DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
VIVIANE DE SOUSA TOMAZ
PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NO COMPORTAMENTO TIPO-DEPRESSÃO INDUZIDO POR LPS
PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NO COMPORTAMENTO TIPO-DEPRESSÃO INDUZIDO POR LPS
Dissertação apresentada ao Programa Pós-Graduação em Microbiologia Médica da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica.
Orientadora: Prof.aDr.aDanielle Macêdo Gaspar
PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NO COMPORTAMENTO TIPO-DEPRESSÃO INDUZIDO POR LPS
Dissertação apresentada ao Programa Pós-Graduação em Microbiologia Médica da Faculdade
de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Microbiologia Médica.
Aprovada em: 31/08/2013
BANCA EXAMINADORA
_________________________________
Prof.aDr.aDanielle Macêdo Gaspar Universidade Federal do Ceará
Orientadora
_________________________________
Prof.aDr.aMariana Lima Vale Universidade Federal do Ceará
Membro da Banca
_________________________________
Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior Universidade Federal do Ceará
Membro da Banca
_________________________________
Prof.aDr.aSilvania Maria Mendes Vasconcelos Universidade Federal do Ceará
Ao todo criador, Deus, que está acima de todas as coisas deste mundo. Concebendo sempre os
nossos desejos e vontades, mesmo quando de forma oculta;
À minha orientadora Profa. Dra. Danielle Macêdo Gaspar que se dedicou a me orientar.
Obrigada pelos ensinamentos, atenção, amizade e dedicação ao longo deste período;
A minha mãe Antonia Ferreira de Sousa, pela confiança, amor, cuidado, e sabedoria;
A Profa. Dra. Edna Maria Camelo Chaves por todas as orientações não só em trabalhos
científicos, mas também na vida;
A Rafaela Carneiro Cordeiro pela participação essencial na execução dos experimentos, sem
você eu não teria conseguido;
A Francisca Lucilene Costa (Lena) e a Maria Vilani Rodrigues (Vila) por todo auxilio durante
a execução dos experimentos;
A Profa. Dra. Mariana Lima Valle e Profo. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior pela
participação na banca de qualificação e por todas as considerações que engrandeceram este
trabalho;
A todos que compõem o Laboratório de Neurofarmacologia do Programa de Pós-gradução em
Farrmacologia da UFC;
Os transtornos psiquiátricos, dentre eles a depressão, estão entre as principais causas de incapacidade no mundo. Desta forma, pesquisas a respeito de novas vias envolvidas na fisiopatologia deste transtorno mental que possibilitem a descoberta de novos alvos para o tratamento deste transtorno têm sido amplamente estudados. O óxido nítrico (NO) e a sua enzima de síntese óxido nítrico sintase (NOS) vem sendo relacionados com a depressão e outros transtornos afetivos. Neste contexto buscou-se determinar o efeito do pré-tratamento de drogas que modulam a via do NO em animais submetidos ao desafio imune pela administração sistêmica de LPS (0,5 mg / kg, ip). Para tanto os comportamentos relacionados à depressão, inibição pré-pulso (PPI) e atividade locomotora, 24 h após a administração da endotoxina, respectivamente, ponto de tempo chave para o desenvolvimento de comportamentos tipo depressivo, e neuroquímicas através da avaliação dos níveis de TBARS, Nitrito e GSH nas áreas cerebrais (córtex pré-frontal - CPF, hipocampo - HC e corpo estriado - CE) foram avaliados. Os animais tratados com LPS, bem como os pré-tratados com L-ariginina antes do LPS aumentaram significativamente o tempo de imobilidade no nado forçado em comparação com os controles. Observou-se uma redução significativa no tempo de imobilidade dos animais pré-tratados com aminoguanidina quando em comparação com os animais do grupo controle e LPS. Notavelmente os animais pré-tratados com sildenafil e L-NAME apresentaram uma diminuição significativa do tempo de imobilidade quando comparado ao grupo que recebeu apenas LPS. O resultados mostraram que 24 horas pós a administração de LPS, a atividade locomotora avaliada através do número de cruzamentos no campo aberto, manteve-se inalterada, apenas havendo aumento significativo nos animais tratados com imipramina. Observou-se uma diminuição significativa nos níveis de PPI 24 h após a administração de LPS nas intensidades de pré-pulso de 70, 75 e 80 dB em relação aos animais controle. A administração de todas as outras drogas (imipramina, L-arginina, sildenafil, L-NAME e aminoguanidina), foi capaz de prevenir a redução dos níveis de PPI causada após a administração sistêmica do LPS. Os níveis de GSH diminuiram em todas as áreas cerebrais estudadas, ou seja, córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado, de animais tratados com LPS quando comparados aos controles. Esta redução foi mantida pelo pré-tratamento com L-arginina no córtex pré-frontal em comparação ao LPS e controle e prevenida pelo pré-tratamento com as drogas imipramina, L-arginina, sildenafil, L-NAME e aminoguanidina. Na avaliação da peroxidação lipídica após a administração do LPS foi evidenciado aumento significativo neste parâmetro. A administração da imipramina manteve o aumento nos níveis de TBARS no córtex pré-frontal e corpo estriado em relação aos animais controle, mas reduziu este parâmetro quando comparado aos animais tratados com LPS. A administração da L-arginina, sildenafil, L-NAME e aminoguanidina reduziu os nível de peroxidação lipídica quando comparado aos animais tratados com LPS em todas as áreas cerebrais estudadas. A pré-administração da imipramina, l-arginina e aminoguanidina foram capazes de prevenir o aumento dos níveis de BDNF causado pela administração sistêmica do LPS. Por outro lado, as análises dos níveis de BDNF 24 h após a administração de LPS dos animais pré-tratados com sildenafil e L-NAME, não demonstraram alterações sisgnificativas. Observou-se um aumento no conteúdo de IL-1β 24 h após a administração de LPS no córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado, todas as drogas foram capazes de prevenir essas alterações no hipocampo e corpo estriado. O óxido nítrico (NO) desempenha um papel significativo neuromodulador no sistema nervoso central. Qualquer manipulação farmacológica da via de NO pode ser considerado como uma nova abordagem terapêutica para o tratamento de distúrbios do SNC, mais ainda para a depressão mental(Heiberg et al., 2002)(1)(1)(1)(1).
INTRODUÇÃO
Figura 1 – Composição e estrutura do LPS...16
Figura 2–Esquema da absorção intestinal da arginina...21
Figura 3–Síntese de NO e as vias de sinalização...22
Figura 4–Funções das isoformas da NOS...23
CAPÍTULO 1 Figura 1 – Tempo de imobilidade no teste de natação forçada (TNF), após 24 hs da administração lipopolissacarídeo (LPS)... 64
Figura 2 – Percentagem de inibição de pré-pulso de sobressalto (PPI), utilizando três intensidades de pré-pulso diferentes (70, 75 e 80 dB), após 24 hs da administração lipopolissacarídeo (LPS)...65
Figura 3–Os níveis de GSH no córtex pré-frontal, hipocampo e tecido estriado após 24 hs da administração lipopolissacarídeo (LPS)...66
Figura 4– Os níveis de TBARS no córtex pré-frontal, hipocampo e tecido estriado e de após 24 hs da administração lipopolissacarídeo (LPS)...67
Figura 5–Os níveis de IL-1β córtex pré-frontal (A), hipocampo(B) e corpo estriado(C), após 24 hs da administração lipopolissacarídeo (LPS)...68
INTRODUÇÃO
BDNF–Fator neurotrófico derivado do cérebro
CaMKII–Cálcio calmodulina cinase II
EDRF–Fator de Relaxamento Derivado do Endotélio
ERNs–Espécies Reativas de Nitrogênio
EROs–Espécies Reativas do Oxigênio
GMPc -Monofosfato cíclico de guanosina
HPA–Hipotálamo-pituitária-adrenal
ISRS–Inibidores seletivos de recaptação de serotonina
ISRSN–Inibidores duplos de recaptação de serotonina e noradrenalina
LCE–Labirinto em Cruz Elevado
LPS–Lipopolissacarídeo
MAPK–Proteína cinase ativada por mitógeno
NO–Óxido Nítrico
PKA–Proteína cinase A
PKC–Proteína cinase C
SNC–Sistema Nervoso Central,
SNP–Sistema Nervoso Periférico
SOD–Superóxido Dismutase
TNF–Teste de Nado forçado
1 INTRODUÇÃO... 11
1.1 Depressão Maior... 11
1.1.2 Hipóteses e Fisiopatologia da Depressão... 12
1.1.3 Tratamento farmacológico da depressão... 13
1.1.4 Modelos animais de depressão... 13
1.1.5 LPS... 15
1.1.6 Depressão e Estresse Oxidativo... 17
1.1.7 Neuroinflamação... 18
1.2 Óxido Nítrico (NO)... 20
1.2.1 Biossíntese do NO... 21
1.2.2 Isoformas de NOS... 23
1.2.3 NO no Sistema Nervoso Central (SNC)... 24
1.2.4 Moduladores da Via do NO... 25
1.2.5 NO e Depressão... 27
2 PERGUNTAS DE PARTIDA... 30
3 HIPÓTESES... 30
4 OBJETIVOS... 31
4.1 Objetivo Geral... 31
4.2 Objetivos Específicos... 31
5 CAPÍTULO 1... 32
1 Introdução
1.1 Depressão Maior
Depressão Maior é um transtorno mental caracterizado por: humor deprimido,
anedonia, avolia, alterações do sono e do apetite, pessimismo, desesperança e baixa
autoestima que aparecem com frequência e podem combinar-se entre si (QUEVEDO et al.,
2009).
