CENTRO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
Ethiane Teixeira Mezadri
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ASSISTIDA POR
ULTRASSOM PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE DEGRADAÇÃO DE PAREDE CELULAR
Santa Maria, RS
2019
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ASSISTIDA POR ULTRASSOM PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE DEGRADAÇÃO DE PAREDE CELULAR
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Engenharia Química, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
Orientador: Prof. Dr. Marcio Antonio Mazutti
Santa Maria, RS 2019
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ASSISTIDA POR ULTRASSOM PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE DEGRADAÇÃO DE PAREDE CELULAR
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Engenharia Química, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
Aprovada em 05 de agosto de 2019:
__________________________________
Marcio Antonio Mazutti, Dr. (UFSM) (Presidente/Orientador)
__________________________________
Sergio Luiz Jahn, Dr. (UFSM) __________________________________
Raquel Cristine Kuhn, Dra. (UFSM) __________________________________
Juliana Ferreira, Dra. (UNIFRA)
Santa Maria, RS 2019
DEDICATÓRIA
Às pessoas mais importantes de minha vida: minha família.
Pessoas que fazem a diferença na minha caminhada, sem as quais de nada vale o esforço de tentar ser alguém cada dia melhor.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por colocar pessoas tão especiais no meu caminho e oportunidades maravilhosas.
Ao meu professor e orientador, Marcio Antonio Mazutti, pela orientação com competência, sabedoria, incentivo e confiança.
Aos professores da banca de defasa por, gentilmente, aceitarem participar da avaliação deste trabalho.
Aos professores do programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Santa Maria, pelo convívio e todo conhecimento e ensinamentos transmitidos.
Aos colegas de turmas e aos colegas de laboratório dos cursos de Graduação, Mestrado e Doutorado, pelo auxilio, companheirismo e ensinamentos.
Aos meus pais, Katia e Claudio, por serem exemplos de força e dedicação. Por todo amor, incentivo e apoio incondicional. Por não medirem esforços para a realização do meu sonho e me apoiarem em todos os momentos.
À minha irmã, Giovana, pela força e incentivo, por me ajudar nos momentos difíceis e por estar sempre ao meu lado.
Ao meu namorado, Henrique Barin, pelo grande apoio, paciência e pela compreensão.
Obrigada por ser esta pessoa maravilhosa pela qual tenho grande admiração.
A todos aqueles que se mostraram amigos neste período.
O meu mais sincero agradecimento!
RESUMO
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ASSISTIDA POR ULTRASSOM PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE DEGRADAÇÃO DE PAREDE CELULAR
AUTORA: Ethiane Teixeira Mezadri ORIENTADOR: Marcio Antonio Mazutti
Resíduos e substratos obtidos da agroindústria possuem custo reduzido, alta disponibilidade e podem ser transformados em produtos de importante valor econômico. A biotransformação destes materiais em compostos de valor agregado, a partir da fermentação em estado sólido (FES), por meio de cultivo com fungos filamentosos, tem se destacado e apresentaram resultados significativos. A aplicação de ultrassom é uma tecnologia atual que pode produzir um efeito positivo na atividade enzimática, no entanto, o número de trabalhos utilizando-o durante o processo fermentativo para incremento da atividade enzimática antes da extração, ainda é muito limitado. Dessa forma, o presente trabalho busca avaliar a produção de enzimas associadas a degradação de parede celular (quitinase, β-1,3-glucanase e celulases - exocelulase e endocelulase) a partir de diferentes materiais, usando o microrganismo Trichoderma harzianum por meio de fermentação em estado sólido. Testes preliminares foram realizados com este microrganismo para possibilitar a escolha do melhor meio e a avaliação das condições ótimas para a produção das enzimas. Após análise estatística e escolha do Arroz Tipo 1 como melhor substrato, foi realizado um delineamento composto central (DCC), tratando-se de um planejamento fatorial 24 com 3 pontos centrais com o intuito de avaliar a influência das variáveis (temperatura, umidade, concentração de solução de nutriente e concentração de extrato de levedura na atividade enzimática). Obteve-se, após 240 horas (10 dias), as maiores atividades de 31,3 U/g, 60,4 U/g, 40,3 U/g e 23,8 U/g para quitinases, exocelulase, endocelulase e β-1,3-glucanases, respectivamente, e foi observado que a umidade apresentou significância e efeito negativo em todos ensaios. Em uma segunda etapa, avaliou-se o teor de umidade do meio e o tempo de ultrassom no meio fermentativo para verificar a influência na atividade enzimática. Os resultados de atividade enzimática foram analisados estatisticamente por ANOVA e Teste de Tukey. Foi possível observar que, para todas enzimas analisadas, o efeito do ultrassom foi positivo. Após 240h (10 dias) de fermentação, com teor de umidade de 50% no meio e utilizando 4h de sonicação indireta diários durante a fermentação, obteve-se, através das análises dos extratos, um incremento de, aproximadamente, 261% na atividade enzimática de quitinase, 122% na atividade de exocelulases, 84% na atividade de endocelulases e de 311% na atividade de β-1,3-glucanases quando comparados com os resultados da atividade enzimática obtidos dos extratos que não fizeram uso de sonicação indireta nas mesmas condições de teor de umidade e tempo de fermentação.
Palavras-chave: Enzimas. Fermentação em estado sólido. Ultrassom.
ABSTRACT
ULTRASOUND SOLID STATE FERMENTATION FOR THE PRODUCTION OF CELL WALL DEGRADATION ENZYMS
AUTHOR: Ethiane Teixeira Mezadri ADVISER: Marcio Antonio Mazutti
The agro-industry waste is low cost, high availability and it can be transformed into products of important economic value. The biotransformation of these substrates into compounds with an aggregated value from the solid-state fermentation by the cultivation with filamentous fungi has been highlighted and presents significant results. The application of the ultrasound bath is a current technology that can produce a positive effect on the enzymatic activity. However, the number of works using it during the fermentation process to increase the enzymatic activity before the extraction is still very limited. In this way, the work seeks to evaluate the production of enzymes associated with cell wall degrading (chitinase, β-1,3-glucanase and cellulases – exocellulase, and endocellulase) from different agro- industrial substrates using the microorganism Trichoderma harzianum by means of solid-state fermentation. Preliminary tests were made with this microorganism in different substrates to enable the choice of the best way and the evaluation of the great conditions for the production of the enzymes.
After statistical analysis and choice of Rice type 1 as the best substrate, a central composite design (CCD) was performed considering a factorial design 24 with 3 central points to evaluate the influence of temperature, humidity, solution concentration of nutrient, and concentration of yeast extract in the enzymatic activity. The highest activity of 31,3 U/g, 60,4 U/g, 40,3 U/g e 23,8 U/g for chitinases, exocelullase, endocellulase, and β-1,3-glucanases respectively was obtained after 240 hours (10 days), and it was observed that the humidity presented significance and negative effect in all tests. In a second step, the moisture content of the medium and the immersion time of the fermentation in the ultrasound bath were evaluated to verify the influence on the enzymatic activity. The results of the enzymatic activity were analyzed statistically by ANOVA and Tukey’s Test. It was possible to observe that for all enzymes that were analyzed, the ultrasound effect was positive. After 240 hours (10 days) of fermentation using 4 hours of ultrasound per day during the fermentation was obtained through the analysis of the extracts an increase of 261% in the activity of chitinases, 122% in the activity of exocellulases, 84% of endocellulases, and 311% in the activity of β-1,3-glucanases when compared to the extracts obtained from the tests performed after the same period of time in the fermentation without the use of ultrasound.
