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CAROLINA CARVALHO DE OLIVEIRA SANTOS
EXPRESSÃO E PRODUÇÃO DE IL-6, TNF-
α E
MCP-1 POR FIBROBLASTOS (3T3) E
ODONTOBLASTOS (MDPC-23) APÓS
EXPOSIÇÃO A BACTÉRIAS ORAIS.
Piracicaba
2015
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Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
CAROLINA CARVALHO DE OLIVEIRA SANTOS
EXPRESSÃO E PRODUÇÃO DE IL-6, TNF-
α E
MCP-1 POR FIBROBLASTOS (3T3) E
ODONTOBLASTOS (MDPC-23) APÓS
EXPOSIÇÃO A BACTÉRIAS ORAIS.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia
Piracicaba
2015
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Clínica Odontológica, na Área de Endodontia.
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Carolina Carvalho de Oliveira Santos e orientada pelo Prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia ___________________________________
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Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Santos, Carolina Carvalho de Oliveira,
Sa59e SanExpressão e produção de IL-6, TNF-α e MCP-1 por fibroblastos (3T3) e odontoblastos (MDPC-23) após exposição a bactérias orais / Carolina Carvalho de Oliveira Santos. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2015.
SanOrientador: Alexandre Augusto Zaia.
SanTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
San1. Fibroblastos. 2. Odontoblastos. 3. Citocinas. 4. Bactérias. I. Zaia, Alexandre Augusto,1968-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: IL-6, TNF-α and MCP-1 production and expression by fibroblasts
(3T3) and odontoblasts (MDPC-23) after oral bacteria exposure
Palavras-chave em inglês:
Fibroblasts Odontoblasts Cytokines Bacteria
Área de concentração: Endodontia
Titulação: Doutora em Clínica Odontológica Banca examinadora:
Alexandre Augusto Zaia [Orientador] Ericka Tavares Pinheiro
Flaviana Bombarda de Andrade José Flávio Affonso de Almeida Caio Cezar Randi Ferraz
Data de defesa: 28-05-2015
Programa de Pós-Graduação: Clínica Odontológica
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
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RESUMO
A polpa dentária contém uma heterogeneidade de células, dentre elas destacam-se os fibroblastos e odontoblastos. Quando este tecido é agredido por micro-organismos ou seus bioprodutos, fibroblastos e odontoblastos secretam diversas citocinas inflamatórias para ativação do sistema imune, dentre estas TNF-α, IL-6 e MCP-1. Este estudo avaliou a expressão gênica e a produção de citocinas inflamatórias após o contato in vitro das espécies Sreptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Enterococcus faecalis e seus bioprodutos com odontoblastos e fibroblastos. A expressão gênica foi avaliada por RT-qPCR e as proteínas foram quantificadas por meio de citometria de fluxo, tipo CBA, nos períodos de 4, 8 e 24 horas. As bactérias estudadas promoveram sensibilização das células para expressão e produção das citocinas IL-6, TNF-α, e MCP-1 principalmente nas primeiras 8 horas de contato. Tanto o contato direto com as bactérias como o contato com seus bioprodutos resultaram em estímulo para as células, contudo, o contato direto com as bactérias S. mutans e E. faecalis se mostrou mais eficiente para a estimulação de expressão e produção de citocinas. Por outro lado, o contato indireto com P. gingivalis mostrou ser mais efetivo para estimular a produção das citocinas. Desta forma, pode-se concluir que odontoblastos e fibroblastos são capazes de expressar e produzir citocinas pró-inflamatórias a partir de diferentes contatos quando estimulados por tipos bacterianos distintos.
PALAVRAS-CHAVE: Fibroblastos; Odontoblastos; Citocinas; E. faecalis; S. mutans; P. gingivalis.
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ABSTRACT
Dental pulp contains a heterogeneity of cells in its composition, among them stand out from fibroblasts and odontoblasts. When this tissue is attacked by bacteria or their by-products, fibroblasts and odontoblasts can secrete several inflammatory cytokines in order to attract and activate immune system to contain infectious agents. TNF-α, IL-6 and MCP-1 are proteins secreted by fibroblasts and odontoblasts mainly involved in the origin and activation of the inflammatory process. This study aimed to evaluate gene expression and secretion of inflammatory cytokines after in vitro contact of bacteria Sreptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Enterococcus. faecalis and its by-products with odontoblasts and fibroblasts. The proteins were quantified by flow cytometry type CBA and gene expression by Real Time - PCR in periods of 4, 8 and 24 hours. The results showed that the studied bacteria promoted sensitizing cells for expression and production of the cytokines IL-6, TNF-α, MCP-1, particularly during the first 8 hours of contact. Both direct contact with bacterias or their by-products resulting in stimulation to the cells, however, direct contact with the bacteria S. mutans and E. faecalis was more efficient for stimulating expression and cytokine production. On the other hand, the indirect contact with P. gingivalis shown to be more effective to stimulate the production of cytokines. Thus, we may conclude that fibroblasts and odontoblasts are able to express and produce proinflammatory cytokines from different contacts when stimulated by different bacterial types.
KEY WORDS: Fibroblasts. Odontoblasts. Cytokines. E. faecalis; S. mutans; P. gingivalis.
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SUMÁRIO
DEDICAT
ÓRIA
xiii
AGRADECIMENTOS
xv
1 INTRODU
ÇÃO
1
2 REVIS
ÃO DA LITERATURA
4
3 PROPOSI
ÇÃO
16
4 MATERIAL E M
ÉTODOS
17
5 RESULTADOS
27
6 DISCUSS
ÃO
45
7 CONCLUS
ÃO
50
REFER
ÊNCIAS
51
xiii
DEDICATÓRIA
A minha mãe Ozelia, exemplo de força e perseverança, que tem sido minha luz nos momentos de sombras me guiando para as conquistas. Você é essencial
em todos os momentos da minha vida!
Ao meu pai Carlos que nunca mediu esforços para que meus sonhos se tornassem realidade. Espero que a conclusão de mais esta etapa seja motivo
xv
AGRADECIMENTOS
A Deus pela presença em minha vida, pela força nos momentos difíceis e pelas pessoas que colocou em meu caminho para que eu pudesse concluir esta etapa.
Aos meus pais pela constante dedicação e amor incondicional. O apoio de vocês às minhas decisões e palavras de incentivo repletas de amor foram essenciais para que eu chegasse até aqui.
A minha família, em especial a minha irmã Mariana, pelo incentivo e atenção nos momentos de folga, não se distanciando apesar da distância.
Ao Thiago Fonseca por me ensinar que o amor está presente em pequenas atitudes e pela nossa cumplicidade. Agradeço pela ajuda nas tarefas acadêmicas e no convívio do dia a dia. Conseguimos driblar a distância e posso dizer que se venci esta etapa é porque você estava ao meu lado.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas, nas pessoas do diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques e do diretor associado Prof. Dr. Francisco Haiter Neto
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, Coordenadora Geral dos Cursos de Pós-Graduação e à Profa. Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz, Coordenadora do Curso de Pós- Graduação em Clínica Odontológica.
Ao Prof. Dr. José Flávio Affonso de Almeida, responsável pelo Departamento de Odontologia Restauradora da FOP/UNICAMP, pela oportunidade da realização deste trabalho.
Ao meu orientador Prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia pelos ensinamentos recebidos durante estes últimos anos. Sua compreensão e incentivo foram essenciais para que eu vislumbrasse a carreira acadêmica e fosse atrás dos meus objetivos.
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Aos professores da Área de Endodontia da FOP-UNICAMP, Dr. Caio Cézar Randi Ferraz, Dr. José Flávio Affonso de Almeida , Dra. Brenda P. F. A. Gomes que se fizeram presentes em vários momentos desta jornada, nas aulas e clínicas, onde pude obter ensinamentos valiosos não só quanto a metodologias e protocolos clínicos, mas me fizeram ver a Endodontia de outra forma.
Aos professores Dr. Edgar Graner e Dr. Sérgio Line que disponibilizaram a estrutura necessária para a realização das metodologias escolhidas.
