Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador-Bahia 2013
CONTAGEM DE FOLÍCULOS ANTRAIS EM FÊMEAS NELORE SUBMETIDAS A UM PROTOCOLO DE IATF
ALEXANDRA SOARES RODRIGUES
CONTAGEM DE FOLÍCULOS ANTRAIS EM FÊMEAS NELORE
SUBMETIDAS A UM PROTOCOLO DE IATF
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos, da Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho
SALVADOR – BA
FEVEREIRO – 2013
CONTAGEM DE FOLÍCULOS ANTRAIS EM FÊMEAS NELORE SUBMETIDAS A UM PROTOCOLO DE IATF
Alexandra Soares Rodrigues
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador, 25 de fevereiro de 2013
BIOGRAFIA DO AUTOR
ALEXANDRA SOARES RODRIGUES, filha de José Rodrigues dos Santos e Maria Nilda Soares Rodrigues, nasceu em 19 de junho de 1986, na cidade de Salvador, estado da Bahia. Iniciou o curso de graduação em Medicina Veterinária em 01 de junho de 2004 e em 05 de agosto de 2010 concluiu a graduação. Em 01 de março de 2011, ingressou no programa de Pós-graduação em Ciência Animal nos Trópicos, pela Universidade Federal da Bahia, sob orientação do professor Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho, defendendo a dissertação de mestrado em 25 de fevereiro de 2013.
“Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o que, com frequência, poderíamos ganhar, por simples medo de arriscar.”
Willian Shakespeare
“Saber não é suficiente; devemos aplicar. Querer não é suficiente; devemos fazer.” Von Goethe
Este trabalho é dedicado a minha mãe Maria Nilda Soares Rodrigues e meu pai José Rodrigues dos Santos que exerceram apoio fundamental em todas as etapas da minha formação profissional, proporcionando coragem e determinação para continuar e superar os obstáculos impostos.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me proporcionado força e coragem para conclusão de mais uma etapa da vida.
A meus pais, José Rodrigues dos Santos e Maria Nilda Soares Rodrigues, meu irmão, Amós Soares Rodrigues, e demais familiares por todo amor, carinho, confiança, assim como, a compreensão da necessidade da ausência nas diversas datas comemorativas.
A meu orientador, Professor Antonio de Lisboa Ribeiro Filho pela confiança e amizade construída durante todos estes anos, desde a época da iniciação científica; além da ajuda e orientação em diversos momentos, sobretudo, nos primeiros passos do exercício da medicina veterinária. Um verdadeiro exemplo de vida, proporcionando a seus orientados grande experiência profissional e pessoal.
Ao professor Marcos Chalhoub Coelho Lima pela grande participação na minha formação acadêmica, representando um coorientador e estando sempre disponível nos momentos de necessidade, assim como, pela emissão de sugestões relevantes e engrandecedoras em todos os trabalhos desenvolvidos pelo grupo de estudos de fisiopatologia da reprodução animal nos trópicos.
Aos Colegas de profissão e grandes amigos formados durante esta trajetória, Sidnei Oliveira, Marcus Vinícius, Priscila Ferraz, Bruno Henrique, Endrigo Adonis, Carlos Henrique e Alana Carvalho pela ajuda na execução das etapas do experimento, pela paciência de conviver durante momentos críticos e estressantes que foram cruciais na realização desta pesquisa, assim como, o apoio nas demais atividades profissionais sempre desenvolvidas em equipe. Sem vocês com certeza, não conseguiria chegar até aqui!
A Fazenda Conceição do Lucas e sua equipe técnica por ter cedido os animais e a infraestrutura essencial no desenvolvimento do trabalho.
A professora Thereza Cristina Borio dos Santos Calmon de Bittencourt pela colaboração na análise estatística do estudo.
Ao Setor de Reprodução Animal, em particular, o Laboratório de Fisiopatologia da Reprodução Animal da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EMEVZ) da UFBA que mesmo com todas as dificuldades concedeu os equipamentos necessários
para desenvolvimento da pesquisa. Diante das melhoras conseguidas pelo setor nos últimos anos, fica evidenciado que trabalhos cada vez mais engrandecedores serão executados por este grupo na área da reprodução animal.
A todos os estagiários, colegas, funcionários e professores do Laboratório de Fisiopatologia da Reprodução Animal da EMEVZ-UFBA que contribuíram na execução do experimento e na minha formação profissional.
A Coordenação Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos de suma importância para desenvolvimento deste trabalho.
A Bahia Embrio e sua equipe técnica pelo apoio na realização de experimentos pilotos que foram essenciais na aquisição de experiência para a realização deste estudo.
As grandes amigas Roberta do Valle, Leila Oliveira, Jamille Machado, Cintia Araújo e Lívia Ramos pela cumplicidade, confiança e afetividade cultivada ao longo dos diversos anos de convivência e amizade.
Aos colegas e amigos que proporcionaram diversos momentos de descontração imprescindíveis para a continuidade desta pesquisa tornando as atividades menos cansativas e enfadonhas.
Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para alcançar esta conquista. Muito Obrigada!
LISTA DE FIGURAS
Contagem de folículos antrais em fêmeas Nelore submetidas a um protocolo de IATF
Página Figura 1. Representação esquemática do protocolo de
sincronização objetivando a inseminação artificial em tempo fixo (IATF), utilizado para mensuração do diâmetro ovariano (DOV) e da contagem de folículos antrais (CFA)
37
Figura 2. Frequência de distribuição do número de folículos antrais ≥3mm detectados por avaliação ultrassonográfica de fêmeas Nelore (n=481) submetidas a um protocolo de IATF
40
Figura 3. Distribuição geral das fêmeas Nelore (n=481) nas categorias de baixa, intermediária e alta contagem de folículos antrais (CFA)
LISTA DE TABELAS
Contagem de folículos antrais em fêmeas Nelore submetidas a um protocolo de IATF
Página Tabela 1. Categorização geral da contagem de folículo antrais (CFA)
em fêmeas Nelore e após a estratificação dos animais de acordo com alguns parâmetros reprodutivos e o índice de escore corporal (IEC)
42
Tabela 2. Comparação do intervalo pós-parto (IPP), do diâmetro ovariano (DOV), do índice de escore corporal (IEC) e da taxa de concepção (TC) em fêmeas Nelore de diferentes categorias de contagem de folículos antrais (CFA) submetidas a um protocolo de IATF
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Tabela 3. Efeito da categoria animal, do intervalo pós-parto (IPP), do diâmetro ovariano (DOV) e do índice de escore corporal (IEC) sobre a contagem de folículos antrais (CFA) em fêmeas Nelore submetidas a um protocolo de IATF
LISTA DE SIGLAS
%: por cento 2
: Qui-quadrado µg: Microgramas
Alto IEC: Alto índice de escore corporal AMH: hormônio anti-mülleriano
Baixo IEC: Baixo índice de escore corporal BE: Benzoato de Estradiol
CBRA: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CE: Cipionato de Estradiol
CFA: Contagem de folículos antrais Cm: Centímetro
D0: Dia 0 D4: Dia 4 D8: Dia 8 D10: Dia 10
DOV: diâmetro ovariano DOV1: diâmetro ovariano 1 DOV2: diâmetro ovariano 2 DOV3: diâmetro ovariano 3
eCG: Gonadotrofina coriônica equina FGE: fator de crescimento epidérmico
FGF2: fator de crescimento fibroblástico básico FOL: folículos
FSH: hormônio folículo estimulante GDF9: fator de crescimento e iniciação-9 GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas h: horas
IA: Inseminação artificial
IATF: inseminação artificial em tempo fixo IEC: Índice de escore corporal
IGF: fator de crescimento semelhante à insulina IGFBP-1: Proteína ligante 1 ao IGF
IGFBP-2: Proteína ligante 2 ao IGF IGFBP-3: Proteína ligante 3 ao IGF IGFBP-4: Proteína ligante 4 ao IGF IGFBP-5: Proteína ligante 5 ao IGF IGFBP-6: Proteína ligante 6 ao IGF
IGF-I: fator de crescimento semelhante à insulina I IGF-II: fator de crescimento semelhante à insulina II im: intramuscular
Intermediário IEC: Intermediário índice de escore corporal IPP: intervalo pós-parto
