Atividade anticoagulante, antioxidante e antitumoral de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula (Lamouroux, 1809)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Atividade anticoagulante, antioxidativa e antitumoral de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula (Lamouroux,1809). KALINE DANTAS MAGALHÃES. Natal/RN 2011.

(2) Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial de Centro de Biociências. Magalhães, Kaline Dantas. Atividade anticoagulante, antioxidante e antitumoral de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula (Lamouroux, 1809) / Kaline Dantas Magalhães. – Natal, RN, 2011. 59 f. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. 1. Polissacarídeos sulfatados – Dissertação 2. Algas marrons – Dissertação. 3. Atividade anticoagulante – Dissertação. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB 577.114.4. CDU. ii.

(3) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Profa. Drª.: Tecia Maria de Oliveira Maranhão. NATAL 2011. iii.

(4) Kaline Dantas Magalhães. Atividade anticoagulante, antioxidante e antitumoral de hetrofucanas da alga Dictyopteris delicatula (Lamouroux, 1809). Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. Natal/RN 2011. iv.

(5) Kaline Dantas Magalhães. Atividade anticoagulante, antioxidante e antitumoral de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula (Lamouroux, 1809). Presidente da Banca (orientador): Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha (UFRN). BANCA EXAMINADORA Profa. Dr.ª.: Luciana Guimarães Alves Filgueira (UFRN) Prof. Dr.: Eduardo Henrique Cunha de Farias (UNIFESP). Aprovada em: 02/12/2011. v.

(6) Abra a janela agora Que pra que eu possa brindar O que acabou vou festejar Donizete Lima. vi.

(7) DEDICATÓRIA. Dedico aos meus pais, José Maria e Marta. Minhas filhas Maria Luiza e Maria Alice. E meu companheiro de todas as horas, Donizete Lima. vii.

(8) Dedico esta obra:. A Hugo, pela oportunidade do convívio com ele e com todos do laboratório, uma família que sempre trarei comigo. Um mestre/amigo que sempre me estendeu a mão, nos momentos mais delicados. Alguém que aprendi a respeitar como um grande pesquisador, mas acima de tudo, como uma pessoa que sempre se faz presente em nossas vidas.. viii.

(9) AGRADECIMENTOS A Universidade Federal do Rio Grande do Norte por fornecer as condições necessárias para realização desse trabalho; Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela oportunidade de cursar uma pós. Ao professor e meu orientador Dr. Hugo Alexandre, pela confiança, credibilidade e paciência para a conclusão desse trabalho e, principalmente, por sua amizade durante esses anos. Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica e do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pelo ótimo convívio e pelos conhecimentos passados. A Alana, Kaliene e todas as secretarias do PPGCSA, pelo carinho e atenção ao longo desse período. A Professora Naisandra (Sandrinha), minha comadre, amiga, irmã e tudo que for necessário. Que com o seu exemplo de perseverança e empenho, demostra que tudo é possível, desde que façamos sempre o melhor. Aos meus colegas da Pós: Antenor, Nednaldo, Ivan e tantos outros pelo convívio tão agradável. Ao amigo Leandro que muito contribuiu para o desenvolvimento deste trabalho. Aos amigos-irmãos do BIOPOL: Ivan, Duda, Ana Karinne (Aninha), Diego (Popó), Jailma (sempre pronta para ajudar), Dayane (Day), Sara, Mariana (Mari), Gabriel, Sayonara, Sandra, Leonardo (Leo), Rafael (Rafa), Ruth (irmã péssima), Nednaldo (Ned), Ranieri, Letícia (Le), Joana e Cynthia pela convivência, amizade, apoio e participação direta e indireta na realização deste trabalho. VOCÊS SEMPRE FARÃO PARTE DA MINHA VIDA, NÃO IMPORTA ONDE ESTEJAMOS!!!!!!!! Aos meus colegas de trabalho da FARN, em especial à Patrícia Fonseca, Fabiana Gonçalves, Ângelo Augusto, Robson Alves, André Davim, José Eduardo, Izete, Gleydson, Jordana e tantos outros, pelo apoio nos momentos de cansaço e pela força nas horas de desalento. MUITO OBRIGADA!!!!!!!! ix.

(10) Aos Professores Eduardo Henrique Cunha de Farias e Luciana Guimarães pela valiosa contribuição feita na defesa dessa dissertação. Ao CNPq pelo apoio dado no decorrer dessa jornada. Agradecimentos especiais à minha mãe Marta, ao meu pai José Maria, meu irmão Hárryson, ao meu sobrinho Yan Lucas, a minha avó Chambrinha e o ao meu avô Antônio Vicente (ambos in memória) que sempre acreditaram e me apoiaram. Ao meu companheiro de vida, Donizete Lima, que sempre está ao meu lado dando força e não me deixando desistir. Meu amor, você é maravilhoso!! Por fim, tenho que agradecer à minha Maria Luiza (Malu), que acompanhou desde início essa jornada (inicialmente na barriga). E depois do seu nascimento, me dando força, apenas com a sua presença, nas madrugadas insones. Obrigada, filha Amada!!!!!! E agora ao final, ganhei uma motivação a mais para concluir esse mestrado e enveredar pelo doutorado, minha pequena Maria Alice. Espero filha, que esse trabalho te motive também a seguir sempre em frente... É POR VOCÊS QUE LEVANTO TODAS AS MANHÃS E NÃO DESISTO DE NADA NESSA VIDA.. x.

(11) Sumário Dedicatória.................................................................................. vii. Agradecimentos........................................................................... ix. Lista de Figuras........................................................................... xii. Lista de Tabelas.......................................................................... xiii Lista de Abreviaturas e Siglas..................................................... xiv. Resumo....................................................................................... xvi 1. INTRODUÇÃO ....................................................................... 1 1.1. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE.............................. 5. 1.2. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.................................... 6 1.3. ATIVIDADE ANTITUMORAL..................................... 7. 2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................. 9 3. ANEXAÇÃO DO ARTIGO ...................................................... 15. 4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES..................... 33. 5. REFERÊNCIAS ...................................................................... 35. 6. ABSTRACT............................................................................. 42. xi.

(12) LISTA DE FIGURAS FIGURA 01. Zonas de distribuição de Phaeophyta ao longo do litoral. brasileiro.................................................................................................2. xii.

(13) LISTA DE TABELAS TABELA 01 Algumas atividades farmacológicas de fucanas extraídas da algamarrons.......................................................................................4. xiii.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS. aPTT. Tempo de tromboplastina parcial ativada. HC II. Cofator II da heparina. Fuc. Fucose. TFPI. Inibidor da via do fator tecidual. Xil. Xilose. FT. Fator tecidual. AT. Antitrombina. PT. Tempo de Protombina. CETAVLON. Brometo de cetiltrimetilamônio. Gal. Galactose. Gli. Glicose. F 0.5. Fração precipitada com 0,5 volumes de acetona. F 0.7 Fração precipitada com 0,7 volumes de acetona F 1.0 Fração precipitada com 1,0 volumes de acetona F 1.3 Fração precipitada com 1,3 volumes de acetona F 1.5 Fração precipitada com 1,5 volumes de acetona F 2.0 FII. Fração precipitada com 2.0 volumes de acetona Protombina. HEP. Heparina. LMWH. Heparina de baixo peso molecular. HPLC. Cromatografia Líquida de Alta Performance. Man. Manose. RPM. Rotações por minuto. xiv.