Aos professores Dr, Rafael Nóbrega Stipp, Dr. Marcos Roberto dos Santos Frozoni e Dr. Marcelo Rocha Marques pelas valiosas contribuições durante o processo de qualificação.
Aos funcionários da FOP-UNICAMP, em especial à Sra. Ana Cristina do Amaral Godoy, Sra. Geovania Caldas de Almeida, Sra. Maria Helidia Neves Pereira, Sr. Fábio Téo, Sra. Flávia Mariano e Sr. Maicon Ricardo Pacini pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Endodontia: Fernanda Graziela Corrêa Signoretti , Giselle Priscilla Cruz Abi Rached , Maria Rachel Figueiredo Penalva Monteiro, Ana Carolina Pimentel Corrêa, Aniele Carvalho Lacerda, Ariane Cássia Salustiano Marinho, Cimara Barroso Braga Brum, Maíra do Prado, Cláudia Leal Sampaio Suzuki, Daniel Rodrigo Herrera Morante, Daniela Cristina Miyagaki, Emmanuel João Nogueira Leal da Silva, Érika Manuela Astéria Clavijo, Carlos Augusto Pantoja, Felipe Nogueira Anacleto, Juliana Yuri Nagata, Aline Cristine, Letícia Nóbrega, Frederico Martinho, Marcos Sérgio Endo, Carlos Meloni, Thais Mageste Duque, Thiago Farias Rocha Lima e Tiago Pereira da Rosa pelo companheirismo e convivência prazerosa durante estes anos.
Aos colegas Luciana Yamamoto, Gustavo, Luís, Emmanuel Nogueira e Andréa Bufalino pela disponibilidade em ajudar durante o desenvolvimento deste trabalho.
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À Faculdade Leão Sampaio, nas pessoas do coordenador Prof. Rodrigo Dutra Murrer e coordenador associado Prof. Thyago Leite Campos Araujo, pelo apoio durante a fase final do Doutorado e compreensão das ausências.
Aos colegas professores do curso de Odontologia da Faculdade Leão Sampaio: João Paulo Martins de Lima, Catarina Martins Tahim, Luciana Mara Araujo, Tiago Norões Gomes, Claudia Leal Suzuki, Simone Scandiuzzi Francisco, Romildo Bringel, Ivo Cavalcante Pita Neto, Manoela Capla Vasconcelos da Silva, Fernando Gonçalves Rodrigues, Larissa Sgarbosa Araujo, Cássio Rocha Medeiros, Diala de Sousa Feitosa, Isabela Barbosa de Matos, Carlos Eduardo de Oliveira Soares, Mário Correia de Oliveira Neto, Mariana Vasconcelos Guimarães, Augusto Henrique Oliveira, Francisco Sandrini, Regiane Cristina do Amaral, Vilson Rocha de Alencar, Raquel Vieira de Andrade, Evamiris Vasques Landim e Mirella Cavalcante Esmeraldo pelo incentivo e compreensão durante minhas ausências, além do convívio agradável durante este último ano.
À FAPESP pela Bolsa de Doutorado (processo 2011/08360-0) e pelo Auxílio à Pesquisa (processo 2012/09961-0) concedidos.
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1 INTRODUÇÃO
A polpa dentária saudável contém populações celulares heterogêneas onde a maioria das células corresponde a fibroblastos, uma quantidade menor é formada por células inflamatórias e imunológicas (células dendríticas, histiócitos/macrófagos, linfócitos T), miofibroblastos e células progenitoras latentes, a maioria envolvida na auto-renovação, além de terminações nervosas e células endoteliais e perivasculares (Slutzky-Goldberg et al., 2004). O elemento dental é alvo de um significativo número de agentes bacterianos que iniciam o desenvolvimento de lesões cariosas. Bactérias cariogênicas desencadeiam eventos inflamatórios e imunológicos na polpa dentária subjacente através da difusão de bioprodutos pelos túbulos dentinários. A invasão de micro-organismos e seus bioprodutos podem resultar em pulpite irreversível, necrose pulpar, e doença periapical (Heyeraas e Berggreen, 1999; Love e Jenkinson, 2002).
Odontoblastos representam a primeira linha de defesa enfrentada pelas bactérias que penetram na dentina (Durand et al., 2006; Veerayutthwilai et al., 2007). Dados recentes sugerem que odontoblastos estão envolvidos na iniciação, desenvolvimento e manutenção das respostas inflamatórias/imunológicas da polpa desencadeadas por bactérias orais. Diversos trabalhos mostram que os odontoblastos podem mediar a resposta inflamatória à cárie diretamente através da produção de peptídeos antimicrobianos, citocinas e, indiretamente, através da ativação de células imunológicas (Durand et al., 2006; Veerayutthwilai et al., 2007; Staquet et al., 2008).
Na cárie dental podem ser encontradas populações de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As bactérias Gram-positivas (gêneros
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Streptococcus e Lactobacillus) são mais comuns na microbiota e detectáveis em cavidades de profundidade média ou rasas ou ainda na parte mais exterior de túbulos dentinários acometidos. Já as bactérias Gram-negativas (gêneros Fusobacterium, Porphyromonas e Prevotella) são encontradas em cavidades de cárie profundas e em canais radiculares infectados por apresentarem baixo requerimento gasoso, sendo associadas com inflamação pulpar e perirradicular (Sundqvist et al., 1998; Love e Jenkinson, 2002). Em casos de falha no tratamento endodôntico primário ou recontaminação do sistema de canais radiculares, a bactéria mais comumente encontrada é Enterococcus faecalis, desempenhando funções na etiologia do insucesso endodôntico e persistência de patologias perirradiculares (Siqueira et al., 2014). Estes micro-organismos e seus bioprodutos são capazes de estimular o sistema imunológico que recrutará células imunocompetentes no intuito de controlar e eliminar o agente infeccioso (Matsushima et al., 1998; Tokuda et al., 2001).
As citocinas secretadas pelas células do sistema imune incluem TNF-α, IL-1, IL-12, IL-18, IFN-γ, IL-6 e IL-10 (Vilcek e Feldmann, 2004). Estudos têm mostrado aumento da expressão de várias citocinas em polpas e/ou por odontoblastos afetados por cáries incluindo fator de necrose tumoral (TNF-α), IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-11 e IFN-γ. TNF-α estimula a produção de IL -1 e afeta a estimulação da própria síntese em um feedback positivo (de Brito et al., 2012). Tal citocina pró-inflamatória manifesta efeitos na reabsorção osteoclástica e também aumenta a resposta vascular local, além de estimular linfócitos em sua capacidade de adesão às células endoteliais e aumentar suas capacidades de fagocitose e quimiotaxia (Danin et al., 2000). IL-6 é uma citocina sintetizada em resposta a estímulos como infecção ou traumas, além disso é capaz de estimular vários processos biológicos como produção de anticorpos, ativação de células T, indução de angiogênese e permeabilidade vascular (Ridker et al., 1997). Além disso, altos níveis de IL-6 foram
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identificados em polpas inflamadas e lesões periapicais (Barkhordar et al., 1999).
Citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL1-β não são normalmente encontradas em polpas dentárias humanas saudáveis, mas os níveis de expressão ficam aumentados em polpas inflamadas ou após estimulação de odontoblastos com LPS (Pezelj-Ribaric et al., 2002; Zehnder et al., 2003; Kokkas et al., 2007; Veerayutthwilai et al., 2007). A literatura mostra que bactérias, como por exemplo. P. gingivalis, são capazes de estimular a produção de citocinas como MCP-1 e TNF-α por células epiteliais, fibroblastos, células endoteliais e macrófagos. (Jiang e Graves, 1999; Steffen et al., 2000).
A importância do conhecimento dos mecanismos inflamatórios do tecido pulpar consiste na melhor compreensão pela Endodontia dos eventos imunopatológicos envolvidos na doença pulpar e pode colaborar para a melhoria do diagnóstico e da terapêutica, interferindo, assim, no sucesso do tratamento endodôntico.
