TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
LƯU THÚY DIỄM
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH TỔNG
FLAVONOID TỪ MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Hóa học
Khóa: 35
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
- - - - - -
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH TỔNG
FLAVONOID TỪ MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ths. Nguyễn Thị Ánh Hồng
Lưu Thúy Diễm
MSSV: 2096741
Lớp: Cử nhân Hóa K35
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài vì kinh nghiệm còn ít ỏi nên em đã gặp rất nhiều khó khăn bên cạnh những khó khăn gặp phải, em cũng nhận được không ít sự yêu thương, ủng hộ, động viên, giúp đỡ từ gia đình, bạn bè, thầy cô. Chính những tình cảm tốt đẹp ấy đã giúp em hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức mới hữu ích cho bản thân. Nay em xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Khoa học Tự Nhiên cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường.
Bộ môn Hóa học trường Đại học Cần Thơ, quý thầy cô, tập thể cán bộ hướng dẫn phòng thí nghiệm của Bộ môn đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho em tiến hành các thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến cô Nguyễn Thị Ánh Hồng và cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn các bạn lớp Hóa học khóa 35 đã giúp đỡ, chia sẻ, đóng góp ý kiến trong suốt thời gian làm luận văn.
Do kinh nghiêm chưa nhiều, kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý từ quý thầy cô cùng các bạn để đề tài của em hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Cần thơ, ngày 20/05/2013 Sinh viên thực hiện
Lưu Thúy Diễm
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Trường Đại học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Đôc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ Môn Hóa Học
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán bộ hướng dẫn: Th.s. Nguyễn Thị Ánh Hồng
1. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV-VIS”
Sinh viên thực hiện: Lưu Thúy Diễm MSSV: 2096741 Lớp: Hóa học – Khóa 35 Nội dung nhận xét: Hình thức ... ... Nội dung ... ... Những vấn đề còn hạn chế ... ... Kết luận, đề nghị và điểm ... ... Cần Thơ, Ngày 20 tháng 05 năm 2013 Cán bộ hướng dẫn Nguyễn Thị Ánh Hồng
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Trường Đại học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Đôc lập – Tự do – Hạnh phúc Bộ Môn Hóa
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán bộ phản biện:
... ... 1. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao
dược liệu bằng phương pháp UV-VIS”
Sinh viên thực hiện: Lưu Thúy Diễm MSSV: 2096741 Lớp: Hóa học – Khóa 35 Nội dung nhận xét: Hình thức ... ... Nội dung ... ... Những vấn đề còn hạn chế ... ... Kết luận, đề nghị và điểm ... ... Cần Thơ, Ngày 20 tháng 05 năm 2013 Cán bộ phản biện
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
MỞ ĐẦU
Flavonoid là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực vật, có trong hơn nửa các loại rau quả dùng hàng ngày. Flavonoid có mặt trong tất cả các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây. Trong cây, flavonoid giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng,…), một số còn có tác dụng điều hoà sự sinh trưởng của cây cối. Hơn thế, flavonoid còn là chất có nhiều hoạt tính sinh học như: ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá, bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ, làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc…. chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan…Vì vậy, việc tách, chiết, định lượng flavonoid từ dược liệu đã và đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, có nhiều phương pháp tách chiết Flavonoid đang được sử dụng : phương pháp chiết xuất ướt, phương pháp chiết xuất trào ngược, sắc kí lớp mỏng, sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao…Nhưng, để phân tích tổng flavonoid, các phương pháp trên cho hiệu suất không cao, tốn nhiều thời gian và chỉ thể hiện kết quả một cách gần đúng dẫn đến kết quả không chính xác. Xuất phát từ lí do trên tôi chọn đề tài “Xây dựng qui trình phân tích tổng
flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV-VIS ” nhằm đưa ra phương pháp mới định lượng Flavonoid một cách chính xác hơn, độ tin cậy cao hơn.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
TÓM TẮT
Với đề tài “Xây dựng qui trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược
liệu bằng phương pháp UV-VIS” luận văn sẽ tiến hành tối ưu hóa quy trình
định lượng tổng flavonoid bằng phương pháp thêm chuẩn với chất chuẩn là Rutin và Quercetin đối với mỗi loại cao dược liệu khác nhau với các thông số: max (200-500nm), nồng độ dung môi ethanol hòa tan (40-90%), nồng độ AlCl3
(5-11%) và thời gian phản ứng. Sau đó tiến hành định lượng tổng flavonoid theo quy trình đã tối ưu hóa.
Kết thúc quá trình thí nghiệm, đề tài đã tối ưu hóa quy trình định lượng tổng flavonoid với các thông số như sau: Tùy theo những dược liệu khác nhau có bước sóng hấp thụ riêng, nồng độ ethamol hòa tan là 80%, nồng độ AlCl3: 10%
và thời gian tiến hành phản ứng là trước 15 phút. Đề tài cũng đã tiến hành định lượng tổng flavonoid trong 5 loại cao: bìm bìm, rau đắng, kim tiền thảo, đinh lăng và diếp cá bằng phương pháp đã tối ưu hóa. Kết quả cho thấy hàm lượng tổng flavonoid trong 5 loại cao trên khá cao và phương pháp thêm chuẩn với chất chuẩn quercetin cho kết quả cao hơn.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN... i
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN... ii
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN...iii
MỞ ĐẦU... iv TÓM TẮT... v MỤC LỤC... vi DANH MỤC BẢNG ...vii DANH MỤC HÌNH ...ix PHẦN 1. TỔNG QUAN CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ FLAVONOID ...2
1.1. FLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU. ...2
1.1.1. Khái niệm [1]. ...2 1.1.2. Nguồn gốc [2]. ...2 1.1.3. Phân loại [1,2]...3 1.1.3.1. Euflavonoid. ...4 1.1.3.2. Isoflavonoid...4 1.1.3.3. Neoflavonoid. ...4 1.1.4. Tính chất [1,2]...5 1.1.4.1. Eucoflavonoid ...5 a. Flavon, Flavonol...5 b. Flavanon, flavanol. ...5 d. Anthocyanidin, anthocyanin. ...6
1.1.4.2. Isoflavonoid (isoflavon, isoflavanon, rotenoid) ...7
1.1.5. Phân bố trong thực vật [2]. ...7
1.1.6. Tác dụng sinh học [2]...8
1.2. TỔNG QUAN VỀ QYERCETIN VÀ RUTIN. ...9
1.2.1. Quercetin...9
1.2.2. Rutin. ...10
1.2.3. Tác dụng sinh học của Quercetin và Rutin ...10
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU. ...12
2.1. PHƯƠNG PHÁP TRÍCH FLAVONOID RA KHỎI CÂY. ...12
2.1.1. Phương pháp trọng lượng. ...12 2.1.2. Phương pháp hấp phụ...13 2.1.3. Phương pháp tách phân đoạn...13 2.2. ĐỊNH TÍNH [1]. ...15 2.3. ĐỊNH LƯỢNG [8]...17 2.3.1. Phương pháp trọng lượng. ...17 2.4.2.Phương pháp UV-VIS. ...18 CHƯƠNG 3. SƠ LƯỢC MỘT SỐ CAO TRONG PHÂN TÍCH. ...20 3.1. HẠT BÌM BÌM BIẾC ...20 3.2. ĐINH LĂNG ...20
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
3.3 RAU ĐẮNG ...21
3.4 DIẾP CÁ...22