IPP1: Intervalo pós-parto 1 IPP2: Intervalo pós-parto 2 IPP3: Intervalo pós-parto 3
KL: fator de crescimento de células tronco km: Quilômetros LH: hormônio luteinizante m: Metros mg: Miligramas Mhz: Megahertz mm: Milímetros NOV: Novilha ºC: Graus Celsius
P4: dispositivo intravaginal de liberação de progesterona PGF2α: prostaglandina F2α
S: Desvio-padrão
SPSS: Statistical Package for Social Science TGF β: fator de crescimento transformante β U.I.: Unidades internacionais
VP: Vaca Parida VS: Vaca Solteira
SUMÁRIO
Contagem de folículos antrais em fêmeas Nelore submetidas a um protocolo de IATF Página Resumo 1 Abstract 3 Introdução 5 Objetivos 7 Hipóteses 7 Revisão de Literatura 8
Fisiologia do ciclo estral em fêmeas zebuínas 8
Oogênese 11
Foliculogênese 13
Foliculogênese pré-antral: fatores intraovarianos e extraovarianos 13 Foliculogênese antral: fatores intraovarianos e extraovarianos 16
Avaliação da população folicular 23
Causas da variação da população folicular 29
Consequências da variação da população folicular 32
Material e Métodos 35
Local e época da pesquisa 35
Animais 36 Experimento 36 Delineamento experimental 38 Procedimentos estatísticos 39 Resultados e Discussão 40 Conclusões 47 Referências 48
Contagem de folículos antrais em fêmeas Nelore submetidas a um protocolo de IATF
RESUMO
Objetivou-se categorizar a contagem de folículos antrais (CFA) em animais da raça Nelore, e posteriormente determinar o efeito de alguns parâmetros reprodutivos e do índice de escore corporal (IEC) sobre a CFA, assim como, comparar as taxas de concepção entre fêmeas Nelore com distintas categorias de CFA submetidas a um protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Para tanto, 481 fêmeas Nelore foram submetidas a um protocolo de sincronização da onda de desenvolvimento folicular, do estro e da ovulação. No D4 do protocolo as fêmeas foram avaliadas por ultrassonografia transretal utilizando-se um transdutor linear de 8Mhz, sendo determinado o diâmetro ovariano (DOV) e a população folicular antral, esta última foi mensurada por meio da contagem de folículos antrais ≥3mm. As inseminações foram executadas utilizando-se sêmen criopreservado. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia transretal. Para estudar as características de interesse as fêmeas de distintas categorias animais foram subdivididas nos grupos, vaca parida (VP, n=313), vaca solteira (VS, n=70) e novilha (NOV, n=98), posteriormente, as VP que apresentavam ≤63, entre 63 e 105 e ≥105 dias pós-parto foram subdivididas em IPP1 (n=91), IPP2 (n=91) e IPP3 (n=94), respectivamente. Subsequentemente, de acordo com o DOV as fêmeas que apresentavam ovário com diâmetro ≤1,90, entre 1,90 e 2,50 e ≥2,50cm foram agrupadas, respectivamente, em DOV1 (n=50), DOV2 (n=73) e DOV3 (n=93) e finalmente, levando em consideração o IEC, os animais que apresentavam IEC ≤2, entre 2 e 3 e ≥3 foram nomeados, respectivamente, como Baixo (n=42), Intermediário (n=125) e Alto IEC (n=144). As fêmeas apresentaram uma CFA média de 46,56±22,62 folículos (FOL), verificando-se grande variabilidade individual para esta característica, oscilando de 7 a 145 FOL/ animal. De acordo com a média da CFA e a maior população folicular intrinsecamente apresentada pelas fêmeas Nelore, se sugeriu uma categorização da CFA exclusiva para esta raça, a qual considerou baixa CFA ≤34, intermediária CFA entre 34 e 53 e alta CFA ≥53 FOL/animal. A categoria animal, o IPP e o IEC não afetou a CFA dos animais, entretanto, houve diferença entre as médias de
CFA nas distintas classes de DOV e verificou-se uma correlação positiva e significativa entre o DOV e a CFA. Em relação à fertilidade não foi demonstrado efeito da CFA sobre as taxas de concepção das fêmeas submetidas à IATF. Os resultados encontrados sugerem que fêmeas Nelore apresentam elevada média de CFA e alta variabilidade individual necessitando de uma categorização da CFA específica para esta raça. A CFA parece ser uma característica intrínseca se mantendo constante independente do status fisiológico do animal. O DOV pode ser inserido como parâmetro para predizer a CFA, no entanto a CFA não afeta a performance reprodutiva em programas de IATF.
Palavras-chave: Bos taurus indicus, Fertilidade, Inseminação artificial, População folicular antral
Antral follicle count in Nellore females subjected to a FTAI protocol
ABSTRACT
This study aimed to categorize the antral follicle count (AFC) in Nellore females, and subsequently determine the effect of some reproductive parameters and index of body condition (IEC) on the AFC, as well as compare conception rates among Nellore females with different categories of CFA subjected to a fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol. For that, 481 Nellore females were submitted a synchronization protocol wave of follicular development, oestrus and ovulation. In D4 protocol females were evaluated by transrectal ultrasonography using a linear transducer of 8Mhz, being determined ovarian diameter (OVD) and antral follicle population, this latter was measured by counting the number of antral follicles ≥3mm. The inseminations were performed using cryopreserved semen. The pregnancy diagnosis was performed by transrectal ultrasonography. To study the characteristics of interest, the females of different animal categories were subdivided into groups, parity cow (PC, n=313), single cow (SC, n=70) and heifers (HEF, n=98), after the PC that had ≤63, between 63 and 105 and ≥105 days postpartum were subdivided into IPP1 (n=91), IPP2 (n=91) and IPP3 (n=94), respectively. Subsequently, according to the OVD, females that had ovarian diameter ≤1.90, between 1.90 and 2.50 and ≥2.50cm were grouped, respectively, in OVD1 (n=50), OVD2 (n=73) and OVD3 (n=93). Finally, taking into account the IEC, animals that had ≤2, between 2 and 3 and ≥3 were, respectively, appointed as Low (n = 42), Intermediate (n = 125) and High IEC (n = 144). The females showed an average AFC of 46.52±22.47 follicles (FOL), verifying large individual variability for this trait, ranging from 7 to 145 FOL/animal. According to this the average of the AFC and the largest population follicular intrinsically presented by the Nellore females, it was suggested that a specific categorization for this breed, which was considered low AFC ≤34, intermediate AFC between 34 and 53 and high AFC ≥53 FOL/animal. The animal category, the IPP and the IEC did not affect AFC of the animals, however, there was a difference between the mean AFC in the different classes of OVD, and the correlation between OVD and CFA was positive and significant. Regarding fertility has not been demonstrated effect of CFA on conception rates of
females inseminated. The results suggest that Nellore females have higher average AFC and great individual variability requiring a categorization of the AFC specifically for this breed. The AFC seems to be an intrinsic characteristic remained constant regardless of the physiological status of the animal. The OVD can be inserted as a parameter to predict the AFC, however the AFC doesn’t affect reproductive performance in FTAI programs.
Keywords: Antral follicular population, Artificial insemination, Bos taurus indicus, Fertility
INTRODUÇÃO
A bovinocultura de corte constitui uma das principais atividades econômicas que impulsionam o agronegócio mundial (MARQUES et al., 2008). No Brasil este setor agropecuário representa a maior parcela do efetivo bovino de aproximadamente 213 milhões de cabeças, colocando o país na posição de maior rebanho comercial do mundo (IBGE, 2011). No entanto, a pecuária de corte brasileira se caracteriza por criações extensivas com baixos índices de produtividade que se tornam uma ameaça constante ao status de maior exportador mundial de carnes, devido às intensas disputas mercadológicas com outros importantes países exportadores (BARCELLOS et al., 2006).