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2 REVIS
ÃO DA LITERATURA
2.1 POLPA DENTÁRIAA polpa dentária é constituída de tecido conjuntivo frouxo derivado das células da crista neural (ectomesênquima) e encontra-se localizada no interior da câmara pulpar e dos canais radiculares. A polpa contém células que desempenham variadas funções odontogênicas, nutritivas, sensoriais e defensivas, as quais mantêm sua vitalidade durante a manutenção da homeostasia (Nanci, 2003). A distribuição celular do tecido pulpar é bastante peculiar quando comparada aos demais tecidos conjuntivos. A camada de odontoblastos circunda a periferia do tecido pulpar com seu corpo celular na polpa e seus prolongamentos no interior dos túbulos dentinários (Sasaki e Garant, 1996; Goldberg e Smith, 2004). Imediatamente abaixo dos odontoblastos, encontra-se a área livre de células, denominada zona de Weil, constituída por fibras neurais não mielinizadas, capilares e processos de fibroblastos. Mais centralmente à polpa situa-se a zona rica em células, constituída de fibroblastos, células mesenquimais indiferenciadas, células de defesa (macrófagos, linfócitos), capilares e fibras nervosas (Nanci, 2003).
Os odontoblastos são células especializadas que se originam da crista neural e se diferenciam em células responsáveis pela organização e regulação da síntese de matriz dentinária (Love e Jenkinson, 2002). Estas células, quando maduras, adquirem uma morfologia específica com processos celulares longos que são localizados no interior dos túbulos dentinários e os corpos celulares na periferia da polpa (Linsuwanont et al., 2007). Assim, os odontoblastos se estabelecem na interface do complexo dentina-polpa onde se organizam como células em paliçadas, fornecendo uma barreira entre a dentina e o tecido pulpar. As células permanecem conectadas pelo seu polo apical por numerosos complexos juncionais (por justaposição e desmossomos) formando uma
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barreira que pode controlar a relação entre a dentina e a polpa em condições fisiológicas e patológicas (Linsuwanont et al., 2007). O corpo celular está em íntimo contato com as terminações nervosas A-delta e C da polpa dentária (Byers e Narhi, 1999).
As funções dos odontoblastos não estão ligadas somente à dentinogênese, formação e manutenção de dentina, mas também com a capacidade de perceber estímulos nocivos no tecido dentinário (Veerayutthwilai et al., 2007; Horst et al., 2011). A formação dentinária pode ser dividida em três momentos: a dentina primária é formada durante o desenvolvimento dental. Seu volume e conformação refletem a forma do dente com variações de tamanho e forma de acordo com a localização do dente no arco (Marshall et al., 1997). A dentina secundária se desenvolve após a formação completa da raiz, representa uma lenta e contínua deposição de dentina pelos odontoblastos que ocorre no teto e no assoalho da câmara pulpar (ocorre ao longo da vida do indivíduo) (Nanci, 2003). A dentina terciária é depositada em sítios específicos em resposta às injúrias sofridas pelo complexo dentino-pulpar. A proporção dessa deposição está diretamente relacionada ao grau da agressão sofrida (Nanci, 2003). Esta camada reacional apresenta muitas similaridades anatômicas, bioquímicas e funcionais com as dentinas primária e secundária e contribui para a proteção do tecido pulpar (Bleicher, 2014).
Os odontoblastos são as primeiras células encontradas pelas bactérias invasoras da polpa. Estas células são imunocompetentes e capazes de organizar uma resposta inflamatória contra o agente agressor (Durand et al., 2006; Veerayutthwilai et al., 2007). Além disso, são capazes de identificar a infecção da dentina em estágios iniciais devido à difusão de componentes bacterianos e seus metabólitos dentro dos túbulos dentinários (Hahn e Liewehr, 2007). Em resposta a estes estímulos, elas liberam fatores de sinalização
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autócrinos e parácrinos como citocinas, quimiocinas e peptídeos antibacterianos contra os micro-organismos invasores (Cooper et al., 2014).
Em uma avaliação por imunofluorescência, foi demonstrado que odontoblastos expressaram Toll-like receptor-2 (TLR2) e Toll-like receptor-4 (TLR4) quando estimulados por LPS e lipopetídeos, sugerindo que estas células podem modular a resposta inicial às bactérias invasoras (Veerayutthwilai et al., 2007). Além disso, odontoblastos expressaram, entre outras proteínas, IL1-β e TNF-α, demonstrando a habilidade destas células em atrair neutrófilos, células dendríticas e células T de memória.
Os fibroblastos são as mais numerosas células do tecido pulpar (Nanci, 2003). Atuam na formação da matriz extracelular, produzindo uma vasta gama de componentes desta estrutura como colágeno, proteoglicanas e fibronectina. São também responsáveis por degradar elementos extracelulares, sendo essenciais para a remodelação do tecido pulpar em condições normais ou patológicas (Pashley, 1996; Nanci, 2003; Kanta, 2015). Em resposta a estímulos agressores no tecido pulpar como calor, trauma, e bioprodutos bacterianos, os fibroblastos possuem a capacidade de aumentar a atividade de remodelação do tecido conjuntivo, evento fundamental para oportunizar o reparo pulpar (Chan et al., 2005). Quando alcançados pelas bactérias e seus bioprodutos, os fibroblastos também são capazes de liberar citocinas e mediadores inflamatórios com atuação contra os micro-organismos invasores (Sipert et al., 2010). A produção de citocinas por estas células sugere seu importante papel na formação do infiltrado inflamatório e tráfego celular durante o reparo pulpar (Sipert et al., 2014).
Jönsson e colaboradores (2008) demonstraram que fibroblastos do ligamento periodontal produziram IL-6 e MCP-1 quando expostos a LPS, com pico de identificação entre 24 e 72 horas (Jonsson et al., 2008). Em outro
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estudo, Ogura e colaboradores (1994) demonstraram que LPS proveniente de Porphyromonas endodontalis isoladas de canais radiculares infectados induziu produção de IL-6 por fibroblastos do ligamento periodontal (Ogura et al., 1994), e ainda, que Porphyromonas gingivalis induziu a expressão de mRNA para IL-6 por estas células (Yamamoto et al., 2006).
2.2 INFECÇÃO DO SISTEMA DE CANAIS RADICULARES
As principais fontes de irritantes bacterianos para a indução da patologia pulpar e perirradicular são as lesões cariosas, por meio do contato direto ou indireto do micro-organismo com o tecido pulpar (Love e Jenkinson, 2002). A composição bacteriana do biofilme da cárie evolui e se adapta ao progresso da doença através do esmalte, dentina e polpa. Assim, quando o ambiente se torna mais anaeróbico, as infecções polimicrobianas tornam-se cada vez mais complexas e possuem alta diversidade de bactérias (Izumi et al., 1995).
A partir da agressão microbiológica por meio da liberação de produtos bacterianos, as células do tecido pulpar entram em colapso, culminando na morte dos componentes celulares da polpa pelo processo de progressão de lesões cariosas (Cooper et al., 2014). As espécies bacterianas que inicialmente penetram o tecido dentinário são as anaeróbias facultativas, como aquelas pertencentes aos gêneros Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus e microrganismos filamentosos (Siqueira, 2001). Dependendo do grau e intensidade da invasão bacteriana e do processo inflamatório, o tecido pulpar pode se tornar necrótico, propiciando assim a invasão do espaço pulpar pelos micro-organismos, o que induz uma variedade de reações inflamatórias e imunológicas na doença pulpar (Love e Jenkinson, 2002).
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Streptococcus mutans é a espécie associada ao início da infecção endodôntica, relacionada principalmente à atividade de cárie (Lima et al., 2011). S. mutans é uma espécie de bactéria Gram-positiva, anaeróbica facultativa, tipo coco (Asahi et al., 2015). É considerada o agente etiológico primário da cárie dentária e possui fatores de virulência que permitem sua sobrevivência e sua seleção em situações ambientais críticas. A capacidade de aderir e formar biofilmes em superfícies duras, metabolizar carboidratos e sobreviver em ambientes de baixo pH constituem fatores importantes para a colonização dental e consequente inflamação pulpar (Siqueira et al., 1998; Lemos et al., 2013).