(15) v/v. Volume/volume. DNA. Ácido desoxirribonucleico. PDA. Diamino propano acetato. EDTA. Ácido etilenodiamino tetra-acético. NBT. Nitroblue tetrazolium. xv.

(16) RESUMO No presente estudo, seis populações de polissacarídeos sulfatados foram obtidas a partir da alga Dictyopteris delicatula (Lamouroux, 1809) e suas atividades anticoagulante, antioxidante e antitumoral avaliadas. Deste modo, as seis frações (F0.5v, F0.7v, F1.0v, F1.3v, F1.5v e F2.0v) foram obtidas por proteólise seguida por fracionamento de acetona e gel filtração molecular Sephadex G-100. Todas as frações apresentaram atividade anticoagulante frente ao ensaio de aPTT, mas não sobre o ensaio de PT. As heterofucanas exibiram atividade antioxidante total, capacidade em sequestrar radicais superóxido e propriedade de quelar ferro. As análises químicas demonstraram que todos os polissacarídeos contêm heterofucanas composta principalmente por fucose, xilose, glicose, galactose, ácido urônico, e sulfato. Nenhuma das frações alterou o PT. Entretanto, todas as frações foram capazes de dobrar o aPTT de uma maneira dose dependente. As heterofucanas F0.7v e F1.0v demonstraram baixa atividade anticoagulante, enquanto a F1.5v apresentou a maior atividade anticoagulante e quando comparada com Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular, em mesma concentração, apresentou antividade anticoagulante semelhante. As fucanas F0.5v e F0.7v a 1,0 mg/mL mostraram alta atividade de quelação ferica (~ 45%), enquanto a fucana F1.3v (0,5 mg/mL) mostrou considerável potencial redutor, cerca de 53,2% da atividade da vitamina C. A melhor atividade antitumoral foi encontrada nas fucanas F1.3v e F0.7v. No entanto, a atividade F1.3v foi muito superior a F0,7v, quase 100% de inibição da proliferação de células HeLa (célula de câncer de colo de útero). Estas fucanas foram selecionadas para novos. xvi.

(17) estudos sobre caracterização estrutural, bem como em experimentos in vivo, que já estão em andamento. Palavras-chaves:. Polissacarídeos. sulfatados,. atividades biológicas.. xvii. Fucoidan,. alga. marrom,.

