Resumo
Técnicas de reprodução assistida, tais como a fer-tilização in vitro, a injeção intracitoplasmática de espermatozóides e a transferência de embriões têm tido seu avanço limitado inúmeras vezes devido a uma escassez de oócitos para fertilização. A estimu-lação artificial, a partir do uso de gonadotrofinas exógenas, aumenta o número de gametas prestes a ovular, mas a resposta aos tratamentos é bastante variável. A maturação in vitro de oócitos imaturos é uma alternativa que vem despertando maior in-teresse dos pesquisadores e clínicos da reprodução assistida nos últimos anos. Entretanto, um fator limitante ao desenvolvimento e aprimoramento dos métodos de cultivo in vitro de oócitos imaturos é o desconhecimento dos fatores envolvidos desde a origem, o crescimento e a maturação in vivo dos oócitos. Este artigo procurou fazer uma ampla revisão do que é sabido e compreendido desde o sur-gimento das primeiras células germinativas no feto feminino, até seu desaparecimento na menopausa. Finalmente, fizemos uma breve exposição sobre o estado de arte da maturação in vitro como uma alternativa ou um acréscimo às tecnologias atual-mente empregadas em reprodução assistida.
PALAVRAS-CHAVE: Oogênese. Maturação in vitro.
Origem, Crescimento, Degeneração
e Maturação In Vitro do Oócito
Origin, Growth, Degeneration and In Vitro Maturation
of the Oocyte
Nilo Frantz*
Adriana Bos-Mikich*
Marcelo Oliveira Ferreira*/**
Gerta Noeli Frantz*
Norma Pagnoncelli de Oliveira*
*Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz
**Centro de Reprodução Humana Gestare, Novo Hamburgo (RS)
Introdução
O conhecimento limitado sobre os fatores envolvidos na regulação do crescimento oocitário e folicular constitui um dos maiores obstáculos para o estabelecimento de condições de cultivo que per-mitam o crescimento, a diferenciação e a maturação oocitária capazes de gerar nascidos vivos, a partir de oócitos coletados de folículos imaturos, tanto em humanos como nas espécies domésticas.
Também é bastante escassa a informação sobre genes e fatores que regulam a formação e o crescimento dos oócitos, a partir das células germi-nativas primordiais (CGP), a formação e o transporte das CGPs e a organização dos oócitos em folículos primordiais (van den Hurk & Zhao, 2005), assim como sua degeneração e gradativa exaustão com o avanço da idade. A ação destes elementos regulado-res provavelmente afeta a qualidade e a quantidade de oócitos durante a vida reprodutiva, bem como a extensão da vida reprodutiva do indivíduo.
Oogênese
Oogênese é a história da formação e matura-ção da célula germinativa feminina. Este processo
tem início na vida embrionária, continua após o nascimento e atinge seu clímax no momento da ovulação. A alteração mais importante que a célu-la germinativa feminina sofre é a meiose, a qual pode ser considerada a antítese da fertilização, pois divide pela metade o número de cromossomos, enquanto que a fertilização restabelece o comple-mento diplóide.
As células germinativas primordiais huma-nas, tanto femininas como masculihuma-nas, aparecem pela primeira vez na parede do saco vitelínico, próximo ao final da terceira semana de desenvolvi-mento. Membros da família do fator transformador do crescimento B (TGF B) foram identificados como os responsáveis pela regulação da diferenciação das células germinativas primordiais, a partir do epiblasto. Estas células migram por movimentos amebóides do saco vitelínico em direção aos pri-mórdios gonadais, onde elas chegam ao final da quarta, início da quinta semana. Nos embriões do sexo feminino, as células germinativas primordiais povoam o primórdio gonadal e se diferenciam em oogônias. Estas células germinativas possuem uma elevada freqüência de divisões mitóticas e uma alta atividade transcripcional. Em torno do terceiro mês, formam-se agregados de células germinativas circundados por células epiteliódes achatadas, as células foliculares, originárias tanto do epitélio superficial ovariano, como derivadas do mesonéfron. Subseqüentemente, cada célula germinativa fica circundada por uma camada única de células foliculares, constituindo o folículo
pri-mordial (Baker, 1982).