É o mais incidente e potencialmente incapacitante dos transtornos afetivos com uma
prevalência de aproximadamente entre 10-30 % em mulheres e 7-15 % em homens
(TIERNEY, 2007; WRIGHT et al., 2013). Segundo Holtzheimer e Nemeroff (2006) a
prevalência da depressão na vida de um indivíduo se situa em torno de 15-17 % na população
geral (HOLTZHEIMER e NEMEROFF, 2006), os pacientes acometidos por depressão grave
apresentam altas taxas de comorbidades e mortalidade, com profundas consequências
econômicas e sociais (NEMEROFF e OWENS, 2002; ZBOZINEK et al., 2012). Vale
ressaltar que a depressão é a segunda causa de incapacitação no mundo, ficando atrás apenas
das doenças cardiovasculares (HOLTZHEIMER E NEMEROFF, 2006; NORTH E
PFEFFERBAUM, 2013).
1.1.2 Hipóteses e Fisiopatologia da Depressão
Na primeira hipótese da depressão foi aventado que este transtorno mental resulta, em
parte, de uma deficiência na atividade monoaminérgica na fenda sináptica (ELHWUEGI,
2004). Além das monoaminas, vários outros sistemas de neurotransmissores e mecanismos de
transdução de sinal estão envolvidos, como a via da L-arginina / óxido nítrico (NO); o sistema
glutamatérgico (PETRIE et al., 2000), os canais de cálcio(Ca) e potássio (K+) (GUO et al.,
1996; ), o sistema opióide (GABILONDO et al., 1995) e o sistema GABAérgico
Além dessas alterações, a depressão pode ser desencadeada por desequilíbrio em
outras vias de sinalização que regulam a neuroplasticidade e a sobrevivência celular como as
descritas no quadro 1:
Quadro 1: Alterações biológicas causadas pela depressão
Alteração: Autor:
• Proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK)/cinase regulada por sinal extracelular (ERK).
DWIVEDI et al., 2001.
• Proteína ligante ao elemento responsivo ao AMPc (CREB);
• Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
MANJI et al., 2001.
• Proteína cinase C (PKC); • Proteína cinase A (PKA);
• Glicogênio sintase cinase 3 (GSK-3).
PICCHINI et al., 2004.
• Proteína antiapoptótica Bcl2. PERERA et al., 2007.
• Liberação de citocinas pró-inflamatórias associadas
com a ativação do sistema imune. DUNN et al., 2005.
• Aumento dos níveis plasmáticos de glicocorticoides;
• Desregulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA).
PERERA et al.,2007;
PITTENGER e DUMAN, 2008.
• Aumento no estresse oxidativo. BILICI et al., 2001.
Desde a década de 80 a depressão vem sendo associada com desregulações no
processo inflamatório (DANTZER, 2008). Desta forma, o comportamento tipo-depressivo em
animais pode ser induzido como resposta a um estímulo inflamatório periférico na fase aguda,
embora esses mecanismos ainda não estejam totalmente esclarecidos (DANTZER et al., 2008;
RICHTER et al., 2011). Leonard e Maes (2012) relatam que a infecção bacteriana possa
causar depressão e comportamento de doença através da ativação do estresse oxidativo,
1.1.3 Tratamento farmacológico da depressão
Alguns fármacos estão disponíveis para o tratamento da depressão há mais de 50 anos,
como os antidepressivos tricíclicos e inibidores da enzima monoamina oxidase. Vale ressaltar
que grande parte dessas drogas antidepressivas foram descobertas ao acaso, sendo que os
mesmos ainda são comercializados apesar dos diversos efeitos colaterais. Os inibidores
seletivos de recaptação de serotonina (ISRS), inibidores duplos de recaptação de serotonina e
noradrenalina (ISRSN) também estão disponíveis no mercado, sendo estes mais seletivos,
produzem menos efeitos colaterais, sendo mais bem tolerados pelos pacientes. Mais
recentemente foram desenvolvidas medicações capazes de modular o ritmo circadiano e o
sistema melatoninérgico, sendo os tratamentos mais modernos disponíveis para esta patologia
(FRAZER, 1997; BERTON e NESTLER, 2006; NEMEROFF, 2006; CHEN e SKOLNICK,
2007; LEISTEDT e LINKOWSKI, 2013).
Geralmente o tratamento da depressão é eficaz em 30% dos pacientes sendo que a
grande maioria necessita em um segundo momento da substituição de medicações ou da
combinação de fármacos para a obtenção de uma resposta terapêutica ideal além do fato
destas drogas apresentarem grande tempo de latência para obtenção dos benefícios clínicos
(entre 3-5 semanas), e ainda há grandes problemas quanto os efeitos colaterais como: perda da
libido e ganho de peso, entre outros (LAPIDUS et al., 2013; ZARATE et al., 2013). Apesar
das inúmeras terapias e fármacos disponíveis para tratamento da depressão, um número
considerável de pacientes são refratários à terapêutica e permanecem com sintomas residuais
incapacitantes (ANDERSON et al., 2000; HOLTZHEIMER e NEMEROFF, 2006). Somente
30-50% dos pacientes mostram remissão completa dos sintomas com a terapia com
antidepressivos com ou sem a associação da psicoterapia (BERTON e NESTLER, 2006;
ZARATE et al., 2013; WRIGHT et al., 2013).
1.1.4 Modelos animais de depressão
Muitos modelos animais de depressão são utilizados com intuito de estudar alguns
aspectos da patologia, essas ferramentas são indispensáveis para o estudo de novas drogas
antidepressivas e da fisiopatologia desta doença (CRYAN et al., 2002; CRYAN e
atividades cognitivas superiores, tais como a emoção e a auto-realização, que não podem ser
facilmente reproduzidas em animais. Os sintomas clínicos da depressão, como: sentimento de
culpa, melancolia e pensamentos suicidas não podem ser reproduzidos e mensurados em
ensaios pré-clínicos (WONG e LICINIO, 2001).
McKinney e Bunney (1969) propuseram que os modelos animais de depressão devem
cumprir os seguintes quesitos: 1) deve existir mudança no comportamento do animal que
possa ser controlada objetivamente; 2) ter equivalência com a depressão humana em sua
manifestação ou sintomas; 3) os ensaios pré-clínicos devem ter reprodutibilidade em
laboratórios; 4) as mudanças comportamentais alteradas no animal devem ser revertidas
através do mesmo tratamento antidepressivo utilizado em seres humanos.