Segundo Baruselli et al. (2004) o comprometimento dos índices produtivos da bovinocultura de corte brasileira fica ainda mais acirrado pelo fato da maioria deste contingente populacional pertencer a subespécie zebuína e particularmente, a raça Nelore, a qual é historicamente caracterizada por uma baixa eficiência reprodutiva em decorrência das suas peculiaridades fisiológicas, que dentre outros fatores, podem dificultar a implementação de biotecnologias da reprodução como a inseminação artificial (IA).
Entretanto, nas últimas décadas tem-se verificado uma intensa utilização de programas de sincronização do estro e da ovulação que permitem a realização da inseminação artificial em tempo fixo (IATF), minimizando os impactos da detecção de estro e do anestro pós-parto característicos dos programas de IA convencional em fêmeas Bos taurus indicus (MENEGHETTI et al., 2009). Segundo Baruselli et al. (2012) a IATF tem sido apontada como a grande responsável pelo crescimento do emprego da IA no rebanho brasileiro, chegando a marca de 10% de fêmeas em idade reprodutiva inseminadas no ano de 2011.
Apesar da evolução alcançada pelos modernos programas de IATF, os índices de concepção obtidos ainda são baixos, encontrando-se entre 40 a 50% (BÓ et al., 2003). Diante deste cenário e do nível tecnológico alcançado pelos protocolos hormonais para IATF, uma das possibilidades de se superar estes baixos índices encontra-se na associação entre a IATF e os recentes achados fisiológicos a respeito da população folicular ovariana em bovinos (BARUSELLI et al., 2012; EVANS et al., 2012).
Segundo Burns et al. (2005) a população folicular antral é uma característica de alta variabilidade e repetibilidade individual e alguns indícios sugerem que este parâmetro afeta uma multiplicidade de aspectos reprodutivos que acabam por impactar direta ou indiretamente na fertilidade em bovinos (IRELAND et al., 2008; JIMENEZ-KRASSEL et al., 2009; SANTOS et al., 2012a).
Neste contexto, a partir de diversos estudos enumerando e catalogando a quantidade de folículos antrais em novilhas e vacas Bos taurus taurus com aptidão para corte ou leite, lactantes ou não, observou-se que o número de folículos se mantém constante independente do status fisiológico do animal, entretanto, existem mecanismos intrínsecos responsáveis por inferir um padrão específico para cada fêmea individualmente (EVANS et al., 2010).
Burns et al. (2005) e Ireland et al. (2007) caracterizaram a população folicular antral em fêmeas taurinas demonstrando uma oscilação do número de folículos entre oito a 54. Estes autores padronizaram a população folicular para esta subespécie em três categorias de acordo com a contagem de folículos antrais (CFA), sendo denominadas de baixa, intermediária e alta CFA as vacas que apresentaram, respectivamente, ≤15, entre 15 e 25 e ≥25 folículos antrais. Adicionalmente a estes achados Cushman et al. (2009) demonstraram que a CFA não sofre grandes variações ao longo do ciclo estral e que existe uma alta correlação com o tamanho do ovário, o que facilita a mensuração desta característica.
A variabilidade da CFA tem gerado consequências importantes sobre a qualidade oocitária e embrionária, além de uma reduzida capacidade de síntese de progesterona e de crescimento endometrial nas fêmeas que apresentaram um número consistentemente baixo de folículos (CUPP et al., 2011; IRELAND et al., 2008, 2011; JIMENEZ-KRASSEL et al., 2009), estas evidências fisiológicas de comprometimento da fertilidade foram recentemente confirmadas por Mossa et al. (2012) em programas de inseminação artificial convencional em vacas Holandesas.
Desta forma, a população folicular antral pode ser um dos parâmetros que afeta as taxas de concepção em programas de IATF (BARUSELLI et al., 2012; EVANS et al., 2010). Entretanto, a literatura aponta uma escassez de estudos abordando o efeito da CFA sobre IATF e em fêmeas Nelore, e a maioria dos trabalhos existentes desconsidera
as particularidades desta raça adotando a divisão em categorias de contagem de folículos estabelecida para fêmeas taurinas (EVANS et al., 2012).
OBJETIVOS
Considerando a necessidade de informações precisas e específicas a respeito da CFA em animais da raça Nelore, os objetivos desta pesquisa foram:
Categorizar a CFA em bovinos da raça Nelore.
Determinar o efeito de alguns parâmetros reprodutivos e do índice de escore corporal (IEC) sobre a CFA em vacas Nelore previamente preparadas para um programa de IATF.
Comparar as taxas de concepção entre fêmeas Nelore com distintas categorias de CFA submetidas a um protocolo de IATF.
HIPÓTESES
Ao realizar este trabalho hipotetisou-se que:
As fêmeas Nelore apresentam em média uma elevada CFA e uma alta variabilidade individual, em relação aos dados previamente reportados na literatura para as raças taurinas, sendo necessário o estabelecimento de uma categorização da CFA específica para esta raça.
A CFA é uma característica intrínseca em fêmeas Nelore, que não sofre influência da categoria animal, do intervalo pós-parto (IPP) e do IEC, se mantendo constante independente do estágio fisiológico dos animais, entretanto, a CFA encontra-se relacionada ao diâmetro ovariano (DOV).
A CFA afeta importantes aspectos reprodutivos como a fertilidade em bovinos da raça Nelore submetidos a um protocolo de IATF.
REVISÃO DE LITERATURA
Fisiologia do ciclo estral em fêmeas zebuínas
O ciclo estral corresponde a um padrão rítmico de eventos fisiológicos e um conjunto de modificações endócrinas que os animais apresentam em períodos regulares, resultando em mudanças na morfologia do sistema genital e no comportamento do animal (FERREIRA, 2010). Na fêmea bovina o ciclo estral tem duração média de 21 dias e constitui um conjunto de eventos cíclicos que ocorrem entre dois estros ou duas ovulações, os quais levam a um contínuo crescimento e regressão de folículos e formação de corpo lúteo, oferecendo as fêmeas repetidas oportunidades de se tornarem gestantes (SENGER, 2003). Esta espécie caracteriza-se por ser poliéstrica anual devido à ocorrência de estros ao longo de todo o ano, sendo interrompido apenas por uma gestação ou alguma disfunção reprodutiva que leve ao anestro (SARTORI e BARROS, 2011).
De acordo com a estrutura dominante presente no ovário, o ciclo estral pode ser dividido em duas fases: a fase luteal e a fase folicular (SENGER, 2003). A fase luteal compreende o intervalo entre a ovulação e a regressão luteínica, apresentando como estrutura predominante o corpo lúteo, responsável por manter elevado os níveis de progesterona (HAFEZ e HAFEZ, 2004). É uma fase que ocupa aproximadamente 80% de todo o ciclo estral e é constituída por dois estágios, o metaestro e o diestro. A fase folicular compreende o espaço entre a regressão do corpo lúteo e a ovulação, período que o folículo pré-ovulatório se torna a estrutura dominante, produzindo altos níveis de estrógeno (PETER et al., 2009). É uma fase relativamente curta, correspondendo a apenas 20% de todo o ciclo estral e caracteriza-se pela ocorrência dos estágios de proestro e estro (SENGER, 2003).
Neste contexto, os quatro estágios que constituem o ciclo estral se desenvolvem em um padrão cíclico (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Após a ocorrência da ovulação no dia zero do ciclo estral, inicia-se o estágio de metaestro caracterizado pela formação do corpo lúteo a partir da luteinização das células foliculares com uma produção incipiente de progesterona, subsequentemente, segue-se a fase de diestro com o corpo lúteo totalmente formado e produzindo máximas concentrações de progesterona, no final
deste período ocorre lise do corpo lúteo e o decréscimo dos níveis de progesterona com a ocorrência do proestro, neste estágio apenas um folículo se torna pré-ovulatório e mantêm altas as concentrações de estradiol (FERREIRA, 2010; GONÇALVES et al., 2008). A partir deste momento o folículo pré-ovulatório alcança seu diâmetro máximo e a produção do limiar de estradiol necessário ao desencadeamento de uma série de alterações morfológicas, fisiológicas e comportamentais, caracterizando o estro (RATHBONE et al., 2001).