Em humanos, as oogônias entram em meiose simultaneamente com o início da diferenciação go-nadal, fenômeno denominado “meiose imediata”. O início da meiose é estimulado pela secreção de
substâncias indutoras da meiose, MIS, pelos ovários
primitivos, no mesmo momento em que ocorre um decréscimo acentuado na esteroidogênese (Byskov & Hoyer, 1988). Em torno do quinto mês de desen-volvimento, o número de células germinativas fe-mininas, oogônias em diferentes estágios da prófase meiótica, atinge seu máximo estimado em 7 x 106 gametas. A partir deste ponto, inicia-se o processo de morte celular característico dos ovários (Baker, 1963), que será discutido mais adiante.
Próximo ao nascimento, todas as células ger-minativas femininas estão em prófase da primeira divisão meiótica, mas, em vez de prosseguirem à metáfase, ficam bloqueadas no diploteno, espe-cificamente chamado de estágio de dictióteno ou de vesícula germinativa. Esta etapa da meiose feminina é usualmente tratada como um período de repouso do gameta. Entretanto, durante este es-tágio em que a cromatina nuclear está amplamente
dispersa formando finas alças de DNA, os oócitos apresentam considerável crescimento, e a presença de grande quantidade de organelas citoplasmáticas relacionadas com a síntese e secreção de proteínas e mucopolissacarídeos demonstram um metabolis-mo e atividade sintética bastante acentuada.
Os oócitos podem permanecer bloqueados no estágio de dictióteno por décadas, até serem esti-mulados à maturação e ao crescimento. A retomada meiótica só ocorre em ocócitos que completaram o crescimento e estão meioticamente competentes no folículo pré-ovulatório (dominante). A maturação
pré-ovulatória do oócito é um passo fundamental
do desenvolvimento gamético, pois irá determinar o sucesso da fertilização e crescimento embrionário e fetal subseqüentes.
O início da maturação pré-ovulatória é marcado por um aumento súbito e dramático na liberação de gonadotrofinas pela hipófise, espe-cialmente do hormônio luteinizante, o dito “pico
do LH”. Pouco antes do pico do LH, existe também
um aumento acentuado no nível de estrógenos, e este incremento é tido como o estímulo para que ocorra o pico (Baker, 1982).
Durante o período entre o pico de LH e a ovulação, o oócito sofre uma série de alterações marcantes, tanto nucleares como citoplasmáticas, num processo chamado de maturação oocitária. A maturação nuclear envolve diversas etapas, que incluem duas divisões meióticas consecutivas e em ausência da replicação do DNA. A maturação do ooplasma é necessária para que haja o bloqueio à poliespermia no momento da fertilização, a des-condensação da cromatina do espermatozóide e para a formação dos pronúcleos.
Ela inclui a redistribuição das organelas celulares, a migração das mitocôndrias para uma posição peri-nuclear e o acúmulo de grânulos ao longo do oolema (van den Hurk & Zhao, 2005). Está bem estabelecido que uma complexa cascata de eventos de fosforilação e desfosforilação está envolvida na regulação da retomada meiótica. Estes processos têm início com a ativação do fator promotor da maturação (MPF), concomitante com a quebra da vesícula germinativa. Outros fatores envolvidos no processo incluem as quinases da proteína mitógena-ativada (MAPKs), os níveis de adenosina monofosfato (AMP) cíclico no oócito e o esterol ativador mitogênico derivado do fluido folicular (Grondahl et al., 2003). Sabe-se ainda que um certo nível de atividade MAPK é também necessário para o bloqueio em metáfase II após a emissão do segundo corpúsculo polar em huma-nos, uma atividade exercida em conjunto com o fator citostático indutor do bloqueio meiótico (CSF) (Fan & Sun, 2004).
Uma estrutura característica dos oócitos é a zona pelúcida. Ela se forma quando cada gameta se encontra circundado por uma camada de célu-las foliculares cubóides, constituindo um folículo
primário. Ela é formada por glicoproteínas, ZP1,
ZP2 e ZP3, a partir da deposição pelo oócito e pelas células foliculares de um material fibrilar, que aca-ba formando um envoltório de aspecto gelatinoso que circunda completamente o oócito. As células foliculares formam junções comunicantes entre si e processos que atravessam a zona pelúcida até o oócito, ambos relacionados com a transferência de material protéico ao gameta. Estas células fo-liculares que subseqüentemente se transformam em células do cumulus oophorus são claramente essenciais para a nutrição do oócito, uma vez que a zona pelúcida está formada. Por outro lado, a formação da zona pelúcida é essencial para o de-senvolvimento folicular (Baker, 1982).