3.5 KIM TIỀN THẢO...22
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...24
CHƯƠNG 1. VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ...25
1.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH...25
1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ...25
1.2.1. Dụng cụ...25
1.2.2. Hóa chất. ...25
1.2.3. Thiết bị nghiên cứu. ...26
1.2.4. Xử lý kết quả thực nghiệm. ...26
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ...27
CHƯƠNG 2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS...28
2.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONPOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS. ...28
2.2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH. ...28
2.2.1. Xác định bước sóng tối ưu...28
2.2.2. Khảo sát nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ...29
2.2.3. Khảo sát nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ...30
2.2.4. Khảo sát thời gian phản ứng ảnh hưởng đến độ hấp thụ...32
2.2.5. Quy trình định lượng tồng flavonoid. ...34
CHƯƠNG 3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONOID TRONG MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS ...36
3.1. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN SỬ DỤNG CHẤT CHUẨN QUERCETIN...36
3.2. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN SỬ DỤNG CHẤT CHUẨN RUTIN...38
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...44
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Phân loại flavonoid...3
Bảng 2. Màu của flavonoid dưới ánh đèn tử ngoại khi có ...16
Bảng 3. Bước sóng cực đại của các chất. ...29
Bảng 4. Nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ...30
Bảng 5. Nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ ...31
Bảng 6. Độ hấp thụ của mẫu với chất chuẩn Quercetin ...36
Bảng 7. Độ hấp thụ của mẫu với chất chuẩn Rutin...38
Bảng 8. Hàm lượng mẫu tính theo Quercetin và Rutin...40
DANH MỤC HÌNH Hình 1. Quy trình tủa flavonoid bằng Chì acetat ...13
Hình 2. Quy trình chiết tách flavonoid ra khỏi cây bằng dung dịch kiềm ...15
Hình 3. Giấy kiểm định chất lượng Quercetin và rutin...26
Hình 4. Quy trình định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-VIS ...28
Hình 5. Đồ thị biểu diển nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ...30
Hình 6. Đồ thị biểu diển nồngdđộ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ...31
Hình 5. Thời gian phản ứng của cao Kim tiền thảo. ...32
Hình 6. Thời gian phản ứng của cao Đinh lăng. ...32
Hình 7. Thời gian phản ứng của cao diếp cá. ...33
Hình 8. Thời gian phản ứng của cao Rau đắng...33
Hình 9. Thời gian phản ứng của cao Bìm bìm...33
Hình 10. Đồ thị biểu diễn độ hấp thu của cao Kim Tiền Thảo-Quercetin ...36
Hình 11. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của cao Đinh lăng-Quercetin...37
Hình 12. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của cao Rau đắng-Quercetin ...37
Hình 13. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Bìm bìm-Quercetin...37
Hình 14. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Rau đắng-Rutin ...38
Hình 15. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Bìm bìm-Rutin ...39
Hình 16. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Đinh lăng-Rutin...39
Hình 17. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Kim tiền thảo-Rutin...39
Hình 18. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của Diếp cá-Rutin ...40
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
PHẦN 1. TỔNG QUAN
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ
FLAVONOID
1.1. FLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU. 1.1.1. Khái niệm [1].
Là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn các flvonoid có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn cơ bản.
Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là hai vòng benzen A và B nối nhau qua dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6.
Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở. Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt
đầu từ dị vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng
B và đánh số phụ trên vòng A.
1.1.2. Nguồn gốc [2].
Cũng giống vitamin C, các flavonoid được khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất của thế kỷ 20: Albert Szent-Gyorgyi (1893-1986). Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về đặc tính của vitamin C và flavonoid.
Trong quá trình phân lập vitamin C, Szent-Gyorgyi đã khám phá ra các flavonoid. Một người bạn của ông đã ngừng chảy máu nứơu răng sau khi dùng dịch chiết giàu vitamin C trong dịch chiết nước chanh. Nhưng sau đó khi người bạn bị chảy máu nướu răng tái phát, Szent-Gyorgyi cho bạn ông dùng vitamin C nguyên chất, thì sự cải thiện không xảy ra. Như vậy đã có sự tham gia của một chất khác bên cạnh vitamin C trong dịch chiết nước chanh. Và Szent-Gyorgyi đã phân lập được chất này, giúp người bạn chống chảy máu nướu răng hữu hiệu.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Ban đầu Szent-Gyorgyi gọi chất này là “vitamin P”, do có khả năng làm giảm tính thấm thành mạch của nó (vascular permeability), một trong những triệu chứng thường gặp của bệnh Scurvy do thiếu vitamin C. Sau này ông đã công bố bệnh Scurvy xảy ra không chỉ do thiếu vitamin C mà còn do thiếu flavonoid. Tuy nhiên vì flavonoid không có đầy đủ tính chất của một vitamin nên sau này người ta bỏ tên vitamin P này đi. Như hầu hết các vitamin và khoáng chất, flavonoid là một dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể chúng ta.
1.1.3. Phân loại [1,2].
Thường các flavonoid mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và vị trí 3,4,5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycosid. Các đường thường gặp nhất là D-glucose, kế đó là D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic.
Các flavonoid được phân thành nhiều nhóm với cấu trúc cơ bản khác nhau, dựa vào việc sinh tổng hợp.
Có nhiều cách phân loại khác nhau, cách phân loại thường dùng là dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3C.
Euflavonoid isoflavonoid neoflavonoid
các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2 các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3 các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4
anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy
flavanon, flavon,flavonol, dihydro chalcon, chalcon, auron. Isoflavan, Isoflav-3-ene, Isoflavan-4-ol, Isoflavon, rotenoid, pterocarpan, Coumestan, 3-phenylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon Bảng 1. Phân loại flavonoid
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
1.1.3.1. Euflavonoid.
Bắt nguồn từ cấu trúc của 2-phenylchromen-4-one (2-phenyl-1,4benzopyrone)
Flavon (= Flav-2-en-4-on) Flavonol (=3-Hydroxy-4-oxoflav-2-en)
Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá)….
Flavanon ( = Flavan-4-on ) Chalcon
Chalcon có chủ yếu ở một số cây họ cúc.
Asteraceac tập trung nhiều nhất ở vỏ cây, gổ lõi (keo, bạch đàn, dẻ, đậu tương, trinh nữ hoàng cung, dương xỉ…). Không tìm thấy ở động vật.