A regulação de todos estes eventos que compõe o ciclo estral é executada por uma interação entre os hormônios produzidos pelo hipotálamo, hipófise, ovário e útero, funcionando por meio de mecanismo de retroalimentação ou feedback que pode ser positivo ou negativo (FORDE et al., 2011).
A cascata de eventos neuroendócrinos e endócrinos que comandam o ciclo estral inicia-se com a produção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelo centro hipotalâmico, o GnRH por meio do sistema porta-hipotalâmico-hipofisário estimulam a hipófise anterior a liberar o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH), estas gonadotrofinas agem nos ovários estimulando a gametogênese, a foliculogênese e a produção de hormônios esteróides (HAFEZ e HAFEZ, 2004; GONÇALVES et al., 2008; RATHBONE et al., 2001).
O FSH estimula o crescimento e a maturação dos folículos ovarianos e o LH estimula a maturação, a ovulação e a luteinização folicular (FERREIRA, 2010). Durante o crescimento folicular estes dois hormônios atuam sinergicamente nas gônadas impulsionando o desenvolvimento e maturação dos folículos por meio da ligação a receptores foliculares específicos com consequente síntese de estradiol e inibina (MIHM et al., 2002). Após a ovulação e luteinização do folículo, o LH atua no corpo lúteo estimulando a síntese da progesterona (WEBB e ARMSTRONG, 1998).
A ação das gonadotrofinas hipofisárias é regulada pelos hormônios esteróides e pela inibina secretada pelo ovário (SCARAMUZZI et al., 2011). O estradiol produzido pelos folículos em desenvolvimento controlam a liberação de LH e FSH, este hormônio gonadal juntamente com a inibina exerce um feedback negativo sobre a hipófise inibindo a liberação de FSH e impedindo o crescimento de novas populações de folículos (GONÇALVES et al., 2008). Além disso, o estradiol exerce uma retroalimentação positiva sobre a hipófise estimulando a liberação do pico de LH para
que ocorra a maturação final e ovulação do folículo em crescimento (FERREIRA, 2010).
Entretanto, a ovulação só irá acontecer a depender das concentrações de progesterona e da fase do ciclo estral em que os animais se apresentam (RATHBONE et al., 2001). Na fase luteal quando os níveis de progesterona estão altos, ocorre diminuição da frequência dos pulsos de liberação de LH por meio de um feedback negativo exercido pela progesterona sobre a hipófise (DISKIN et al., 2003). Contudo, durante a fase folicular, a síntese de prostaglandina F2α (PGF2α) no endométrio uterino é aumentada e precede à lise do corpo lúteo, consequentemente, os níveis séricos da progesterona decrescem e a supressão hipofisária deixa de existir, permitindo a liberação do LH em um padrão pré-ovulatório, responsável pelo crescimento final do folículo e o desencadeamento do comportamento de estro, seguido pela ovulação (DISKIN et al., 2003; RATHBONE et al., 2001; SENGER, 2003).
Durante o comportamento de estro a fêmea bovina apresenta inquietação, lordose, a vulva fica edemaciada, exibe uma descarga de muco translúcido, aumenta a receptividade sexual e a aceitação da monta, caracterizando assim, os principais sinais que precedem a ovulação e historicamente auxiliam na identificação de fêmeas em estro para o emprego de biotecnologias da reprodução como a IA convencional (PETER et al., 2009).
No entanto, as subespécies zebuínas e taurinas apresentam particularidades em relação à duração e incidência do comportamento de estro (SARTORI e BARROS, 2011). Mizuta (2003) usando um aparelho de radiotelemetria para identificação do estro em zebuínos e taurinos demonstrou que a média de duração do estro em vacas Nelore (12,90h) foi 3,40h mais curto do que os verificados em fêmeas da raça Angus (16,30h), enquanto os animais mestiços Angus x Nelore (12,40h) não apresentaram diferença em relação às vacas Nelore. Outros experimentos encontraram resultados semelhantes confirmando a menor duração do estro nos zebuínos, observando ainda, uma grande atividade de monta no período noturno (SARTORI e BARROS, 2011; RANDEL, 1976). Corroborando a estes achados, Pinheiro et al. (1998) reportaram que, aproximadamente, 54% das fêmeas zebus utilizadas em seu experimento tiveram comportamento de estro noturno e que deste total 30% começaram e terminaram o estro à noite.
As particularidades reprodutivas das fêmeas zebuínas constituem os principais gargalos para o emprego da IA convencional nesta subespécie, devido a grande ocorrência de falhas na detecção de estro que associadas ao anestro pós-parto resultam em baixas taxas de serviço e consequente redução da eficiência reprodutiva (BARUSELLI et al., 2004). No Brasil a situação agrava-se ainda mais, devido ao fato de 80% do rebanho bovino ser constituído de zebuínos, criados em sua maioria quase exclusivamente a pasto (MARQUES et al., 2008). Em consequência a estes entraves tornou-se de grande interesse nos últimos anos o emprego de protocolos de sincronização do ciclo estral objetivando a IATF (BÓ et al., 2003).
Segundo Baruselli et al. (2012) o emprego da IATF no gado de corte brasileiro vem crescendo linearmente e no ano de 2011 esta biotecnologia chegou a marca de seis milhões, representando um pouco mais que 50% das inseminações realizadas no país. O sucesso da aplicação desta biotécnica é atribuído, sobretudo, a superação das particularidades de comportamento de estro apresentadas pelos zebuínos (MENEGHETTI et al., 2009).
Oogênese
O potencial reprodutivo da fêmea bovina é formado durante a vida fetal por meio do desenvolvimento de um estoque finito de oócitos em um processo denominado oogênese (SENEDA et al., 2010). Segundo Silva et al. (2002) a oogênese consiste na formação e diferenciação de células germinativas primordiais até o estágio de oócito fecundado.
Todos os mecanismos que acontecem durante a oogênese são coordenados por uma série de fatores autócrinos, parácrinos e endócrinos, que desempenham importantes papéis também na foliculogênse, entretanto, estes fatores e suas respectivas ações ainda são pouco esclarecidos (BINELLI et al., 2009). A oogênese e a foliculogênese são processos distintos, porém interdependentes (SILVA et al., 2002).
Na maioria das espécies domésticas a oogênese inicia-se antes do nascimento, mas somente alguns oócitos conseguem completar este mecanismo, meses ou anos mais tarde no animal adulto, após a fecundação (MARTINS et al., 2008). Em bovinos, este
evento é iniciado entre os 30 a 40 dias de vida uterina por meio da migração das células germinativas primordiais do saco vitelino para região das gônadas primitivas, ao chegarem nesta região, as células germinativas sofrem mudanças morfológicas e proliferam-se por divisões mitóticas formando as oogônias (SILVA et al., 2002). Em torno dos 70 a 85 dias de gestação as oogônias começam a entrar em meiose e estacionam-se na fase de diplóteno da prófase I, constituindo os oócitos primários, permanecendo neste estágio, pelo menos até a puberdade (KASTELIC, 2006).
Segundo Diniz et al. (2005), na espécie bovina a maioria das mitoses cessam entre 150 e 180 dias de vida, quando todos os gametas atingem a meiose tornando-se oócitos primários. Binelli et al. (2009) observaram que a presença da maior reserva ovariana ocorreu neste período sendo composta por cerca de 2,1 milhões de oócitos, posteriormente, o número destas células diminuía gradativamente decorrente de atresia e apoptose, de modo que no momento do nascimento os autores estimaram haver em torno de 130.000 células. Com relação à população de oócitos ao nascimento, os resultados encontrados apontam uma grande variabilidade: Yang et al. (1998), Santos et al. (2013) e Silva (2009) encontraram respectivamente 150.000, 200.000 e 250.000 células, sendo estas discrepâncias atribuídas a uma variação individual intrínseca.