Crescimento Folicular
A formação dos primeiros folículos primor-diais é coincidente com o início da meiose. Estas es-truturas caracterizam-se por um oócito circundado por uma única camada de células pavimentosas, as
células da pré-granulosa. Este conjunto de folículos
primordiais permanece relativamente dormente até próximo à puberdade, quando o ovário se torna apto a responder ao estímulo das gonadotrofinas (Eichenlaub-Ritter & Peschke, 2002). Neste mo-mento, eles são recrutados para a população de folículos em crescimento. Diariamente, um grupo de folículos primordiais é recrutado, e a ordem com que eles iniciam seu desenvolvimento parece ser a mesma em que foram formados. Os folículos passam a se chamar folículos primários, quando a monocamada de células da granulosa circundando o oócito torna-se cubóide. Esta transição de folículo primordial para primário é um processo lento, prin-cipalmente de maturação, visto que o diâmetro do oócito basicamente não muda. É nesta transição, entretanto, que ocorre o comprometimento ao de-senvolvimento folicular subseqüente.
O ovário é uma estrutura dinâmica, na qual folículos vesiculares formados por diversas cama-das de células foliculares estão constantemente se desenvolvendo, a partir de folículos primários. Quando duas ou mais camadas de células folicula-res se formam em torno do oócito, temos um
folícu-lo secundário ou pré-antral. Neste estágio, o oócito
entra em sua fase de crescimento mais extenso, as células da granulosa proliferam ativamente e uma camada de células da teca se desenvolve a partir
das células do estroma intersticial (van den Hurk & Zhao, 2005). Enquanto aumenta de volume, o oócito sofre também uma complexa reorganização citoplasmática, dependente tanto da produção de novos produtos gênicos e de novas organelas, como da modificação e redistribuição dos pré-existentes. Dá-se um enorme aumento na síntese de RNA e proteínas, no número de ribossomos, mitocôndrias e outras organelas citoplasmáticas (Eichenlaub-Ritter & Peschke, 2002).
Fatores sinalizadores intercambiados entre o oócito e suas células da granulosa são essenciais para induzir e regular a diferenciação folicular de um determinado estágio ao próximo e, assim, pro-porcionar o desenvolvimento de um oócito capaz de ser fertilizado e comportar o desenvolvimento embrionário (Eppig, 2001).
Atualmente, é amplamente aceito que o oóci-to desempenha um papel muioóci-to ativo em promover não apenas o crescimento folicular e direcionar a diferenciação das células da granulosa, mas tam-bém seu próprio crescimento (Matzuk et al., 2002). Os oócitos exercem estas tarefas, em parte liberan-do fatores de crescimento parácrinos que atuam nas células da granulosa imediatamente vizinhas, as quais por sua vez, modulam a síntese protéica e os níveis de fosforilação no oócito (Trounson
et al., 2001). Su e colaboradores, 2002,
demonstra-ram ainda a influência das células foliculares somá-ticas nas quinases do ciclo celular do oócito, sendo a MAPK essencial para a retomada meiótica.
O oócito é também responsável pelo estabele-cimento e manutenção das diferentes linhagens de células da granulosa e esta interação, em geral, ini-be a sua luteinização por promover o crescimento, regular a esteroidogênese e a síntese de inibinas, e por inibir a expressão dos receptores do hormônio luteinizante. As células da granulosa das paredes foliculares que não mantêm qualquer contato com o gameta e recebem uma concentração mais diluída dos fatores secretados pelo oócito, seguem um caminho de diferenciação fenotípica diferente (Gilchrist et al., 2004).