Keywords: Enzymes. Solid-state fermentation. Ultrasound.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Histórico do consumo de agrotóxicos e afins entre os anos de 2000 e 2017
... 18
Figura 2 - Esquematização do crescimento de fungos em substratos sólidos ... 25
Figura 3 - Ciclo de vida assexual do Trichoderma ... 26
Figura 4 - Estrutura da quitina ... 32
Figura 5 - Esquema simplificado da hidrólise por celulases ... 35
Figura 6 - Espectro do som ... 37
Figura 7 - Fluxograma representativo da metodologia utilizada para manutenção do microrganismo e preparo do inóculo ... 41
Figura 8 - Fluxograma representativo da metodologia seguida para realização da etapa 1 do trabalho ... 42
Figura 9 - Fluxograma representativo da metodologia seguida para realização da etapa 2 do trabalho para ensaios fermentativos seguindo o planejamento experimental com delineamento composto central (DCC) ... 43
Figura 10 - Fluxograma representativo da metodologia seguida para realização da etapa 3 do trabalho ... 44
Figura 11 - Fluxograma representativo da metodologia seguida para determinação da atividade enzimática ... 45
Figura 12 - Placas de petri com microrganismo Trichoderma harzianum cultivados em meio BDA ... 46
Figura 13 - Média da atividade de quitinases obtida com aplicação de ultrassom durante a fermentação variando a umidade em 30%, 40% e 50% em 5 dias e 10 dias de fermentação ... 68
Figura 14 - Média da atividade de exocelulases obtida com aplicação de ultrassom durante a fermentação variando a umidade em 30%, 40% e 50% em 5 dias e 10 dias de fermentação ... 68
Figura 15 - Média da atividade de endocelulases obtida com aplicação de ultrassom durante a fermentação variando a umidade em 30%, 40% e 50% em 5 dias e 10 dias de fermentação ... 69
Figura 16 - Média da atividade de β-1,3-glucanases obtida com aplicação de ultrassom durante a fermentação variando a umidade em 30%, 40% e 50% em 5 dias e 10 dias de fermentação ... 69
Figura 17 - Comparativo da produção enzimática através dos resultados de atividade das enzimas avaliadas após 10 dias de fermentação sem uso de ultrassom e com uso de 4h diárias de ultrassom ... 71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Histórico das vendas de produtos semioquímicos e microbiológicos ... 20 Tabela 2 - Substâncias sintetizadas pelo microrganismo Trichoderma e suas atividades ... 28 Tabela 3 - Variáveis reais e codificadas do DCC ... 48 Tabela 4 - Planejamento experimental seguido para avaliar a melhor condição de porcentagem de umidade necessária ao substrato e a influência do tempo de sonicação indireta durante a fermentação ... 50 Tabela 5 - Análise estatística (Teste de Tukey) do meio de cultura através da FES por T. harzianum ... 56 Tabela 6 - Matriz do delineamento composto central (DCC) para avaliar a influência nas variáveis independentes ... 59 Tabela 7 - Estimativa dos efeitos das variáveis independentes na atividade enzimática de β-1,3-glucanses, exocelulases, endocelulases e quitinases ... 60 Tabela 8 - Avaliação estatística (Teste de Tukey) da atividade enzimática de quitinases, exocelulases, endocelulases e β-1,3-glucanases produzidas por fermentação em estado sólido fazendo uso diário de sonicação indireta (0h, 1h, 2h, 4h e 6h) ... 66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus Celsius Aa Atividade de água
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas abs Absorbância
AE Atividade enzimática
AMM Água de maceração de milho ANOVA Análise de Variância
AR1 Arroz Branco Tipo 1 ART Açúcares redutores totais Atm Atmosfera
Aw Atividade de água
BC Bagaço de cana-de-açúcar BG β-1,3-glucanase
BD Meio batata/dextrose BDA Meio batata/dextrose/agar BM Bagaço de malte
Cm Centímetro (s)
CMC Carboximetilcelulose CO2 Dióxido de Carbono
DCC Delineamento Composto Central DNS Ácido 3,5- dinitrosalicílico
EE Concentração de extrato enzimático
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EGase Endoglucanase
ExGase Exoglucanase FS Farelo de Soja
FES Fermentação em Estado Sólido FSm Fermentação Submersa
g Gramas
h Hora
ha Hectare
IA Ingrediente ativo
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística i.e. Índice enzimático
L Litro
m/v massa por volume mg Miligrama
min Minuto mL Mililitro
N Nitrogênio
n número de variáveis independentes NacGlc N-acetilglicosamina
O2 Oxigênio
p p-valor
PDA Potato Dextrose Agar rpm Rotações por minuto spp Espécies
U Unidade de atividade enzimática
UI Atividade enzimática em Unidades Internacionais.
UFSM Universidade Federal de Santa Maria
US Ultrassom
USb Ultrassom em banho maria µmol Micromol
v/v Volume por volume v/m Volume por massa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
2 OBJETIVOS ... 16
2.1 OBJETIVO GERAL ... 16
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 16
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 17
3.1 AVANÇO DO CONTROLE BIOLÓGICO ... 17
3.2 PRODUÇÃO DE BIOFORMULAÇÕES ... 20
3.3 FERMENTAÇÃO EM MEIO SÓLIDO PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS ... 21
3.4 RESÍDUOS E PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS COMO SUBSTRATO PARA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ... 23
3.5 MICRORGANISMOS EMPREGADOS NA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ... 24
3.5.1 Trichoderma Harzianum ... 26
3.6 ENZIMAS DE INTERESSE AGRÍCOLA ... 29
3.6.1 β-1,3-Glucanase ... 30
3.6.2 Quitinases ... 31
3.6.3 Celulases ... 34
3.7APLICAÇÃO DE ULTRASSOM NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ... 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 41
4.1 MICRORGANISMO, MEIOS DE CULTIVO, PRÉ-INOCULAÇÃO E INOCULAÇÃO ... 46
4.2 ETAPA 1 – ENSAIOS PARA ESCOLHA DO SUBSTRATO ... 47
4.3 ETAPA 2 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL COM DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL (DCC) ... 48
4.4 ETAPA 3 - AVALIAÇÃO DO USO DE ULTRASSOM DURANTE A FERMENTAÇÃO ... 49
4.5 EXTRAÇÃO DO CALDO ENZIMÁTICO ... 51
4.6 REAÇÕES ENZIMÁTICAS E QUANTIFICAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES ... 51
4.6.1 Reação enzimática para determinação da atividade de quitinase ... 51
4.6.2 Reação enzimática para determinação da atividade de endocelulase ... 51
4.6.3 Reação enzimática para determinação da atividade de exocelulase ... 52
4.6.4 Reação enzimática para determinação da atividade de β-1,3-glucanase .. 52
4.7 QUANTIFICAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES ... 53
4.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 53
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 54
5.1 ESCOLHA DO SUBSTRATO ... 54
5.2 DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL (DCC) ... 57
5.2.1 Estudo da produção de quitinases ... 57
5.2.2 Estudo da produção de β-1,3 glucanase ... 61
5.2.3 Estudo da produção das celulases ... 62
5.2.3.1 Exocelulases ... 62
5.2.3.2 Endocelulase ... 63
5.3 USO DO ULTRASSOM DURANTE O PROCESSO FERMENTATIVO ... 64
6 CONCLUSÃO ... 73
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 75
REFERÊNCIAS ... 77
1 INTRODUÇÃO
Buscando alternativas para reduzir o uso de produtos sintéticos de alta toxicidade, utilizados para o controle de pragas e doenças em plantas na agricultura, como, também, diminuir os resíduos e os diversos problemas ambientais ocasionados pelo uso desses, como contaminação do solo, contaminação da água e dos seres vivos, o aumento da resistência de patógenos e o desequilíbrio biológico (BETTIOL;
MORANDI, 2009), o controle biológico se coloca em destaque, onde o principal efeito positivo é o fato de não contaminarem os alimentos e nem o meio ambiente, participando naturalmente da ciclagem dos nutrientes. Nos últimos anos, diferentes tipos de produtos microbianos têm gerado interesse devido a sua baixa toxicidade e biodegradabilidade (JOSHI et al., 2015).