Durante o período pré-natal até a puberdade, o oócito primário irá sofrer modificações morfológicas com aquisição da zona pelúcida e aumento do crescimento, entretanto, é apenas após a puberdade que o oócito primário conseguirá superar o bloqueio meiótico (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Este evento ocorre sob a ação do pico pré-ovulatório de LH, que proporcionará a maturação nuclear e citoplasmática do oócito, ocorrendo à extrusão do primeiro corpúsculo polar e a continuação da divisão meiótica, até sua parada na fase de metáfase II, neste momento forma-se o oócito secundário (CAMPOS JÚNIOR et al., 2009).
A segunda divisão meiótica é retomada apenas durante a fertilização, por meio da penetração do espermatozoide na membrana do oócito, a qual leva a oscilações de cálcio no interior do gameta feminino, culminando com a liberação do segundo corpúsculo polar, conclusão da meiose e a iniciação do desenvolvimento embrionário (ARROYO, 2008).
Foliculogênese
A foliculogênese é o processo de formação e desenvolvimento folicular, que inicia-se durante a vida pré-natal com a constituição dos folículos primordiais e estende-se até a faestende-se pós-natal com os folículos atingindo o estágio pré-ovulatório (WEBB et al., 2004). Contudo, estimativas apontam que apenas 0,1% dos folículos presentes nas reservas ovarianas conseguem chegar à fase pré-ovulatória devido à atresia folicular sofrida por essas estruturas (WEBB e CAMPBELL, 2010).
O crescimento folicular ocorre simultaneamente a oogênese, quando o oócito está entre as fases de prófase I e metáfase II, este processo inicia-se após e termina antes da oogênese (MARTINS et al., 2008). Neste mecanismo os folículos constituem as unidades funcionais dos ovários, e por meio da foliculogênese oferecem um ambiente adequado para o crescimento e maturação dos oócitos (GONÇALVES et al., 2008). Para a ocorrência deste evento, uma série de hormônios e fatores de crescimento de origem intraovariana e extraovariana atuam de forma altamente coordenada estimulando todo o desenvolvimento folicular, no entanto, apesar dos inúmeros avanços alcançados nos últimos anos a respeito do tema, a cascata de agentes que coordenam a foliculogênese ainda não foi totalmente elucidada (WEBB e CAMPBELL, 2010).
De acordo a presença ou não de antro (cavidade repleta de líquido no interior das camadas multilaminares dos folículos), a foliculogênese pode ser dividida em duas fases: foliculogênese pré-antral que se estende desde a formação dos folículos primordiais até o estágio de folículo secundário, e a foliculogênese antral que se estende do início da formação do folículo terciário até o mesmo chegar ao estágio de pré-ovulatório (SILVA et al., 2009).
Foliculogênese pré-antral: fatores intraovarinos e extraovarianos
Na maioria das espécies domésticas a foliculogênese pré-antral é um processo extremamente lento que representa cerca de 85% de todo desenvolvimento folicular, na fêmea bovina a mesma tem uma duração de aproximadamente três meses (WEBB et al., 2004). Todo este processo ocorre independente da ação de gonadotrofinas e é
comandado por fatores de crescimento, sendo que o LH e o FSH desempenham apenas um papel permissivo (WEBB e CAMPBELL, 2010).
O desenvolvimento folicular pré-antral inicia-se em torno de 90 a 140 dias de vida com a colonização do ovário fetal por células mesonéfricas, precursoras das células foliculares, estas células somáticas achatadas circundam o oócito e formam uma camada de células da pré-granulosa originando os folículos primordiais (PICTON, 2001). Após a formação, os folículos primordiais permanecem em um estado de quiescência no interior da gônada feminina, estes tipos foliculares constituem o pool de reserva ovariana que será constantemente ativada durante toda vida do animal desde a fase pré-natal (ESPINOZA-VILLAVICENCIO et al., 2007).
À medida que ocorre a ativação dos folículos primordiais, os mesmos evoluem para o estágio de folículos primários, esta transição ocorre por meio da mudança na morfologia das células da granulosa passando de um formato achatado para cuboide (CAMPOS JÚNIOR et al., 2009). Neste período ocorre também o aparecimento da zona pelúcida e de outra linhagem de células somáticas, as células da teca, circundando externamente a camada da granulosa, porém, nesta fase a camada da teca e a zona pelúcida não apresentam-se totalmente formadas (PICTON, 2001).
A ativação de folículos primordiais é um processo irreversível e contínuo que culminará no crescimento folicular ininterrupto até a ovulação ou atresia (PICTON, 2001). Acredita-se que os folículos primordiais são estimulados a iniciar o crescimento por fatores intraovarianos parácrinos e autócrinos (FORTUNE, 2003; WEBB e CAMPBELL, 2010). A literatura tem relatado alguns estimuladores iniciais, sendo verificado que os mesmos são sintetizados tanto pelas células foliculares quanto pelos oócitos (FORTUNE, 2003).
Dentre os diversos fatores intraovarianos que atuam na ativação folicular, destacam-se o fator de crescimento de células tronco (KL) e seu o receptor C-kit ligante, o fator de crescimento fibroblástico básico (FGF2), o fator de crescimento epidérmico (FGE), ativinas, inibinas e alguns membros da superfamília de fatores de crescimento transformantes β como o fator de crescimento e iniciação-9 (GDF-9) e o hormônio anti-mülleriano (AMH) (BINELLI et al., 2009; BURATINI, 2006). Este último tem sido amplamente pesquisado, devido às descobertas de sua expressão e função em fêmeas após o dimorfismo sexual (VISSER et al., 2006).
O AMH é produzido pelas células da granulosa de folículos primários e folículo antrais em estágios iniciais de crescimento e a avaliação do nível sérico do AMH em animais tem sido amplamente empregada de forma eficiente para predizer a população folicular antral em fêmeas bovinas (FAIR, 2003). Durante o estágio pré-antral acredita-se que o AMH limita a ativação de folículos primordiais controlando o pool de folículos quiescentes nas reservas ovarianas (SCARAMUZZI et al., 2011; TANG et al., 2012).
Após a transição folicular primordial-primário ocorre o aumento do metabolismo folicular com crescimento do oócito e proliferação das células da granulosa, desta forma, o folículo adquire duas ou mais camadas de granulosa em formato cuboide (multilaminar) e passa a ser denominado de folículo secundário (PICTION, 2001). Neste momento, a zona pelúcida e a camada da teca estão totalmente formadas e as células da granulosa se diferenciam em duas porções: o cumulus que circunda intimamente o oócito e as células murais que estão em contato direto com lâmina basal (GILCHRIST et al., 2004). As células do cumulus apresentam junções trans-zonais que estabelecem uma conexão direta com o oócito aumentando as trocas metabólicas bidirecionais com transferência de nutrientes, metabólitos, fatores de estimulação e/ou inibição, fatores de crescimento, neurotropinas e hormônios entre o folículo e o oócito (FORTUNE, 2003). O folículo secundário apresenta ainda sensibilidade a gonadotrofinas e neste período já ocorre a esteroidogênese (SENEDA et al., 2010).
No processo de esteroidogênese as células da teca convertem o colesterol em andrógeno sobre ação do LH, subsequentemente este andrógeno é convertido em estrógeno pela enzima P450 aromatase localizada nas células da granulosa e sob comando do FSH (SCARAMUZZI et al., 2011). O produto da esteroidogênese representa um dos importantes constituintes do fluído folicular que irá ser depositado no interior das camadas da granulosa iniciando-se assim a fase antral da foliculogênese (SENGER, 2003; HAFEZ e HAFEZ, 2004).
Fortune (2003) verificou que ao cultivar folículos secundários em meio rico com FSH e LH ocorria um rápido crescimento e maior sobrevivência folicular acelerando a formação do antro folicular, comprovando que existe uma pequena ação das gonadotrofinas já nas fases finais da foliculogênese pré-antral. Neste estágio a superfamília do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) também atua favorecendo o crescimento folicular e a esteroidogênese por meio de uma interação
entre fatores intraovarianos e extraovarianos levando a um aumento da sensibilidade das células foliculares as gonadotrofinas (ARMSTRONG et al., 2002).