As bactérias anaeróbias de pigmentos negros têm ganhado atenção especial na pesquisa de micro-organismos associados com a etiologia da infecção endodôntica. Estas bactérias expressam uma variedade de fatores que desempenham funções importantes na patogenicidade, incluindo fímbrias, proteases e lipopolissacarídeos (endotoxinas). A invasão do tecido do hospedeiro por micro-organismos e seus bioprodutos frequentemente induz a uma variedade de reações imunopatológicas como a destruição de tecidos pulpares (Coil et al., 2004).
A literatura descreve que durante o processo de infecção radicular, a evolução da patogênese pulpar se dá por meio da progressão e perpetuação microbiológica, seguida da necrose dos componentes teciduais da polpa (Kakehashi et al., 1965; Moller et al., 1981). Nesse sentido, para que ocorra a sucessão microbiológica na infecção endodôntica é necessária a morte do tecido pulpar com consequente inibição da resposta imunitária (Siqueira, 2001; Siqueira, 2002).
A infecção intrarradicular primária é causada por micro-organismos que inicialmente invadem e colonizam o tecido pulpar necrótico. É
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caracterizada por um misto de bactérias onde predominam as anaeróbias compondo uma quantidade de aproximadamente 10 a 30 espécies por canal (Siqueira et al., 2001; Siqueira, 2002; Siqueira e Rocas, 2004; Siqueira et al., 2007) e uma quantidade total de aproximadamente 103 a 108 células bacterianas por canal infectado (Sundqvist et al., 1998; Vianna et al., 2006; Sakamoto et al., 2007; Siqueira et al., 2007). O perfil bacteriano da microbiota endodôntica varia de acordo com o indivíduo no que diz respeito à riqueza e quantidade de espécies (Siqueira e Rocas, 2004; Sakamoto et al., 2007), o que indica que o processo infeccioso pulpar e radicular apresenta etiologia heterogênea, no qual nenhuma espécie sozinha pode ser considerada o patógeno endodôntico principal, e sim múltiplas combinações (Metzger et al., 2009).
Diversos grupos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas têm sido identificadas nas infecções endodônticas primárias (Gomes et al., 2012; Hong et al., 2013; Shang et al., 2013). Das espécies de Porphyromonas, P. endodontalis e P. gingivalis são consistentemente encontradas em infecções endodônticas e possuem suspeita na etiologia dos abscessos agudos (van Winkelhoff et al., 1985; Haapasalo, 1986; Sundqvist et al., 1989; Siqueira et al., 2001; Seol et al., 2006).
P. gingivalis é uma bactéria Gram-negativa, anaeróbica estrita, que adquire sua energia através da fermentação de aminoácidos (Cugini et al., 2013). Esse micro-organismo apresenta diversos fatores de virulência como: lipopolissacarídeos (LPS), polissacarídeo capsular, fímbrias, hemaglutinina, enzimas proteolíticas (Yoshimura et al., 2009; Cugini et al., 2013). Os lipopolissacarídeos são considerados o principal fator de virulência de micro-organismos frequentemente encontrados em infecções endodônticas primárias (Sipert et al., 2014). A literatura descreve que, neste tipo de infecção, P.
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gingivalis é a bactéria mais frequente e sua presença está associada à sintomatologia dolorosa e exsudação purulenta (Gomes et al., 2004; Jacinto et al., 2006).
A infecção secundária e/ou persistente é causada por micro-organismos que faziam parte da infecção primária e, de alguma forma, resistiram aos procedimentos intracanal antimicrobianos e enfrentaram períodos de privação de nutrientes nos canais radiculares manipulados (Siqueira, 2002). Infecções intrarradiculares persistentes ou secundárias são as maiores causas de problemas clínicos como insucesso do tratamento endodôntico, que é caracterizado pela persistência ou aparecimento de periodontite apical após o tratamento (Siqueira et al., 2014). Análises de estudos de cultura bacteriana identificaram 51 bactérias e 2 fungos em amostras obtidas no momento da obturação e do retratamento como: Propionibacterium acnes, P. propionicum, Actinomyces naeslundii, Actinomyces odontolyticus, P. intermedia, Anaerococcus prevotii, Eggerthela lenta, E. faecalis, G. morbillorum, P. micra, P. alactolyticus, S. anginosus, S. mitis, F. nucleatum e C. albicans (Gomes et al., 2008).
A literatura tem descrito que E. faecalis tem sido a espécie mais prevalente em casos de insucesso endodôntico (Gomes et al., 2008; Pirani et al., 2008). Esse micro-organismo é raramente encontrado em infecções primárias, mas é a espécie predominante em casos de retratamento endodôntico, chegando a constituir de 38 a 70% da microbiota nos casos de infecções endodônticas persistentes associadas a dentes com canais obturados (Molander et al., 1998; Sundqvist et al., 1998; Pinheiro et al., 2003; Rocas et al., 2004; Siqueira e Rocas, 2004; Sedgley et al., 2006; Zoletti et al., 2006). Apesar de muitos estudos terem demonstrado a presença frequente de E. faecalis em canais radiculares infectados, o papel preciso desse
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organismo nas infecções endodônticas ainda não é bem estabelecido (Sipert et al., 2010).
E. faecalis é uma bactéria anaeróbica facultativa, Gram-positiva do tipo coco. Geralmente esta espécie é encontrada isoladamente, mas pode arranjar-se aos pares (diplococos) ou em pequenas cadeias (estreptococos). Tal micro-organismo exibe grande resistência ao sistema imune do hospedeiro em detrimento de seus fatores de virulência como: resistência a níveis de pH elevados, suportam ambientes inóspitos com altas concentrações de sais, suportam escassez nutricional, são capazes de resistirem ao ressecamento e voltarem ao estado vegetativo clássico, aderem-se à dentina, colonizam os túbulos dentinários, inibem a ação dos linfócitos, utilizam o líquido tissular como fonte nutricional, competem de maneira efetiva com outras bactérias, organizam-se em biofilme e possuem a capacidade de transferir características de virulência às bactérias adjacentes em especial quando organizados em biofilme. (Stuart et al., 2006; Holt et al., 2007). A presença de E. faecalis é provavelmente um dos principais fatores na etiologia de lesões persistentes. Apesar disso, não é claro como esse micro-organismo e seus bioprodutos poderiam ser capazes de iniciar ou manter respostas do sistema imune por células residentes da polpa dental e região periapical (Sipert et al., 2014).
2.3 FISIOLOGIAPATOLOGIA DO TECIDO PULPAR
As doenças infecciosas representam uma categoria de interações que envolvem o hospedeiro frente aos microrganismos com potenciais agentes colonizadores e patogênicos (Socransky e Haffajee, 2005). Em certas situações, tais microrganismos podem invadir locais normalmente estéreis do organismo, como o tecido pulpar, e desencadear um processo infeccioso (Henderson e Wilson, 1998). O grau de patogenicidade de tais organismos, denominado virulência, é o fator determinante para que
micro-12
organismos produzam formas variadas de doença (Mohammadi, 2011; Matsui et al., 2014).
Respostas celulares e moleculares ocorrem na polpa estimuladas por lesões de cárie e trauma, e estes eventos podem se manifestar como processos inflamatórios e/ou regenerativos em níveis celulares e teciduais. A polpa, como qualquer outro tecido que sofre injúrias, monta uma resposta de defesa na intenção de remover a infecção e permitir que o reparo aconteça (Bjorndal e Darvann, 1999). Claramente, o dente representa um ambiente especializado com capacidade de edema limitada e um sistema linfático relativamente pobre, o que dificulta os fenómenos de exsudação plasmática e celular oriundos da inflamação e consequentemente o combate à infecção bem como o reparo (Cooper et al., 2014). Como parte do processo defensivo dos tecidos dentários contra os micro-organismos invasores, as células pulpares liberam mediadores moleculares como citrinas, quimiocinas e citocinas, as quais promovem o recrutamento de células inflamatórias para o local da infecção e injúria no intuito de eliminar as bactérias invasoras e reestabelecer a homeostasia tecidual dentária (Matsushima et al., 1998; Tokuda et al., 2001).