O controle biológico de doenças de plantas pode ser definido como “a redução da densidade de inóculo ou das atividades determinantes da doença, está provocada por um patógeno ou parasita nos seus estados de atividade ou dormência, por um ou mais organismos, realizada naturalmente ou através de manipulação do ambiente, hospedeiro ou antagonista, ou pela introdução em massa de um ou mais antagonistas”
(BAKER; COOK, 1974). Dentro da área de controle biológico, destacam-se os biofungicidas formulados por complexos enzimáticos. São produtos que apresentam especificidade e são capazes de utilizar diferentes mecanismos de ação como parasitismo, antibiose e competição. Além de atuarem como indutores de resistência das plantas contra doenças, são utilizados no controle biológico devido à presença de enzimas hidrolíticas extracelulares degradadoras de parede celular tais como, β-1,3- glucanase, celulases e quitinases (HERMOSA et al., 2000).
O controle biológico de doenças de plantas iniciou-se como ciência em 1926, quando B. B. Sanford publicou um trabalho sobre fatores que afetavam a patogenicidade de Streptomyces scabies, agente causal da sarna comum da batata.
Após, diversas pesquisas e estudos começaram a ser realizados com esse objetivo.
Weindling e Fawcett, em 1936, expôs a ação do uso de estirpes do gênero Trichoderma no controle de doenças causadas em citros por Rhizoctonia solani.
Espécies do gênero Trichoderma são as mais estudadas e utilizadas no controle de fitopatógenos pelo fato de produzirem diferentes metabolitos enzimáticos, estarem disponível em diversos ambientes, por apresentarem crescimento acelerado em uma variedade de substratos e por serem de fácil cultivo (MACHADO et al., 2012).
A produção enzimática pode ser avaliada através da atividade enzimática de extratos enzimáticos obtidos por meio de processos fermentativos em estado sólido, utilizando materiais lignocelulósicos como fonte de carbono e açúcares, fazendo uso de fungos filamentosos. Estudos apresentam resultados positivos e otimistas para a produção de complexos enzimáticos (IEDE, 2010; THOMAS et al., 2013). Assim, a prospecção de microrganismos capazes de produzir bioprodutos e sua posterior utilização em processos fermentativos de escala industrial tem sido alvo de diversos estudos.
Resíduos e produtos obtidos por processos agroindustriais (bagaço de cana, farelo de trigo, malte, arroz, batata, mandioca, palhas, etc.) podem ser usados como substrato para o crescimento celular. Devido ao baixo ou nenhum custo comercial e a sua abundância são uma alternativa atrativa e promissora, que além de agregar valor à materiais de baixo custo no mercado podem vir a reduzir em muito o preço final das enzimas. Estes materiais orgânicos possuem elevado teor de carboidratos, atuando como fonte de carbono e nitrogênio (CORREIA, 2004). De acordo com dados expostos pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) no Levantamento Sistemático da Produção Agrícola (LSPA), na safra de 2018/2019 no Rio Grande do Sul, na produção total de cereais, leguminosas e oleaginosas oriunda das lavouras temporárias de verão (amendoim, arroz, feijão 1ª e 2ª safras, girassol, milho grão, soja e sorgo grão) a área plantada no estado detém ao redor de 7.649.004 de hectares (ha), dentre os quais 987.705ha são lavouras de arroz e 5.828.790ha são plantações de soja (IBGE, 2019). Com a elevada quantidade de resíduos agroindustriais gerados nesse setor, que podem ser reaproveitados, pode-se considerar o Rio Grande do Sul como uma região promissora para o mercado de produção de compostos enzimáticos que visam o controle de pragas por meio de degradação de parede celular.
Visando agregar valor aos resultados de produção enzimática e aumentar a eficiência dos processos fermentativos, estudos atuais estão sendo realizados com o uso de ondas de ultrassom em alguma etapa do processo para avaliar o efeito gerado na atividade enzimática (WANG et al., 2012; NGUYEN; LE, 2013; SZABÓ; CSISZÁR, 2013; SILVELLO, 2018). Segundo Barton et al., 1996; Sakakibara et al., 1996 e Özbek;
Ulgen, 2000, a influência de ondas ultrassônicas na atividade e estabilidade de enzimas tem demonstrado ser específica para cada enzima e dependente dos parâmetros de sonicação (LEÃES, 2012).
Dentro deste contexto, é imprescindível a busca de alternativas que diminuam o uso de agrotóxicos sintéticos nas lavouras do Brasil, que é um dos líderes mundiais no consumo desses produtos. Uma alternativa para isto é a utilização de produtos biotecnológicos, como bioinseticidas e biofungicidas, produzidos por meio de compostos enzimáticos obtidos de microrganismos através de processos fermentativos, utilizando substratos agroindustriais como meio de cultivo. Em conjunto, há a possibilidade de testar e avaliar o efeito de tecnologias, como ondas ultrassônicas, durante o processo fermentativo para alcançar melhores resultados.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar a produção de enzimas associadas a degradação de parede celular por meio de fermentação em estado sólido (FES), assistida por sonicação indireta, utilizando Trichoderma harzianum em substratos agroindustriais
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar diferentes substratos agroindustriais para a escolha do melhor meio de cultura fermentativo na produção de enzimas (quitinases, celulases e β-1,3- glucanases).
Determinar as melhores condições de temperatura, teor de umidade, concentração de solução de nutrientes e concentração de extrato de levedura para a produção de enzimas com o substrato pré-determinado.
Avaliar o efeito gerado na atividade enzimática de diferentes tempos de ultrassom (sonicação indireta) e de diferentes percentuais de umidade utilizados na fermentação.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 AVANÇO DO CONTROLE BIOLÓGICO
A expansão agrícola tem resultado no consumo elevado de produtos sintéticos de alta toxicidade para o desenvolvimento das lavouras e redução de perdas na produção agrícola, produtos esses produzidos a partir de fontes não renováveis, o que favorece o aumento da demanda por produtos oriundos do petróleo e, consequentemente, o aumento da preocupação ambiental. Nesse contexto, surge a necessidade do desenvolvimento de tecnologias sustentáveis e que possuam a mesma finalidade, mas que sejam livres dos possíveis efeitos prejudiciais à saúde humana, animais e meio ambiente (BITTENCOURT-JUNIOR; SOARES, 2013).
Conforme a Lei nº 7.802 de 1989 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os agrotóxicos são definidos como produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas nativas ou implantadas e de outros ecossistemas, e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos (BRASIL, 1989).
De acordo com o último boletim anual de produção, importação, exportação e vendas de agrotóxicos no Brasil, elaborado pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), no ano de 2017, 126 empresas titulares de registro de produtos “Químicos e Bioquímicos” encaminharam os relatórios semestrais de agrotóxicos em atendimento ao artigo 41 do Decreto n° 4.074/2002. Os relatórios de produtos formulados recebidos abrangem um total de 329 ingredientes ativos e uma venda total de 539.944,95 toneladas no mercado interno (IBAMA, 2019).
A Figura 1 ilustra o crescimento do consumo de agrotóxicos no Brasil no período de 2000 a 2017.
Figura 1 - Histórico do consumo de agrotóxicos e afins entre os anos de 2000 e 2017
Fonte: IBAMA (2018).
O uso de agrotóxicos na produção agrícola convencional é uma prática destinada ao controle de doenças que afetam plantas cultivadas e ao manejo de pragas. Se estas pragas não forem eliminadas ocorre grande risco na redução da produção e no aumento de custos, tanto para o produtor como para o consumidor final, como já ocorreu no passado. Diversas medidas de manejo das pragas estão disponíveis, atualmente, para os produtores agrícolas, desde ações para impedir sua entrada, planejamento de rotação de culturas, uso de plantações resistentes e o controle biológico (IBAMA, 2019).