1.1.3.2. Isoflavonoid.
Bắt nguồn từ cấu trúc của 3-phenylchromen-4-one (3-phenyl-1,4-benzopyrone)
Isoflavan isoflavonoid
1.1.3.3. Neoflavonoid.
Bắt nguồn từ cấu trúc của 4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2-benzopyrone). Vì thế flavonoid được xem là một nhóm hoạt chất lớn trong dược liệu.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Neoflavan Neoflavonoid
* Người ta còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan.
1.1.4. Tính chất [1,2]
Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa.
Do từng phân nhóm của flavonoid có cấu tạo riêng, chúng vừa có tính chất chung vừa có những khác biệt về tính chất vật lí và hóa học.
Trong thực vật, các hợp chất trên thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp của các dẫn xuất, với tỷ lệ khác nhau, tùy theo nguồn gốc thực vật.
1.1.4.1. Eucoflavonoid
a. Flavon, Flavonol.
Flavon Flavonol
- Là hợp chất phân cực nên tan trong nước, ít tan trong dung môi hữu cơ. - Hơ tờ giấy có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac cho màu vàng sáng. - Acid sunfuaric nhỏ lên các dẫn chất flavon, flavonol cho màu vàng đậm. - Dung dịch SbCl5/CCl4 : màu vàng đậm. b. Flavanon, flavanol.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Flavanon Flavanol
- Các dẫn xuất flavan-3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt.
- Flavanon, flavanol có trong lá, vỏ hoặc gỗ của một số loại cây. Flavanon, flavanol là các dẫn chất không màu, nhưng khi tác dụng với acid vô cơ thì có màu đỏ.
- Dễ bị oxy hóa và trùng hợp hóa nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn.
c. Chalcon.
Chalcon - Kém bền trong môi trường kiềm.
- Tác dụng với dung dịch FeCl3 : cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tùy
theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử.
- Dễ tan trong nước nóng, alcol,...tạo dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực nnhu7benzene hoặc chloroform.
- Dưới tác dụng của H+ hoặc OH-, chalcon có thể chuyển sang flavanon - Khi tạo liên kết glycoside phần đường nối vào vị trí 4’, một số ở 2’.
d. Anthocyanidin, anthocyanin.
Anthocyanidin
- Anthocyanidin có tính base đủ mạnh để tạo thành muối bển với acid vô cơ. - Chúng tạo dung dịch màu đỏ trong acid và màu xanh da trời trong môi trường kiềm.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
- Ở dạng base tự do, anthocyanidin là chất đồng phân với flavanon. - Là dẫn xuất của flavon mà nhóm carbonyl bị khử thành rượu.
- Anthocyanidin thường tồn tại dưới dạng glycozit, gọi là anthocyanin.
1.1.4.2. Isoflavonoid (isoflavon, isoflavanon, rotenoid)
Isoflavon Isoflavanon
Tất cả các Isoflavonoids không có màu sắc. Nó được tạo thành từ axetat theo cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamat dẫn xuất được sát nhập vào vòng B và C-2,-3 và -4 của dị vòng.
1.1.5. Phân bố trong thực vật [2].
Flavonoid ít gặp trong thực vật bậc thấp. Trong ngành rêu ít thấy, trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.
- Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid.
- Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rất nhiều dẫn chất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan-3-ol. Họ Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ Rosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp các anthocyanin có mạch đường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavonol sulfat.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
- Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae, Poaceae.
- Ðộng vật không tổng hợp được flavonoid nhưng trong một vài loài bướm khi phân tích thấy có flavonoid là do chúng lấy từ thức ăn thực vật.
Hàm lượng và cả thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng.
1.1.6. Tác dụng sinh học [2].
Flavonoid là nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học:
- Trước hết, các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như OH•, ROO• (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hoá,…
Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá màng. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ.
- Hyaluronidase là enzym làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzym này sẽ xảy ra hiện tượng xuất huyết dưới da. Flavonoid ức chế sự hoạt động của hyaluronidase, vì thế, nếu được bổ sung flavonoid, tình trạng trên sẽ cải thiện. Phối hợp với vitamin C, flavonoid của hoa Hoè (rutin) sẽ tăng cường tác dụng trị liệu. - Những nhà nghiên cứu cũng đã chỉ ra những tác động của thực phẩm giàu flavonoid với những nguy cơ về tim mạch như huyết áp cao. Flavonoid làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc…
- Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan.
- Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, favanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, đó là các flavonoid có trong lá Diếp cá, trong cây Râu mèo…
- Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myricetin, hỗn hợp các catechin của Trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim…
- Cao chiết từ lá Bạch quả (Ginko biloba) chứa các chất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt…
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
- Theo nghiên cứu của bác sĩ Lee Hooper, giảng viên trường đại học East Anglia tại bang Norwich,U.K., và cộng sự đã sàng lọc hơn 133 nghiên cứu đã tìm ra được mối liên kết giữa những phân lớp flavonoid khác nhau và thực phẩm giàu flavonoid trên những tác nhân gây nguy cơ cho bệnh tim mạch, như cholesterol có hại, huyết áp cao hay máu chảy chậm. Báo cáo đưa ra kết luận sau:
+ Ăn chocolate hoặc ca cao làm tăng sự giãn nở mạch máu. Chúng cũng làm giảm áp suất của máu, tâm thu (phản ánh áp lực tối đa khi tim co lại) bằng khoảng 6 điểm, và tâm trương (phản ánh áp lực tối đa khitim giãn) khoảng 3.3 điểm.
Nhưng điều này dường như không có ảnh hưởng gì đến cholesterol LDL xấu .+ Protein đậu nành cũng làm giảm áp lực máu tâm trương gần bằng 2 điểm thủy
ngân và cải thiện protein xấu, nhưng không ảnh hưởng đến cholesterol HDL tốt. Những ảnh hưởng này được tìm thấy trong protein đậu nành đơn, không có trong những sản phẩm từ đậu nành khác.
+ Thói quen uống trà xanh cũng làm giảm lượng cholesterol xấu trong máu, nhưng uống trà đen sẽ làm tăng áp suất của cả tâm thu và tâm trương, tăng lên 5.6 điểm cho tâm thu và 2.5 điểm cho tâm trương. - Nghiên cứu tác dụng chống viêm của flavonoid chiết xuất từ rễ cây cao cẳng (Radix Ophiopogonis confertifolius) trên thực nghiệm. Đề tài do các tác giả Nguyễn Thị Vinh Huê, Nguyễn Duy Thuần (Viện Dược liệu), Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Trọng Thông (Bộ môn Dược lý – Trường ĐH Y Hà Nội) thực hiện nhằm đánh giá
tác dụng chống viêm của flavonoid chiết từ rễ cao cẳng trên thực nghiệm. Trong dân gian từ lâu đã sử dụng những dược liệu giàu flavonoid để giữ gìn sức
khoẻ bằng cách dùng đơn giản là trà thuốc, thuốc sắc như nước trà (chè), trà artichaut,… vừa rẻ tiền vừa hiệu quả. Những dược liệu có hàm lượng cao flavonoid đã được khai thác và chiết xuất lấy flavonoid để phục vụ nền công nghiệp dược: hoa Hoè, vỏ Cam, Núc nác, Hoàng cầm, lá Xoài, bồ Kết… và một số flavonoid đã được nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: thuốc viên, thuốc nước,… rất tiện sử dụng.