A resposta inflamatória da polpa dental apresenta algumas particularidades em relação aos outros tecidos, não só em relação à sua localização anatômica, mas também em função das células ali presentes, bem como dos mediadores produzidos e a suas características fisiológicas (Adachi et al., 2007). Na polpa dental humana, o principal indutor de resposta infamatória, e consequente produção de citocinas, é a agressão microbiológica (Bergenholtz e Warfvinge, 1982). Uma vez que a cárie dental se processa lentamente, antes mesmo das bactérias alcançarem diretamente a polpa, seus subprodutos já estimularam as células pulpares, induzindo uma resposta inflamatória inicial (Cleaton-Jones et al., 2004; Adachi et al., 2007; Horst et al., 2011). Desta forma, quando as células bacterianas entram em contato com o tecido pulpar, a resposta imune já foi ativada (Hahn e Liewehr, 2007).
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Os odontoblastos representam a primeira linha de defesa enfrentada pelas bactérias que penetram na dentina (Love e Jenkinson, 2002). Dados recentes sugerem que essas células estão envolvidas na iniciação, desenvolvimento e manutenção das respostas inflamatórias da polpa desencadeadas por bactérias orais (Horst et al., 2011). Diversos trabalhos mostram que os odontoblastos podem mediar a resposta inflamatória à cárie diretamente através da produção de peptídeos antimicrobianos, citocinas e, indiretamente, através da ativação de células imunológicas (Durand et al., 2006; Veerayutthwilai et al., 2007; Staquet et al., 2008). Os odontoblastos, bem como os fibroblastos pulpares, possuem a capacidade de detectar os componentes bacterianos via receptores de reconhecimento (Pattern recognition receptor - PRRs), e com isso, liberar mediadores químicos relacionados com o recrutamento do processo inflamatório (Takeda e Akira, 2005). Indiscutivelmente, a família melhor caracterizada de PRRs são os receptores Toll-like (Toll-Like Receptors - TLRs), que reconhecem uma gama de modelos moleculares associados a patógenos como ácido lipoteicoico, lipopolissacarídeos (LPS), flagelos e fragmentos de material genético bacteriano (Medzhitov, 2001; Pevsner-Fischer et al., 2007). A detecção do processo infeccioso pelas células pulpares estimula a produção e liberação de citocinas, o que resulta na geração de gradientes quimiotáticos para recrutamento e ativação de células do sistema imune como linfócitos T e B, neutrófilos e macrófagos, além de modificações vasculares e secreção dentinária pelos odontoblastos (Cooper et al., 2014). Vários estudos têm demonstrado a expressão de diferentes citocinas pelo tecido pulpar inflamado em detrimento das diferentes exposições das células da polpa aos agentes bacterianos. IFN-γ, IL-4, IL-1α, IL-1β, CCL2 (MCP-1), TNF e IL-10 são exemplos de citocinas descritas no tecido pulpar agredido (Hahn et al., 2000; Lu et al., 2002; Zehnder et al., 2003).
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As citocinas são peptídeos produzidos por uma variedade de células do sistema imune, assim como por células epiteliais e endoteliais, além de células pulpares como os odontoblastos e fibroblastos, podendo apresentar ação sistêmica e/ou local (Basset et al., 2003). Atuam sobre receptores específicos de ação autócrina e também parácrina, regulando as atividades celulares e a ativação de diferentes células efetoras (Maciel et al., 2012; Yamaguchi et al., 2014). A interação entre bactérias e as células do hospedeiro, invariavelmente, resulta na liberação de uma ou mais citocinas, sendo que o tipo de citocina produzida depende da bactéria e célula do hospedeiro envolvida nessa interação (Kumar et al., 2005). Algumas citocinas possuem ação pró-inflamatória, enquanto, outras apresentam função antiinflamatória (O'Garra, 1998; Netea et al., 2003; Kumar et al., 2005).
O aumento da expressão de várias citocinas em polpas e/ou odontoblastos afetados por cáries já foi demonstrado, incluindo fator de necrose tumoral (TNF-α), IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-11 e IFN-γ (Danin et al., 2000; Pezelj-Ribaric et al., 2002). Citocinas como IL-6, MCP-1 e TNF-α constantemente são alvos de estudo dado suas características peculiares no processo inflamatório (Mathew et al., 2010; Park et al., 2013; Kato et al., 2014). A IL-6 apresenta múltiplos efeitos biológicos relacionados à modulação da resposta inflamatória do hospedeiro frente a agressões. A sua expressão está relacionada com o aumento dos níveis de proteínas de fase aguda como a proteína C-reactiva e regulação de moléculas de adesão, além da indução de angiogênese, aumento na permeabilidade vascular e atividade clástica (Tokuda et al., 2001; Gabay, 2006). O TNF-α é um mediador inflamatório importante do inicio da cascata inflamatória, incluindo a indução da produção de citocinas, ativação e expressão de moléculas de adesão e de estimulação da proliferação celular (Bradley, 2008). A MCP-1/CCL2 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) é um membro da família de citocinas que possui uma potente capacidade quimiotática para monócitos. Tal citocina é produzida por uma variedade de
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tipos de células incluindo fibroblastos, células epiteliais e endoteliais e do músculo liso (Deshmane et al., 2009).
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3 PROPOSIÇÃO
3.1 Geral
Avaliar a expressão e a produção de IL-6, TNF-α e MCP-1 por fibroblastos (3T3) e odontoblastos (MDPC-23) após exposição a bactérias orais.
3.2 Específicas
- Avaliar qual forma de contato mais estimula a produção e a expressão de citocinas inflamatórias secretadas por fibroblastos e odontoblastos;
- Verificar qual tipo bacteriano ou seus bioprodutos mais contribui para alteração da produção de citocinas;
- Analisar o período de tempo necessário à estimulação por bactérias para expressão de citocinas por reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR);
- Avaliar o período de tempo necessário para a produção de citocinas inflamatórias por citometria de fluxo tipo CBA.
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4 MATERIAL E M
ÉTODOS
4.1 CULTURA DE CÉLULAS Foram utilizadas células como fibroblastos imortalizados da linhagem 3T3 (Balb/c American Tissue Type Collection; ATCC, Manassas, VA) e odontoblastos imortalizados da linhagem MDPC-23 (Hanks et al., 1998). Estas células foram inicialmente cultivadas em meio Dulbecco’s modified Eagle’s médium – DMEM (Gibco, Grand Island, NY) com suplementação de 10% de soro fetal bovino (FBS) (Gibco, Grand Island, NY) e antibiótico e antifúngico associados a 1% (10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 µg/mL de estreptomicina e 25 µg/mL de anfotericina B, Gibco, Grand Island, NY) em frascos próprios de 75cm2 e acomodados em estufa a 37oC e 5% CO2 até que
atingissem subconfluência (80%). O meio de cultura foi trocado a cada 2 dias e em seguida, as células foram suspensas em solução de tripsina-EDTA 0,25% (Gibco, Grand Island, NY). Estas células foram utilizadas após replicarem por duas vezes e, então, cultivadas em placas de 6 poços próprias para cultivo celular com DMEN suplementado com 10% de FBS sem antibióticos ou antifúngicos. Um total de 3x105 células viáveis foram cultivadas em cada cavidade. A contagem foi realizada em câmera de Neubauer e a viabilidade dessas células confirmada com corante azul de Trypan (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). As células ficaram em repouso na estufa por um período de 48 horas, quando uma monocamada celular foi observada com aproximadamente 80% de confluência e, dessa forma, as células estavam prontas para a exposição bacteriana.
4.2 CULTURA BACTERIANA
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-
Streptococcus mutans (ATCC 25175): cultivada em placas de Brain Heart Infusion (BHI) ágar contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, incubada aerobicamente a 37°C, por 48 horas.-
Porphyromonas gingivalis (ATCC 49417): cultivada em Fastidious Anaerobe Agar (FAA) ágar-sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, acrescidos de hemina (5 mg/L) e vitamina K1 (1mg/L), incubados anaerobicamente a 37°C, por 14 dias.-
Enterococcus faecalis: (ATCC 29212): cultivada em placas de BHI ágarcontendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, incubada aerobicamente a 37°C, por 48 horas.