O desenvolvimento de atividades produtivas mais sustentáveis, realizadas com uso de produtos biotecnológicos que utilizem insumos renováveis, tem atraído atenção e entusiasmado nos setores da agricultura, ambiental e industrial (GAVRILESCU; CHISTI, 2005). O controle biológico faz parte do chamado Manejo Integrado de Pragas (MIP) e permite o uso de organismos vivos ou obtidos por manipulação genética para combater pragas e doenças provocadas por lagartas comuns, mosca, nematoides (vermes microscópicos), cigarrinha das raízes, broca da cana, ácaros e fungos, e outros agentes nocivos para a agricultura. Os produtos biológicos podem ser utilizados em qualquer cultura, desde frutas e verduras, até grãos, cana de açúcar, entre outros (MAPA, 2019). Para o Brasil e para outros países que possuem a agricultura como base econômica, o controle biológico de pragas e doenças tem se mostrado um caminho alternativo para aumentar a produção e
atender à procura, cada vez maior, de produtos e alimentos livres de resíduos tóxicos (LOPES, 2009).
O desenvolvimento de bioprodutos ativos, com especificidade ao alvo e não tóxicos para o resto, tem feito a indústria buscar a prospecção de microrganismos como novos agentes de controle (REIS et al., 2017). A eficácia, praticidade e segurança dos processos para a aplicação e manutenção de fungos são fundamentais, tanto para o sucesso do biocontrole nos sistemas de cultivo, quanto para a aceitação do biocontrole pelos agricultores e pela sociedade (MACHADO et al., 2012).
Os biopesticidas microbianos, produtos que se mostram como tendência na indústria agrícola, são definidos como agentes produzidos em massa a partir de bactérias, fungos, vírus ou protozoários. Apresentam baixa geração de resíduos, baixa toxicidade, boa compatibilidade com o ambiente e podem ter alta eficiência (MNIF;
GHRIBI, 2015). São atraentes para a agricultura comercial porque atingem alguns nichos onde o controle químico não é capaz de atuar e a resistência nos organismos alvo não é facilmente gerada, ao contrário do que ocorre com alguns produtos químicos semelhantes (REIS et al., 2017).
Segundo informações disponibilizadas junto à Associação Brasileira das Empresas de Controle Biológico (ABCBIO) e ao Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários (AGROFIT) do MAPA, que proporcionam o banco de registro dos biodefensivos e também dos agrotóxicos, já é possível verificar o registro de quase 300 itens para vários alvos biológicos e aptos para utilização em todos os cultivos agrícolas (SAMPAIO, 2018). Segundo o boletim anual de produção, importação, exportação e vendas de agrotóxicos no Brasil (IBAMA, 2017) a venda dos semioquímicos foi de 8.484 quilograma (kg) de ingredientes ativos e para produtos microbiológicos as vendas totais foram de 188.499 kg de ingredientes ativos.
A Tabela 1 ilustra o histórico de vendas de semioquímicos e produtos microbiológicos entre os anos de 2014 a 2017, por meio de dados fornecidos ao IBAMA pelas empresas registrantes de produtos técnicos, agrotóxicos e afins. Dados referentes a agentes biológicos de controle que ainda não tiveram históricos divulgados.
Tabela 1 - Histórico das vendas de produtos semioquímicos e microbiológicos SEMIOQUÍMICOS
Unidade: Kg de IA
ANO
Atividade 2014 2015 2016 2017
Produção 372,2974 22,6680 12,9864 359,9052 Importação 547,5230 977,0211 9.841,0282 8.185,9645 Exportação 0,0283 0,0024 0,0000 0,0000 Vendas Internas 829,6453 1.022,3651 10.176,8510 8.484,7545
MICROBIOLÓGICOS
Unidade: Kg de IA
ANO
Atividade 2014 2015 2016 2017
Produção 68.437,100 53.108,175 93.923,155 135.847,259 Importação 408.424,461 149.236,112 44.394,852 34.713,520 Exportação 16,273 0,000 3.761,114 194,800 Vendas Internas 428.812,61 190.585,567 176.159,696 188.499,340
Fonte: Adaptados de IBAMA (2018).
Embora a produção de produtos biológicos para controle de pragas e doenças agrícolas tenha crescido mais de 70% no último ano no Brasil, movimentando R$464,5 milhões ante R$262,4 milhões em 2017 (MAPA, 2019), a falta de bioformulados devidamente registrados no MAPA ainda é um fator limitante desses produtos na utilização agrícola. Atualmente, existem 1.345 pedidos de registro de agrotóxicos em análise no Mapa (MAPA, 2019). Além do MAPA, também analisam os pedidos os Ministérios da Saúde, do Meio Ambiente e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa).
3.2 PRODUÇÃO DE BIOFORMULAÇÕES
Na literatura atual, dados e detalhes disponíveis para desenvolver formulações de bioprodutos são escassos. Esse é um processo complexo e diversos parâmetros devem ser controlados e otimizados para o desenvolvimento de uma nova fórmula eficaz. A metodologia e o planejamento de produção devem levar em conta aspectos
químicos e nutricionais do substrato utilizado, as características do sistema, as características dos inertes envolvidos, o microrganismo, a estabilidade durante o armazenamento e o efeito gerado sobre o alvo (MACHADO et al., 2012).
Diversas tecnologias se mostram capazes de obter bioprodutos com potencial para integrar o mercado agroindustrial. A produção de enzimas e demais compostos bioativos, a partir de fungos por fermentação em estado sólido, vem apresentando resultados excelentes (BRAMORSKI, 1997; DAHIYA et al., 2005; BINOD et al., 2007;
FLORENCIO, 2010; BALDONI, 2016) e chamando a atenção, principalmente, pelo uso de resíduos agroindustriais como substrato. A aplicabilidade se torna promissora por utilizar matéria-prima de baixo valor comercial e gerar compostos de alto valor agregado (THOMAS et al., 2013; SANTOS et al., 2013).
3.3 FERMENTAÇÃO EM MEIO SÓLIDO PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS
O interesse industrial por tecnologias que envolvam produções enzimáticas vem aumentando gradativamente e estão mostrando ser um dos campos mais promissores para síntese de compostos de alto valor agregado (FERNANDES et al., 2004). A fermentação em estado sólido vem se destacando nos progressos obtidos no aproveitamento de resíduos.
Pode-se definir a fermentação em estado sólido como o crescimento de microrganismos em materiais sólidos, na superfície ou no interior, com escasso teor de água livre, mas onde os substratos contêm uma umidade suficiente para aguentar o crescimento microbiano e a atividade metabólica do microrganismo. O substrato sólido pode ser fonte de macro e micronutrientes ou pode ser um suporte inerte impregnado com os nutrientes apropriados que permitam o desenvolvimento dos microrganismos (THOMAS et al., 2013).
Dentre as principais vantagens do uso da fermentação em estado sólido tem- se, primeiramente, o fato de poder utilizar um meio simples, nutritivo e de baixo custo, como os produtos agrícolas refinados ou não, que geralmente envolvem um fácil pré- tratamento. Geralmente, o único componente necessário a ser adicionado ao meio é água ou solução tamponante. Em alguns casos excepcionais, exigem outros nutrientes, como fonte de nitrogênio ou minerais. O custo de esterilização é reduzido e o espaço ocupado pelo equipamento de fermentação é pequeno, considerando o
alto rendimento do produto. Além disso, o tratamento de efluentes e a disposição de resíduos é, geralmente, simples ou mínima (BRAMORSKI, 1997; LU et al., 1998;
SANTOS, 2007).
De acordo com Losane et al. (1985) as etapas do processo fermentativo em estado sólido, geralmente, envolvem uma seleção cuidadosa das matérias-primas a serem utilizadas, o tratamento prévio do substrato a ser utilizado, a preparação de um inóculo específico, a fermentação, propriamente dita, e o controle da mesma. As condições, como temperatura de incubação, umidade, pH, tempo de incubação, agitação, atividade de água, nível de oxigênio e concentração de nutrientes extras afetam, significativamente, o crescimento celular e a formação de produto (SANTOS, 2007).