A formação de uma cavidade cheia de fluido, o antro, dentro de uma granulosa de múltiplas ca-madas, caracteriza o folículo antral. O fluido antral pode servir como uma importante fonte de elemen-tos regulatórios ou moduladores derivados do san-gue ou secreções das células foliculares, tais como gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento, enzimas, proteoglicanas e lipoproteínas. O oócito no interior de um folículo antral pode atingir um diâmetro de 120 μm em humanos, adquirindo então competência para retomar a meiose (van den Huck & Zhao, 2005). Folículos em crescimento e alguns vesiculares são observáveis já antes do nascimento
nas gônadas fetais femininas. Mas, apenas com o estabelecimento do equilíbrio hormonal adequado e com o início dos ciclos reprodutivos na puberdade é que o processo de crescimento folicular culmina com a ovulação.
A grande maioria dos folículos vesiculares que são produzidos após a puberdade (e todos antes dela) sofre degeneração em algum momento de seu crescimento. O número de folículos que chega à ovulação é mais ou menos fixo para as diferentes espécies pelos níveis de gonadotrofinas circulantes. A cada ciclo reprodutivo, como uma conseqüência direta da liberação de FSH, um grupo de folículos em desenvolvimento é estimulado a continuar o crescimento e a maturação. Em humanos, somente um folículo, em geral, sofre ovulação a cada mês; os demais, cerca de vinte, degeneram em diferentes estágios do crescimento (Baker, 1982).
A injeção de gonadotrofinas exógenas nos tratamentos de Reprodução Assistida resgata os múltiplos folículos destinados a degenerar, e faz com que eles atinjam o ponto pré-ovulatório, quando são coletados e aproveitados para alguma técnica de fertilização in vitro.
O pico do LH induz a última onda de multi-plicação das células do cumulus. A quantidade de fluido no folículo antral aumenta e o folículo cresce muito, atingindo o diâmetro final de 2,5 cm próximo ao momento da sua ruptura, a ovulação.
Durante a maturação gamética e folicular final, as células foliculares imediatamente ad-jacentes ao oócito, que constituem o cumulus
oophorus, se desprendem das demais células da
granulosa, ficando, eventualmente, unidos ape-nas por um pedículo. No folículo prestes a ovular, fatores secretados pelos oócitos também exercem papéis fundamentais na expansão das células do
cumulus, e na regulação da estabilidade da matriz
extracelular, facilitando assim a ovulação (Gilchrist
et al, 2004).
Degeneração Gamética e Menopausa
Como mencionado anteriormente, a maioria dos oócitos contidos nos ovários degenera, antes da ovulação por um processo chamado de atresia. A grande perda de células germinativas ocorre já antes do nascimento, afetando as oogônias, nas primeiras divisões mitóticas e durante as primeiras etapas da prófase. Em humanos, cerca de 5 x 106 oogônias e oócitos são eliminados dos ovários entre o quinto mês de gestação e o nascimento. A atresia continua a eliminar grande parte da população gamética rapi-damente após o nascimento e em uma taxa menos
acentuada ao longo da vida até a menopausa, quan-do poucos oócitos podem ser detectaquan-dos em cortes histológicos dos ovários (Baker, 1963).
Do total de aproximadamente 7 x 106 oó-citos presentes ao nascimento, apenas 400-500 serão ovulados durante a vida reprodutiva, o que parece ser um processo muito desperdiçador em reprodução (Baker, 1982). Esta conclusão fica ainda mais óbvia quando consideramos a mulher moderna, a qual deixa em geral um descendente e raramente mais de três. Entretanto, este des-perdício tem razão de ser se levarmos em conta os fatores limitantes ao número de descendentes, ao momento da concepção e do nascimento, na conjuntura social atual.
Os fatores que levam a tamanho desperdício pela degeneração celular não foram totalmente esclarecidos, sabendo-se, entretanto, que fatores genéticos e metabólicos contribuem para que ela ocorra. Um exemplo de fator genético que afeta a sobrevivência das células germinativas femininas é encontrado nas mulheres portadoras da Síndro-me de Turner. Nesta condição, temos apenas um cromossomo X em todas as células do organismo e estas mulheres não apresentam qualquer célula germinativa após o nascimento. Seus ovários fetais, entretanto, são inicialmente normais, mas as célu-las germinativas são eliminadas gradativamente antes das meninas atingirem a puberdade.