Os modelos de comportamento tipo-depressivo mais utilizados na avaliação
pré-clínica são: o modelo de desespero comportamental e o modelo de desamparo aprendido. Um
exemplo de modelo de desespero comportamental seria o Teste de Nado forçado (TNF)
(PORSOLT et al., 1977) e o Teste de Suspensão de cauda (TSC) (STERU, et al., 1985), e o
exemplo de modelo de desamparo aprendido seria a esquiva ativa de duas vias após
administração de choques inescapáveis e imprevisíveis (SHERMAN et al., 1982).
O TNF (PORSOLT et al., 1977) utilizado em ratos e posteriormente em camundongos
e TSC (STERU et al., 1985) utilizado somente em camundongos são os menos complexos e
mais amplamente utilizados, apesar dessas abordagens serem criticadas por envolver estresse
agudo. Estes modelos são baseados na observação do animal colocado em um estado de
desespero. Inicialmente, o animal apresenta movimentos para tentar escapar da situação
praticamente inescapável, mas após um tempo determinado de luta, o animal apresenta uma
postura quase imóvel. A imobilidade pode ser entendida como o fracasso na tentativa de
escapar do estímulo estressante (comportamento de desespero) (WILLNER, 1984). Outra
possível interpretação é que a imobilidade pode ser um comportamento resultante do estado
de desesperança no qual o animal perde a expectativa de fuga, ou mesmo, um comportamento
adaptativo do animal para a manutenção de energia (PRESTON e WEST, 1990).
O modelo de comportamento depressivo induzido pela administração sistêmica de
LPS, um lipopolissacarídeo de bactéria gram-negativa, é bastante utilizado atualmente
de novos fármacos antidepressivos, é de fácil uso e de boa reprodutibilidade (CRYAN et al.,
2002; NESTLER et al., 2002a/b; CRYAN e SLATTERY, 2007; LEONARD & MAES,
2012).
1.1.5 Lipopolissacarídeo (LPS)
A parede celular das bactérias gram-negativas é constituída por uma camada de
peptideoglicano e três outros componentes que a envolvem externamente: lipoproteína,
membrana externa e LPS (Lipopolissacarídeo). O peptídeoglicano, responsável pela forma
das células e proteção do citoplasma frente às diferenças de pressão osmótica entre os meios
externo e interno, confere rigidez ao corpo bacteriano. A lipoproteína está ligada de modo
covalente ao peptideoglicano e não covalente a membrana externa–sua função é estabilizar a
membrana externa e ancorá-la à camada de peptideoglicano. A membrana externa é uma
dupla camada contendo fosfolipídeos e proteínas, apresentando em sua camada externa o
LPS. Quimicamente a endotoxina das bactérias Gram-negativas é um LPS, que tem na sua
porção mais interna um lipídeo A (glicolipídeo responsável pela atividade endotóxica),
seguido de core e, na região externa, e o antígeno O, composto por cadeias repetidas de
oligossacarídeos (Figura 1). O lipídeo A é a porção responsável pela toxicidade da molécula e
é antigenicamente bem conservado entre as bactérias gram-negativas patogênicas (DE
CASTRO et al. 2008; MESSNER et al., 2008; SALAZAR et al., 2012; GREENFIELD et al.,
2012; BILBO & SCHWARZ, 2012).
Considerado o principal fator de virulência das bactérias gram-negativas, o LPS
determina efeitos biológicos que resultam na amplificação das reações inflamatórias
(KELLEY & DANTZER, 2011). Essa endotoxina é um antígeno fraco, não específico, que
não é facilmente neutralizado por anticorpos, sendo capaz de ativar a cascata do
complemento. A ativação do complemento envolve a formação de cininas, outros importantes
mediadores da inflamação, ativação de plaquetas, mastócitos, basófilos e células endoteliais
(SHIMADA et al., 2012). O LPS induz os macrófagos a secretarem as citocinas
pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e IL-8), TNF-α , óxido nítrico, interferons, fator ativador de
Figura 1–Composição e estrutura do LPS
O LPS, administrado sistemicamente, vem sendo utilizado como modelo para induzir
neuroinflamação. Essa endotoxina é reconhecida pelo sistema imunitário dos mamíferos como
agente patogênico associado a molecula padrão (PAMP). Liga-se ao receptor toll-like 4
(TLR4) através do adaptador de proteína CD14 (NETEA et al., 2002), e aumenta a expressão
de citocinas pró-inflamatórias, seguindo a translocação nuclear de NF-kB (ZHANG &
GHOSH, 2000). O LPS administrado por via intracerebral ou sistemicamente desencadeia a
ativação da microglia e o subsequente aumento da expressão de citocinas (THIBEAULT et
al., 2001; RIVEST et al., 2003).
Alguns estudos evidenciaram alterações de comportamento induzidas pela
administração sistêmica de LPS relacionadas ao tempo. Com base nessa questão, as de curto
prazo (ou seja, alterações comportamentais durante o pico de liberação de citocinas), foram
relacionadas com o comportamento de doença, enquanto que as alterações a longo prazo (isto
é, após o pico de citocinas), foram relacionados com a depressão, propriamente dita
(KONSMAN et al., 2004; DANTZER, 2008, LEONARD&MAES, 2012).
Custódio et al. (2013) em seu estudo pré-clínicos identificou sintomas tipo-depressivos
em camundongos bem como uma diminuição nos níveis de nitrito em todas as áreas do
cérebro em 1.5 e 24 horas pós-tratamento com LPS. O mesmo trabalho ressaltou uma possivel
ação neuroprotetora do NO endogeno.
1.1.6 Depressão e Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo é caracterizado pelo desequilíbrio entre a produção de espécies
reativas do oxigênio (EROs), consideradas oxidantes, e os agentes antioxidantes, o que vem
a resultar num perfil pro-oxidante deletério ao organismo. (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
2007). Esse processo vem sendo relatado na patogênese de algumas doenças
neurodegenerativas que acometem o sistema nervoso central (SNC), como: Doença de
Alzheimer, Doença de Parkinson e Epilepsias (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990). Isso
ocorre porque o SNC é muito sensível ao estresse oxidativo, devido ao alto consumo de
oxigênio e do alto conteúdo lipídico, principalmente de ácidos graxos poliinsaturados, os
quais servem de substrato para a peroxidação lipídica (HALLIWELL, 1992).
O Estresse Nitrosativo é uma condição, próxima do estresse oxidativo, na qual o
principal fator de dano celular é a modificação covalente de componentes celulares pela
reação com NO e moléculas aparentadas (MAES; SONG; YIRMIYA, 2012).
O Stress oxidativo e nitrosativo (O&NS) são os subprodutos da fosforilação oxidativa,
paticipam dos processos celulares homeostaticos , como: apoptose, mitose e resposta a lesões
ou infecções. Porém em muitos processos celulares os niveis de desse stress podem aumentar
além da capacidade normal de produção dos antioxidantes pelas células, dessa forma o
aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio
(RNS), bem como a diminuição da defesa ao ciclo redox podem acarretar danos aos
componentes celulares, incluindo proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios. Tais
danos podem promover diversas alterações na função dos ácidos graxos nas proteínas de
membrana (VALKO et al., 2007; HOVATTA et al., 2010).
A formação das espécies reativas de oxigênio (radicais livres) ocorre em razão da
configuração eletrônica do oxigênio, que o faz apresentar forte tendência a receber um elétron
de cada vez. Essa característica, em situação de estresse oxidativo, pode interferir no
metabolismo de óxido nítrico da seguinte maneira: A adição de um elétron a uma molécula de
oxigênio no estado fundamental gera a formação do radical superóxido (O2•-). O radical superóxido pode reagir diretamente com o óxido nítrico (NO), um radical livre centrado no
nitrogênio, gerando peroxinitrito. Este pode levar à formação de um oxidante com
Há várias formas do O&NS contribuir para a patogênese da depressão, dentre os quais:
i) Quando os antioxidantes e os níveis de enzimas antioxidantes estão diminuídos, há uma
maior resposta inflamatória, que podem ser acompanhados por níveis elevados de citocinas,
mediando mais sintomas de inflamação; ii) O metabolismo do triptofano, induzido pela
inflamação gera o ácido quinolínico, que estimula neurotransmissão glutamatérgica. Este
caminho é induzido pela inflamação, como a enzima que inicia o caminho é a indoleamina
dioxigenase, ela também pode está envolvida na patogênese da depressão (MAES et al.,
2011).