(18) 1 INTRODUÇÃO. 1. INTRODUÇÃO O termo ”macroalgas marinhas” inclui as algas verdes, vermelhas e pardas macroscópicas e multicelulares (1). Podem ser divididas em três grandes grupos, levando em consideração os pigmentos nelas existentes: as algas vermelhas (Rodophytas), marrons (Phaeophytas) e verdes (Clorophytas). As macroalgas pertencentes à divisão Phaeophyta, são quase exclusivamente marinhas, vivendo fixadas em um substrato ou flutuando, formando imensas “florestas” algáceas submersas. São os maiores e mais abundantes representantes bentônicos existentes, podendo atingir tamanhos superiores a 25 metros. A divisão Phaeophyta esta subdividida em ordens que consequentemente são divididas em famílias, em gêneros e espécies. Os representantes da classe Phaeophyceae estão distribuídos em torno de 14 ordens, destacando-se as Dictyotales e Fucales, com espécies frequentes e abundantes em mares tropicais e subtropicais (2). Embora o número de espécies seja inferior ao das macroalgas vermelhas (Rhodophyta) e macroalgas verdes (Chlorophyta), as pardas destacam-se em termos de biomassa como um grupo importante dentro das quatro zonas fitogeográficas brasileiras, proposta por Oliveira Filho (1977) (Figura 1, Página 2). a – Zona Equatorial, com limites estabelecidos entre o Amapá a costa oeste do Ceará, e bastante influenciada por aguas fluviais, com baixa diversidade de espécies algáceas. b – Zona Nordeste-Oriental, compreendida entre a costa oeste do Ceara ate o norte do Rio de Janeiro, e que abriga uma grande diversidade de algas. Contudo, a faixa de litoral do Espirito Santo ate o norte do Rio de Janeiro Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(19) 2 INTRODUÇÃO. (Búzios) e considerada a parte, devido às particularidades quanto ao tipo de substrato, e quanto aos afloramentos de agua fria. c – Zona Sudeste compreende a região de Cabo Frio (RJ) ate o sul da Ilha de Santa Catarina, com flora algácea rica, porém, menos diversificada do que na zona anterior. d – Zona Sul compreende do sul de Santa Catarina ate o Rio Grande do Sul, que se caracteriza pela ausência de substrato consolidado e flora algácea com diversidade reduzida. Zona Equatorial: do Amapá (AP) a costa oeste do Ceara (CE). Zona Nordeste Oriental: da costa oeste do Ceará (CE) até o norte do Rio de Janeiro (RJ) Zona Sudeste: de Cabo frio (RJ) até sul de Santa Catarina (SC). Zona Sul: do sul de Santa Catarina (SC) até o Rio Grande do Sul (RS). Figura 1. Zonas de distribuição de Phaeophyta ao longo do litoral brasileiro segundo Oliveira Filho 1977 (Figura adaptada de Freitas, 2006).. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(20) 3 INTRODUÇÃO. Constituída por cerca de 250 gêneros, totalizando mais de 1500 espécies, as macroalgas pardas representantes da divisão Phaeophyta se destacam pelo alto valor nutritivo e pela produção de diversos metabólitos com potencial farmacológico, dentre estes, destaque para os polissacarídeos sulfatados (PSs), denominados fucanas, que fazem destes organismos foco das mais variadas pesquisas da área biomédica (4,5-6). Fucana. é. o. termo. utilizado. para. denominar. uma. família. de. polissacarídeos sulfatados cujo açúcar mais representativo é a L-fucose sulfatada e localizam-se nos tecidos intracelulares ou matriz mucilaginosa (7,8-9). Levando. em. consideração. sua. heterogeneidade,. as. fucanas. foram. classificadas com base nos seus açucares constituintes em homofucanas e heterofucanas(10). As homofucanas são polímeros contendo mais de 90% de L-fucose, enquanto que as heterofucanas (fucoidans), além de L-fucose sulfatada apresentam outros açúcares neutros e ácido urônico(11,12). A grande complexidade. na. estrutura. das. fucanas. está relacionada. às. muitas. possibilidades de ligações entre os diferentes monossacarídeos e as possíveis distribuições dos grupos sulfatos(13). As fucanas vêm sendo descritas como possuidoras das mais diversas atividades farmacológicas(10,14,15). A tabela I resume algumas destas atividades, no entanto três merecem destaque. A atividade anticoagulante, por ser a mais estudada e as atividade antioxidante e antitumoral que tem proporcionado à publicação de uma grande quantidade de trabalhos nos últimos anos.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(21) 4 INTRODUÇÃO. Tabela 1: Algumas atividades farmacológicas de fucanas extraídas de algas marrons. ATIVIDADE Antiadesiva. ALGAS. REFERÊNCIAS. Spatoglossum schröederi. ROCHA et al., 2001. Antiadipogênica. Fucus vesiculosis. KIM et al., 2010. Anticoagulante. Laminaria japônica, Laminaria saccharina, Dictyota menstrualis. CUMASHI et al., 2007; LI et al., 2008; WANG et al., 2010. Antioxidante. Sargassum crassifolia, Sargassum pallidum,. AL-AMOUDI et al., 2009; YE et al., 2008; ZHAO et al., 2007. L. japônica Antiproliferativa F. vesiculosos, Cladosiphon okamuramus. Antitrombótica. S. schröederi. TERUYA et al., 2007; YAMASAKI – MIYAMAMOTO et al., 2009 ALMEIDA-LIMA et al., 2010; BARROSO et al., 2008; ROCHA et al., 2005a. Antitumoral. S. pallidum, S. stenophillum. DIAS et al., 2005; YE et al., 2008. Antiúlcera. C. okamuramus, F. vesiculosos. SHIBATA et al., 2003. L. japônica, C. okamuramus, F. vesiculosos. HIDARI et al., 2008; MAKARENKOVA et al., 2010; QUEIROZ et al., 2008. Antiviral. Rocha, 2006.. Descreve-se agora, detalhadamente, as atividades farmacológicas que estão correlacionadas com os resultados obtidos nessa dissertação.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(22) 5 INTRODUÇÃO. 1.1. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE As doenças cardiovasculares têm sido a maior causa de morte nos tempos atuais e o número de casos registrados vem aumentando. A maioria destes casos origina-se da aterosclerose, uma condição na qual colesterol, outros lipídeos, células de defesa e tecido fibroso se depositam nas paredes das artérias de grande e médio calibre, provocando sua obstrução progressivamente, com maior ou menor velocidade e consequentemente menos sangue passa por estes vasos ocluídos. Pelo menos oito fatores de risco podem ajudar a predizer uma doença cardiovascular: hereditariedade, idade avançada, diabetes, obesidade, sedentarismo, tabagismo, sexo e a hipertensão arterial sistêmica(16). Os anticoagulantes são um dos principais grupos de fármacos utilizados no tratamento de doenças cardiovasculares e a heparina é o mais utilizado na terapia, haja vista que, diferente dos demais fármacos disponíveis, apresentam um maior espectro de atuação no tratamento destes tipos de patologias(17). A heparina é um polissacarídeo sulfatado de origem animal, extraído para uso comercial de intestino de suínos, ela apresenta alta atividade anticoagulante devido, principalmente, ao fato de possuir vários sítios de ação(18). Entretanto, pode apresentar algumas reações adversas, como o aparecimento de trombocitopenia, osteopenia e efeito hemorrágico residual em alguns pacientes(19). Além desses riscos, apesar de não ter casos confirmados, há a possibilidade de ocorrer à contaminação viral, uma vez que é obtida através de tecidos animais(20). Devido a essas complicações decorrentes do. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(23) 6 INTRODUÇÃO. uso da heparina a procura por novos compostos anticoagulantes tem aumentado consideravelmente. Diante desses fatos, a busca por novos compostos anticoagulantes tem se intensificado. e um dos principais compostos estudados são os. polissacarídeos sulfatados. Sendo as macroalgas, os organismos que apresentam uma maior quantidade desses biopolímeros(8). A grande vantagem dos polissacarídeos sulfatados em relação a outros compostos é que eles apresentam tanto atividade anticoagulante como antioxidante(21), deixando-os em foco no tratamento de várias doenças, como as cardiovasculares. 1.2. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE Radical livre é qualquer espécie química, com existência independente, que contenha um ou mais elétrons desemparelhados, nos orbitais externos. Este desemparelhamento de elétrons confere alta reatividade a estes compostos, fazendo com que reajam nos sítios onde foram formadas (22). Reações de oxidação e redução são essenciais no metabolismo normal de todos os organismos. Mas, ao agir com o DNA, podem, caso não haja um correto reparo, gerar mutações ou inativar genes importantes. Ao reagir com as proteínas, podem alterar a função destes componentes. Por fim, ainda podem ocasionar mudanças estruturais e funcionais nas membranas estruturais e funcionais nas membranas celulares. Entretanto, vale ressaltar que estas espécies não geram apenas malefícios, pois participam de importantes eventos de sinalização celular e atuam na defesa contra agentes patogênicos(23,24). O estresse oxidativo tem sido associado a uma ampla gama de doenças, relacionada com a idade e com as condições degenerativas e inflamatórias, Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(24) 7 INTRODUÇÃO. tais. como. aterosclerose,. diabetes,. carcinogênese(25),. esclerose. lateral. amiotrófica, assim como as doenças de Alzheimer e Parkinson (26). A aplicação tópica ou administração oral de antioxidantes tem sido uma das maneiras de prevenção aos danos desencadeados pelo estresse oxidativos(27). Mas, a maioria dos antioxidantes sintetizados industrialmente são apontados como responsáveis por danos no fígado e pela carcinogênese(28). Neste contexto, muitos estudos têm se desenvolvido visando à busca de antioxidantes. eficazes,. sendo. que. as. algas. mostram-se. organismos. promissores como fonte de novas biomoléculas. Nos últimos anos, polissacarídeos sulfatados de algas, especialmente aqueles extraídos das algas marrons, importante. tem sido demonstrado que. como. antioxidantes na. desempenham. prevenção. do dano. um papel. oxidativo. em. organismos vivos(20,29). Os PSs atuam em vários alvos moleculares como na quelação de metais, eliminação das espécies reativas de oxigênio e inibição da peroxidação lipídica(30,31,32-29).. 1.3. ATIVIDADE ANTITUMORAL Várias estratégias terapêuticas diferentes como a quimioterapia, radioterapia ou cirurgia têm sido utilizados para tratar vários tipos de câncer. Infelizmente, vários desses tratamentos trazem apenas poucos benefícios, além disso, há complicações indesejáveis e em longo prazo efeitos colaterais do tratamento(33,34). Consequentemente, a busca de medidas preventivas ou com potencial terapêutico já perdura por anos e recentemente o foco tem sido direcionado. para. compostos. bioativos. de. origem. natural,. incluindo. polissacarídeos sulfatados de alga marrons(16). Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(25) 8 INTRODUÇÃO. Muitos artigos têm sido publicados que indicam o potencial antitumoral dos polissacarídeos sulfatados tanto in vivo quanto in vitro(35,36,37-38). Os PSs agem por vários mecanismos para impedirem o crescimento, a proliferação de células tumoriais, induzem a apoptose de células cancerígenas, além de estimular. o. sistema. imune. do. indivíduo(39).. Adicionalmente,. diversos. polissacarídeos sulfatados têm comprovada capacidade de modular a proliferação e migração de células endoteliais vasculares através da alteração da ligação de fatores de crescimento com seus receptores celulares, impedindo assim a angiogênese e desenvolvimento de metástases (40). Portanto, cada polissacarídeo pode possuir conformação estrutural única, e consequentemente apresentar atividades biológicas diferentes e ou mais potentes de que outros polissacarídeos ou outros compostos já descritos. Tendo em vista a grande variabilidade estrutural, fisiológica e farmacológica dos diversos compostos das diferentes classes e espécies de algas marinhas, torna-se necessário um maior aprofundamento desses estudos, pois o entendimento do mecanismo de ação desses compostos ajudaria também na compreensão dos mecanismos das diversas doenças, em que essas substâncias venham a atuar. Por outro lado, o isolamento de um novo composto traz novas perspectivas de descoberta de um novo fármaco e/ou fontes de matérias prima para serem empregadas na indústria (41). Com base nestas considerações, o objetivo do presente estudo foi à obtenção de polissacarídeos. sulfatados de D. delicatula e avaliar suas. atividades anticoagulante, antioxidante e antitumoral in vitro.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(26) 9 REVISÃO DA LITERATURA. 2 - REVISÃO DA LITERATURA Muitas espécies de algas marinhas são utilizadas como alimento e também tem encontrado uso em medicina tradicional por causa de seus benefícios. proporcionados. a. saúde.. As. algas. são. ricas. fontes. de. polissacarídeos sulfatados, incluindo alguns que se tornaram valiosos aditivos na indústria de alimentos por causa da as suas propriedades reológicas, como agentes de gelificação e de espessamento. Além disso, os polissacarídeos sulfatados são reconhecidos por possuírem diversas atividades biológicas incluindo anticoagulante, atividades antioxidante e antitumoral que podem encontrar relevância em alimentos funcionais, cosméticas e aplicações farmacêuticas(42). Nas algas marrons, dentre os polissacarídeos sulfatados os compostos bioativos mais estudados são as fucanas, constituintes da parede intracelular destas algas. O seu alto caráter higroscópico tem como finalidade proteger a alga da desidratação quando submetida a longos períodos de exposição ao sol durante as marés baixas. A matriz mucilaginosa destes compostos também parece contribuir para tornar a alga suficientemente flexível, para crescer em ambientes líquidos e, rígida para permanecer estendida, de forma a melhor captar a luz e os nutrientes existentes (43). Os estudos iniciais sobre fucanas foram realizados por Kylim (44-45) com as algas Laminaria digitata, Fucus vesiculosus e Ascophyllum nodosum, porém, só em 1931 e que foi demonstrada a presença de grupos sulfato(46). Já o entendimento das características químico-estruturais desses compostos só veio se intensificar a partir dos anos 50 do século passado (47).. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(27) 10 REVISÃO DA LITERATURA. No ano de 1941 foi relatada a presença de atividade anticoagulante mediada por polissacarídeos sulfatados, a partir do estudo com alga marrom Laminaria, porém estudos significativos in vitro e in vivo só foram realizados anos mais tarde, com uma homofucana denominada de Fucus vesiculosus(15). Trabalhos já verificaram que este composto tem ação anticoagulante pela formação de um complexo tenário HC II/fucana/trombina e, em menor escala, pela inibição do fator Xa(48,49). O conhecimento do mecanismo de ação anticoagulante de fucanas de outras algas, já está avançado, por exemplo, já se observou que o fucoidan extraído da alga Ecklonia kurome é capaz de inibir a geração de trombina através. de. três. mecanismos:. bloqueando. a. formação. do. complexo. protrombinase, prevenindo a geração do fator Xa e aprimorando a atividade da antitrombina via cofator II da heparina (50). Além destes mecanismos de ação, fucanas também podem atuar de forma indireta no processo de coagulação, promovendo a liberação do TFPI (Inibidor do fator tecidual) ou de heparan sulfato (glicosaminoglicano) por células endoteliais(51,9,52-53). Alguns autores atribuem à ação da atividade anticoagulante exercida pelas fucanas ao grau de sulfatação e tamanho dos polímeros. Desta forma, polímeros com teores maiores de sulfato e menores pesos moleculares apresentariam melhores atividades(54). No entanto, outros trabalhos têm demonstrado que estes fatores não são majoritariamente preponderantes, sendo o efeito anticoagulante de fucanas atribuído principalmente ao caráter estéreo. especifico. dos. sítios. de. sulfatação. e/ou. das. ligações. glicosídicas(33,54,14). Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(28) 11 REVISÃO DA LITERATURA. A grande variedade de mecanismos de ação anticoagulante, e consequentemente da intensidade destas atividades, exibidas pelas fucana, se deve principalmente a sua diversidade estrutural. Assim, a extração e purificação de novas fucanas pode levar a descoberta de potenciais agentes anticoagulantes com atividades possivelmente distintas das exibidas pelos compostos já estudados. Apesar da atividade anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados ser a melhor caracterizada, a atividade antioxidante vem chamando bastante atenção dos pesquisadores. Embora quase todos os organismos apresentem sistemas de defesa antioxidante e de reparo envolvidos na proteção contra o dano oxidativo, estes sistemas são capazes de prevenir que todos os danos oxidativos aconteçam principalmente em situações favoráveis ao surgimento de grandes quantidades de espécies reativas. Por isso, os organismos fazem uso de substâncias antioxidantes exógenas, provenientes da alimentação, como ferramenta adicional para combaterem os radicais livres(56). Neste contexto,. os. polissacarídeos sulfatados, de algas marinhas, vêm ganhando grande destaque. Estes compostos foram descritos pela primeira vez como agentes antioxidantes por Xue e colaboradores(57) e nos últimos anos, tem sido amplamente. descritos. como. potenciais. compostos. antioxidantes.. Os. mecanismos de ação utilizados pelos PSs, extraídos de macroalgas marinhas, são bastante variados. Muitos estudos mostram que fucoidan apresenta atividade antioxidante significativa em experimentos in vitro. É um excelente antioxidante natural e tem um grande potencial para a prevenção de doenças mediadas por radicais Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(29) 12 REVISÃO DA LITERATURA livres(58,59,60). Por exemplo, a partir de fucanas F. vesiculosus apresentou redução dos íons de ferro/poder antioxidante e considerável capacidade de eliminação do radical superóxido(59). Frações da fucana de L. japonica também demostraram significativa capacidade de remoção dos radicais superóxido e hidroxila,. evidenciando. uma. significativa. atividade. antioxidante(61,62,60).. Atividade sequestradora do radical superóxido apresentou correlação positiva com o teor de sulfato das frações polissacarídicas(63,62). Propriedades antioxidantes de carragenanas(63) e ulvans(64) também demonstraram relação com o teor de sulfato. Rocha Souza et al. a partir de relatos sobre a homofucana F. vesiculosus e a heterofucana. de Padina gymnospora demonstrou efeitos inibitórios na. formação de radicais hidroxilo e radical superóxido. Em 1974, Yamamoto et al. reportaram que uma fração não dializada de algumas algas comumente utilizadas no Japão como: Sargassum fulvellum, S. kjiellmanianum, Laminaria angustata e L. angustata var. lonngissima, inibia o crescimento de células do sarcoma 180 implantadas subcutanêamente. em. camundongos, e que esta fração consistia principalmente de polissacarídeos. Muitos polissacarídeos de algas com o potencial antitumoral têm chamado a atenção para o desenvolvimento de novas drogas(67). A α-L-carragenina, uma galactana sulfatada isolada da alga vermelha Chondrus ocellatus, inibi o crescimento tumoral do sarcoma 180 e H22 em camundongos através da proliferação de linfócitos e células NK do baço(68). O potencial antitumoral de polissacarídeos provavelmente minimiza as insatisfações provocadas pelo tratamento do câncer através da quimioterapia e radioterapia. Um grande número de compostos químicos que têm sido Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(30) 13 REVISÃO DA LITERATURA. identificados como agentes específicos para matar células tumorais, como também citotóxicos para células não neoplásicas(69). Desta maneira, muitas dessas drogas antitumorais possuem consideráveis efeitos colaterais, com baixa viabilidade para o uso clínico. Diante desta circunstância, a descoberta e identificação de novas drogas seguras com atividade antitumoral tornou-se uma importante meta da pesquisa nas Ciências Biomédicas(55). O efeito antiproliferativo “in vitro” de fucanas frente a diversas linhagens tumorais já vem sendo estudado há um longo tempo. Como, por exemplo, pode-se citar o efeito antiproliferativo de fucanas frente a células oriundas de carcinoma. broncopulmonar(70),. hepatoma(71),. carcinoma. de. Ehrlich(72),. adenocarcinoma de mama(73), carcinoma de cervix uterino(74), leucemia(75), câncer de colo retal(76) e linfoma(77).Sua ação sobre a proliferação celular ocorre principalmente por duas maneiras: promove parada do ciclo celular e/ou induz morte celular, Porém os estudos aqui citados mostram que esse efeito antiproliferativo se dá devido a uma ação direta das fucanas. Relata-se também que para que esses PSs desempenhem seus efeitos nas células o teor de sulfato presente em suas moléculas é de importância crucial (40,78). A fucana mais estudada com relação ao seu mecanismo de ação antiproliferativo é a fucana de F. vesiculosus conhecida como fucoidan. Este PS promove a ativação de caspase-3, o que consequentemente induz apoptose de células de linfoma humano (HS-sultan cells). Quando este fucoidan de F. vesiculosus foi avaliado com células de carcinoma de colo humano (HCT-15), observou-se que também estimulava apoptose nas HCT-15 por ativar caspases. Os dados mostraram que este efeito era responsável pela atividade. antiproliferativa. Magalhães, K.D.. do. fucoidan(79).. Já. quando. o. mecanismo. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(31) 14 REVISÃO DA LITERATURA. antiproliferativo deste mesmo fucoidan foi avaliado em células pro-mielocíticas humanas (HL60), verificou-se que além de ativar as caspases e aumentar os níveis de fosforilação de ERK, o efeito antiproliferativo do fucoidan também era dependente do aumento da produção de Óxido Nítrico (ON) e da diminuição dos níveis de glutationa citoplasmáticos(75). Por outro lado, em células de câncer de colo humano (HT-29) o mecanismo antiproliferativo do fucoidan nas células HT-29 é mediado por duas vias: a via mitocondrial (intrínseca) e a via ativada por receptores de morte (extrínseca)(76). Ainda não se conhecem todos os mecanismos intracelulares que as fucanas usam para desempenhar suas atividades antiproliferativas. O motivo principal é a sua diversidade estrutural e o fato desses polissacarídeos poderem se associar a uma gama de moléculas. Contudo, parece que esse efeito antiproliferativo não é somente dependente do sulfato presente nas fucanas, mas também da distribuição desses grupamentos na molécula(14,80), uma vez que algumas delas não apresentaram efeito frente algumas linhagens de células tumorais, apesar de serem sulfatadas, enquanto que outras fucanas se mostraram bastante eficazes (79). Apesar das fucanas apresentarem atividade antiproliferativa em diferentes tipos celulares e em alguns casos existir semelhança entre os seus mecanismos de ação, a maioria dos trabalhos existentes na literatura utilizaram o fucoidan de F. vesiculosus e devido às diferenças estruturais esse mecanismo de ação não pode ser generalizado para fucanas presentes em outras espécies de algas.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(32) 15 ANEXAÇÃO DO ARTIGO. Anticoagulant, Antioxidant and Antitumor Activities of Heterofucans from the seaweed Dictyopteris delicatula Revista: International Journal of Molecular Science FATOR DE IMPACTO: 2,279. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(33) 16. Int. J. Mol. Sci. 2011, 12 OPEN ACCESS. International Journal of. Molecular Sciences ISSN 1422-0067 www.mdpi.org/ijms Article. Anticoagulant, Antioxidant and Antitumor Activities of Heterofucans from the Seaweed Dictyopteris delicatula Kaline Dantas Magalhães 1,2,†, Leandro Silva Costa 1,3,†, Gabriel Pereira Fidelis 1, Ruth Medeiros Oliveira 1, Leonardo Thiago Duarte Barreto Nobre 1, Nednaldo Dantas-Santos 1,2, Rafael Barros Gomes Camara 1, Ivan Rui Lopes Albuquerque 1,2 , Sara Lima Cordeiro 1, Diego Araujo Sabry 1, Mariana Santana Santos Pereira Costa 1, Luciana Guimaraes Alves 1 and Hugo Alexandre Oliveira Rocha 1,2,* 1. 