A temperatura é um fator crítico, pois grandes quantidades de calor são liberadas, devido ao acúmulo de calor metabólico gerado, afetando diretamente a germinação de esporos, o crescimento e a formação do produto desejado (PINTO et al., 2006). A temperatura ótima para o crescimento da maioria dos fungos compreende a faixa de 25ºC a 35ºC. A aplicação de altas temperaturas pode ocasionar a desnaturação (YOON et al., 2014).
De acordo com Palma (2003) e Del Bianchi et al. (2001), em fermentações com substratos sólidos, o pH ideal é levemente ácido, entre 5,0 e 6,5. É determinado com exatidão somente no início e no final do processo. Para amenizar as possíveis variações bruscas, o ideal é o uso de soluções-tampão durante a etapa de umidificação do substrato (MARRA et al., 2015) ou de substratos com boa capacidade tamponante.
Outra variável importante no controle é o tempo de fermentação. Esse parâmetro está relacionado com a presença de nutrientes dispersos contribuindo para o crescimento do microrganismo. O esgotamento destes nutrientes, ocasionado pelo consumo, provoca uma diminuição da produção microbiana e queda na produção dos metabolitos (SANTOS et al., 2013).
Como foi apresentado por Gervais e Molin (2003), de todos os parâmetros que influenciam o processo fermentativo em estado sólido, a água exibe papel de destaque, em virtude do seu elevado grau de interação com as substâncias que compõem a fase sólida. O teor de umidade, que deve ser adequado para o substrato, permitindo a formação de um filme de água na superfície, para facilitar a dissolução e
a transferência de nutrientes e oxigênio. A umidade na fermentação sólida pode variar de 18% a 85%, variando em função da capacidade de absorção do meio de cultivo utilizado (DEL BIANCHI et al., 2001; LIMA et al., 2001). Quando o teor de umidade é inferior ao mínimo exigido, a solubilidade dos nutrientes é limitada, impedindo a absorção eficaz dos nutrientes pelos microrganismos, retardando o crescimento microbiano e, consequentemente, obtendo uma menor produção do produto desejado.
Em um nível muito alto de umidade, as partículas do substrato ficam rodeadas por uma camada espessa de água que resulta em diminuição da porosidade e baixa difusão de oxigênio no interior do meio, reduzindo as trocas gasosas e criando uma condição desfavorável para o crescimento (LONSANE et al., 1985; YOON et al., 2014;
PINTO et al., 2006; BRITO, 2015).
No entanto, mesmo sendo um processo que venha apresentando destaque, algumas desvantagens também são relatadas. Em função das condições e dos parâmetros envolvidos no processo, os tipos de microrganismos que podem ser usados são limitados. O controle das medidas de pH, O2 e CO2, durante o processo, são difíceis e envolvem procedimentos complexos. Em operações de grande escala, o calor gerado pelo metabolismo microbiano deve ser removido, o que envolve outras tecnologias (BRAMORSKI, 1997).
3.4 RESÍDUOS E PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS COMO SUBSTRATO PARA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
De acordo com dados expostos pela Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2019), a área nacional de grãos plantada na safra 2018/2019 foi de 62,6 milhões de hectares. A estimativa da produção brasileira de grãos para a safra 2018/2019, pode chegar a 238,9 milhões de toneladas no final do ano de 2019.
Segundo estimativas, na safra de 2018/2019 a soja pode alcançar uma produção de 114,8 milhões de toneladas, 3,7% a menos do que a safra 2017/2018. No caso do milho, a produção total poderá atingir 97 milhões de toneladas, alta de 16,9% em relação ao ciclo anterior. A produção de arroz está prevista em 10,5 milhões de toneladas, 12,9% menor que a safra passada.
A geração de resíduos está associada ao desperdício no uso de insumos, às perdas entre a produção e o consumo, e aos materiais que, gerados ao longo da
cadeia agroindustrial, não possuem valor econômico evidente. Nesse cenário, com toneladas de grãos sendo produzidas, toneladas de refugos agrícolas são descartados, incluindo casca, palha, bagaço, sabugo, entre outros (Salazar et al., 2005). Estima-se que, em média, de 20% a 30% da safra de grãos, de frutas e de hortaliças colhidas no Brasil sejam desperdiçadas no caminho entre a lavoura e o consumidor. Os dados sobre o tipo e volume de resíduos gerados no agronegócio mundial sem valor agregado são escassos (ONG BANCO DE ALIMENTOS, 2004).
Os resíduos e produtos obtidos por processos agroindustriais (bagaço de cana, farelo de trigo, malte, arroz, batata, mandioca, palhas, etc.) podem ser usados como substrato para o crescimento celular. Vários bioprocessos têm sido desenvolvidos utilizando estes materiais, como substratos para a produção de diversas moléculas com alto valor agregado, tais como: proteínas microbianas, ácidos orgânicos e enzimas (PANDEY et al., 2000; PANDEY, 2003). Devido ao baixo ou nenhum custo comercial e a abundância são uma alternativa atrativa e promissora. Estes materiais orgânicos possuem elevado teor de carboidratos, atuando como fonte de carbono e nitrogênio (CORREIA, 2004).
Esses substratos são divididos em três grupos: os que apresentam amido como fonte de carbono principal (arroz, batata, mandioca e milho, entre outros), os que apresentam celulose ou lignocelulose como fonte de carbono principal (madeira e palhas) e os que apresentam açúcares solúveis como fonte de carbono principal (forragem, polpas de frutas e beterraba, entre outros). Substratos ideais são aqueles que fornecem todos nutrientes necessários para o crescimento celular. Em alguns casos é necessária a suplementação adicional do meio (PINTO et al., 2005, PALMA, 2003). Na FES esses substratos, além de fornecerem os nutrientes para os microrganismos, também atuam como suporte para o crescimento (PANDEY,2002).
3.5 MICRORGANISMOS EMPREGADOS NA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
Muitos grupos de microrganismos podem crescer em substrato sólido. Fungos filamentosos, entretanto, possuem melhor capacidade de crescer na ausência de água livre. As bactérias e leveduras crescem, preferencialmente, na superfície, enquanto os fungos filamentosos penetram nas partículas do substrato (PANDEY,
2003). A dificuldade na escolha de microrganismos capazes de crescer sob condições de baixa umidade, condições controladas de umidade, pH e fluxo de ar é uma das limitações impostas pelo processo de FES (MAHADIK et al., 2002).
Os fungos pertencem ao Reino Fungi e são organismos heterotróficos, constituídos, na maioria, por sistemas de hifas, que obtêm nutrientes por absorção.
Diferentes tipos de microrganismos podem crescer em substratos sólidos, mas os mais adaptáveis a esse tipo de processo são os fungos filamentosos, pois o ambiente se assemelha ao seu habitat natural, visto que são capazes de crescer com baixa atividade de água e de decompor a matéria orgânica lignocelulósica para utilizá-la como fonte de carbono e energia, o que torna mais fácil de conservar e controlar o seu ciclo morfológico (HOLKER; LENZ, 2005). Diferentes gêneros de microrganismos podem ser utilizados para a produção destas enzimas, como Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Cerrena, Botritis, Gliocladium, Bacillus, etc. A Figura 2 ilustra o crescimento de um fungo filamentoso em meio sólido.
Figura 2 - Esquematização do crescimento de fungos em substratos sólidos
Fonte: HÖLKER; LENZ (2005).
Após a esporulação, a hifa do fungo se desenvolve em um emaranhado micelial, este por sua vez, pode projetar-se formando hifas aéreas ou penetrar o substrato. A atividade metabólica ocorre, principalmente, próxima à superfície do substrato e entre os poros, contudo, regiões expostas do micélio (hifas aéreas) também mostram metabolismo e servem como transportadoras de substâncias para as hifas penetrativas (HÖLKER; LENZ, 2005).