Os distúrbios psiquiátricos podem estar relacionados a excesso de espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio, sendo estas moléculas importantes fatores de danos em vários
processos patológicos e toxicológicos (MAES et al., 2000). Tsuboi et al. (2006) relatou
correlação do estresse oxidativo aumentado e sintomas de depressão em pacientes,
comprovado pela redução das defesas antioxidantes e pelo aumento da peroxidação lipídica
no plasma de pacientes.
1.1.7 Neuroinflamação
O termo neuroinflamação tem sido empregado na neurociência contemporânea, para
descrever o papel dos processos inflamatórios na fisiopatologia das doenças
neurodegenerativas (MAES, 2010).
A neuroinflamação pode ser caracterizada como resultado de um processo
inflamatório sistêmico associada à patogênese de diversos transtornos, dentre eles: a
depressão, Alzheimer, Parkinson, esquizofrenia, transtorno afetivo bipolar, autismo além de
esclerose lateral amiotrófica e esclerose múltipla (FAN et al., 2012).
O fato de diferentes doenças/transtornos está associado a neuroinflamação deve-se as
alterações patológicas que incluem: o aumento da permeabilidade da barreira
hemato-encefálica, o aumento da concentração de citocinas pró-inflamatórias, a ativação de células
Estudos têm demonstrado que a neuroinflamação contribui para a etiologia e o
agravamento de doenças neurodegenerativas e que os mediadores da inflamação, tais como a
interleucina-1β (IL-1β ), interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral-α (TNF-α ),
quimiocinas e radicais livres de oxigênio, são indutores das vias de sinalização em cascata
patológica para resultar nessas doenças (CHEN et al., 2008; HUANG et al., 2007;
GODBOUT et al., 2007; LEE et al., 2008).
Inicialmente o processo inflamatório envolve a síntese e liberação de mediadores
pró-inflamatórios, tais como citocinas e quimiocinas. Em nível periférico, a inflamação
geralmente envolve monócitos, neutrófilos e macrófagos, células elaboradas da cascata do
complemento, gerando espécies reativas de oxigénio (radicais livres) nos locais de infecção
ou ferimento. Dentro do sistema nervoso central (SNC), a microglia ativada e a astroglia, isto
é, as células da glia cerebral conhecidas por servirem como fonte e alvo de mediadores
pró-inflamatórios, assumem esse papel (CALLAGHAN, 2008).
A resposta inflamatória dominante para todos os tipos de injúrias que acometem o
SNC é a ativação da microglia e astroglia, muitas vezes referidas como gliose, nos locais de
lesão. Apesar de não terem sido ainda totalmente identificados, os mediadores de gliose,
citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas têm sido implicadas nesse processo. A microglia e
astroglia também são consideradas como uma fonte de mediadores inflamatórios e de
geradores de radicais livres, e assim chamadas lado escuro da glia, por causa do potencial que
estas respostas tem de danificar alvos neuronais (CZAPSKI et al., 2010).
Os efeitos prejudiciais da ativação glial podem ser desencadeados por respostas
aberrantes ou prolongadas ao insulto primário neural, ou até mesmo devido a sua ativação
como alvos diretos da doença, trauma ou lesões tóxicas do SNC (SRIRAM &
O’ CALLAGHAN, 2007). Assim, tem sido demonstrado que a microglia, em repouso ou
ativada, e os astrócitos são fontes de fatores tróficos, incluindo citocinas pró-inflamatórias,
que provavelmente são importantes na plasticidade, desenvolvimento e reparação do SNC.
Além disso, estão envolvidas em processos fisiológicos como dor, estresse e respostas
autonômicas e imune, processos-chave para a manutenção da homeostase normal
1.2 Óxido Nítrico (NO)
O óxido nítrico (NO) é um radical livre e gasoso em temperatura ambiente,
inorgânico, incolor, com cinco elétrons de nitrogênio e seis de oxigênio, sendo um desses
elétrons desemparelhado, altamente reativo devido à presença de radical livre. Quando
diluído, o NO tem uma meia vida de menos de 10 segundos devido à sua rápida oxidação a
nitrito e nitrato (SNYDER, BREDT, 1992). Desempenhou um papel fundamental nos
primeiros estágios da evolução, pois acreditasse que constituiu um mecanismo de defesa
fundamental para microorganismo primitivos (MONCADA et al., 1991).
Apesar de descoberto no século XVII por Jan B. Helmont e estudado por muitos anos
por Joseph Priestley o NO era considerado apenas como um poluente atmosférico diretamente
ligado a chuva ácida, a destruição da camada de ozônio e a formação de compostos
oncogênicos até o final da década de 70 (CHATKIN, 2000).
Furchgott e Zawadzki em 1980 descobriram uma das primeiras funções fisiológicas do
NO na vasculatura, quando demonstraram que a ação da acetilcolina sobre o receptor na
célula endotelial resulta na liberação de fatores que agem sobre as células musculares lisas da
parede arterial, produzindo a vasodilatação, que foi denominado como Fator de Relaxamento
Derivado do Endotélio (EDRF) (FURCHGOTT, 1981).
Palmer, Ferrige e Moncada descobriram em 1987 que EDRF e o NO exerciam as
mesmas funções biológicas: ambos eram instáveis, promoviam vasodilatação, suas ações
eram potencializadas pela superóxido dismutase (SOD) e neutralizadas pela hemoglobina, a
partir dessas evidências foi então confirmado que eram a mesma substância (PALMER et al.,
1987; IGNARRO et al., 1987).
Os estudos da via L-arginina/NO foi tema do Prêmio Nobel em Medicina em 1998,
mesmo após 20 anos NO, o mesmo vem sendo estudado extensivamente em vários processos
1.2.1 Biossíntese do NO
O NO é sintetizado a partir da L-arginina (L-arg), um aminoácido semi-essencial
utilizado no ciclo da uréia e síntese de poliamidas e creatinina e em diversas partes do
organismo. Por ser amplamente utilizada, há varias alternativas para produção da L-arginina,
tais como conversão de proteínas no rim para utilização no ciclo da uréia (síntese ocorre
parcialmente no fígado) e através da produção de critrulina (ocorre no epitélio intestino) para
conversão em L-arginina (nos macrófagos) (FLORA FILHO e ZILBERSTEIN, 2000).
Fig. 2: Esquema da absorção intestinal da argina. A arginina é absorvida diretamente ou pode ser transformada em ornitina e citrulina. A arginina absorvida diretamente vai apra o Ciclo da uréia. A citrulina é transportada para os rins onde é substrato da neosíntese de arginina. Em algumas células, como macrófagos, a citrulina é transformada em arginina (FLORA FILHO e ZILBERSTEIN, 2000)
Na reação química de síntese do NO, a L-arg através da ação de Óxido Nítrico
Sintases (NOS), catalisam uma série de eventos óxido-redutivos, sendo inicialmente a L-arg
oxidada pelo intermediário N-hidrox-arginina (NOH-arg), que é convertido em
L-citrulina (L-cit) e NO. Os passos da reação requerem a presença de fosfato de
flavinas e bioproteínas como cofatores, para se ligarem a sítios específicos das enzimas no
processo de transferência de elétrons (BARRETO et al., 2005).
Fig. 3: Síntese de NO e as vias de sinalização (TONELLI et al., 2013)
Os estímulos fisiológicos para a produção de NO ainda não são completamente
entendidos, no entanto, o fluxo pulsátil e o estresse de cisalhamento são os estímulos mais
importantes (POHL et al., 1986). Ainda precisa ser melhor compreendido o papel de outros
sistemas, como sistema nervoso autônomo ou outras substâncias vasoativas liberadas pelas
células endoteliais que induzem a produção de NO (MONCADA et al., 1991;
FORSTERMANN & SESSA, 2012 ). Acredita-se que o controle vasomotor do tônus vascular
dependente do NO é regulado localmente, portanto, pode ser um dos mais simples e mais
importantes mecanismos de adaptação no sistema cardiovascular (MONCADA et al., 1991;
JIN e LOCALZO, 2010).