1.2. TỔNG QUAN VỀ QYERCETIN VÀ RUTIN. 1.2.1. Quercetin.
Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one Tên khác: Shophoretin, Meletin, Xanthaurine, Quercetol, Quercitin, Quertine, Flavin meletin.
Công thức phân tử: C15H10O7.
Khối lượng mol: 302.236 g/mol Tỷ trọng: 1.799 g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: 3160C
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Là hợp chất tinh thể màu vàng nhạt, phát huỳnh quang ở bước sóng 510nm. Tan tốt trong methanol, ethylacetat, không tan trong nước, n-hexan, aceton.
1.2.2. Rutin. Tện IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyloxy]-4H-chromen-4-one Công thức phân tử: C27H30O16 Khối lượng phân tử: 610,52 g mol-1 Nhiệt độ nóng chảy: 242 ° C
Là tinh thể màu vàng nhạt hay hơi vàng lục, không mùi hay hơi có mùi đặc trưng. Dể ra ánh sáng có màu hơi sẫm lại.
Phần glycon của rutin là quercetin (= quercetol) thuộc nhóm flavonol, phần đường là rutinose (=6-O--L-rhammopyranosul--D-glucopyranose).
Dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và trong các dung dịch kiềm loãng, tan ít trong glycerin, khó tan trong etanol (1/650) và iso-propanol, tan trong etanol nóng (1/60), khó tan trong nước (1/10000), tan trong nước nóng (1/200), không tan trong: aceton, ether, chloroform, eter dầu hỏa, benzene, các acid và carbon disulfid.
1.2.3. Tác dụng sinh học của Quercetin và Rutin.
Quercetin và Rutin là những hợp chất có nhiều tác dụng sinh học:
Chúng là những hợp chất chống oxy hóa, do có khả năng dập tắc các gốc tự do như OH˜, ROO˜ (là các yếu tố gây biến dị, hủy hại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hóa). Đồng thời, tạo phức với một số kim loại mà các ion kim loại đó là tác nhân của các phản ứng oxy hóa trong cơ thể. Do đó chúng có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa chứng xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ, làm cho vết thương chóng lành sẹo.
Quercetin, Rutin ức chế sự hoạt động của Hyaluronidase là enzyme làm tăng tính thấm mao mạch, khi thừa enzyme sẽ xảy ra hiện tượng xuất huyết dưới da, vì thế nếu bổ sung Quercetin, Rutin đầy đủ và kịp thời tình trạng trên sẽ được cải thiện, phối hợp với Vitamin C sẽ tăng cường tác dụng điều trị.
Quercetin, Rutin làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, rối loạn tuần hoàn võng mạc.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Quercetin, Rutin còn có tác dụng chống độc, làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức năng gan lợi tiểu và làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, được dùng cho những người có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc, đầu óc kém tập trung, hay cáo gắt,…
Ngoài ra, Rutin còn có hoạt tính của Vitamin P, có tác dụng tăng cường sức bền và làm giảm tính thấm của mao mạch, làm tăng sự bền vững của hồng cầu, làm hạ thấp trương lực cơ nhãn, chống co thắt.
Bên cạnh đó, Rutin còn được dùng để phòng biến chứng và điều trị chứng chảy máu trong nhãn cầu do đái tháo đường (chưa có xuất hiện trong nhãn cầu cũng như các vi phình mạch trên những mao mạch của võng mạc).
Rutin khi thủy phân cho ra Quercetin enzyme.
Rutin tăng sức bền mao mạch và làm giảm tính thấm của các mao mạch nhỏ. Rutin bít các lổ thủng li ti trên những vi phình mạch của những bệnh nhân đái tháo đường.
Tuy nhiên, Rutin không được dùng trong trường hợp nghẽn mạch, máu có độ đông cao.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, ĐỊNH
TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG
DƯỢC LIỆU.
2.1. PHƯƠNG PHÁP TRÍCH FLAVONOID RA KHỎI CÂY.
Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số lượng nhóm hydroxy và các nhóm thế khác có trong cấu trúc hóa học, nên rất khó có một phương pháp chung để ly trích flavonoid ra khỏi cây. Flavonoid nào mang nhiều nhóm metoxy – OCH3 và ít nhóm hydroxy –OH, có tính phân cực yếu, tan tốt trong dung môi ít
phân cực như: benzen, cloroform, etyl acetate đôi khi tan một phần trong hexan. Flavonoid mang nhiều nhóm hydroxy có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan trong dung môi có tính phân cực như aceton, etanol, butanol, nước…
Các flavonoid glycosid, antocyanidin không tan trong dietyl eter, nhưng tan trong nước nóng, etanol nóng. Riêng antocyanidin, do khá bền với nhiệt độ nên có thể được chiết tách dưới dạng clorur bởi dung dịch 0,01 N HCL/metanol.
Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết
được phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất
methoxy flavonoid. Các chất anthocyanin thường kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin được acyl hoá với các acid aliphatic do đó người ta thường chiết bằng methanol có mặt của các acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Có tác giả dùng một lượng nhỏ acid mạnh dễ bốc hơi là trifluoroacetic acid (0,5-3%) để chiết các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dể bốc hơi trong quá trình làm đậm đặc. Dịch chiết đem làm đậm đặc dưới chân không ở nhiệt độ thấp (40-70oC). Ðối với những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì nên làm đông khô.
2.1.1. Phương pháp trọng lượng.
Nguyên tắc: Chì acetat kiềm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với các dẫn chất có nhóm o.dihydroxyphenol. Dựa vào nguyên tắc này ta sử dụng chì acetat để tủa flavonoid sau đó dùng Na2SO4 để
loại chì khỏi flavonoid.
Qui trình được trình bày trong sơ đồ sau. Cao chiết được hòa tan vào dung dịch 10% etanol / nước chứa trong một erlen. Từ từ rót vào erlen này một dung dịch nước 10% acetat chì, khuấy nhẹ sẽ có tủa flavonoid. Lọc thu lấy tủa. Hòa tan tủa trở lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy nhẹ cho thành dung dịch treo đồng nhất. Rót
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
thêm vào dung dịch nước bão hòa Na2SO4 nhằm loại bỏ chì PbSO4. Lọc lấy dung
dịch nước trong, đuổi nước bằng cô quay chân không thu được cao tho chứa flavonoid toàn phần. Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid.
Hình 1. Quy trình tủa flavonoid bằng Chì acetat
2.1.2. Phương pháp hấp phụ.
Nguyên tắc: Hấp thụ flavonoid bằng than hoạt tính và dùng dung môi hữu cơ thích hợp để chiết các flavonoid khác nhau.