3.5.1 Trichoderma Harzianum
Em 1794, o gênero Trichoderma foi descrito por Persoon, incluindo quatro espécies na descrição, e em 1969 foi reclassificado por Rifai. De acordo com Melo (1991), os microrganismos Trichoderma pertencem à subdivisão Deuteromicotyna, ordem Hifomicetes e família Moniliaceae.
Fungos do gênero Trichoderma são classificados como fungos filamentosos, possuem reprodução assexuada, são naturais do solo, sendo encontrados em matéria orgânica em decomposição e na rizosfera de diversas plantas. Ocorrem em praticamente todos os tipos de solo, embora se desenvolvam melhor em condições ambientais ácidas. Fungos desse gênero possuem habilidade significativa de biossíntese e facilidade de crescer em meio simples, contendo basicamente glicose como fonte de carbono e alguns tipos de compostos orgânicos essenciais (MELO,1998).
Fungos desse gênero exibem como característica macroscópica crescimento em cultura (4-7 dias de acordo com a composição do meio), atuam numa temperatura ótima de aproximadamente 25°C (MELO, 1991; HARMAN et al., 2004), apresentam formação de halos concêntricos alternando-se entre tonalidades verde clara e escura de acordo com seus ciclos e podendo, ainda, ser influenciada pelo pH do meio de cultura (PELCZAR et al., 1980; SILVEIRA, 1995; LIMA, 2002). A Figura 3 demonstra o ciclo de vida assexual do Trichoderma.
Figura 3 - Ciclo de vida assexual do Trichoderma
Fonte: MACHADO et al. (2012).
Algumas espécies do gênero Trichoderma são amplamente estudadas por serem antagonistas de fungos fitopatogênicos e na promoção de crescimento vegetal devido a sua versatilidade de ação, como parasitismo, antibiose e competição. Além de atuarem como indutores de resistência das plantas contra doenças, também são utilizados no controle biológico devido à produção elevada de enzimas hidrolíticas extracelulares degradadoras de parede celular, tais como celulases e quitinases (HERMOSA et al., 2000).
O parasitismo é uma relação direta e estreita entre dois organismos que geralmente são bem determinados: o hospedeiro e o parasito, vivendo o segundo à custa do primeiro. Essencialmente unilateral, o hospedeiro é indispensável ao parasita, que separado dele morrerá por falta de nutrição (PESSOA, 1972). Vários são os microrganismos com essa habilidade, mas o uso como controladores biológicos só é aceito se esse antagonista for capaz de atingir as estruturas-alvos antes que o dano seja causado à planta (AMORIM et al., 2011).
O hiperparasitismo é um nível mais elevado de parasitismo, no qual o hospedeiro é, também, um parasita (STADNIK; BETTIOL, 2000). Os fungos do gênero Trichoderma são considerados excelentes hiperparasitas, atacando hifas e estruturas de reprodução e sobrevivência dos patógenos de plantas, assim reduzindo a capacidade de infecção (BETTIOL; GHINI, 1995). A relação hospedeiro-parasita é caracterizada por um período relativamente longo de contato, que pode ser físico ou metabólico, com digestão por enzimas hidrolíticas, como quitinases, proteases, glucanases e lipases (BETTIOL, 1991; MELO; FAULL, 2000).
A competição é um processo referente à interação entre dois ou mais organismos, empenhados na mesma ação. O agente controlador deve ser capaz de crescer de maneira mais eficiente que o patógeno no local da infecção, para que o controle seja adequado (AMORIM et al., 2011). Os organismos competem entre si para obter nutrientes, água, luz, espaço, fatores de crescimento, oxigênio, entre outros (MELO, 1996). Como exemplos, pode-se citar espécies de Trichoderma capazes de mobilizar e absorver prontamente os nutrientes à sua volta e de utilizar diferentes fontes de carbono, desse modo, multiplicando-se e colonizando rapidamente a rizosfera (HARMAN, 2004).
Segundo Benítez et al. (2004) e Amorim et al. (2011), antibiose é definida como a interação entre organismos na qual indivíduos de uma população secretam
metabólitos voláteis ou não-voláteis capazes de inibir ou impedir o desenvolvimento dos indivíduos de uma população de outra espécie. Segundo Harman (2000), muitas espécies de Trichoderma já estudadas obtiveram como resposta a produção de metabólitos secundários tóxicos, como antibióticos e enzimas líticas capazes de inibir e destruir propágulos de fungos fitopatogênicos.
Através da Tabela 2 pode-se visualizar algumas das substâncias sintetizadas por espécies de Trichoderma harzianum já descritas na literatura.
Tabela 2 - Substâncias sintetizadas pelo microrganismo Trichoderma e suas atividades
Substância Atividade Referência
Gliotoxina, viridina, trichodermina,
suzucacilina, alameticina e dermadina
Antibiótica Bastos (1991)
Enzimas hidrolíticas extracelulares
Antagonista Thrane, Jensen e Tronsmo (2000)
Proteases Degrada enzimas sintetizadas pelo
patógeno
Harmen (2000)
Quitinases, glucanases e
peroxidases
Indução de resistência Romeiro (2007)
Ácido indolacético (auxina)
Promoção de crescimento
Filho et al. (2008);
Gravel, Antoum e Tweddell (2007)
Sideróforos Solubilização Hoyos-Carvajal et al.
(2009)
Fonte: Adaptado de MACHADO et al. (2012).
Atualmente, diversos produtos à base de Trichoderma são vendidos em formulações comerciais no Brasil. Entre eles, destacam-se Ecotrich WP, Smuticontrol, Predatox e Trichodermil SC 1306, todos a base de Trichoderma harzianum (AGROFIT, 2017).
3.6 ENZIMAS DE INTERESSE AGRÍCOLA
Enzimas são macromoléculas biocatalisadoras de reações químicas, muito potentes e eficazes, que aumentam a velocidade das reações sem alterar o processo como um todo. Estão presentes e são essenciais para o sistema metabólico de todos os organismos vivos. Podem ser extraídas e aplicadas de forma livre ou imobilizadas em outros sistemas metabólicos diferentes daqueles que as originou. São formadas por longas cadeias de aminoácidos com ligações peptídicas. A maioria das enzimas sintetizadas por células é retida para funções intracelulares. As enzimas extracelulares são subsequentemente secretadas para fora dos limites da membrana celular (MARQUES, 2007). Possuem um papel fundamental na degradação da matéria orgânica, na infecção do hospedeiro e deterioração dos alimentos (SAID;
PIETRO, 2004). São utilizadas em uma extensa gama de setores, incluindo a saúde humana e animal, na indústria química e alimentícia, na agricultura, para produção de energia e no saneamento ambiental.
Dentro do setor agrícola, um dos campos de interesse da biotecnologia é o controle biológico de pragas agrícolas. O crescimento do mercado brasileiro de defensivos biológicos segue tendência mundial de redução do uso de agroquímicos para combater pragas e doenças nas lavouras. O controle biológico apresenta papel de destaque, sendo recomendado para manter as pragas em baixos níveis populacionais. A aplicação de enzimas com essa finalidade mostra-se uma alternativa aos processos químicos convencionais por se tratar de uma tecnologia mais limpa, que quando adequadamente aplicada consome pouca energia e não acarreta riscos de intoxicação aos homens e animais, podem permanecer por longos períodos no ambiente, não deixam resíduos nos produtos e podem ser empregadas juntamente com outros métodos de controle (IEDE, 2010).
Muitos microrganismos conseguem romper a parede celular de leveduras, fungos e paredes celulares vegetais. Em condições de parasitismo, hiperparasitismo
e micoparasitismo, o Trichoderma utiliza os fitopatógenos como alimento, consumindo suas reservas e produzindo enzimas hidrolíticas, quitinases, proteases, glucanases e lipases, tóxicas para o hospedeiro. As enzimas que conseguem desenvolver essa ação de rompimento da parede celular são as β-1,3 glucanases, β-1,6 glucanases, mananases, proteases e quitinases. Todas essas enzimas atuam sinergicamente, mas somente duas são essenciais para o rompimento da célula: a protease lítica específica, que degrada a camada externa, e a β-1,3 glucanase lítica, que degrada a camada interna de glucana (RODRÍGUEZ-COUTO et al., 2004; SINGHANIA et al., 2007). O Trichoderma também pode atuar na indução de resistência nas plantas, mecanismo desencadeado pelo estímulo a atividades de enzimas do tipo quitinases, glucanases e peroxidases. Estas enzimas possibilitam que a planta reconheça a presença do patógeno e, desta forma, desencadeiam na planta a síntese de outras enzimas envolvidas no processo de resistência ao causador da doença.