1.2.2 Isoformas de NOS
A enzima é encontrada em três formas diferentes, das quais duas são constitutivas,
dependentes de cálcio e produzem NO em pequenas concentrações. A NOS contitutiva
(cNOS) foi designada de nNOS tem origem neuronal e função de neurotransmissor não
regula o fluxo sanguíneo gastrointestinal. Estas duas isoformas são dependentes de cálcio e
produzem baixos níveis de NO. Já a terceira isoforma é indutiva denominada de iNOS é
produzida em quantidades maiores e é regulada pelo estímulo inflamatório gerado por
lipopolissacarídeos de membrana bacteriana, endotoxinas, citocinas pró-inflamatórias em
humanos e em modelos animais de sepse (PALMER 1988; MONCADA et al., 1997; ZHOU e
ZHU, 2009; DUDZINSKI et al., 2006;).
Fig. 4: Funções das isoformas da NOS (FORSTERMANN & SESSA, 2012)
As isoformas da NOS podem ser inibidas por análogos da arginina N3 -do grupo
guanidino substituídos, como a NG-monometil-L-arginina (L-NMMA),
N-imino-etil-Lornitina (L-NIO), NG-amino-L-arginina (L-NAA), NG-nitro- L-arginina (L-NA) e o metil
éster correspondente, o NG-nitro-L-arginina-metil-éster (L-Name) (MORRIS e BILLIAR,
1994; ALDERTON et al., 2001; MONCADA et al., 1991). Além destes inibidores a
Aminoguanidina é capaz de inibir a NOS, apresentando seletividade para i-NOS (SZABÓ,
1995).
1.2.3 NO no Sistema Nervoso Central (SNC)
O NO é um mensageiro importante de vários sistemas biológicos, quando produzido
pelos nervos não-adrenérgicos não-colinérgicos (NANC) causam importante vasodilatação,
e sistema renina angiotensina tem grande importância para regulação do tônus vascular
(GALLEY e WEBSTER, 2004).
O NO é sintetizado de forma cálcio-dependente, principalmente nos eventos celulares
desencadeados por aminoácidos (ZHANG e SNYDER, 1995), tais como transmissão
sináptica anterógrada ou retrógrada (GARTHWAITE, 1991), além de processos de
plasticidade neural, (HÖLSCHER, 1997). O aumento da liberação de aminoácidos
excitatórios aumenta a síntese de NO, podendo causar crises convulsivas e induzir
neurotoxicidade (HECKER et al., 1995).
Quando o NO é sintetizado nos neurônios do SNC tem ação de neuromediador em
várias funções fisiológicas, dentre elas: termorregulação, coordenação entre as atividades
neuronais e fluxo sanguíneo, regulação da liberação de neurotransmissores em muitas áreas
do cérebro, formação de memória, potencialização e depressão de longo prazo (LTP e LTD)
no hipocampo e cerebelo, como mensageiro retrógrado que regula a eficácia sináptica no
SNC, modulação da nocicepção e ainda no controle do sono (HYNES, 1999).
A liberação excessiva do NO pelos neurônios no SNC implica fisiopatologicamente na
isquemia cerebral e em algumas doenças neurodegenerativas, por meio das espécies reativas
de nitrogênio (ERNs) (CALABRESE et al., 2007). No sistema nervoso periférico (SNP), o
NO atua como neurotransmissor NANC mediando diversas ações homeostáticas, dentre elas o
relaxamento do músculo liso nos tratos gastrointestinais e genitais (ALPIN et al., 1998).
Além do papel fisiológico como molécula mensageira no SNC e SNP, o NO é
citotóxico em concentrações altas (HUMPHIRIES e NEWHAM, 1998), atuando na defesa do
hospedeiro em reações imunológicas e nas reações inflamatórias (KEELY et al., 1998;
PARISE et al., 2000).
1.2.4 Moduladores da Via do NO
A parti de pesquisas, obteve-se um conhecimento amplo da participação da via NO
em processos fisiopatológicos, e o uso de mediadores da produção do NO passo a ser
ser obtido através de diversos tipos de substâncias, entre as quais os doadores de NO
(proporcionam NO em reações não mediadas por enzimas), os precursores do NO (substratos
que necessitam de uma reação enzimática e co-fatores para gerarem NO) e os inibidores da
produção de NO (inibem fundamentalmente a enzima NOS) (MARÍN e
RODRIGUES-MARTINEZ, 1997; ELAHI et al., 2009).
Os nitrovasodilatadores vêm sendo indicados em algumas condições clínicas como
síndrome coronariana aguda, insuficiência cardíaca congestiva, emergências hipertensivas e
hipertensão pulmonar; apesar de até pouco tempo a ação dessas susbstâncias não ser
completamente compreendida (MONCADA et al., 1991; MAYER e BERETTA, 2008).
Estudos demonstraram que os nitratos orgânicos induzíam a um aumento nos níveis de GMPc
em células musculares lisas (SCHULTZ et al., 1977; KATSUKI et al., 1977). O
nitroprussiato de sódio, conhecido por sua ação vasodilatadora, libera NO espontaneamente,
já os nitratos orgânicos, precisam de interação com outras substâncias e reações mais
complexas para liberar o NO (MONCADA et al., 1991; MAYER e BERETTA, 2008).
Estudos sugerem que o NO é a molécula efetora final comum de todos os nitrovasodilatadores
que ativam a GCs (MONCADA et al., 1991).
Podemos classificar os nitrovasodilatadores como: nitratos orgânicos, nitritos
orgânicos, compostos nitrosos inorgânicos, sidnoniminas e S-nitrosotióis (MONCADA e
HIGGS, 1995), vale ressaltar que todos esses compostos são doadores de NO, agindo como
pró-drogas, exercendo o seu efeito através da biotransformação nãoenzimática em NO
(MONCADA e HIGGS, 1995). A vasodilatação no leito arterial e venosos é a principal ação
dessas substâncias (MARÍN e RODRIGUESMARTINEZ, 1997; MAYER e BERETTA,
2008).
A L-arginina um aminoácido essencial para o crescimento e desenvolvimento serve de
substrato para diferentes enzimas, como arginase, NOS e argininadecarboxilase (NAKAKI e
KATO, 1994), sendo também um precursor do NO através da via da NOS ou da via da
arginina-carboxilase, que catalisam a transformação de Larginina em agmatina nas células
endoteliais, pruduzindo assim um efeito relaxante (DIOGUARDI, 2011). A administração de
L-arginina provoca hipotensão em seres humanos sadios, devido à estimulação da produção
L-arginina pode reduzir os níveis de pressão arterial e melhorar o relaxamento dependente do
endotélio (MARÍN e RODRIGUES-MARTINEZ, 1997).
Estudos mostram que o NO pode ser igualmente importante na expressão de
comportamentos inatos em roedores, a administração de L-arginina ou de inibidores da NOS
(Nω -nitro-L-arginina, L-NOARG, e L-N-nitro-L-arginina-metil-ester, L-NAME) interferiu na
ingestão de alimentos (MORLEY e FOOD, 1991) e no comportamento sexual de ratos. A
ansiedade reduzida e prejuízo do aprendizado e memória foi observado em animais
“knockout” para NOS1 (WULTSCH et al., 2007), sendo confirmado pela injeção de
inibidores da NOS e do análogo de GMPc, a 8-BR-GMPc, no núcleo dorsal da rafe (SPIACCI
et al., 2008).
Alguns análogos do aminoácido L-arginina agem principalmente na inibição
competitiva pela NOS, tendo como principal consequência a diminuição na produção de NO
pelos diferentes sub-tipos de NOS (LUCAS; RHODEN, 1999). Os inibidores da NOS têm
grande utilidade, pois ajudam a esclarecer as funções da via L-arginina/NO com grande
potencial clínico, pois parecem ser novas opções terapêuticas para diversas situações
patológicas.
O derivado da guanidina dimetil-guanidina foi utilizada como possível inibidor da
NOS, o mesmo atenuou a expressão da cNOS, enquanto que a diaminoguanidina e a
aminoguanidina inibiram a iNOS., no entanto, não se sabe se esses compostos são
competitivos, não-competitivos ou inibidores irreversíveis da NOS (HASAN et al., 1993).