Cho than hoạt tính vào dung dịch cao chiết nhầm hấp thu flavonoid. Lọc lấy than. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ từ phân cực yếu đến phân cực mạnh, thí dụ etyl eter, etyl acetate, metanol, nước nóng, phenol 7%... để chiết các flavonoid có tính phân cực khác nhau.
2.1.3. Phương pháp tách phân đoạn. Cao chiết
Dung dịch nước
Hòa vào etanol 10%
- Dung dịch nước acetat chì 10%, khuấy đều, để yên - Lọc
Dung dịch nước Tủa
- Hòa vào etanol 10%
- Thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4
- Để yên. Lọc
Tủa PbSO4 Dung dịch nước
Cô quay chân không Flavonoid thô Sắc ký cột Các flavonoid riêng rẽ
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Nguyên tắc: Các flavonoid do co mang nhiều nhóm –OH phenol nên có thể tan trong dung dịch kiềm. Dựa vào nguyên tắc này, sử dụng các dung dịch kiềm loãng hoặc nước vôi để chiết flavonoid khỏi cây cỏ, sau đó dung dịch chiết dược acid hóa để trả flavonoid về dạng –OH tự do.
Cách tiến hành: Hòa tan cao chiết vào dung môi hữu cơ thích hợp thí dụ clorofom, acetat etyl,… Tiếp theo, thực hiên sự chiết lỏng-lỏng dung dịch này với dung dịch nước kiềm 5-10% như: dung dịch Na2B4O7.10H2O, NaHCO3,
Na2CO3,…Các dung dịch nước kiềm được gộp chung lại và được acid hóa. Sử dụng
dung môi hữu cơ phù hợp để chiết tách các flavonoid ra khỏi dung dịch nước. Làm khan nước bằng CaCl2, Na2SO4,… Đuổi dung môi thu được cao thô chứa flavonoid
toàn phần. Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Hình 2. Quy trình chiết tách flavonoid ra khỏi cây bằng dung dịch kiềm 2.2. ĐỊNH TÍNH [1].
Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)
- Phân biệt sơ bộ bằng hơi amoniac:
Dưới ánh đèn tử ngoại UV365 và sự hiện diện của hơi amoniac, các flavonid sẽ thay
đổi màu sắc. Cao chiết được chấm thành hai chấm riêng biệt lên trên cùng tấm giấy sắc ký lớp mỏng, giải ly. Cắt bản mỏng chia ra làm đôi: một bản để tự nhiên còn
Cao chiết
Dung dịch hữu cơ
Hòa vào cloroform hoặc etyl acetat
- Thực hiện chiết lõng – lõng với dung dịch nước kiềm 5-10%
Pha hữu cơ Pha nước kiềm
Acid hóa
Pha nước Pha hữu cơ
- Làm khan với chất làm khan - Đuổi dung môi
Flavonoid thô
Sắc ký cột Các flavonoid riêng rẽ Pha nước acid
Thực hiện chiết lõng – lõng với dung môi hữu cơ: cloroform, etyl acetat…
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
bởi dung dịch 1% KOH/etanol. Lần lượt quan sát màu của vết trên hai bản: dưới ánh sáng thường và ánh sáng đèn tử ngoại 365nm. Sự khác nhau về màu tùy theo hợp chất flavonoid được trình bày trong bảng sau.
Không có dung dịch kiềm Phun xịt với dung dịch kiềm
Flavonoid Ánh sáng thường (VIS) UV365 Ánh sáng thường (VIS) UV365 Flavon Không màu đến vàng nhạt Nâu Xanh dương Vàng Vàng Flavonol Vàng nhạt đến vàng xậm Vàng, Vàng – lục Vàng Vàng
Flavanon Không màu Không màu Không màu Vàng
Flavonol-3-glycosid Không màu đến vàng nhạt Nâu tối Vàng Vàng, Vàng – lục
Catechin Không màu Không màu Không màu Vệt tối
Antocyanin Đỏ Nâu tối Xanh dương Vệt tối
Chalcon Vàng sẩm Vàng nâu xậm Vàng cam – cam đỏ Cam – đỏ Tía Bảng 2. Màu của flavonoid dưới ánh đèn tử ngoại khi có
và không có xử lý với kiềm
- Tác dụng của FeCl3: Dựa trên phản ứng của các nhóm phenol (-OH trên vòng
thơm) với Fe3+ tạo phức có màu từ xanh đến nâu.
- Tác dụng của NH3: Dựa trên phản ứng tạo màu của các loại flavonid với NH3.
Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương. Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam. Một số nhóm khác như flavan-3-ol, flavanon, isoflavon màu không thay đổi
- Tác dụng của NaOH đậm đặc và đun nóng (phân hủy kiềm): flavonoid với dung dịch KOH 30% thì sẽ mở vòng C rồi dẫn đến tạo thành dẫn chất acid thơm và dẫn chất phenol. Tùy theo nhóm thế và vị trí thế vào vòng A và B mà có các dẫn chất acid thơm và phenol khác nhau. Có thể xác định các dẫn chất này bằng phương pháp sắc ký đối chiếu với chất mẫu, kết quả thu được dùng để góp phần biện luận cấu trúc. Ví dụ khi phân huỷ chất Chrysin thì thu được phloroglucin, acid benzoic. . Tuy nhiên nếu thực hiện định tính với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ.
- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Hòatan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đậm đặc:
flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm đến vàng cam và có phát huỳnh quang đặc
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
biệt . Ðối với chalcon và auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho màu cam rồi đỏ.
- Tác dụng của antimoin pentachlorid (Phản ứng Martini Bettolo): SbCl5 trong CCl4 cho
màu từ đỏ đến tím với chalcon, vàng đến vàng cam với flavon. Dihydrochalcon thì mất nối đôi liên hiệp giữa nhóm carbonyl và vòng B nên không cho màu với SbCl5 hoặc với H2SO4
- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater): Phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/etanol trên các dẫn xuất flavonoid.
Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon, isoflavanon, auron
dung dịch không đổi màu.
• Nếu sử dụng bột Zn thay thế cho bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu đỏ xậm, còn flavonol và flavanon cho màu hồng nhạt hoặc không màu.
- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm: Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid.
Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm o.dihydroxyphenol.
- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni: Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ. - Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/ etanol: Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid/ hòa tan trong etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ.Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến đỏ tím.
2.3. ĐỊNH LƯỢNG [8].
2.3.1. Phương pháp trọng lượng.
Nguyên tắc: tận chiết flavonoid và loại tạp với các loại dung môi thích hợp. Đuổi dung môi, sấy, cân.