Foliculogênese antral: fatores intraovarianos e extraovarianos
A fase antral da foliculogênese é caracterizada pela presença de folículos terciários ou antrais, morfologicamente formados por um oócito circundado por uma zona pelúcida, um antro, várias camadas de células da granulosa, duas camadas de células da teca, a teca interna e a teca externa, e uma membrana basal (SILVA et al., 2002). O fluído folicular presente no interior do antro é constituído por água, eletrólitos, proteínas séricas e altas concentrações de estradiol e inibina, ambos produzidos pelas células da granulosa (MARTINS et al., 2008).
Segundo Diniz et al. (2005) na espécie bovina, populações de folículos antrais são observadas na vida pré-natal a partir dos 240 dias de gestação. A foliculogênese antral ocorre imediatamente após a conversão dos folículos secundários em terciários, durante o desenvolvimento ininterrupto de uma população de folículos ativados (BINELLI et al., 2009). Esta etapa do crescimento folicular ocorre de forma relativamente rápida e estende-se por 42 dias, ou seja, corresponde a apenas 15% de todo o processo de foliculogênese (WEBB et al., 2007).
Entretanto, no início da foliculogênese antral o crescimento ainda é lento e pouco dependente das gonadotrofinas, mas quando os folículos excedem o diâmetro de 3 a 4mm e alcançam o crescimento terminal, estes hormônios passam a atuar de forma mais incisiva aumentando a taxa de crescimento folicular, ao passo que, os fatores de crescimento exercem apenas um papel permissivo (SILVA et al., 2002; WEBB et al., 2004).
A maioria dos fatores de crescimento que participam do controle da foliculogênese antral são semelhantes àqueles observados na foliculogênese pré-antral, destacando-se o FGF, FGE, ativinas, inibinas, alguns membros da superfamília TGF β como o GDF-9 e, sobretudo, a superfamília IGF, a qual é formada por dois fatores de crescimento (IGF-I e IGF-II), dois receptores para os fatores de crescimento (Tipo I e II), seis proteínas ligantes (1, 2, 3, 4, 5 e
IGFBP-6) e uma enzima de ação proteolítica contra as proteínas ligantes (FORTUNE et al., 2004).
O sistema IGF favorece o crescimento folicular por meio de uma potencialização da ação das gonadotrofinas, coordenada por uma intrincada interação entre todos os componentes desta superfamília que acaba culminando no aumento da sensibilidade das células da teca e da granulosa ao LH e FSH, respectivamente (WEBB e CAMPBELL, 2010). Fortune et al. (2004) demonstraram a regulação do crescimento folicular por este mecanismo, apontando que inicialmente o IGF-I e IGF-II se ligam ao seus receptores e estimulam a síntese de estradiol no folículo, enquanto as proteínas ligantes controlam este crescimento folicular prevenindo a ligação do IGF a seus receptores. Já as proteases clivam essas proteínas ligantes permitindo que o IGF interaja com seus receptores e assim ocorra o desenvolvimento folicular, e o estímulo à produção de estradiol (CARVALHO, 2005).
O desenvolvimento folicular terminal segue um padrão de ondas de crescimento folicular descoberto com o advento da ultrassonografia (GINTHER et al., 1989). As ondas de desenvolvimento folicular não são eventos exclusivos de fêmeas que alcançaram a maturidade sexual, estando presente também antes da puberdade e durante a gestação (PEÑA et al., 2007).
Desta forma, o crescimento folicular terminal é caracterizado pela presença de uma, duas, três ou até quatro ondas de desenvolvimento folicular por ciclo estral (BARUSELLI et al., 2007). Durante a avaliação ultrassonográfica de fêmeas bovinas cíclicas, Ginther et al. (1989) demonstraram que a maioria dos ciclos estrais são constituídos por duas a três ondas foliculares, entretanto, esta característica pode variar de acordo com a raça, o estado fisiológico e principalmente a subespécie animal. Diversos estudos demonstram que fêmeas taurinas apresentam maior incidência de duas ondas de desenvolvimento folicular, enquanto na subespécie zebuína observa-se uma alteração desta característica de acordo com a categoria animal, com as vacas e as novilhas apresentando predominância de duas e três ondas foliculares, respectivamente (COUTINHO et al., 2007; FIGUEIREDO et al., 1997; RHODES et al., 1995). O número de ondas foliculares que compõe o ciclo estral apresenta-se ainda como uma característica de alta repetibilidade durante grande parte da vida reprodutiva bovina (IRELAND et al., 2007).
Em um ciclo estral composto por duas ondas foliculares, cada onda de crescimento folicular tem duração média de 10 dias (CARVALHO, 2005) e é caracterizada pela ocorrência de cinco eventos: emergência, desvio, seleção, dominância e atresia folicular (ESPINOZA-VILLAVICENCIO et al., 2007).
A emergência envolve o crescimento organizado e simultâneo de um conjunto de pequenos folículos antrais medindo entre 3 a 4mm, sobre estímulo do FSH (GINTHER et al., 2003). Esta etapa estende-se por dois a três dias e os folículos apresentam uma taxa de crescimento constante (MIHM e BLEACH, 2003; PETER et al., 2009). De acordo com o número de ondas presentes no ciclo estral a emergência folicular pode ocorrer em momentos distintos, quando o padrão de crescimento é de duas ondas foliculares a primeira inicia-se concomitante a ovulação, no dia denominado zero, e a segunda no dia nove a 10 do ciclo, apresentando intervalos interovulatórios de 20 dias; já quando o padrão caracteriza-se por três ondas foliculares a primeira, segunda e terceira onda ocorrem, respectivamente, nos dias zero, oito a nove e 15 a 16 do ciclo, com intervalos interovulatórios de 23 dias (ADAMS et al., 2008; ALVES et al., 2002; FIGUEIREDO et al., 1997; GINTHER et al., 1989).
Durante muitos anos, acreditou-se que a emergência era marcada pelo crescimento de um número constante entre 23 a 25 folículos antrais (ADAMS et al., 1992; GINTHER et al., 1996), no entanto, com a evolução do emprego da ultrassonografia na avaliação da dinâmica folicular ovariana verificou-se que os zebuínos e particularmente a raça Nelore apresenta uma superioridade numérica em relação aos taurinos, recrutando cerca de 30 a 50 folículos por onda (ALVAREZ et al., 2000; BURATINI et al., 2000; CARVALHO et al., 2008; LOUREIRO et al., 2012). Esta característica intrínseca tem sido justificada pelo fato dos indivíduos Bos taurus indicus apresentarem maiores níveis circulantes de IGF-I e insulinas livres, os quais aumentam a sensibilidade das células da granulosa ao FSH, favorecendo assim o recrutamento folicular (ALVAREZ et al., 2000; SARTORI e BARROS, 2011).
Seguindo esta mesma linha de pesquisa, estudos recentes têm demonstrado que o número de folículos antrais presentes no momento da emergência é uma característica que apresenta alta variabilidade individual (IRELAND et al., 2007; JIMENEZ-KRASSEL et al., 2009). Burns et al. (2005) ao mensurarem este parâmetro em fêmeas taurinas constataram uma oscilação entre oito e 54 folículos nos diferentes indivíduos, e
demonstraram que a quantidade de folículos recrutados se repete constantemente nos animais ao longo de cada onda. Estes achados têm revolucionado as emergentes frentes de pesquisa, gerando consequências importantes na aplicação das mais diversas biotecnologias assistidas (SARTORI e BARROS, 2011).
Após a emergência folicular, as células da granulosa dos folículos em crescimento produzem quantidades crescentes de estradiol e inibina, responsáveis por agir de forma indireta na hipófise, inibindo a liberação de FSH, e de forma direta na população de pequenos folículos, reduzindo o número de receptores para o FSH (SENGER, 2003). Estas alterações são responsáveis pelo chamado desvio ou divergência folicular, onde se observa o comprometimento do crescimento dos pequenos folículos com seleção de um único folículo, denominado dominante, que continua a se desenvolver mesmo em um ambiente apresentando baixas concentrações de FSH (ALVES et al., 2002; GIBBONS et al., 1999).