Alguns inibidores da protease sérica, foram capazes de reduzir a iNOS induzida por
interferon e LPS (HASAN et al., 1993). Em estudos in vitro o L-NMMA se mostrou como
um inibidor competitivo da NOS (PALMER; MONCADA, 1989), sendo capaz de induzir a
constrição vascular dependente do endotélio em outros estudos in vivo (PALMER et al.,
1988), como também inibiu o relaxamento dependente do endotélio induzido por acetilcolina
no estudo realizado por Rees et al. (1989).
Gardiner et al. (1990) em seu estudo experimental também demonstrou que a
administração de LNMMA e não de D-monometil-L-arginina (D-NMMA) induz a um
induzido pelo L-NMMA foi acompanhado por aumento na resistência vascular periférica e
visceral. Na pesquisa realizada por Vallance et al. (1989) demonstrou o mesmo efeito.
Existem diferentes inibidores da NOS descritos na literatura, sendo os mais citados
L-NMMA, L-NA e seu metil-éster, o L-NAME, e a aminoguanidina (ALDERTON et al., 2001).
O inibidor L-NAME necessita de hidrólise do radical metiléster para se tornar o inibidor
funcional L-NA, para agir como forma seletiva das enzimas nNOS e eNOS (GRIFFITH;
KILBOURN, 1996), já o L-NMMA inibe de forma não-seletiva as isoformas iNOS, nNOS e
eNOS e a aminoguanidina é um inibidor altamente parcial da iNOS (ALDERTON et al.,
2001).
Alguns estudos descrevem as alterações do NO, tanto por aumentar quanto por
diminuir comportamentos relacionados à ansiedade. A administração sistêmica de L-NAME
aumentou o nível de ansiedade no teste de labirinto em cruz elevado (LCE) (CZECH et al.
2003). O tratamento sistêmico administrado de forma aguda (GUIMARÃES et al. 1994) e
sub-crônica (DUNN e cols., 1998) com inibidores da enzima NOS, aumentou o tempo de
exploração dos animais aos braços abertos do LCE.
A contribuição via do NO nos transtornos psiquiátricos precisa ser estudada. Isso
significa que existem na literatura dados contraditórios em relação ao NO e as alterações
comportamentais (DEL BEL et al. 2005).
1.2.5 NO e Depressão
O papel do NO na fisiopatologia da depressão vem sendo amplamente estudado
atualmente. Em 1996 Finkel et al., relataram em seu estudo clínico que a paroxetina um
inibidor seletivo da recaptação de serotonina (ISRS) é também um inibidor da NOS, vale
ressaltar que esses pesquisadores comprovaram suas evidências clínicas através de cultura de
células. Para DHIR e KULKARNI (2011), apesar da disponibilidade de inúmeras drogas
antidepressivas com distintos mecanismos de ação, um número considerável de pacientes
acometidos por esse distúrbio apresentam resistência a essas drogas, fazendo-se necessárias
O bloqueio da NOS no cérebro pode ter uma ação antidepressiva, nos sugerindo uma
relação do NO endógeno na fisiopatologia da depressão grave (JOCA & GUIMARÃES,
2005). Alguns inibidores de NOS como o L-NAME (inibidor não seletivo de NOS) e
7-nitroindazole (7-NI, um inibidor seletivo da nNOS) reduzem o período de imobilidade dos
camundongos submetidos ao modelo de comportamento tipo depressivo, no teste do nado
forçado (YILDIZ et al., 2000; JOCA & GUIMARÃES, 2005) . O inibidor da NOS 1 [2
-(trifluorometil) fenil] imidazol (TRIM) demonstrou ação protetora no modelo experimental de
estresse crônico em ratos (MUTLU et al., 2009).
Estudos em animais indicaram que o NO, através da modulação dos níveis de
monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) produziu comportameto depressivo (KASTER et
al., 2005). Wong et al. (2005) demonstram que os fármacos que afetam a enzima fosfodiesterase (PDE) influenciam nas funções de cGMP, vale ressaltar que cGMP é degradada em GMP é degradada, com a ajuda da PDE, nos sugerindo que fármacos que atuam
nessa via poderiam úteis para o tratamento da depressão.
A venlafaxina é um potente antidepressivo inibidor seletivo da recaptação da
serotonina e norepinefrina (REDROBE et al., 1998). O L-NAME e azul de metileno
(inibindo a enzima guanilato ciclase) potencializaram a ação da venlafaxina, diminuindo o
tempo de imobilidade dos camundongos no teste do nado forçado, já a L-arginina (precursor
imediato do NO) bloqueou significativamente o efeito protetor da venlafaxina (KUMEL et al.,
2010).
Tem sido demonstrado que os inibidores na NOS podem ser tão eficazes quanto a
imipramina na redução do período de imobilidade no teste de natação forçada (HARKIN et
al., 1999). Através de análises neuroquímicas foi comprovado que a administração aguda de
L-NNA (inibidor da NOS) não interfere no metabolismo da dopamina, mas diminuiu
significativamente o volume de serotonina na região do córtex frontal no cérebro de ratos,
esse efeito foi semelhante ao da imipramina, no entanto, a administração crónica de L-NNA
produziu um aumento do metabolismo da dopamina nas mesmas áreas cerebrais
(KAROLEWICZ et al., 2001).
Os inibidores de NOS podem produzir um efeito anti-imobilidade nos modelos de
neurotransmissores. Além disso, a combinação de L-NNA com o hormônio melatonina
(N-acetil-5-metoxitriptamina) endógeno produziu efeito antidepressivo, comprovado através no
teste de nado forçado em ratos (ERGUN et al., 2007).
Alguns estudos sugerem um papel importante da via do NO e da l-arginina na
fisiopatologia da depressão (HARKIN et al., 2003; YILDIZ et al., 2000). No estudo realizado
por Zhang et al. (2013) o pré-tratamento com L-arginina, bloqueou os efeitos antidepressivos
da cetamina em ratos no nado forçado. Já a combinação de uma dose sub-anti-depressivo de
L-NAME e uma dose sub-anti-depressivo de cetamina produziram efeitos antidepressivos
sinérgicos.
Ergun et al. (2007) evideciaram que a L-arginina em três diferentes doses produziram
alterações diferentes no teste do nado forçado, na dose de 30 mg/kg a droga não apresentou
nenhuma alteração, a dose ligeiramente mais elevada de 100 mg/kg teve um efeito
anti-imobilidade e a dose bem mais elevada de 1000 mg/kg produziu um estado de tipo depressivo
nos animais. Segundo o mesmo autor o efeito pro-depressivo de L-arginina é invertido por
vários inibidores de NOS, tais como L-NNA e [1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-a]
quinoxalin-1-ona].
Os estudos nos sugerem que óxido nítrico desempenha um papel importante na
patogénese da depressão. Vários inibidores de NOS foram considerados agentes
antidepressivos potentes. No entanto, contrariamente a estas observações, há alguns estudos
demonstraram que a redução dos níveis de óxido nítrico em pacientes deprimidos por sua vez
podem contribuir para as alterações cardiovasculares como tais como hipertensão, espasmo da
artéria coronária, e agregação de plaquetas(PAUL & SKOLNICK, 2003). Para se avaliar a
razão de risco/benefício são necessárias evidências clínicas que comprovem não só a eficácia,
mas também relação de segurança antes de prescrever os medicamentos moduladores do
2 PERGUNTAS DE PARTIDA
1. Quais as alterações comportamentais e neuroquímicas desencadeadas
após 24 hs da administração sistêmica de Lipopolissacarídeo de
Escherichia coli?
2. Qual a influência do óxido nítrico na patogênese da depressão?
3 HIPÓTESES
1. A administração sistêmica de Lipopolissacarídeo em animais produz um
comportamento tipo depressivo após 24hs da sua administração.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar o papel da via do Óxido Nítrico (NO) em animais adultos submetidos ao
modelo de depressão induzida por Lipopolissacarideo (LPS), utilizando moduladores da via
do NO.