Essas bactérias, após a replicação, foram testadas quanto à coloração de Gram e reação da Catalase para se obter confirmação do tipo bacteriano utilizado. A seguir, na tabela 1, as características de cada bactéria utilizada quanto à coloração de Gram e teste da Catalase são apresentadas.
Tabela 1 - Características das bactérias quanto à reação de Gram e teste da Catalase.
4.3 EXPOSIÇÃO BACTERIANA
As colônias de cada espécie bacteriana, após a replicação em placas de Petri, foram colocadas em solução de DMEN suplementada com 10% de soro fetal bovino. Essa solução foi levada ao espectrofotômetro para a quantificação baseada na escala visual de Mcfarland. De acordo com a
Coloração de Gram Catalase
Streptococcus mutans GRAM + CATALASE -
Porphyromonas gingivalis GRAM - CATALASE -
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metodologia adaptada por (Tyrrell et al., 2002), utilizou-se a marca de 0,5 Mcfarland com transmitância de 90±4 para o início da diluição seriada, até que fosse alcançada a quantidade de 300.000 células bacterianas. Assim, como 100μL da solução inicial diluída por 100 vezes continha 150.000 bactérias, para alcançar o fator de infecção de 1:1 foram aliquotados 200μL desta última solução.
Dessa forma, em cada poço onde estavam inicialmente as 300.000 células aderidas, foi colocada a quantidade de 200µL da solução contendo as bactérias em cada poço da placa de cultivo de células, resultando em um fator de infecção de 1:1. A exposição das células às bactérias se deu de duas formas: por contato direto e indireto. Na primeira forma, a solução com bactérias foi colocada diretamente sobre as células; de outra maneira, a solução contendo as bactérias foi depositada sobre um insert/transwell que contém uma membrana permeável com poros de 0,4µm de diâmetro (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) permitindo que apenas os bioprodutos bacterianos secretados juntamente com o meio de cultura passassem pelo filtro, como demonstrado pela figura 01. Logo após o contato, as placas de cultivo celular foram levadas à estufa a 37oC e 5% CO2 quando as
bactérias utilizadas na contaminação eram aeróbias facultativas e em câmara de anaerobiose a 37oC quando o contato foi realizado com P. gingivalis.. Nesse momento, os controles negativos foram definidos, onde as células da mesma linhagem celular foram colocadas em contato com a mesma quantidade de meio de cultura suplementado com FBS sem o acréscimo de bactérias e armazenados nas mesmas condições.
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Figura 1 - Inserts/transwell. Membrana porosa de 0,4µm de diâmetro (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Antes e em posição numa placa de cultura celular de 6 poços.
Todos os grupos experimentais foram realizados em triplicata e armazenados em câmara de anaerobiose para comparação com as amostras contaminadas por P. gingivalis e, em estufa com CO2 a 37oC, para comparação
com as amostras testadas frente a E. faecalis e S. mutans. Os períodos de acompanhamento foram de 4, 8 e 24 horas. Os grupos experimentais são listados no quadro 1.
Finalizados os períodos de estímulo, o sobrenadante da cultura celular foi coletado para análise por citometria de fluxo tipo CBA e as células
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tiveram seu RNA purificado para a reação em cadeia da polimerase quantitativo (RT-qPCR).
Odontoblastos Fibroblastos
S.mutans E. faecalis P. gingivalis S. mutans E. faecalis P.gingivalis
Contato direto e indireto 4 horas Contato direto e indireto 4 horas Contato direto e indireto 4 horas Contato direto e indireto 4 horas Contato direto e indireto 4 horas Contato direto e indireto 4 horas Contato direto e indireto 8 horas Contato direto e indireto 8 horas Contato direto e indireto 8 horas Contato direto e indireto 8 horas Contato direto e indireto 8 horas Contato direto e indireto 8 horas Contato direto e indireto 24 horas Contato direto e indireto 24 horas Contato direto e indireto 24 horas Contato direto e indireto 24 horas Contato direto e indireto 24 horas Contato direto e indireto 24 horas Controle 4 horas aerobiose e anaerobiose Controle 4 horas aerobiose e anaerobiose Controle 8 horas aerobiose e anaerobiose Controle 8 horas aerobiose e anaerobiose Controle 24 horas aerobiose e anaerobiose Controle 24 horas aerobiose e anaerobiose
Quadro 1 - Divisão dos grupos experimentais.
4.4 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA (RT-qPCR)
4.4.1 PURIFICAÇÃO DE RNA
As células aderidas à placa de cultivo celular foram lavadas com solução tampão de PBS 1X (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e tratadas com Trizol (TriReagent, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) por 10 minutos para rompimento da membrana e liberação do conteúdo nuclear. Este conteúdo foi coletado e submetido ao seguinte protocolo: adição de 200µL de clorofórmio (Merk, Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), sendo a mistura agitada em vortex
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por 15 segundos e incubada por 3 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugada por 15 minutos a 12.000 x g (rcf) a 4oC. Para precipitação do RNA aquoso, foram adicionados 400µL de álcool isopropílico (Merk, Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), sendo a mistura homogenizada e incubada por 10 minutos à temperatura ambiente e, posteriormente, centrifugada por 10 minutos a 12.000 x g (rcf) a 4oC, resultando em um pellet contendo o RNA precipitado. O líquido sobrenadante foi eliminado e o RNA lavado com a adição de 1ml de álcool etílico 75% (Merk, Inc., Whitehouse Station, NJ, USA) e centrifugado por 5 minutos a 12.000 x g (rcf) a 4oC. O pellet foi deixado secar por 5 a 10 minutos à temperatura ambiente e, após seco, foi ressuspendido em 20µL de água DEPC (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), aliquotado e armazenado à temperatura de -80oC.
4.4.2 SÍNTESE DE DNA COMPLEMENTAR (cDNA)
Para a confecção das moléculas de cDNA, 1,0µg de RNA total foi tratado com 1µL de DNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) afim de evitar contaminação de DNA genômico. Os RNAs foram submetidos à ação da enzima SuperScript III utilizando o First Strand Synthesis kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) conforme o protocolo fornecido pelo fabricante.
Resumidamente, a 1,0µg de RNA total foi adicionado 1µL de primer Oligo dT (500µg/mL), 1µL de dNTPs (10mM) e água ultrapura suficiente para 20µL a posterior incubação a 65°C durante 5 minutos. Em seguida, houve adição de 2µL de 5X First Strand Buffer, 2µL de DTT (0,1M), 4µL de MgCl2 (25
mM) e 1µL de RNAse out (40U/µl). Logo após, foi adicionado 1µL da enzima SuperScript III (200 U/µL) perfazendo um volume final de reação de 20µL. A reação foi incubada a 50°C por 50 minutos e, posteriormente, foi adicionado 1µL de RNAseH por 20min a 37oC e a reação inativada através de incubação a
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85°C por 5 minutos. Terminada a reação, o produto da síntese foi diluído 10X pela adição de 180µL de água livre de DNAse/RNAse.
Como controle de qualidade dos cDNA, foi amplificado um fragmento do gene β-actina, com a utilização dos primers β-actina (F: ACC AGT TCG CCA TGG ATG AC R: TGC CGG AGC CGT TGT C) e os produtos de PCR avaliados através de eletroforese em gel de agarose 6,5%.
4.4.3 RT-qPCR
As reações de RT-qPCR foram realizadas no aparelho Applied Biosystems StepOne Plus (Applied Biosystems, Foster City, U.S.A.) para os genes TNF-α, IL-6 e MCP-1 cujos primers foram desenhados através do software Primer Express versão 3.0 (Appied Biosystems, Foster City, CA, USA) e encontram-se listados na tabela 2. A reação foi realizada utilizando SybrGreen Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e as condições de reação foram estabelecidas seguindo as recomendações do fabricante (95oC por 10 minutos, 40 ciclos de 95oC por 15 segundos e 60oC por 1 minuto) com volume final de 20μl e todas as amostras em duplicata. O nível de expressão foi determinado baseando-se no método da curva padrão relativa, onde um calibrador sabidamente positivo para os primers escolhidos é utilizado em uma diluição seriada e os valores encontrados são comparados a uma amostra de referência. Como controle endógeno da reação, foi utilizada amplificação de um fragmento do gene β-actina (Tabela 02).