Tiến hành : Cân chính xác M (g) (khoảng 10g) bột dược liệu, chiết bằng n-hexan trong bộ dụng cụ Soxhlet đến khi dung dịch trong suốt, không màu. Sấy dược liệu đến 500C đến khô. Tiếp tục chiết bằng cồn ethanol 960 trong dụng cụ Soxhlet liên tục trong 8 giờ đến khi dung dịch trong suốt, không màu và không cho màu vàng với dung dịch NaOH 0.1N. Thu được dịch chiết cồn. Cất, thu hồi cồn thu được dung dịch cao đặc, xử lý với 50ml nước nóng, lọc, chiết với etyl acetat (5 lần, mỗi lần 15ml). Dịch chiết etyl acetat được cất thu hồi dung môi đến cặn. Sấy cặn ở 700C đến khối lượng không đổi, cân, ghi nhận khối lượng. Kết quả được tính theo công thức :
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Trong đó :
+ F là hàm lượng flavonoid toàn phần được biểu thị bằng phần trăm (kl/kl). + p là khối lượng flavonoid toàn phần thu được.
+ M là khối lượng mẫu dược liệu ban đầu. + h là hàm ẩm của dược liệu. Ưu điểm : + Nhanh, giá thành thấp. + Dụng cụ rẻ tiền, dễ thực hiện. Nhược điểm : + Độ chính xác không cao. + Mất nhiều thời gian. + Quy trình phức tạp. 2.4.2.Phương pháp UV-VIS.
Nguyên tắc : Dựa vào đặc tính tạo phức màu rất mạnh của các flavonoid với kim loại. Al3+ thường được sử dụng để khảo sát vì nó là kim loại tạo phức màu mạnh và không độc hại.
Ưu điểm : Độ chính xác cao, dễ thực hiện.
Nhược điểm : Nền mẫu phức tạp nên cần có bước hiệu chỉnh quy trình. Một số công trình nghiên cứu về định lượng tổng flavonoid bằng phương pháp UV-VIS.
Theo nhóm tác giả Hongbin Zhu, ‘‘Analysis of Flavonoids in Portulaca
oleracea L. by UV–Vis Spectrophotometry with Comparative Study on Different
Extraction Technologies. Portulaca oleracea L’’. Các điều kiện tối ưu khảo sát: nồng độ ethanol là 70% (v / v), tỷ lệ rắn lỏng là 1:50, đun nóng ở nhiệt độ là 50 ° C và thời gian là 9 phút. Định lượng được thực hiện bằng phương pháp quang phổ UV-Vis với hệ thống sinh màu với NaNO 2-Al (NO 3) 3 NaOH.
Theo Ana Josane Santas Fernandes và cộng sự; “Tatal flavonoid content in the raw material and aqueous extractive from Bauhinia monadra Kurz (Caesalpiniaceae)”. Các điều kiện tối ưu đã được khảo sát: nồng độ ethanol: 80%, nồng độ AlCl3: 9%.
Theo báo cáo của nhóm tác giả Yujie Chen, “Determination of total flavonoids in three Sedum crude drugs by UV–Vis spectrophotometry” đăng trên tạp chí Pharmacogn Mag. 2010 Oct-Dec; 6(24): 259–263.
Tiến hành trích dược liệu với ether dầu hỏa, bằng siêu phương pháp siêu âm hai lần trong 40 phút. Sau khi bột mẫu được sấy khô hoàn toàn, ethanol 70% được thêm vào, siêu âm trong 90 phút (3 × 30 phút) ở 55 ° C, và sau đó được lọc vào bình định mức với ethanol 70%.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Dung dịch mẫu được cho phản ứng với 5% NaNO 2 để 6 phút. Sau đó cho
tiếp dung dịch Al 10% (NO 3) 3 trong 6 phút và điều chỉnh pH cho hỗn hợp bằng dung
dịch NaOH 4%, để yên trong 15 phút và độ hấp thụ với mẫu trắng.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
CHƯƠNG 3. SƠ LƯỢC MỘT SỐ CAO TRONG
PHÂN TÍCH.
3.1. HẠT BÌM BÌM BIẾC
Tên khoa học: Ipomoea hederacea Jacp (Pharbitis hederaceaChoisy). Semen Pharbitidis.
Mô tả: Bìm bìm là loại cây dây leo nhờ thân quấn, thân mảnh, có lông. Lá 3 thùy nhẵn, xanh ở mặt trên, xanh nhạt và có lông ở mặt dưới, dài 14 cm, rộng 12 cm, cuống dài 5-9 cm. Hoa màu hồng tím hoặc lam nhạt. Quả nang, hình cầu nhẵn, có 3 ngăn, 2-4 hạt, 3 cạnh lưng khum, 2 bên dẹt, nhẵn nhưng ở tể hơi có lông, màu đen hoặc trắng tùy loại.
Bộ phận dùng: Hạt
Phân bố: Bìm bìm mọc hoang khắp nơi ở nước ta, thường thấy ở các bụi rậm ven đường, hay được trồng làm cảnh và giàn che nắng. Bìm bìm còn mọc ở Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Nhật Bản, Philippines, Trung Quốc.
Thành phần hóa học: Trong hạt bìm bìm biếc có chứa khoảng 2% pharbitin (pharbitic acid và vài purolic acid) còn gọi là glucosit. Ngoài ra hạt bìm bìm biếc còn chứa khoảng 11% chất béo và 2 sắc tố cũng là glucosit. Tác dụng dược lý: Trong hạt bìm bìm có chứa chất pharbitin là một chất có tác dụng tẩy xổ mạnh, ức chế giun đũa.
Ngoài ra, hạt bìm bìm cũng làm tăng độ lọc inilin của thận. Bìm bìm biếc có khả năng gây độc, đối với chuột LD50 là 37,5/kg. ở người có thể
gây buồn nôn do thuốc kích thích trực tiếp lên đường tiêu hóa. Liều cao có thể ảnh hưởng đến thận dẫn đến tiểu ra máu cũng như các triệu chứng thần kinh. Công dụng: Tính chất theo Đông y thì bìm bìm biếc vị cay, tính nóng hơi có độc, vào 3 kinh phế, thận và đại tràng. Có tác dụng tả khí phân thấp nhiệt, trục đờm, tiêu ẩm lợi nhị tiện là thuốc chữa tiện bĩ và cước khí, chủ trị hạ khí, lợi tiểu, chữa cước thũng, sát trùng.
Trong thực tế, bìm bìm biếc dùng làm thuốc thông đại và tiểu tiện, thông mật, đôi khi có tác dụng tẩy giun.
3.2. ĐINH LĂNG
Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias Fruticosa Harms thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), trong dân gian còn gọi là cây gỏi cá.
Mô tả: Đinh lăng thuộc loại cây nhỏ, cao 0,8-1,5m. Cây có lá kép, mọc so le, lá 3 lần xẻ lông chim, mép khía có răng cưa. Hoa đinh lăng màu lục nhạt hoặc trắng xám, quả dẹt, màu trắng bạc. Quả dẹt, dài 3 - 4mm, dày khoảng 1mm.