4.2 Objetivo específicos
1. Observar as alterações comportamentais em animais adultos submetidos ao modelo
depressão induzida por LPS utilizando os testes de inibição pré-pulso, nado forçado,
campo aberto e teste da sacarose;
2. Verificar as possíveis ações de drogas modulatoras do sistema nitrérgico, como
L-arginina, Sildenafil, L-NAME e aminoguanidina em animais submetidos ao modelo
de depressão por LPS;
3. Avaliar no hipocampo dos animais tratados os níveis de BDNF;
4. Dosar no hipocampo, córtex pré-frontal e corpo estriado os níveis da citocina IL-1β e
5 CAPÍTULO 1
ANTIDEPRESSANT-LIKE EFFECT OF NITRIC OXIDE SYNTHASE INHIBITORS AND SILDENAFIL AGAINST LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED
DEPRESSIVE-LIKE BEHAVIOR IN MICE
Paper Published to the European Journal of Neuroscience
Antidepressant-like effect of nitric oxide synthase inhibitors and sildenafil against lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice
Neuroscience, Volume 268, Issue null, Pages 236-246
Abstract
The involvement of NO in depression is important, but still controversial. Recently the
inflammatory hypothesis of depression has gained increasingly importance. To date there are
no studies evaluating the possible role of NO pathway on lipopolysaccharide (LPS)-induced
depressive-like symptoms. Thus, herein the following NO pathway modulating drugs were
intraperitoneally administered prior to LPS (0.5 mg/kg): aminoguanidine (75 mg/kg),
L-NAME (30 mg/kg), sildenafil (5 mg/kg) and L-arginine (150 mg/kg). Twenty-four hours after
LPS or saline Swiss mice were subjected to behavioral (open field, forced swimming test
-FST and prepulse inhibition of the startle - PPI) and neurochemical determinations (oxidative
stress parameters –GSH and lipid peroxidation, IL-1β and BDNF) in the hippocampus (HC),
prefrontal cortex (PFC) and striatum (ST), in order to evaluate the possible mechanisms
underlying the effects. Twenty four hours post LPS there was an increase in the immobility
time in the FST, decrease in PPI levels accompanied by a decrease in GSH levels and
increases in lipid peroxidation, IL-1β and BDNF levels. The administration of the nitric oxide
synthase inhibitors (NOS), L-NAME and aminoguanidine as well as sildenafil was able to
prevent the behavioral alterations induced by LPS. Likely these drugs prevented
neurochemical alterations with the exception of sildenafil and L-NAME that were not able to
prevent the increase in BDNF induced by LPS. The behavioral and neurochemical alterations
observed in the animals treated with the NOS inhibitors and sildenafil was similar to those
obtained with the antidepressant drug imipramine. The precursor of NO synthesis, L-arginine,
was not able to prevent the alterations induced by LPS. Taken together our results show that
NO pathway is important in the modulation of the depressive-symptoms induced by LPS.
1 Introduction
Major depression is a mental disorder characterized by: depressed mood, anhedonia,
loss of interest or pleasure in nearly all activities, pessimism, low self-esteem, which appear
frequently or combined (Holtzheimer & Nemeroff, 2006b). Remarkably, projections of future
mortality and disability related to depression revealed that this mental disorder is the second
leading cause of disability in the world, behind only cardiovascular diseases (Giunchedi et al.,
2013).
Currently, the treatment of major depression is effective in only 30% of patients (Rush
et al., 2012). Consequently, for a better outcome, the majority of these patients require a
therapy based on combination of antidepressant drugs or augmentation therapy to achieve an
optimal therapeutic response (Carvalho et al., 2013; Silva et al., 2013). Furthermore,
antidepressants present greater latency times for obtaining clinical benefit (between 3-5
weeks), and present side effects such as: loss of libido and weight gain, among others. Despite
the numerous available therapies a considerable number of patients do not present a remission
from their symptoms (Anderson, 2000; Holtzheimer & Nemeroff, 2006a) .
In this regard the identification of new neurobiological targets in major depression is a
priority area in research, leading to hopes of discovering antidepressants that act more
effectively and faster (Machado-Vieira et al., 2009; Rizvi & Kennedy, 2011). Based on this
premise the neurotrophic hypothesis of depression is gaining attention (Groves, 2007; Ota &
Duman, 2013). This hypothesis proposes that the brain and plasma levels of neurotrophins
(e.g., brain-derived neurotrophic factor - BDNF) in patients with major depression are lower
when compared with healthy subjects (Sen et al., 2008; Yu & Chen, 2011).
In addition, in the last two decades evidences indicate that depression is accompanied
by activation of the immune-inflammatory pathways (Maes et al., 1993; Maes, 1995; Seidel et
the outer membrane of Gram-negative bacteria and a potent stimulator of immune cells
(macrophages and monocytes) and glial cells triggering the release of various
pro-inflammatory cytokines and free radicals, is becoming a tool for the study of
neuroinflammatory mechanisms underlying various neuropsychiatric diseases (Tuin et al.,
2006). In this regard, there is considerable evidence that the administration of LPS, promotes
persistent effects on the behavior of mice triggering, among others, depressive-like behaviors
(Konsman et al., 2004; Dantzer et al., 2008; Leonard & Maes, 2012; Custodio et al., 2013a;
Ohgi et al., 2013).
In the last decade evidences for the involvement of nitric oxide (NO) in the
pathogenesis of depression have been demonstrated. One of this evidences point toward an
increased expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in the
hypothalamic-pituitary-adrenal axis after the exposure to stress (Yildiz et al., 2000; Joca & Guimaraes, 2006).
Furthermore, selective nNOS inhibitors such as 7-nitroindazole (7-NI) were demonstrated to
present antidepressant effects (Yildiz et al., 2000).
Although the NOS inhibitors are being considered as antidepressants (Yildiz et al.,
2000; Yazir et al., 2012), some studies have been demonstrating that depressed patients
present a reduction in NO levels, which in turn can contribute to cardiovascular disorders such
as hypertension, coronary artery spasm, and platelet aggregation (Paul & Skolnick, 2003). In
addition antidepressants such as paroxetine present nitric oxide synthase inhibitor effect
(Finkel et al., 1996).
In this regard we recently demonstrated that 24 h post-LPS administration, the
depressive-like behaviors induced by this endotoxin were accompanied by increases in IL-1β
content in the prefrontal cortex (PFC) and by decreases in nitrite levels in the hippocampus,
controversial since some evidences point toward increases and decreases in this gas as being
related to depressive behavior (Hu et al., 2012).
Thus, based on the fact that: i) depressive patients present abnormal serum NO levels;
ii) drugs that modulate NOS have shown interesting effects in animal models of depression
and iii) NO modulates immune-inflammatory pathways in the brain and hippocampal BDNF
synthesis (Zhou et al., 2007), the present study aimed to study the behavioral and
neurochemical changes triggered by the modulation of nitrergic pathway in animals subjected
to depressive-like symptoms induced by LPS.
2 Material e Methods 2.1 Animals
For the experiments Swiss adult male mice weighing 20-30 g were used. The animals
were housed in polycarbonate cages with food and water ad libitum from the Central Animal
Facility of the Federal University of Ceará (UFC), held a light / dark cycle of 12 he set in
groups. The experimental procedures were performed in the period from 8:00 to 17:00 h,
according to the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH, 2011) and the
Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). The research protocol was approved
by the local ethics committee of UFC.