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Tabela 2 - Sequências dos primers utilizados no estudo.
4.5 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS PELO CBA (CITOMETRIC BEAD ARRAY)
Os sobrenadantes da cultura celular foram coletados das amostras que tiveram tanto contato direto quanto indireto com as bactérias. As amostras do contato indireto foram coletadas diretamente abaixo dos inserts e as do contato direto passaram por um filtro para seringas com poros de 0,22µm de diâmetro (EasyPath, Brasil) onde as bactérias foram separadas do sobrenadante.
Citocina Primer
β-actina
TNF-α
F: ACC AGT TCG CCA TGG ATG AC R: TGC CGG AGC CGT TGT C F:ATCCGCGACGTGGAACTG R:ACCGCCTGGAGTTCTGAA IL-6 F:TTCCATCCAGTTGCCTTCTTG R:GGGAGTGGTATCCTCTGTGAAGTC MCP-1 F:CAG GTC CCT GTC ATG CTT CT R:CGT TAA CTG CAT CTG GCT GA
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Figura 2 - Filtro para seringa com membrana porosa de 0,22µm diâmetro (EasyPath, Brasil). Antes e colocados em posição para filtragem do sobredante da cultura celular.
A citometria de fluxo tipo CBA permite quantificar várias proteínas simultaneamente com menor quantidade de amostra e gerar curvas padronizadas para todas as análises. O uso de fluorescência, melhor que as mensurações colorimétricas, provém maior sensibilidade e uma variedade maior de citocinas quantificadas (Young et al., 2008). Os biomarcadores avaliados foram TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, IL-8, IL-12p70 através do uso de kit laboratorial específics (Mouse Inflammation kit, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). No entanto, em um estudo piloto, verificou-se que somente as proteínas IL-6, TNF-α e MCP-1 foram identificadas. Os experimentos foram desenvolvidos de acordo com o protocolo do fabricante e resumidamente consistiram na realização de curvas padrões com 6 pontos de
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diluição seriada dos padrões liofilizados reconstituídos fornecidos pelo kit. O controle negativo foi realizado com as amostras sem os padrões, somente com o solvente. Em seguida, uma quantidade de 50μL das amostras a serem analisadas e dos pontos da curva foram misturadas às beads das diferentes citocinas e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente protegidas da luz. Posteriormente, as amostras foram lavadas com solução tampão fornecida pelo kit e centrifugadas por 5 minutos a 200 x g (rcf). O pellet foi então suspenso em solução tampão e levado para leitura no equipamento FACScalibur 4 cores (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). O software CellQuest foi utilizado para aquisição dos dados.
4.6 ANÁLISE DOS DADOS
A análise dos dados foi conduzida separadamente para fibroblastos e odontoblastos. Não tendo sido observados indícios da normalidade residual por meio dos coeficientes de assimetria e curtose, assim como pelo Teste de Shapiro-Wilk, optou-se pela realização da análise de variância baseada em postos (Rank Based ANOVA) que utiliza a estatística F como aproximação da estatística não-paramétrica. Adicionalmente os efeitos significativos tiveram suas médias comparadas por meio do teste t ajustado pelo método de Tukey-Kramer. Todos os testes estatísticos foram calculados por meio do sistema SAS® (SAS Institute Inc. The SAS System, release 9.3. SAS Institute Inc., Cary:NC, 2010) e na interpretação de todos os testes estatísticos foi adotado o nível de significância de 5%.
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5 RESULTADOS
5.1 Análise por Citometric Bead Array (CBA)
Para determinar a quantificação de citocinas, após o estímulo pelas bactérias, o sobrenadante da cultura celular de células tipo odontoblastos e fibroblastos foi coletado após três períodos de tempo: 4, 8 e 24 horas.
5.1.1 Odontoblastos
A análise demonstrou que as células tipo odontoblastos, nos períodos avaliados, produziram após os estímulos (contato direto e indireto) as citocinas IL-6, MCP-1 e TNF-α.
Para a citocina IL-6, as células, quando em contato direto com E. faecalis, somente no período de 4 horas, produziram a proteína (15,51±2,60pg/mL) e nos demais períodos não foi observada a produção de IL-6 (Figura 3). Quando do contato direto com S. mutans, somente no período de 8 horas foi observada a produção da citocina (5,74±1,66pg/mL). Vale ressaltar que os grupos controle não apresentaram produção de IL-6 (Figura 4). Quando da interação da P. gingivalis com os odontoblastos, foi percebido que no contato indireto houve somente a produção de IL-6 no período de 24 horas (8,76±0,56pg/mL) e nos demais períodos não foi observada produção da citocina (Figura 6) (Tabela 3).
Em relação a MCP-1, quando da estimulação odontoblástica com E. faecalis foi observado que, em contato direto por 24 horas (29,67±3,04pg/mL), a quantidade de citocina foi superior aos demais tempos de contato com esta bactéria, independentemente da forma de contato, mostrando diferença também em relação ao grupo controle (p ≤ 0,05) (Figura 3). Quando do contato
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com S. mutans, foi percebido o aumento da quantidade da citocina tanto no contato direto (51,78±3,39pg/mL) quanto indireto (8,92±2,58pg/mL) no período de 8 horas (p ≤ 0,05) (Figura 4). Com o contato com P. gingivalis, os contatos indiretos nos períodos de 8 e 24 horas apresentaram maior produção da citocina quando comparados aos outros períodos de tempo, independentemente do tipo de contato, bem como com o grupo controle com valor de p ≤ 0,05 (Figura 6) (Tabela 3).
Para a citocina TNF-α, a estimulação celular por E. faecalis durante o contato direto no período de 4 horas proporcionou um aumento da produção da citocina (27,18±1,07pg/mL) quando comparada aos outros períodos de tempo e de tipo de contato (p ≤ 0,05). Adicionalmente, a produção em contato indireto com E. faecalis por 8 horas (8,97±4,67pg/mL) foi aumentada em comparação com o contato direto no mesmo período de tempo (Figura 3). Quando da estimulação pelo S. mutans, somente houve produção dessa citocina no período de 8 horas sob contato direto (18,90±4,44pg/mL), enquanto nas demais situações, não foi identificada a produção de TNF-α (Figura 4). Com a contaminação com P. gingivalis, diferença estatística foi encontrada entre os contatos direto (3,92±0,86pg/mL) e indireto (21,23±1,99pg/mL) por 24 horas, sendo a maior produção de proteína encontrada no contato indireto com valor de significância p ≤ 0,05 (Figura 5) (Tabela 3).
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Tabela 3 - Análise por citometria de fluxo tipo CBA da produção por odontoblastos das citocinas MCP-1, IL-6 e TNF-α nas combinações dos tipos de tratamento estimulados por bactérias e tempos de exposição. Médias (desvio padrão) com letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey-Kramer com nível de significância de 5%.
MCP-1 IL-6 TNF- α
4 horas 8 horas 24 horas 4 horas 8 horas 24 horas 4 horas 8 horas 24 horas
E.faecalis Contato direto 0 (0,0) H 0 (0,0) H 29,67 (3,04) DE 15,51 (2,60)A 0 (0,0) E 0 (0,0) E 27,18 (1,07) A 0 (0,0) D 0 (0,0) D Contato indireto 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) D 8,97 (4,67) C 0 (0,0) D Controle 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) D 0 (0,0) D 0 (0,0) D S. mutans Contato direto 0 (0,0) H 51,78 (3,39) C 0 (0,0) H 0 (0,0) E 5,74 (1,66) C 0 (0,0) E 0 (0,0) D 18,90 (4,44) B 0 (0,0) D Contato indireto 0 (0,0) H 8,92 (2,58) G 0 (0,0) H 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) D 0 (0,0) D 0 (0,0) D Controle 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) D 0 (0,0) D 0 (0,0) D P. gingivalis Contato direto 0 (0,0) H 0 (0,0) H 18,14 (0,65) EF 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) D 0 (0,0) D 3,92 (0,86) C Contato indireto 12,55 (1,70) FG 61,72 (3,29) B 57,56 (3,89) B 0 (0,0) E 0 (0,0) E 8,76 (0,56) B 0 (0,0) D 0 (0,0) D 21,23 (1,99) AB Controle 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) H 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) E 0 (0,0) D 0 (0,0) D 0 (0,0) D
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Figura 3 - Quantificação de MCP-1, IL-6 e TNF-α secretadas por odontoblastos após análise por citometria de fluxo tipo CBA; Odontoblastos expostos a E. faecalis.