3.6.1 β-1,3-Glucanase
As glucanas são polímeros de açúcar que podem ter centenas ou milhares de unidades monossacarídicas, e diferem entre si pelas ligações glicosídicas que as unem, comprimento de suas cadeias polissacarídicas, e também pelo grau de ramificação, quando presente. As β-1,3-glucanases são produzidas por bactérias, leveduras e fungos filamentosos (VÁSQUEZ-GARCIDUEÑAS et al., 1998; FLEURI;
SATO, 2005) e desempenham um papel importante no processo morfogênico, principalmente em leveduras, onde estão relacionadas aos processos de germinação, esporulação e no crescimento celular. Além disso, auxiliam na manutenção da rigidez e integridade da parede celular (SEVIOUR et al., 1992; STONE; CLARKE, 1992). São enzimas multifuncionais que através de hidrólise podem degradar polissacarídeos como a celulose e outras β-glucanas. Estas enzimas participam diretamente do processo de controle biológico porque hidrolisam β-1,3 e β-1,6-glucanas constituintes da parede celular de alguns patógenos (PITSON et al., 1993; KUMAR; DEOBAGKAR, 1996; IORIO et al., 2008; FLEURI; SATO, 2008).
Como exemplo deste tipo de glucana pode ser citado a laminarina, isolada da Laminaria digitata, que possui apenas 10% de grau de ramificação e tem sido muito utilizada como substrato para a determinação da atividade de β-1,3-glucanases. O
fungo T. harzianum, por exemplo, tem sido descrito como produtor de um complexo enzimático constituído por sete β-1,3-glucanases quando cultivado na presença de laminarina (NEBREDA et al., 1987; DAENEN et al., 2008; VÁSQUEZ-GARCIDUEÑAS et al., 1998; PITSON et al., 1993; BROCK, 1965; STUBBS et al., 1999; MOLERO et al.,1999; BARSANTI et al., 2001; BAUERMEISTER. A. et al., 2010). A produção de β−1,3-glucanases pelo micoparasita Trichoderma harzianum é induzida na presença de parede celular purificada dos fungos Pythium sp., Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, assim como de quitina, N-acetilglicosamina e laminarina (NORONHA et al., 2000), corroborando a potencial ação da enzima no micoparasitismo.
O controle biológico é uma das principais aplicações biotecnológicas destas enzimas. A aplicação de β-1,3-glucanases ou dos microrganismos produtores dessas enzimas é importante para retardar o crescimento de fungos patogênicos. O controle biológico ocorre devido à composição da parede celular dos microrganismos patogênicos, a qual é composta principalmente de β-glucanas (IORIO et al., 2008;
FLEURI; SATO, 2008). β-1,3-glucanases são muito utilizadas para a caracterização da parede celular microbiana, como também na indústria alimentícia, na produção de bebidas como vinho e cerveja, ou como suplemento alimentar em rações, devido à presença de β-1,3-glucanas (BAUERMEISTER et al., 2010).
3.6.2 Quitinases
A quitina é um polímero de ligações β-1,4 de N-acetilglicosamina (NacGlc) e um constituinte importante das paredes celulares de fungos, do exoesqueleto de insetos e da carapaça de crustáceos. Estudos demonstraram que se refere a uma estrutura cristalina altamente ordenada e amplamente distribuída, insolúvel em água e instituída, depois da celulose, o polissacarídeo mais abundante na natureza. Na maioria dos fungos, a quitina é o maior componente estrutural da parede celular, sendo, portanto, susceptível a inúmeras espécies que podem agir como antagonistas devido à produção de enzimas quitinolíticas (FLEURI; SATO, 2005). A Figura 4 ilustra a estrutura do polímero de quitina com as ligações β-1,4 de N-acetilglicosamina.
Figura 4 - Estrutura da quitina
Fonte: SANTOS (2011).
As enzimas quitinolíticas pertencem a grande família das β-glicosil hidrolases e podem ser divididas em N-acetilglicosaminidases e quitinases, as quais diferem nos seus padrões de clivagem no polímero de quitina (SCHRANK; VAINSTEIN, 2010). As quitinases são importantes na decomposição da quitina, transformando-as em uma fonte renovável. Aplicações de quitinase vão desde o biocontrole, por serem capazes de degradar a quitina presente nas paredes celulares de fungos e no exoesqueleto de insetos em dissacarídeos e oligossacarídeos de cadeia longa (RIBEIRO, 2000), como também na preparação de protoplasto em fungos, e na produção de oligossacarídeos como substâncias biologicamente ativas (COELHO; NASCIMENTO, 2008).
Os organismos que possuem quitina como polímero constituinte de alguma estrutura morfológica têm a capacidade de produzir quitinases, bem como aqueles que utilizam a quitina como fonte de carbono e nitrogênio em seu metabolismo. O número de quitinases produzidas varia consideravelmente entre espécies diferentes, como, por exemplo, as leveduras produzem poucos tipos, enquanto os fungos filamentosos produzem uma diversidade muito grande destas enzimas (REIS, 2017).
Na literatura, os relatos de produção de quitinase fúngica ocorreram, predominantemente, pelo processo de fermentação submersa (FSm). Porém, nos últimos anos, tem se mostrado crescente o número de estudos que utilizam a FES para a produção de quitinases por fungos filamentosos (PANDEY, 2013). O maior crescimento fúngico acontece na superfície do material sólido que, conforme demonstrado por diversos estudos, ocorre excreção em maior quantidade e diversidade de enzimas (SINGHANIA et al., 2009; THOMAS; LARROCHE; PANDEY, 2013).
O período de incubação apresenta um efeito significativo na produção de quitinases, os níveis de produção aumentam durante certo período de tempo e, após, diminuem. O principal motivo para a diminuição da produção se deve ao consumo gradual dos nutrientes no meio de cultura. Esse comportamento da enzima pode ser observado no estudo realizado por Hao et al. (2012), onde, após uma fase de adaptação de aproximadamente 48h dos microrganismos, o rendimento das quitinases aumentou gradualmente e atingiu o rendimento máximo após cerca de 84h, decaindo drasticamente após esse período (REIS, 2017).
A fonte de nitrogênio utilizada apresenta um papel fundamental na produção de quitinases. O pH e a temperatura de incubação apresentam um papel importante na produção de quitinases. Isso é confirmado pelo fato de que a produção de quitinases ocorre, preferencialmente, em pH abaixo de 6.0 (WASLI et al., 2009; REIS, 2017).
Com relação à temperatura, tanto na FSm como na FES a produção máxima de quitinases ocorre em temperaturas mesofílicas de 25-35ºC (SUDHAKAR;
NAGAJARAN, 2011; CHEN et al., 2013).
Já foi demonstrado que, na presença de parede celular purificada dos fungos fitopatogênicos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani, há indução na produção de quitinases pelo fungo micoparasita Trichoderma sp. (LIMA et al., 1999). Foi demonstrado também que o Trichoderma harzianum é capaz de parasitar o fitopatógeno Crinipellis perniciosa, causador da vassoura de bruxa do cacau (BASTOS,1996), e produzir uma quitinase quando crescido em meio indutor contendo quitina como fonte de carbono.