Acredita-se que a morte celular programada, apoptose, desempenha um papel proeminente no desenvolvimento do ovário fetal e no ciclo ovaria-no pós-natal. A perda de oócitos, tanto de forma direta por morte das células germinativas como indiretamente por atresia folicular, é um evento fundamental, associado com a definição do período de reprodução normal ou senescência prematura das fêmeas mamíferas. O destino da maioria dos folículos é a degeneração atrésica. Em humanos, este processo culmina na quase exaustão total da reserva oocitária aproximadamente na 5ª década de vida, levando à menopausa. Sabe-se que a apoptose folicular está associada a decréscimos substanciais do RNA mensageiro para receptores de FSH e LH nos folículos atrésicos, consistente com a sua di-minuída capacidade de resposta às gonadotrofinas (Tilly et al., 1996).
Como é também o caso com outros órgãos ou sistemas, um conjunto de genes e rotas sinalizado-ras conservados evolutivamente tem sido relacio-nado com o mecanismo de apoptose ou “suicídio celular” no ovário, por mais de uma década. Sabe-se da existência de genes especificamente envolvidos com a sobrevivência ou morte das células germi-nativas ou somáticas ovarianas. A expressão do gene repressor da morte bcl-2 é fundamental para
a manutenção do complemento normal de células germinativas e folículos primordiais nos ovários de mamíferos. Animais transgênicos homozigotos para ausência deste gene apresentaram um número total de folículos primordiais significativamente reduzido, quando comparado com o tipo selvagem ou heterozigoto para o alelo (Ratts et al., 1995). Por outro lado, estudos sobre a expressão do gene Bax, demonstrou que a ausência de seu produto em fê-meas de idade avançada leva a uma reserva oocitária e função ovariana compatíveis com fêmeas jovens (Perez et al., 1999). Existem também indícios de que a aceleração do processo de apoptose observada com o avanço da idade está associada à função das células do cumulus. Na ausência de células do
cumu-lus, oócitos obtidos de camundongos fêmeas de
idade avançada e mantidos in vitro, apresentaram a mesma taxa de apoptose que oócitos de fêmeas jovens (Perez & Tilly, 1997). Por fim, acredita-se que a apoptose das células germinativas possa ser regulada pelos seus próprios níveis de MPF e MAPK (Fissore et al., 2002).
Um estudo de grande impacto no conheci-mento sobre a reserva folicular ovariana foi pu-blicado, em 2004, por Bukovsky e colaboradores. Baseados em dados histológicos e imunohisto-químicos, estes autores sugerem a existência de um processo de formação seqüencial e de novo de folículos primordiais, a partir de células me-senquimais progenitoras, encontradas na túnica albugínea ovariana. A formação de novos folículos primordiais ao longo de todo o período reprodutivo compensaria pela atresia observada em grande parte do pool folicular e garantiria a preservação de um número relativamente constante de folículos iniciais encontrados nos ovários de mulheres entre 18 e 38 anos de idade. Além disto, o conhecimento dos mecanismos regulatórios deste processo de formação de novas células germinativas e folículos primordiais em mulheres adultas levaria a aplica-ções clínicas relevantes relacionadas à expansão terapêutica da reserva folicular, como maneira de retardar a falha ovariana prematura ou normal (van den Hurk & Zhao, 2005).
Um ponto importante a ser ainda mencio-nado, é a extrema vulnerabilidade das células germinativas femininas a uma série de insultos pa-tológicos, tais como as terapias anti-câncer, as quais eventualmente levam à falha ovariana precoce e à infertilidade, devido à morte acelerada dos oócitos. O entendimento sobre o papel que os membros da família bcl-2 desempenham na regulação da apop-tose nas gônadas femininas, assim como a função da ceramida e do fosfato-1-sphingosina (S1P) como uma mediadora e um supressor, respectivamente, da apoptose nos oócitos induzida por agentes de
terapia anti-câncer, pode, eventualmente, permitir o desenvolvimento de novas estratégias, baseadas no uso de lipídios para evitar a infertilidade e a menopausa prematura em pacientes oncológicas jovens (Tilly & Kolesnick, 2002).