Figura 4 - Quantificação de MCP-1, IL-6 e TNF-α secretadas por odontoblastos após análise por citometria de fluxo tipo CBA; Odontoblastos expostos a S. mutans
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Figura 5 - Quantificação de MCP-1, IL-6 e TNF-α secretadas por odontoblastos após análise por citometria de fluxo tipo CBA; Odontoblastos expostos a P. gingivalis.
5.1.2 Fibroblastos
A análise demonstrou que as células tipo fibroblastos, nos períodos avaliados, produziram após os estímulos (contato direto e indireto) as citocinas IL-6, MCP-1 e TNF-α.
Quanto à produção de IL-6 por fibroblastos, quando estimulados por E. faecalis, foi percebido que o contato direto estimulou maior produção da citocina que o contato indireto da bactéria e o grupo controle (p ≤ 0,05). Adicionalmente, notou-se maior produção de IL-6 no contato direto no período de 24 horas (253,3x10±64,7pg/mL) (Figura 6). Na estimulação celular pelo S. mutans, observou-se que no contato direto houve um aumento significativo da produção da citocina quando comparada com os grupos de contato indireto e controle (p ≤ 0,05). Ainda, foi percebida uma maior produção de IL-6 no contato
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direto no período de 24 horas (206,8x10±3,69pg/mL) (Figura 7). Com a contaminação por P. gingivalis, foi observado que o contato indireto resultou em uma maior produção de IL-6 quando comparado com os grupos de contato direto e controle. O contato indireto, nos períodos de 4 e 24 horas, apresentou aumento significativo da produção da citocina quando comparados aos mesmos períodos dos contatos diretos e do controle (p ≤ 0,05) (Figura 8) (Tabela 4).
Em relação à produção de MCP-1, quando da estimulação celular por E. faecalis, não foram observadas diferenças na produção de citocina entre contato direto e indireto. Adicionalmente, foi identificado que a produção de MCP-1 nos grupos estimulados pela bactéria (períodos de 4 e 8 horas) foi significativamente menor que a produção do grupo controle (p ≤ 0,05) (Figura 6). Quando estimuladas por S. mutans não houve diferença de produção de MCP-1 entre os tipos de contato. Além disso, foi observada a diminuição da produção da citocina nos períodos de 4 e 8 horas quando da comparação entre os contatos e o grupo controle (p ≤ 0,05) (Figura 7). Quando o estímulo foi realizado com P. gingivalis, não foram observadas diferenças na quantidade de produção da citocina nos diferentes grupos estudados (Figura 8) (Tabela 4).
Quanto à citocina TNF-α, somente houve produção da citocina quando do estímulo por E. faecalis no período de 8 horas sob contato indireto e sob a estimulação por S. mutans no período de 24 horas sob contato indireto (7,7±2,5pg/mL) (Figuras 6 e 7) (Tabela 4).
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Tabela 4 - Análise por citometria de fluxo tipo CBA da produção por fibroblastos das citocinas MCP-1, IL-6 e TNF-α nas combinações dos tipos de tratamento estimulados por bactérias e tempos de exposição. Médias (desvio padrão) com letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey-Kramer com nível de significância de 5%.
MCP-1 IL-6 TNF- α
4 horas 8 horas 24 horas 4 horas 8 horas 24 horas 4 horas 8 horas 24 horas
E.faecalis Contato direto 74,30x102 (0,59) JKL 91,93x102 (6,37) DEF 114,58x102 (1,30) A 105,3x10 (3,6) DEFG 159,7x10 (8,1) ABCD 253,3x10 (64,7) AB 0 (0,0) C 0 (0,0) C 0(0,0) C Contato indireto 74,75x102 (1,23) IJKL 94,14x102 (1,24) DEF 112,06x102 (1,95) AB 35,7x10 (0,5) IJK 35,1x10 (0,3) JKL 31,7x10 (0,2) LMN 0 (0,0) C 2,1 (1,5) B 0(0,0) C Controle 97,06 (2,03) CDE 102,91x10 2 (0,79) BCD 107,37x102 (5,78) ABC 31,2x10 (0,3) MNO 34,5x10 (0,1) KLM 36,1x10 (0,0) IJK 0 (0,0) C 0 (0,0) C 0(0,0) C S. mutans Contato direto 68,67x102 (1,08) KL 84,99x10 2 (0,29) FGH 101,90x10 2
(5,78) ABCD (0,07) 91,7x10 EFGH 12,85x10 (1,9) CDEF 206,8x10 (3,6) ABC 0 (0,0)
C 0 (0,0) C 0(0,0) C Contato indireto 76,95 x10 2 (0,06) HIJKL 88,98x10 2 (2,80) EFG 103,26x10 2 (0,04) BCD 36,1x10 (0,9) IJK 34,8x10 (0,1) JKL (0,3) 32,0x10 LMN 0 (0,0) C 0 (0,0) C 7,7 (2,5 ) A Controle 97,06x102 (2,03) CDE 102,91x10 2 (0,79) BCD 107,37x10 2
(5,78) ABC (0,3) 31,2x10 MNO (0,1) 34,5x10 KLM 36,1x10 (0,0) IJK 0 (0,0)
C 0 (0,0) C 0(0,0) C P. gingivalis Contato direto 75,99x102 (0,82) HIJKL 94,82x102 (0,005) DEF 108,13x102 (15,66) ABC 34,3x10 (0,3) KLM 40,2x10 (6,6) HIJ 29,6x10 (0,1) MNOP 0 (0,0) C 0 (0,0) C 0(0,0) C Contato indireto 76,31x10 2 (1,8) HIJKL 79,87x10 2 (0,84) GHIJK 106,98x10 2
(1,43) ABC 44,5x10 (0,6) GHI (0,2) 51,4x10 FGH 37,0x10 (0,1) HIJ 0 (0,0)
C 0 (0,0) C 0(0,0) C Controle 83,13x102 (0,99) FGHIJ 98,75x10 2 (0,32) CDE 110,12x10 2 (7,19) AB (0,05) 15,5x10 OP (0,1) 18,7x10 NOP 12,4x10 (0,2) P 0 (0,0) C 0 (0,0) C 0(0,0) C
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Figura 6 - Quantificação de MCP-1, IL-6 e TNF-α secretadas por fibroblastos após análise por citometria de fluxo tipo CBA; Fibroblastos estimulados por E. faecalis.
Figura 7 - Quantificação de MCP-1, IL-6 e TNF-α secretadas por fibroblastos após análise por citometria de fluxo tipo CBA; Fibroblastos estimulados por S. mutans.
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Figura 8 - Quantificação de MCP-1, IL-6 e TNF-α secretadas por fibroblastos após análise por citometria de fluxo tipo CBA; Fibroblastos estimulados por P. gingivalis.
5.2 Análise por RT-qPCR
5.2.1 Odontoblastos
A análise da expressão gênica de citocinas das células tipo odontoblastos, nos períodos avaliados, revelou a detecção de cópias de cDNA das citocinas IL-6, MCP-1 e TNF-α.
Em relação à IL-6, quando da estimulação celular por E. faecalis, foi observada a expressão da citocina em todos os grupos e períodos, contudo, houve o aumento significativo da expressão da proteína quando do contato direto nos períodos de 4 e 8 horas em comparação aos outros grupos e períodos (p ≤ 0,05) (Figura 9). A estimulação por S. mutans gerou a expressão