Bộ phận dùng: Cây đinh lăng được sử dụng toàn bộ các bộ phận của cây. Phân bố: Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polunésie ở Thái Bình Dương, cây được trồng ở Indonesia, Malaysia, Campuchia, Lào, mọc ở cả miền nam Trung
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Quốc. Ở Việt Nam, đinh lăng đã có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, trong đình chùa, trạm xá, bệnh viện,… để làm cảnh, làm thuốc và rau gia vị.
Thành phần hóa học: Trong rễ đinh lăng có glycoside, alkaloild, vitamin (B1, B2, B6, C), các phytostrol và 20 loại acid amin, trong đó các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, tryptophan, cystein). Qua phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá thấy có saponin, coumarin, tinh dầu, phytosterol, tannin, acid hữu cơ, đường khử và các hợp chất uronic. Từ rễ và lá của đinh lăng, 11 saponin triterpen có thành phần aglycon là acid oleanolic đã được xác định, trong đó có 8 hợp chất mới được dặt tên là polysioside A-H. Có 5 hợp chất polyacetylen trong rễ đinh lăng cũng đuọc phân lập, trong đó panaxynol, panaxydol và heptadecaien-diyn-diol là hợp chất có trong nhân sâm và 2 polyacetylen chủ yếu được phân lập từ lá cũng là panaxynol, heptadecaien –diyn-diol.
Tác dụng dược lý: Năm 1961, các khoa dược lý, dược liệu và giải bệnh lý Viện y quân sự Việt Nam nghiên cứu tác dụng của cây đinh lăng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể và một số tác dụng khác.
Công dụng: Trong dân gian, đinh lăng thường dùng để trị ho ra máu, chữa tắc tia sữa, làm mát huyết, lợi tiểu, chữa mẫn ngứa. Lá đinh lăng cũng được dùng để nấu canh với thịt, cá để bồi bổ cho sản phụ, người già hoặc người ốm mới dậy.
Theo y học cổ truyền, rễ đinh lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có công dụng thông huyết mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ. Nói chung, ngoài công dụng lương huyết và giải độc thức ăn, những tính chất khác của đinh lăng gần giống như nhân sâm.
3.3 RAU ĐẮNG
Rau đắng hay Biển súc, Cây càng tôm, Cây xương cá.
Tên khoa học : Glinus oppositifolius (L.) DC. Họ rau đắng (Molluginaceae). Cây mọc hoang ở nhiều nơi trong nước ta.
Mô tả : Cỏ nằm, phân nhiều nhánh, không lông. Lá đơn, mọc chụm 2-5 lá, phiến nguyên, hình xoan hẹp, dài 2-2,5 cm, 1 gân chính. Hoa xanh dợt, nhỏ, có cọng dài, không nhánh, 5 tiểu nhị và 3 vòi nhụy. Trái nang.
Bộ phận dùng: Toàn cây (Herba Glini oppositifolii)
Nơi sống : Cây phân bố từ Hải Phòng, Nam Định tới Sóc Trăng và Trà Vinh. Thường gặp trên đụn cát dọc bờ biển hay vùng ngập theo mùa, ao hồ và ruộng.
Thành phần hóa học: Rau đắng đất có saponin, flavonoid. Từ lá đã phân lập được các chất: spergulagenin A, spergulin A, spergulin B, spergulacin và
spergulacin A.
Tác dụng dược lý: Có tác dụng kích thích tiêu hóa, khai vị, kháng sinh, lợi tiểu, nhuận gan và hạ nhiệt.
Công dụng:
+ Rau đắng đất được dùng làm thuốc hạ sốt, chữa bệnh về gan, vàng da.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
3.4 DIẾP CÁ
Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb, thuộc họ lá Giấp (Saururaceae).
Mô tả : Cây thảo cao 15-50 cm, thân màu lục hoặc tím đỏ. Lá mọc so le, hình tim, có bẹ, khi vò ra có mùi tanh như mùi cá. Cụm hoa hình bông bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn.
Diếp cá là một loại cây thảo, mọc rất phổ biến ở Việt Nam và một số nước châu Á dùng để chửa nhiều bệnh như trĩ, phù thũng, thoát mủ, thông tiểu tiện, viêm, giải độc, thanh nhiệt… Vì trong diếp cá có chứa một số hoạt chất có tính kháng khuẩn và chống oxy hóa.
Bộ phận dùng: thân và lá
Phân bố: Cây diếp cá phân bố rộng rãi ở châu á, phân bố từ Ấn Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và các nước Đông Dương. Ở nước ta, diếp cá mọc hoang ở chỗ ẩm ướp, thường được trồng làm rau ăn. Thu hái cành lá quanh năm, thường dùng tươi, có thể phơi hay sấy khô để dùng dần. Thành phần hóa học: Diếp cá chứa khoảng 0.049% là tinh dầu của các aldehyde. Ngoài ra trong diếp cá còn chứa alkaloid và flavonoid.
Tác dụng dược lý: Theo Kyoko Hayashi và cộng sự Diếp cá ức chế trực tiếp virus herpes chủng 1 (HSV-1), virus cúm, virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở người loại 1 (HIV-1) mà không biểu hiện độc tính, nhưng không chống lại poliovirus và coxsackie virus. Mức độ giảm virus liên quan đến thời gian xử lý bằng thuốc. Ba thành phần chính có tác dụng là: xeton methyl n-nonyl, aldehyde lauryl, và aldehyde capryl.
Công dụng: Diếp cá có tác dụng lợi tiểu, tính chất lợi tiểu do quercitin và chất vô cơ có trong diếp cá. . Dẫn xuất của dioxyflavonon đều có tính chất của rutin, có tác dụng là tăng sức chịu đựng vi huyết quản làm cho huyết quản khó dứt vỡ. . Alkaloid codalin có tác dụng kích ứng da, gây phồng.
3.5 KIM TIỀN THẢO
Tên Khoa Học: Herba Jinqiancao, Desmodium styracifolium (Osbeck) Merr. Họ Cánh Bướm (Fabaceae).
Mô Tả: Cây thảo, sống lâu năm, bò sát đất, dài khoảng 1m. Lá mọc so le, gồm 3 lá chét hình tròn, có lông &1 vàng. Hoa tự hình chùm. Tràng hoa hình bướm, màu tía. Quả loại đậu, dài 14-16mmm, chứa 4-5 hạt.Mọc hoang trên vùng đồi trung du, vùng núi.
Bộ Phận Dùng: Toàn cây.
Thành Phần Hóa Học: Ancloid, Tannin, Flavones, Phenols. Tác Dụng Dược Lý:
+Tác Dụng Lên Tim Mạch tuần hoàn mạch vành tăng, hạ áp lực động mạch, làm chậm nhịp tim, giảm lượng oxy ở tim đối với Chó.
+Tác Dụng Trên Mật: có tác dụng tống sạn mật, làm giảm đau ở ống mật, hết vàng da.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
+Tác Dụng Đối Với Hệ Bài Tiết: lợi tiểu đối với chuột và thỏ, có thể do chất Potasium chứa trong thuốc.