2. 3. †. Laboratory of Biotechnology of Natural Polymers (BIOPOL), Department of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brazil; E-Mails: gabrielfideliss@gmail.com (G.P.F.); rmo_85@hotmail.com (R.M.O.); leo_dnobre@yahoo.com.br (L.T.D.B.N.); nednaldod@hotmail.com (N.D.S.); rafael_bgc@yahoo.com.br (R.B.G.C.); ivan.rui@click21.com.br (I.R.L.A.); sara-cordeiro@hotmail.com (S.L.C.); popoh_diego@hotmail.com (D.A.S.); marispc_bio@yahoo.com.br (M.S.S.P.C.); lucianagalves@hotmail.com (L.G.A.) Health Post-Graduate Program, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brazil; E-Mail: kdmbio@yahoo.com.br Federal Institute of Education, Science and Technology of Rio Grande do Norte (IFRN), Santa Cruz-RN, Brazil; E-Mail: leandro-silva-costa@hotmail.com These authors contributed equally to the work.. * Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: hugo@cb.ufrn.br; Tel.: +55-84-32153416 (ext.) 207; Fax: +55-84-32119208. Received: 9 March 2011; in revised form: 11 April 2011 / Accepted: 19 May 2011 / Published:. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(34) 17 Abstract: In the present study, six families of sulfated polysaccharides were obtained from seaweed Dictyopteris delicatula by proteolytic digestion, followed by acetone fractionation and molecular sieving on Sephadex G-100. Chemical analyses demonstrated that all polysaccharides contain heterofucans composed mainly of fucose, xylose, glucose, galactose, uronic acid, and sulfate. The fucans F0.5v and F0.7v at 1.0 mg/mL showed high ferric chelating activity (~45%), whereas fucans F1.3v (0.5 mg/mL) showed considerable reducing power, about 53.2% of the activity of vitamin C. The fucan F1.5v presented the most prominent anticoagulant activity. The best antiproliferative activity was found with fucans F1.3v and F0.7v. However, F1.3v activity was much higher than F0.7v inhibiting almost 100 % of HeLa cell proliferation. These fucans have been selected for further studies on structural characterization as well as in vivo experiments, which are already in progress. Keywords: fucoidan; brown seaweed; biological activities; sulfated polysaccharides. 1. Introduction Marine seaweeds (green, red and brown) are the most abundant source of nonmammalian anticoagulant sulfated polysaccharides in nature. Some structural similarities between sulfated seaweed polysaccharides and heparin led several groups to study algal polysaccharides as antithrombotic [1], anti-adhesive [2], antitumoral [3], antiviral [4], anticoagulant, antioxidant, proangiogenic, anti-inflammatory, anthelmintic compounds [5,6]. The well known sulfated polysaccharides from red seaweed are homogalactans [7] and from brown algae are αL-fucose-containing sulfated homo and heteropolysaccharides [6] called fucan and fucoidan, respectively. On the other hand, green algae synthesize several kinds of sulfated homo and heteropolysaccharides [6]. The Brazilian’s northeast coast has a great variety of seaweeds. However, few pharmacognostical and pharmacological investigations about these seaweeds are carried out to identify new drugs or to find new structures for the development of novel therapeutic agents for the treatment of human diseases such as cancer and infectious diseases [8]. In Brazil, the brown seaweed Dictyopteris delicatula is common along the northeast coast. Recently, we obtained a polysaccharide-rich extract from D. delicatula, which exhibited assorted biological activities, including anticoagulant, antiproliferative and antioxidant activities [9]. However, the biological activities of the purified sulfated polysaccharides from D. delicatula have not been investigated. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(35) 18 On the basis of these considerations, the purpose of the present study was to obtain sulfated polysaccharides from D. delicatula and to evaluate their anticoagulant, antioxidant and antiproliferative activities in vitro. Our results show several noteworthy differences in the activities of polysaccharides from D. delicatula, which are likely connected to differences in the chemical structure of these compounds. This work was directed to the selection of the most active sulfated polysaccharide samples to be studied further as potential novel drugs for thrombosis, antitumor and/or antioxidant therapy. 2. Results and Discussion 3.1. Chemical Analysis Using a methodology that combined proteolysis and acetone precipitation we obtained six polysaccharides preparations from brown seaweed D. delicatula. The addition of increasing volumes of acetone gradually decreased the dielectric constant of water, thereby promoting different sulfated polysaccharide precipitation rates. Acetone separates polysaccharides by the way in which the charges of these polymers interact with water. Thus, those that interact more with water are the last to precipitate. Each fraction was subjected to molecular sieving on Sephadex G-100, monitored for total sugar and metachromasia. Each fraction had a single peak, which indicates that each fraction is composed of a unique population of sulfated polysaccharide (Data not shown). The tubes containing the sulfated polysaccharides were pooled and lyophilized, and the sulfated polysaccharides were also named F0.5v; F0.7v; F1.0v; F1.3v; F1.5v and F2.0v respectively. The chemical analysis of sulfated polysaccharides is summarized in Table 1; sulfate and fucose were found in all polysaccharides. Moreover, other neutral monosaccharides were also found as components of these polymers indicating that that D. delicatula synthesizes at least six families of sulfated heterofucans. Table 1. Chemical composition of sulfated polysaccharides extracted from Dictyopteris delicatula. Total Fucans. Sulfate/. sugar. Sulfate. Total sugar. Proteins. (%). (%). (%/%). (%). Molar ratio. Fuc. Gal. Glc. Man. Xyl. Gluc A. F0.5v. 89.1. 14.1. 0.16. 0.1. 1.0. 2.0. 0.3. 0.5. 0.7. 0.9. F0.7v. 70.0. 17.8. 0.25. 0.3. 1.0. 3.0. 0.4. 0.6. 1.5. 2.2. F1.0v. 65.0. 19.0. 0.29. 0.5. 1.0. 1.9. 0.2. 0.5. 0.8. 1.5. F1.3v. 68.2. 14.5. 0.21. 0.1. 1.0. 2.4. 0.3. 0.2. 0.6. 0.5. F1.5v. 61.3. 15.4. 0.25. 0.1. 1.0. 1.6. 0.2. 0.4. 1.3. 1.9. F2.0v 64.3 16.0 0.25 0.7 1.0 1.8 0.2 0.4 1.6 2.2 Fuc—fucose; Gal—galactose; Glc—glucose; Man—mannose; Xyl—xylose; Gluc A—glucuronic acid.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(36) 19. The heterofucan F1.0v was the polysaccharide with the higher percentage of sulfate (19.0%) in comparison to other heterofucans. In addition, when the sulfate/total sugar ratio was determinate (Table 1) F1.0v showed the highest ratio, whereas F0.5v presented the smallest ratio. All the polysaccharides showed low protein contamination, which ranged from 0.1 (F0.5v, F1.3v and F1.5v) to 0.7% (F2.0v); this is due to the use of the proteolytic enzyme during the method of polysaccharide extraction. The monosaccharide composition of sulfated polysaccharides is also shown in Table 1. All fractions showed the same constitution on monosaccharides: fucose, galactose, glucose, mannose, xylose and glucuronic acid. The data showed galactose as the main sugar present in the all of the heterofucans, but the amount of this sugar is different in each polymer. In addition, there are differences among the relative proportions of glucuronic acid and xylose observed in different polysaccharides; they are found in greater amounts in F0.7v; F1.5v and F2.0v. On the other hand, the proportion of mannose and glucose did not show higher differences among the heterofucans. Thus, it is clear that the relative amounts of these sugars vary according to the fucan