser coletada do doador em observação.
A amostra pode ser coletada logo após o momento do
Amostras Biológicas Não-Convencionais
A amostra pode ser coletada logo após o momento do
incidente.
Coleta não invasiva e pode ser feito pelos próprios
doadores na maioria das situações.
Uma série de dispositivos estão disponíveis para a
Coleta de Amostra
O coletor emprega um rolo de algodão dental (poliéster), que é mastigado pelo doador por 30-45 segundos, com ou sem
Amostras Biológicas Não-Convencionais
30-45 segundos, com ou sem estimulação do ácido cítrico. Após ser embebido com fluido
oral, o rolo de algodão é
colocado em um recipiente que se encaixa em um tubo de centrífuga. O algodão absorve 1-1,5 mL de fluido oral.
Coleta de Amostra
Dispositivos de coleta mais modernos geralmente usam um material absorvente em uma haste semelhante ao utilizado para testes de álcool na saliva. O dispositivo ao lado consiste
Amostras Biológicas Não-Convencionais
O dispositivo ao lado consiste em um bloco de papel de filtro impregnado com sais de tampão em uma haste de plástico. O bloco é colocado na boca por 2-5 minutos. Após a coleta, o papel é colocado em um tubo com líquido conservante e enviadas ao laboratório para análise. Absorção de cerca de 0,4 mL de fluido oral.
Coleta de Amostra
Amostras Biológicas Não-Convencionais
O coletor Cozart Rapiscan usa uma almofada de algodão
absorvente destacável em um indicador de punho. Depois que o indicador passou de branco para azul, que indica que 1 mL de saliva foram coletadas, a almofada pode ser destacada e mantida em um tubo de ensaio que contém conservante tampão até a análise.
Coleta de Amostra
O coletor Finger (utiliza uma
propriedade odontológico
absorvente (espuma
Amostras Biológicas Não-Convencionais
absorvente (espuma
AccuSorb), que absorve a saliva, quando colocado na boca por alguns minutos. A saliva é extraída a partir da pressão do dedo sobre o material absorvente.
Coleta de Amostra
O teste de saliva
DrugWipe tenta limpar a língua com um pino de limpeza e transferir os fluidos orais recolhidos
Amostras Biológicas Não-Convencionais
fluidos orais recolhidos por lavá-lo em uma tira de teste.
O DrugWipe testa
substâncias como
maconha, cocaína e crack, opiáceos como a heroína, morfina e metadona Todos
os medicamentos da
classe das anfetaminas e
ecstasy, bem como os
DrugWipe DrugWipe
Testes de Confirmação
Quando os imunoensaios são utilizados como testes de
triagem para drogas na saliva, testes cromatográficos deve ser utilizada para confirmação.
Amostras Biológicas Não-Convencionais
Eles devem ser capazes para detectar os níveis de
drogas que aparecem na saliva.
Métodos CG/EM foram relatadas para a confirmação