+Tác Dụng Đối Với Sỏi, Sạn: nước sắc Kim tiền thảo liều cao ( trên 80g), thường được dùng trị sạn ở mật hoặc đường tiểu.
+Đối Với Bệnh Nhiễm Khuẩn: nước sắc Kim tiền thảo trị 10 cas ho gà, có 7 cas khỏi, 2 cas có tiến triển. Loại Lysimachia (Quá Lộ Hoàng) đối với tụ cầu vàng, loại Glechoma ( Hoạt Huyết Đơn) đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn thương hàn, lỵ, trực khuẩn mủ xanh đều có tác dụng ức chế.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM
VÀ KẾT QUẢ
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
CHƯƠNG 1. VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU.
1.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH.
Việc nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp “Xây dựng quy trình phân tích
tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV-VIS “ được tiến
hành tại phòng thí nghiệm Hóa Đại Cương A3 và phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1 – Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: 01/2013 – 05/2013 1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
1.2.1. Dụng cụ
- Các loại pipet: 0.1ml, 1ml, 2ml, 10ml - Bình định mức: 10ml, 25ml, 50ml.
- Cốc, đũa thủy tinh, quả bóp. Bình xịt nước cất - Ống đong 10ml, 25ml.
Các dụng cụ được rửa sạch và tráng rửa nhiều lần bằng nước cất 2 lần trước khi làm thí nghiệm.
1.2.2. Hóa chất.
- NaNO2, AlCl3.3H2O được bảo quản trong lọ kín.
- Dung môi: DMSO, etanol. - NaOH 10%
- Nước cất 2 lần
- Chất chuẩn: Quercetin tinh khiết 97.71%, Rutin tinh khiết 85.5%.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Hình 3. Giấy kiểm định chất lượng Quercetin và rutin 1.2.3. Thiết bị nghiên cứu.
- Máy đo UV 6800.
- Cân phân tích chính xác 10-4g. - Máy tính.
- Bể điều nhiệt.
1.2.4. Xử lý kết quả thực nghiệm.
Các thông số được xử lý theo chương trình phần mềm MicrosoftTM Excel 2003.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
Để hoàn thành các yêu cầu của đề tài luận văn, quá trình thực hiện gồm: - Ly trích flavonoid toàn phần bằng etanol từ các cao dược liệu có sẳn trong phòng thí nghiệm Hóa Đại Cương A3.
- Tối ưu hóa qui trình phân tích tồng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis. - Định lượng tổng flavonoid trong một số cao dược liệu có sẳn trong phòng thí nghiệm Hóa Đại Cương A3
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
CHƯƠNG 2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH ĐỊNH
LƯỢNG TỔNG FLAVONOID BẰNG PHƯƠNG
PHÁP UV-VIS.
2.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONPOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS.
Theo tài liệu [14,15,16] qui trình định lượng tổng flavonoid được đưa ra như sau:
Hình 4. Quy trình định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-VIS
Từ qui trình trên tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sau: - Bước sóng tối ưu (200-500nm).
- Nồng độ dung môi ly trích (40-90%). - Nồng độ AlCl3 tối ưu (4-12%).
- Thời gian phản ứng tối ưu. 2.2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH.
2.2.1. Xác định bước sóng tối ưu.
Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác một lượng mẫu 5 loại cao có khối lượng m0
(khoảng 30g ) cho vào becher 100ml, thêm tiếp 20ml etanol 80 %, lắc đều, lắt trong bể điều nhiệt ở 50oC khoảng 5 phút. Để nguội, lọc lấy dung dịch, định mức đến 25ml bằng etanol 80%. Thu được 5 mẫu dung dịch nồng độ C0.
Cao dược liệu ethanol
Tủa Dung dịch
AlCl3, môi trường kiềm.
Dung dịch màu Đo độ hấp thụ Ghi nhận A
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Tiến hành:
Mẫu cao: Cho vào bình định mức 50ml: 0.1ml mẫu, 0.1ml chuẩn(100g/ml), 10ml nước cất, 3ml NaNO2, 3ml AlCl3, 2ml NaOH 10% định mức đến 50ml
bằng nước cất.
Chất chuẩn: tiến hành phản ứng tương tự với 0.2 ml dung dịch chuẩn. Khảo sát độ hấp thụ trong khoảng 200-500 nm.
Tên Quercertin Rutin Bìm bìm Rau đắng Đinh lăng Diếp cá Kim tiền thảo max (nm) 356 356 378 383 410 385 382 Bảng 3. Bước sóng cực đại của các chất.
Kết quả cho thấy ở pH > 7, phức của các loại cao hấp thụ ở các bước sóng khác nhau và có sự chênh lệch khá lớn do nền mẫu khác nhau dẫn đến bước sóng hấp thu cực đại khác nhau. Vì vậy khi tiến hành định lượng tổng flavonoid của những loại dược liệu khác nhau ta cần khảo sát lại bước sóng hấp thu cực đại.
2.2.2. Khảo sát nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ.
Tiến hành: Cân một lượng mẫu bằng nhau các loại cao (0.5g) cho vào 5 becher 100ml, thêm lần lượt vào các becher 10ml etanol nồng độ 50%, 60%, 70%, 80% và 90%, để trong bể điều nhiệt ở 50oC khoảng 5 phút. Để nguội, lọc lấy dung dịch, định mức đến 10ml bằng etanol nồng độ tương ứng. Thực hiện phản ứng như trên, ghi nhận độ hấp thụ ở max tương ứng khảo sát ở mục 2.2.1
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Bảng 4. Nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ. 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0 20 40 60 80 100 Nồng độ EtOH (%) Đ ộ h ấ p t h ụ ( A ) bìm bìm rau đắng đinh lăng diếp cá kim tiền thảo
Hình 5. Đồ thị biểu diển nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ. Từ kết quả thu được ở bảng trên và đồ thị cho thấy phức có độ hấp thụ lớn nhất khi hòa tan trong etanol 80% điều đó cho thấy flavonoid chiết tốt trong ethanol 80%. Vì vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo tôi sử dụng dung môi etanol 80% để ly trích mẫu.
2.2.3. Khảo sát nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ.
Chuẩn bị mẫu: Cân một lượng mẫu bằng nhau của các loại cao (15g) cho vào becher 100ml, thêm 20ml etanol 80%, lắc trong bể điều nhiệt khoảng 5 phút ở 500C. Để nguội, lọc, lấy dung dịch định mức đến 25ml bằng etanol 80%. Thu được dung dịch mẫu nồng độ Cm ( giữ mẫu được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo).
40 60 70 80 90 Bìm bìm 0.0918 0.1102 0.1198 0.1237 0.0892 Rau đắng 0.0989 0.1152 0.1285 0.1386 0.0852 Đinh lăng 0.1152 0.1179 0.1244 0.1325 0.0863 Diếp cá 0.1022 0.1089 0.1167 0.1261 0.0821
Kim tiền thảo
0.1625 0.1687 0.1712 0.1784 0.1325