extracted. Most brown seaweeds synthesize sulfated polysaccharides consisting mainly of sulfated L-fucose with fucose content about 34–44%. They may as well contain small portions of galactose, mannose, glucose, xylose and glucuronic acid [5]. However, there are also heterofucans with only minor fucose components. In these polysaccharides, other monosaccharides like glucuronic acid [10] exceed the fucose content. It is well known that several brown seaweeds produced only one kind fucan, this not a rule and several brown seaweeds synthesize more than one kind of fucan. Using the same method described in this paper we have extracted three fucans from Dictyota mertensii [11] and Spatoglossum schröederi [10] as well as five fucans from Dictyota menstrualis [12] and Padina gymnospora [13]. In addition, other studies have shown brown seaweed synthesizing more than one fucan, including Adenocystis utricularis [14], Analipus japonicus [15], Ascophylum nodosum [16,17], Sargassum vulgare [11], Padina pavonia [18], Sargassum stenophylum [19]. Heterofucans from brown seaweed have been described since 1950 [20] and in some cases galactose was reported to be a major component [21,12]. Because they have not been frequently described, we decided to analyze the some biological activities of these heterofucans from D. delicatula. 3.2. Anticoagulant Activity by APTT and PT Assays The anticoagulant properties of the heterofucans were evaluated using PT and APTT assays. No clotting inhibition was observed in PT test of any of the samples at the concentrations assayed (data not shown). On the other hand, APTT were prolonged by Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(37) 20 all the polysaccharides, in a dose-dependent manner, with regards to the control (Figure 1). The heterofucans F0.7v and F1.0v showed low anticoagulant activity while F1.5v presented the most prominent anticoagulant activity with 3.8 of APTT ratio with only 0.40 mg/mL of plasma. When compared to Clexane®, a low molecular weight heparin, at same concentration F1.5v presented similar anticoagulant activity (p < 0.05). Fucans have a wide variety of biological activities, but their potent anticoagulant action is by far the most widely studied. The heterofucans from D. delicatula exhibited anticoagulant activity by APTT test only, which suggested that the sulfated polysaccharide extracted from D. delicatula inhibited both the intrinsic and/or common pathways of coagulation. In addition, none of the fucans from D. delicatula affected a PT test, which indicates that the extrinsic pathway of coagulation would not be inhibited or, at least, the high kinetic of the assay would not allow the detection of the anticoagulant activity of these polymers. All the fucans from D. delicatula showed anticoagulant activity in different levels, however there was no correlation between total sulfate content and the APTT test (R2 = 0.190). Thus, the heterofucan F1.5v was the most potent anticoagulant compound, followed by F0.5v and F2.0v. In addition, F1.5v showed anticoagulant activity similar to Clexane®, an anticoagulant commercial drug of reference. Our data are in agreement with several works that clearly show that the anticoagulant effect of fucans was stereo-specific and not merely a consequence of their charge density or sulfate content [22]. The position of sulfate groups on sugar residues is also very important for the anticoagulant activity of fucan. The activity relates to the concentrations of C-2 sulfate and C-2,3 disulfate [16], moreover, Silva and colleges reported that 3-O-sulfation at C-3 of 4-α-L-fucose-1 → units was responsible for the anticoagulant activity of heterofucans from Padina gymnospora [13]. F1.5v has been selected for further bio-guided fractionation and isolation of active fractions containing potent anticoagulant fucans which will be further submitted to structural analysis in order to identify the structural features responsible for their anticoagulant activity.. Figure 1. Anticoagulant activity of sulfated polysaccharides from Dictyopteris delicatula. Results were expressed as ratios obtained by dividing the clotting time achieved with the anticoagulant by the time achieved with the control. Hep—Heparin; Cle—Clexane® (Enoxaparin). Each value is the mean ± SD of three determinations (n = 6). a indicates a significant difference when compared with Clexane® control; b indicates a similar APTT ratio when compared with Clexane® control.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(38) 21. 3.3 Antioxidant activity Antioxidant activity was evaluated in different assays: scavenging hydroxyl and superoxide radicals, power reducing and ferrous chelating. Antioxidants inhibit interaction between metal and lipid through formation of insoluble metal complexes with ferrous ion or generation of steric hindrance. The ironchelating capacity test measures the ability of antioxidants to compete with ferrozine in chelating ferrous ion. Activity is measured as the decrease in absorbance of the red Fe2+/ferrozine complex. The plot of iron-chelating capacity as a function of sample concentration is shown in Figure 2A. The results revealed that heterofucan F1.3v did not statistically exhibit significant differences (p > 0.05) in ferrous chelating capacity compared with negative control (saline, data not shown), while F1.5v and F2.0v showed very low activity. On the other hand, the heterofucans F0.5v, F0.7v and F1.0v presented a dose-dependent chelating capacity. The most active compound was F0.5v with 45.5% of ferrous chelating at 1.5 mg/mL. This activity was only 1.8 times lower than EDTA activity at the same concentration under the same experimental condition (Data not shown). The purification process did not increase the chelating effect of the heterofucans compared to the chelating effect of sulfated polysaccharide-rich extract from D. delicatula [9]. However, ferrous ions are considered to be the most effective pro-oxidants present in food systems [23]. Thus, the metal-chelating property of these heterofucans, mainly F0.5v and F0.7v, showed that they might be applied in adsorption, metal ions separation or wastewater treatment and antioxidant therapy. Figure 2. Antioxidant activity of sulfated polysaccharides from Dictyopteris delicatula. (A) Chelating effect; (B) Power reducing assay. Each value is the Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(39) 22 mean ± SD of three determinations. a,b,c,d Distinct letters indicates a significant difference between sulfated polysaccharides when compared at each concentration (p < 0.05). A. B. The reducing power assay was expressed as percentage activity of ascorbic acid control at 0.1 mg/mL and the data are shown in Figure 2B. Here, the heterofucans F0.5v, F0.7v and F2.0v showed extremely low activity when compared to the activity of vitamin C (0.1 mg/mL). Furthermore, fucans F1.0v, F1.3v and F1.5v showed considerable reducing power, especially F1.3v, which showed 53.2% of the activity of vitamin C at 0.5 mg/mL. It has been previously reported that there was a direct correlation between antioxidant activities and reducing power of polysaccharide. The reducing activities were usually related to the development of reductones. Reductones were reported to be terminators of free radical chain reactions by donating a hydrogen atom. In most cases, irrespective of the stage in the oxidative chain in which the antioxidant action is assessed, most nonenzymatic antioxidative activity is mediated by redox reactions [24]. Thus, several workers have reported that the antioxidant activity was concomitant with the reducing power. Zhang et al. [25] showed that acetylated polysaccharides with high donating-hydrogen abilities showed excellent reducing power, and in sulfated polysaccharides, the presence of the sulfate groups lead to the diminution of hydroxyl groups, which resulted in the descent of the reducing power. Our data showed that the most active fucan (F1.3v) is the fucan that has the smallest sulfate/total sugar ratio. Thus, our data indicates that the reducing power activity of the D. delicatula fucans studied here depends on the spatial patterns of sulfate groups, and it is unlikely to be merely a charge density effect.