Lima et al. (1997) produziram quitinase por 6 diferentes cepas de Trichoderma sp. A produção máxima obtida de quitinase foi de 514 U/g para um dos isolados, em meio contendo 0,1% de peptona, 0,1% de ureia e 0,5% de quitina em pH 5,5. A quitinase purificada e bruta destruiu a parede celular de Sclerotium rolfsü, entretanto, somente o caldo bruto de fermentação destruiu as paredes de Rhizoctonia solani (DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006; BALDONI, 2016). Em outro estudo recente, o isolado Trichoderma harzianum produziu quitinases e β-1,3-glucanase em resposta a presença de fungos fitopatogênicos e não fitopatogênicos em meio de cultivo (TING;
CHAI, 2015).
Os elevados custos de produção comercial da quitinase reduzem as aplicações em larga escala, gerando um maior interesse por pesquisas que visam aumentar a
produção de quitinase utilizando diferentes técnicas de fermentação combinada com a otimização das variáveis a serem utilizadas para a montagem de um meio de produção ideal (BINOD et al., 2007). Ainda existem muitos desafios para a obtenção de uma produção alta e estável dessas enzimas.
3.6.3 Celulases
A celulose é um polímero linear formado por unidades de glicose ligadas entre si por ligações β–1,4 que possui papel estrutural, protegendo a célula vegetal contra a ação da pressão osmótica e estresses mecânicos (IGARASHI et al.,2007). É o composto renovável mais abundante do globo terrestre e possui importância mundial como matéria-prima industrial e fonte de energia renovável.
Um dos organismos mais extensivamente estudados para a produção de complexos celulolíticos é o fungo Trichoderma reesei, por ser considerado o melhor microrganismo produtor de celulases, o conjunto de enzimas envolvidas na degradação da celulose, capazes de romper as ligações glicosídicas β-1,4, entre as unidades de glicose. A celulase de origem fúngica é produzida quando o microrganismo é inoculado em meios de culturas que contenham celulose, sefarose (polissacarídeo bastante utilizado na produção de resinas para a purificação de proteínas), lactose ou celobiose como fonte de carbono (PEIXOTO, 2006; MACHADO et al., 2012).
O mecanismo de hidrólise enzimática completa da celulose mais aceito atualmente descreve a ação cooperativa de pelo menos três classes de enzimas pertencentes ao complexo celulolítico: as Endo-β(1-4) glucanase, as Exo-β(1-4) glucanase, e as β(1-4) glicosidase (ZHANG; LYND, 2004). A Figura 5 ilustra de forma simplificada a sequência de hidrólises realizadas pelas celulases na quebra da molécula de celulose até o estado final de glicose.
Figura 5 - Esquema simplificado da hidrólise por celulases
Fonte: DA SILVA et al. (1997).
Endo-β(1-4)-glucanase, também conhecidas como β(1-4)-D-glucano-4- glucanohidrolase ou Endocelulases ou CMCase (REYES et al., 1998; LIMA et al., 2001) são responsáveis pela iniciação da hidrólise, rompendo moléculas de celulose ao acaso e hidrolisando ligações β(1-4) no meio das regiões amorfas, dentro da cadeia de celulose, liberando fragmentos menores de glicose, celobiose e celodextrinas e que servem de substrato para as exo-glucanases (LYND et al., 2002). A carboximetilcelulose é utilizada como substrato preferencial para a atividade dessas enzimas (CAO; TAN, 2002).
Após o rompimento inicial, quem atua são as Exo-β(1-4) glucanase (ou Avicelase ou exo-glucana-4-glucanohidrolase ou Exocelulases). Essas enzimas atuam na porção cristalina da molécula de celulose e catalisam a hidrólise de ligações β-1,4-D-glicosídicas na celulose, liberando celobiose das extremidades das cadeias (WOOD et al., 1989; LYND et al., 2002).
As β-glicosidases têm a propriedade de hidrolisar celobiose e oligossacarídeos solúveis em glicose. Assim como as celobiohidrolases, também são reportadas por sofrerem inibição por seu produto de hidrólise (LYND et al., 2002). A atividade dessas
enzimas diminui com a diminuição da cadeia do substrato (JUHÁSZ et al., 2005; LYND et al., 2002).
3.7 APLICAÇÃO DE ULTRASSOM NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
De forma geral, o ultrassom (US) pode ser explicado como uma onda mecânica acústica produzida pelo movimento oscilatório das partículas de um ambiente e precisa de um meio físico (sólidos, líquidos ou gases) para se propagar (MASON et al., 2005). O sistema é composto por um gerador de frequência que transmite um sinal a um transdutor piezoelétrico, constituído por uma cerâmica piezoelétrica disposta entre duas chapas metálica que transmite os impulsos ultrassonoros ao meio reacional. A cerâmica piezoelétrica transforma as ondas elétricas em ondas mecânicas e chapas metálicas amplificam estes sinais (BARBOSA; SERRA, 1992).
O tipo de onda sônica é determinado pela frequência, sendo esta propriedade importante para classificar os diferentes espectros do som. O termo infrassom faz referência às ondas sônicas de baixa frequência inaudíveis pelo ouvido humano. A faixa de audição humana encontra-se entre 20 Hz a 20 kHz. A palavra ultrassom refere-se às ondas sônicas cuja frequência supera a faixa de audição humana. Este espectro ultrassônico pode ser dividido em duas sub-faixas: ultrassom de potência, onde o maior foco de estudo encontra-se na faixa de frequências entre 20 kHz e 1 MHz e, ultrassom de diagnóstico, que ultrapassa a frequência de 1 MHz (KENTISH;
ASHOKKUMAR, 2011). A Figura 6 ilustra o espectro do som, mostrando a faixa de frequência em cada subdivisão. A maioria dos usos no processamento de alimentos opera entre 16 kHz e 100 kHz, porque a cavitação pode ser produzida dentro dessa faixa de frequência (KOUTCHMA, 2015). No campo da biotecnologia, a busca por novas técnicas que possam melhorar o rendimento de processos industriais tem recebido muita atenção. O ultrassom com baixas frequências vem se mostrando como uma opção próspera devido aos benefícios que pode gerar e à sua aplicabilidade em uma ampla gama de atividades (KWIATKOWSKA et al. 2011).
Figura 6 - Espectro do som
Fonte: KENTISH; ASHOKKUMAR (2011).
Em termos de energia e potência, os empregos do ultrassom são, geralmente, classificados em dois grupos. Os de baixa energia (baixa potência, baixa intensidade), compreendem o emprego de intensidades de ultrassom abaixo de 1 W/cm2. Os de alta potência, de alta intensidade que utilizam intensidades acima de 1 W/cm2 (1-1000 W/cm2) em baixos alcances de frequência.
Os principais efeitos do ultrassom são decorrentes da propagação das ondas de choque e da cavitação, que pode ser resumida como o aumento da turbulência do sistema através da formação de bolhas que diminuem de tamanho, seguido da expansão e implosão. A combinação do aumento de calor, pressão e turbulência é utilizada para catalisar e alterar reações biológicas e químicas, rompimento da cadeia de polímeros, ou a quebra da parede celular das plantas (LIN; THOMAS, 2004;
ASHOKKUMAR; MASON, 2007; DALAGNOL, 2017). Outro efeito gerado em decorrência do colapso das bolhas é o aumento da temperatura do meio, consequência da conversão de energia em calor (KENTISH; ASHOKKUMAR, 2011;
DALAGNOL, 2017). A cavitação transitória é indesejável em processos biotecnológicos, uma vez que pode causar um aumento da temperatura e pressão que, certamente, desintegraria as células ou desnaturaria as enzimas, porém, a cavitação estável, na qual bolhas oscilam de um modo regular induzindo ao seu redor uma micro correnteza que afeta algumas partículas, diminuindo o estresse (SINISTERRA, 1992; LEÃES, 2012).
As aplicações de ondas ultrassonoras podem ser feitas, basicamente, utilizando dois métodos: direta ao produto (sondas) ou indiretamente (banhos em água). A sonda encontra-se fixada na extremidade do amplificador do transdutor em