A progressão do desenvolvimento do folículo dominante é atribuída à aquisição de um grande número de receptores de LH nas células granulosa por meio de um evento chamado mudança na dependência de gonadotrofina (GINTHER et al., 2003). A medida que a seleção folicular progride o folículo dominante deixa de depender de FSH e passa a depender apenas de LH para o seu crescimento (MIHM et al. 2002; XU et al., 1995).
Castilho et al. (2007) e Ginther et al. (2001) caracterizaram o desvio folicular como o momento onde a diferença no crescimento entre os dois maiores folículos se torna evidente e observa-se a regressão dos demais folículos remanescentes. Em um estudo abordando a dinâmica folicular em fêmeas taurinas Ginther et al. (1996) demonstraram que o desvio folicular nesta subespécie ocorreu quando o folículo dominante e o subordinado apresentaram um diâmetro médio de 8,50 e 7,20mm, respectivamente; enquanto Gimenes et al. (2008) e Sartorelli et al. (2005) em estudos semelhantes, porém utilizando a subespécie zebuína, verificaram a ocorrência da divergência folicular quando o diâmetro do folículo dominante aproximou-se de 6,20 e 6,10mm e do folículo subordinado apresentou cerca de 5,90 e 5,40mm, respectivamente. Apesar de durante o desvio folicular as fêmeas Bos taurus indicus apresentarem folículos dominantes e subordinados de dimensões menores em relação aos animais Bos taurus taurus, a ocasião na qual ocorre este evento é semelhante entre os dois subgrupos de animais, sendo em torno de 2,30 a 2,80 dias após a ovulação (CASTILHO et al.,
2007; SARTORI e BARROS, 2011). Os achados acima reportados podem ser atribuídos ao fato das fêmeas zebus apresentarem uma comprometida taxa de crescimento folicular (CARVALHO et al., 2008) associada a uma precoce mudança da dependência de gonadotrofina, quando os animais apresentam um pequeno diâmetro folicular (GIMENES et al., 2008).
A seleção folicular determina um aumento no nível de estradiol no folículo dominante em consequência a maior expressão da enzima P450 aromatase nas células da granulosa do folículo (ADAMS et al., 2008). Este mecanismo é extremamente complexo e não se encontra totalmente elucidado, mas sabe-se que envolve a participação de hormônios gonadotróficos e gonadais, assim como, a ação de inúmeros fatores de crescimento pertencentes à superfamília TGF β e IGF, estes últimos vem sendo apontados como essenciais para manutenção da saúde e do crescimento folicular (FORDE et al., 2011; GINTHER et al., 2003).
Neste contexto, o desenvolvimento de modernos aparelhos ultrassonográficos tem questionado alguns conceitos previamente estabelecidos, demonstrando que a seleção pode preceder a emergência folicular, a exemplo do trabalho de Adams et al. (2008), que ao avaliarem a dinâmica folicular em bovinos, identificaram o folículo dominante com 1mm de diâmetro, cerca de seis a 12h antes do surgimento da população de folículos recrutados.
Em espécies monovulatórias como o bovino, com a superação da fase de seleção segue-se a dominância folicular, neste momento um único folículo selecionado continua a apresentar altas taxas de crescimento produzindo altos níveis de estradiol e inibina, que exercem feedback negativo sobre a liberação de FSH na hipófise, impedindo o crescimento dos demais folículos subordinados e o surgimento de outra onda folicular (DISKIN et al., 2003; PETER et al., 2009).
O folículo dominante é aquele que se caracteriza por apresentar altos níveis intrafoliculares de estradiol, IGF-I livre e um substancial aumento de tamanho (GINTHER et al., 2003). A etapa de dominância será o período onde esta estrutura alcançará as máximas taxas de crescimento, chegará ao seu diâmetro máximo e em baixos níveis de progesterona, crescerá ainda mais e se tornará um folículo pré-ovulatório (SENGER, 2003).
Sendo assim, a depender da fase do ciclo estral e das concentrações de progesterona no momento em que a dominância for estabelecida o folículo dominante pode seguir dois destinos: 1) atingir o diâmetro e a capacidade ovulatória e responder ao aumento da pulsatilidade do LH, resultando em ovulação ou, 2) na ausência de pico de LH começar a entrar em atresia (FORTUNE, 1994).
Desta forma, os níveis de progesterona modulam a liberação de LH e consequentemente o destino do folículo dominante (WILTBANK et al., 2002). Na fase luteal onde existem elevados níveis de progesterona a liberação de LH ocorre em pulsos com alta amplitude e baixa frequência, comprometendo o crescimento folicular e o processo ovulatório, com consequente atresia (FORDE et al., 2011). Já a fase folicular é precedida pela regressão lútea e redução dos níveis de progesterona, assim a liberação de LH segue um padrão de pulsos com baixa amplitude e alta frequência ocasionando profundas mudanças no folículo dominante, fazendo com que o mesmo atinja o estágio de pré-ovulatorio, conseguindo produzir estradiol suficiente para induzir a liberação de um pico de LH e indução da ovulação (MIHM et al., 2002; WILTBANK et al., 2002).
O processo de ovulação está condicionado à aquisição de capacidade ovulatória pela obtenção de receptores de LH nas células granulosa e diâmetro ovulatório específico, associado à ocorrência de uma regressão luteal e consequente liberação de LH em um padrão pré-ovulatorio (GINTHER et al., 1989; XU et al., 1995).
O diâmetro do folículo pré-ovulatório tem sido apontado como um dos importantes parâmetros que afetam a fertilidade em bovinos submetidos a programas de IATF (FERRAZ et al., 2010). Entretanto, durante a foliculogênese antral, fêmeas Bos taurus indicus têm demonstrado folículo dominante e pré-ovulatório com diâmetro em torno de 10 a 12mm, inferiores aqueles reportados para as fêmeas Bos taurus taurus de 15 a 20mm (COUTINHO et al., 2007; FIGUEIREDO et al., 1997; GINTHER et al., 1989; SARTORI e BARROS, 2011).
Esta diferença fisiológica entre fêmeas zebuínas e taurinas foi explicada por Gimenes et al. (2008) utilizando animais da raça Nelore, para desenvolver um experimento similar ao realizado por Sartori et al. (2001), em fêmeas da raça Holandesa, os autores supracitados avaliaram o momento de aquisição de capacidade ovulatória, para tanto acompanharam o desenvolvimento folicular por ultrassonografia e aplicaram LH nos animais quando os mesmo atingiram o diâmetro folicular entre 7,00 a 8,40 mm;
8,50 a 10,00mm e acima de 10,00mm, sendo verificado que diferentemente das fêmeas Holandesas que só adquiriram capacidade ovulatória a partir 10,00mm, os animais da raça Nelore estavam aptos para ovulação desde 8,50mm de diâmetro. Estes resultados foram posteriormente confirmados por Barros et al. (2009) e Nogueira et al. (2007), comprovando que os menores diâmetros ovulatórios verificados em vacas zebu ocorreram devido uma expressão precoce de receptores de LH nas células da granulosa em quantidade suficiente para induzir a ovulação.
Os altos níveis de estradiol produzidos pelo folículo pré-ovulatório desencadeiam também uma série de alterações comportamentais na fêmea, tornando-a sexualmente receptiva à ocorrência da cópula (SENGER, 2003). Subsequentemente, o folículo pré-ovulatório alcança o diâmetro máximo e o limiar nível de estradiol, estimulando o pico pré-ovulatório de LH e a ocorrência da ovulação em cerca 24 a 32 horas após (SARTORI e BARROS, 2011). De acordo com Adams et al. (2008), o pico de estradiol produzido pelo folículo pré-ovulatório é cerca de duas vezes maior que aquele produzido pelo folículo dominante de uma onda anovulatória.
O mecanismo ovulatório estimulado pelo pico de LH ocorre em consequência às mudanças na parede do folículo até o seu rompimento (FERREIRA, 2010). Posteriormente, o LH induz a luteinização das células foliculares da teca e da granulosa, sendo transformadas em células luteais resultando inicialmente na formação do corpo hemorrágico, que se reorganiza e forma o corpo lúteo, passando a produzir eficientemente progesterona (GIOMETTI et al., 2009).