A Maturação Oocitária In Vitro
A base para a maturação in vitro (IVM) é a maturação em condições artificiais de um oócito do estágio de vesícula germinativa até a metáfase II. Basicamente, todos os tratamentos de Reprodução Assistida envolvem a estimulação ovariana, na qual a mulher recebe gonadotrofinas exógenas, a fim de induzir um grande número de folículos ao cresci-mento e à maturação, para que sejam produzidos muitos oócitos aptos à fertilização. Estes tratamen-tos, entretanto, são bastante dispendiosos e podem acarretar efeitos colaterais não desejáveis, tal como a síndrome da hiperestimulação ovariana. Uma al-ternativa que vem sendo amplamente investigada é a maturação in vitro (IVM) de oócitos coletados sem qualquer estímulo gonadotrófico.
A IVM é um procedimento de rotina nos la-boratórios de melhoramento animal bovino, sendo a maior parte dos embriões para transferência obtidos a partir de oócitos imaturos coletados de ovários de matadouro. Em humanos, esta meto-dologia apenas recentemente tem recebido maior atenção, apesar de o primeiro relato de IVM e fer-tilização de oócitos humanos ter sido já na década de 60 (Edwards, 1965). Trounson e colegas (1994) foram os primeiros a relatar uma gestação, a partir da coleta de oócitos imaturos de uma paciente com ovários policísticos. Desde então, diversos grupos têm relatado casos de nascimentos após IVM de oócitos obtidos a partir de ciclos não induzidos por gonadotrofinas.
Mulheres com ovário policisticos constituem a população ideal para este tipo de tratamento, visto sua enorme sensibilidade à estimulação ovariana, desenvolvendo freqüentemente a sín-drome da hiperestimulação. O segundo grupo de mulheres com forte indicação para IVM é daquelas pacientes com ciclos regulares e ovários normais, as quais são encaminhadas à reprodução assistida por severo fator masculino. Recentemente, casos de gestações e nascimentos foram relatados, nos quais os embriões foram obtidos por IVM e injeção intracitoplasmática de espermatozóides obtidos a partir de aspiração testicular (Yun et al., 2005).
O aprimoramento da técnica de coleta de oócitos imaturos combinada com novas técnicas de maturação in vitro tem possibilitado índices
gestacionais entre 20 e 24% por aspiração folicular (Mikkelsen, 2005; Lê Du et al., 2005). Agulhas de aspiração de calibre bastante fino, baixa pressão de aspiração e capacidade do ultra-sonografista em selecionar os folículos adequados para aspiração, parecem ser os principais componentes do sucesso deste procedimento. Sabe-se que o diâmetro míni-mo do folículo do qual o oócito humano matura in vitro é de 5 mm e que o tamanho mínimo do oócito para que ele possa reassumir meiose em cultura é de q 110 μm, pois apenas com este diâmetro ou maior, as células germinativas tornam-se meiotica-mente competentes (Combelles et al., 2005).
O tratamento de IVM acoplado à fertilização por injeção intracitoplasmática de espermatozói-des (ICSI) em ciclos não estimulados passou a ser considerado um tratamento viável, não apenas para pacientes com ovários policísticos, mas também para uma ampla população de casais inférteis que procuram os serviços de Reprodução Assistida. O re-finamento da técnica com o conhecimento adquirido a partir dos trabalhos pioneiros certamente levará a índices gestacionais superiores aos atuais, com custos significativamente mais reduzidos do que nas metodologias atuais de Reprodução Assistida.
Abstract
Assisted reproduction technologies such as in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer have had a limited progress mainly because of a lack of oocytes for fertiliza-tion. Artificial stimulation with exogenous gona-dotropins increases the number of pre-ovulatory oocytes, but individual response to the treatment is very variable. In vitro maturation of immatu-re oocytes has obtained incimmatu-reased immatu-research and clinical interest in human assisted reproduction in the last few years. However, a limiting factor to the developement and improvement of in vitro culture methods for immature oocytes is the lack of knowledge of the in vivo maturation factors involved as origen, growth and in vivo maturation of the female gamet. The present article aimed to do a broad review on what is already known and understood since the generation of the first germ cells in the female fetus, until their disappearance when women reach menopause. Finally, we pre-sent a brief state of the art of in vitro maturation in humans as an alternative to the currently used technologies in assisted reproduction.
KEYWORDS: Oogenesis. In vitro maturation.
Leituras Suplementares
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