2.2 Drugs
Were used lipopolysaccharide (LPS) of E. colli, species 055:B5, Aminoguanidine,
L-NAME (Nw-nitro-arginine methyl ester), L-arginine ((S)-2-Amino-5-guanidinopentanoic
acid)) (Sigma-Aldrich Corp.., St. Louis, USA) and Sildenafil citrate® (EMS Sigma Pharma,
2.3 Experimental Design
The LPS dosage was chosen based on a previous study that evaluated depressive-like
behavioral changes and neurochemical alterations in mice (Lejuez et al., 2011; Custodio et
al., 2013a; Ohgi et al., 2013). Animals were randomly divided into seven groups of eight
animals for each behavioral determination. The administration of the drugs was performed as
follows: Group 1: a single intraperitoneal injection of 0.5 mg/kg LPS dissolved in distilled
water; Group 2: a single administration of saline (0.9%) i.p. 30 minutes prior to LPS 0.5
mg/kg i.p.; Group 3: a single dose of imipramine 10 mg/kg i.p. , 30 minutes prior to LPS 0.5
mg / kg i.p.; Group 4: a single dose of Aminoguanidine 75 mg/kg i.p. (Montezuma et al.,
2012), 30 minutes before LPS 0.5 mg/kg i.p.; Group 5: a single dose of L-NAME
(Nw-nitro-arginine methyl ester – 30 mg/kg) (Heydarpour et al., 2013), 30 minutes prior to LPS 0.5
mg/kg i.p.; Group 6: a single dose of Sildenafil citrate 5 mg/kg i.p. (Ludka et al., 2013), 30
minutes before LPS 0.5 mg/ kg i.p.; Group 7: a single dose of L-arginine 150 mg/kg i.p
(Vasconcelos Rios et al., 2013), 30 minutes prior to LPS 0.5 mg/kg i.p. The doses were
chosen based on the studies evaluating the central effect of these drugs in mice shown in
parenthesis. Twenty-four hours after the administration of LPS or saline (control group) the
animals were subjected to behavioral tests. For this end, open field, forced swimming and
prepulse inhibition tests were performed in distinct animals. For neurochemical
determinations mice were sacrificed by cervical dislocation. The brain areas prefrontal cortex
(PFC), hippocampus (HC) and striatum (ST) were dissected and immediately stored at -80º C
until assayed.
2.4 Behavioral Tests
The test was adapted from the model initially proposed by Archer 1973 (Archer,
1973). The animals were individually subjected to analysis of locomotor capacity. The
experimental trial was conducted in a dark room with red light where the mice were
individually placed in a transparent acrylic box (80 x 80 x 30 cm) divided equally into 9
quadrants. Each animal was placed in the center of the experimental arrangement immediately
before the test and allowed to explore it for 5 min, 1 min of adaptation and 4 min of actual
evaluation. During this time, locomotor activity was observed (the number of times that the
animal invaded with all four legs of the fields in the arena) recorded as the total number of
squares traversed or crossed. The arena was cleaned with a 5% ethanol solution between each
test animal.
2.4.2 Forced swimming test (FST)
In this test, animals were subjected individually to the analysis of the depressant
status, based on a model adapted from Porsolt et al. at 1977 (Porsolt et al., 1977), in which
was quantified the immobility period, the greater this time, the lower the animal’ s stimulation
to escape the tube (Russell et al., 2008) during 6 minutes. Animals were placed individually
in an acrylic cylinder (25 cm high and 10 cm diameter) containing water at 25 ° C and a depth
of 8 cm, being unable to escape or touch the bottom of the cylinder. Twenty-four hours after
drug administration, animals underwent a 6-minute forced swim sessions to acclimate to the
scheduled test.
2.4.3 Evaluation of Pre-pulse inhibition (PPI)
Each mouse was placed in the startle chamber for 5 min to an acclimatization period
with a 68 dB noise. After this period, 10 startle pulses (120 dB, 40 ms duration) were taken
with an interval of 15 s to define the basic individual startle reactivity of the animal. Each
animation was then exposed to six periods without stimulation, six isolates startle pulses (120
to each prepulse intensity followed by a startle pulse of 120 dB after 80 ms. The percentage of
PPI induced by each prepulse was calculated according to the following formula: 100 x
(PP-PPP) / PP, PP being the mean startle amplitude followed by the startle pulse and PPP being
the mean startle response followed by the combination of a certain pre-pulse and the startle
pulse.
2.5 Neurochemical Determinations 2.5.1 Evaluation of GSH levels
Reduced glutathione levels were evaluated to estimate endogenous defenses against
oxidative stress. The method was based on Ellman’ s reagent (DTNB) reaction with free thiol
groups (Ellman, 1959). The brain areas were diluted in EDTA 0.02 M buffer (10% w/v) and
added to a 50 % trichloroacetic acid solution. After centrifugation (3,000 rpm/15 min), the
supernatant of the homogenate was collected and mixed with 0.4 M tris-HCl buffer, pH 8.9
and 0.01 M 5,5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid (DTNB). The resultant yellow color was
immediately read at 412 nm using a spectrophotometer (Beckman coulter UV/Visible).
Results were calculated based on a standard glutathione curve and expressed as ng of GSH/g
wet tissue.
2.5.2 Evaluation of TBARS levels
Lipid peroxides formation was analyzed by measuring the thiobarbituric-acid reacting
substances (TBARS) in the homogenates (Draper et al., 1993) as an index of ROS production.
The samples were mixed with 1 mL of trichloroacetic acid 10% (TCA) and 1 mL of
thiobarbituric acid 0.67 % (TBA), then heated in a boiling water bath for 15 minutes and
immediately kept cold in a bath of ice. Lipid peroxidation was assessed by the absorbance at
532 nm and expressed as µmol of malonaldehyde (MDA)/g tissue.
The brain areas, PFC, HC and ST were homogenized in 8 volumes of PBS buffer with
protease (EMD Biosciences) and phosphatase (Sigma-Aldrich) inhibitors and centrifuged
(10,000 rpm, 5 min). The concentration of the cytokines in 50 µL samples was determined by
immunoenzymatic assay - ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) according to the
manufacturer’ s protocol and expressed in pg/g tissue.
2.6 Statistical Analyses
For statistical analysis of the results ANOVA followed by Tukey's Multiple Comparison Test
were used. The computer program used was GraphPad Prism 5.0. The criterion of
significance was p < 0.05.
3 Results
For the assessment of depressive-like behavior immobility time in the FST was
recorded 24 h after LPS administration (Fig. 1A). The results showed that the administration
of LPS significantly increased immobility time [F (6,48)= 33.45, P <0.0001] when compared
to control animals. The same increase in immobility time occurred in the animals treated with
the NO donor, L-Arginine [P <0.001]. On the other hand, a significant reduction in the
immobility time was observed in the animals pretreated with the selective inducible nitric
oxide inhibitor (iNOS), aminoguanidine, and the tricyclic antidepressant imipramine [P
<0.05] when compared to control and LPS treated groups. The prior administration of
sildenafil, a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, and L-NAME, a NOS inhibitor,
significantly decreased the immobility time when compared to LPS group [P <0.0001].
Locomotor activity measured by the number of crossings in the open field was unchanged in
presented an augmentation of this behavioral parameter [F (6,48) = 22.90, P <0.0001] (Fig.
1B).
The analysis of PPI data (Fig. 2) by two-way ANOVA revealed a significant main
effect of "experimental groups" (df = 37, F = 19.94 P = 0.0001). It was observed a significant
decrease of PPI levels 24 h after LPS administration in the prepulse intensities of 70 (P
<0.05), 75 (P <0.05) and 80 dB (P <0.05) compared to animals control. The administration of
imipramine, L-arginine, sildenafil, L-NAME and aminoguanidine was able to prevent the
reduction of PPI levels caused by the systemic administration of LPS.
The evaluation of GSH levels (Fig. 3) showed a reduction of its content in all brain
areas investigated, namely, PFC, HC, and ST of animals treated with LPS when compared to
controls [F (6,120) = 4.238 P <0.0001]. This reduction was maintained in the PFC and
hippocampus of animals pretreatment with L-arginine when compared to LPS.
Aminoguanidine was able to significantly increase GSH levels in the PFC when compared to
LPS treated animals. Imipramine and sildenafil significantly prevented the decrease in GSH
levels induced by LPS in the HC.
LPS administration significantly increased lipid peroxidation 24 h after LPS
administration as compared to control animals (Fig. 4). The administration of imipramine,
L-arginine, sildenafil, L-NAME and aminoguanidine significantly decreased the level of lipid
peroxidation when compared to LPS treated animals in all brain areas studied [F (20,147)=
34.41, P <0.0001].
Since depressive-like behavioral changes induced by LPS are related to the induction
of proinflammatory cytokines expression in the brain the levels of IL-1β were measured (Fig
5). LPS administration caused a significant increase in the content of IL-1β when compared to
control animals in the prefrontal cortex [F (6,50)= 6.150, P <0.0001], hippocampus [F (6,48)=