Apesar da ovulação ser um evento essencial para a fêmea alcançar satisfatórios índices de fertilidade este acontecimento biológico se caracteriza por ser extremamente raro, uma vez que durante a foliculogênese a maioria dos folículos antrais sofrem atresia (SENGER, 2003). A atresia é o processo fisiológico de degeneração ou apoptose quando o ambiente parácrino, autócrino ou endócrino não é adequado ao desenvolvimento dos folículos. Este evento ocorre durante todo o processo de foliculogênese e embora seja um fenômeno natural resulta em redução significativa do número de oócitos viáveis, fazendo com que a fêmea apresente um limitado potencial reprodutivo (MARTINS et al., 2008; SILVA et al., 2002).
Avaliação da população folicular
A história da avaliação da população de folículos antrais em fêmeas bovinas iniciou-se por meio de estudos histológicos de ovários de matadouro (RAJAKOSKI, 1960), nesta fase inicial a avaliação in vivo dos folículos dos animais só era possível por meio da laparotomia seguida pela marcação destas estruturas com corantes (MATRON et al., 1981). Entretanto, estes métodos de acesso ao pool de folículos antrais geravam achados contraditórios a respeito da população folicular limitando o completo entendimento da dinâmica ovariana durante o ciclo estral (GINTHER et al., 1996).
Uma nova fronteira de acesso à população folicular antral se abriu a partir da década de 70, com o surgimento da ultrassonografia (PIERSON e GINTHER, 1988). Porém, foi na década de 80 que a técnica de ultrassonografia passou a ser adaptada para avaliação reprodutiva de grandes animais (PIERSON e GINTHER, 1987). Palmer e Driancourt (1980) foram os pioneiros a empregarem a ultrassonografia para avaliação reprodutiva em equinos, obtendo resultados promissores na visualização de folículos ovarianos e no diagnóstico precoce de gestação. Posteriormente, inúmeros trabalhos foram desenvolvidos em bovinos, estabelecendo a ultrassonografia como importante técnica para avaliação ovariana nesta espécie, sobretudo, devido sua propriedade pouco invasiva (ADAMS et al., 1992; PIERSON e GINTHER, 1987, 1988; SIROIS e FORTUNE, 1988). Neste momento, os eventos que caracterizavam a dinâmica folicular começaram a ser intensamente estudados e melhor compreendidos (GINTHER et al., 1989; SINGH et al., 1998; TOM et al., 1998).
Os avanços na área da computação proporcionaram o surgimento de equipamentos de ultrassonografia cada vez mais sofisticados (FERREIRA, 2010). A maioria dos aparelhos de ultrassom consiste de um console que possui uma fonte de energia e serve para recebimento, amplificação e conversão de sinais em imagens; um teclado alfanumérico e de funções variadas; além de um transdutor que emite e recebe as ondas ultrassonográficas estando conectado ao console por um cabo (GONÇALVES et al., 2008).
Os equipamentos mais utilizados para avaliar os órgãos genitais de bovinos na rotina de campo são do tipo modo B em tempo real que se caracterizam por apresentarem imagens em várias tonalidades de cinza sendo atualizadas em frações de
segundos (DESCÔTEAUX et al., 2006). Estes equipamentos emitem projeções bimencionais e apresentam frequência de 3,5 a 15,0Mhz, sendo que para o exame geral do trato reprodutivo tem-se uma predileção pelo emprego das frequências de 5,0 a 6,0Mhz, e ao se avaliar os ovários preconiza-se a utilização de 7,5 a 8,0Mhz pelo fato destas frequências proporcionarem uma melhor resolução e consequente visualização dos pequenos folículos (LAMB et al., 2003). Os transdutores usualmente empregados para escanear os órgãos reprodutivos por via transretal são aqueles do tipo linear, enquanto os transdutores setoriais convexos têm sido empregados em bovinos basicamente para a técnica de aspiração folicular guiada por ultrassonografia (DESCÔTEAUX et al., 2006).
A formação da imagem ultrassonográfica acontece a partir de ondas sonoras que atingem os tecidos e são refletidas de volta para o transdutor, assim estruturas cheias de líquidos, como os folículos antrais, refletem pouco as ondas sonoras e aparecem em tom preto na imagem ultrassonográfica, sendo denominada de anecóica (LAMB et al., 2003; MATSUI e MIYAMOTO, 2009). Enquanto estruturas sólidas refletem facilmente as ondas e aparecem com vários tons de cinza ou branco, sendo chamada de hiperecogênica (MATSUI e MIYAMOTO, 2009).
Nos últimos anos, com o aperfeiçoamento da ultrassonografia reprodutiva, tem surgido uma nova metodologia baseada no estudo da hemodinâmica dos órgãos reprodutivos, denominada ultrassonografia Doppler, a qual tem sido amplamente empregada em trabalhos de pesquisa que avaliam a atividade ovariana, a gestação e as mais diversas patologias reprodutivas em bovinos, e é provável que futuramente essa técnica seja economicamente acessível e cotidianamente empregada na rotina da reprodução de bovinos (AYRES e MINGOTI, 2012).
Neste contexto, na avaliação ultrassonográfica da população folicular ainda preconiza-se o emprego do ultrassom modo B em tempo real, onde os pequenos folículos antrais são visualizados na imagem como estruturas arredondadas anecóicas (DESCÔTEAUX et al., 2006). Pierson e Ginther (1987) validaram este método como eficaz para avaliação do número de folículos ≥2mm de diâmetro, para tanto, estes autores fizeram um estudo comparativo entre o número de folículos visualizados pela ultrassonografia transretal e os observados histologicamente nos cortes dos ovários. Os
resultados confirmaram que o ultrassom tem 92% de capacidade de predizer a população e o diâmetro folicular em bovinos (PIERSON e GINTHER, 1987).
Os achados acima reportados abriram precedentes para o estabelecimento da ultrassonografia como ferramenta primordial para o estudo in vivo da população folicular ovariana (PIERSON e GINTHER, 1988). Houve a evolução das pesquisas sobre a foliculogênese antral e ficou demonstrado que a população de folículos antrais presente no ovário no momento da emergência foi variável de acordo com a subespécie animal. Deste modo, em diversos estudos avaliando ultrassonograficamente o número de folículos antrais em fêmeas zebuínas e taurinas foram observados que as mesmas apresentaram cerca de 50 e 24 folículos, respectivamente (BURATINI et al., 2000; GINTHER et al., 1989). Esta maior quantidade de pequenos folículos antrais visualizados em fêmeas Bos taurus indicus e particularmente em vacas Nelore, é relevante, sobretudo, para produção in vitro de embriões, que tem alcançado extraordinárias taxas de recuperação oocitária nesta raça (BURATINI et al., 2000; GINTHER et al., 1989, 1996).
Entretanto, as possíveis justificativas para a superioridade da população folicular antral das fêmeas zebu, ainda não foi totalmente elucidada, uma vez que Silva-Santos et al. (2011) desenvolveram trabalhos no sentido de verificar se a explicação para estas diferenças se encontravam na reserva folicular pré-antral, mas apesar destes autores confirmarem as mudanças na população folicular antral em animais Bos taurus taurus em relação a Bos taurus indicus, os mesmos não observaram distinções referentes a quantidade de folículos pré-antrais entre os grupamentos. Diante deste quadro, algumas correntes de pesquisa têm sugerido que os zebuínos apresentam a maior concentração sérica de IGF-I e, consequentemente, uma elevação na sensibilidade as gonadotrofinas no momento da emergência folicular, explicando as diferenças acima reportadas (SARTORI e BARROS, 2011).
Ao longo de muitos anos após os achados das divergências na população folicular antral entre animais taurinos e zebuínos acreditou-se que os indivíduos apresentavam durante a emergência folicular sempre um número constante de folículos característico de cada subespécie (FERREIRA et al., 2004). No entanto, estudos recentes em fêmeas taurinas e zebuínas estabeleceram que nestes grupamentos existem