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(40) 23 Superoxide anion scavenging results in the presence of the heterofucans or commercial antioxidant are exhibited in Table 2. In this assay, the fucans F1.0v, F1.3v and F2.0v did not show superoxide scavenging activity, while F0.5v and F0.7v presented very low superoxide scavenging with 5.7 and 4.8% at 0.5 mg/mL, respectively. Moreover, F1.5v was the unique polysaccharide with moderate superoxide radical scavenging activity (13.4% of scavenging at 0.5 mg/mL). This value is 2.4-fold less than the superoxide activity of a rich-sulfated polysaccharide extract from D. delicatula obtained in previous study [9]. This suggests that sulfated polysaccharides of D. delicatula may act synergistically to promote a more efficient superoxide radical scavenging. We determined the hydroxyl radical scavenging activity of the heterofucans of D. delicatula. Table 2 depicts the results obtained for the inhibition of hydroxyl radical formation. Only the sulfated polysaccharides F0.5v, F0.7v and F1.0v have shown activity in hydroxyl radical scavenging. However, these polysaccharides showed moderate activity with scavenging activity of 14.4%, 15.6% and 17.0%, respectively, at 0.5 mg/mL. For this assay, gallic acid showed 93.7% radical scavenging effect at 0.5 mg/mL concentration. In this work, all the polysaccharides from D. delicatula were poor effective hydroxyl radical scavengers, which is unsurprising, since the most of the sulfated polysaccharides reported in the literature have a weak hydroxyl radical scavenger activity [22]. However, heterofucans from Padina gymnospora [26], which have similar monosaccharide composition of fucans from D. delicatula, as well as, homofucans from Fucus vesiculosus and Laminaria japonica [26,27] have high activity as hydroxyl radical scavengers. The results reported here are very interesting, since they indicate that brown seaweed D. delicatula synthesizes heterofucans with different antioxidant mechanisms. Although their antioxidant potential was not significantly high in some assays, the sum of individual effects of these polymers should be used as a defense strategy of this seaweed. This would supply a more efficient defense against free radicals. 3.4. Antiproliferative Activity The viability of HeLa cells treated with sulfated polysaccharides for 24 h was determined using a colorimetric MTT-based assay (Figure 3). Initially, the antiproliferative activity of sulfated polysaccharides was evaluated in a single concentration, 2.0 mg/mL. F2.0v showed the lowest activity inhibiting only 14.1% of cell viability. The best antiproliferative activity was found with F1.3v and F0.7v that inhibit 91.8% and 60.0% of HeLa cells proliferation, respectively (Figure 3A). Thus, the antiproliferative activity of these fucans was evaluated at different concentrations.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(41) 24 Figure 3B demonstrates that this effect of fucan F0.7v is a dose-dependent effect, reaching the saturation around 0.4 mg/mL. In addition, it showed higher antiproliferative activity than F1.3v in low concentration (from 0.1 to 0.6 mg/mL). The heterofucan F1.3v also showed a dose-dependent antiproliferative activity, reaching the saturation around 2.0 mg/mL. However, its activity was much higher than F0.7v inhibiting almost 100 % of HeLa cell proliferation.. Table 2. Hydroxyl and superoxide radical scavenging activity of sulfated polyssacharides from Dictyopteris delicatula. Sulfated polysaccharides F0.5v. F0.7v. F1.0v. F1.3v. F1.5v. F2.0v. Gallic acid. Magalhães, K.D.. Concentration (mg/mL) 0.05 0.1 0.25 0.5 0.05 0.1 0.25 0.5 0.05 0.1 0.25 0.5 0.05 0.1 0.25 0.5 0.05 0.1 0.25 0.5 0.05 0.1 0.25 0.5 0.05 0.1 0.25 0.5. Inhibition (%) OH. O2-. 6.1 ± 0.7 2.8 ± 2.1 9.6 ± 0.4 4.9 ± 3.1 11.0 ± 0.9 5.1 ± 3.4 14.4 ± 2.1 5.7 ± 4.0 0.5 ± 0.7 3.9 ± 0.3 12.4 ± 3.5 6.1 ± 0.9 13.4 ± 4.7 6.7 ± 3.1 15.6 ± 3.8 4.8 ± 2.4 6.6 ± 3.1 0±0 12.7 ± 2.9 0±0 16.9 ± 2.2 0±0 17.0 ± 3.4 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 3.9 ± 2.1 0±0 4.9 ± 3.1 0±0 9.6 ± 3.4 0±0 13.4 ± 2.1 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 11.6 ± 1.7 28.9 ± 3.8 43.6 ± 2.4 41.8 ± 4.7 64.3 ± 3.0 72.1 ± 2.9 93.7 ± 3.7 86.3 ± 3.1. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(42) 25 Earlier, we demonstrated a polysaccharide-rich extract from D. delicatula inhibiting Hela proliferation in a dose-dependent manner, reaching the saturation around 2.0 mg/mL (~61%) [9]. When we purified the fucans from this seaweed, it was clear that the fucan F1.3v was the most responsible for antiproliferative activity of the polysaccharide-rich extract from D. delicatula, since this fucan inhibited almost 100% HeLa proliferation. There have been a number of studies on the antitumor activity of fucan in vivo and in vitro [5,6,22,28]. Although the precise mechanisms underlying this activity remain to be determined, a few possibilities have been proposed. Fucan is speculated to act by inhibiting tumor angiogenesis modulating host immune systems [22], arresting the cell cycle, and/or inducing apoptosis [29]. From the experiment carried out here it was clear that the mechanism of action of F1.3v is directly on the HeLa cell. Further studies will clarify the antiproliferative mechanism of fucan F1.3v. Figure 3. Influence of sulfated polysaccharides from Dictyopteris delicatula on inhibition of cell proliferation of HeLa cells after 72 h incubation: (A) Antiproliferative activity of sulfated polysaccharides at concentration of 2.0 mg/mL; (B) Dose-dependent effect of sulfated polysaccharides. Each value is the mean ± SD of seven determinations. Different letters indicates a significant difference between concentrations of individual sulfated polysaccharides (p < 0.05); the asterisk indicates a significant difference between different sulfated polysaccharides at same concentration (p < 0.05).. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(43) 26 3. Experimental Section 3.1. Materials Arabinose, mannose, galactose, xylose, fucose, glucuronic acid and unfractionated heparin were obtained from Sigma (St. Louis, MO, USA). Acetone and sulfuric acid were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). Clexane® (enoxaparin) was purchased from Aventis (São Paulo, Brazil). 3.2. Extraction of Polysaccharides The marine alga Dictyopteris delicatula Lamouroux was collected in the sub littoral of Natal, RN, Brazil. The extraction of sulfated polysaccharide followed the procedure described by Rocha et al. [30]. Immediately after collection, the seaweed was dried at 50 °C under ventilation and ground in a blender. Next, it was treated with acetone to eliminate lipids and pigments. One hundred grams of defatted, dried, and powdered alga were suspended in 500 mL of 0.25 M NaCl, and the pH was adjusted to 8.0 with NaOH. Twenty milligrams of maxatase, an alkaline protease from Esporobacillus (Biobras, MG, Brazil), was added to the mixture for proteolytic digestion. After 18 h of incubation at 60 °C under agitation, the mixture was filtered through cheesecloth. The filtrate, which is the D. delicatula’ polysaccharide-rich extract, was fractionated by acetone precipitation as follows: 0.5 volumes of ice-cold acetone was added to the solution under gentle agitation and maintained at 4 °C for 24 h. The precipitate formed was collected by centrifugation (10.000 × g, 20 min), vacuum dried, resuspended in distilled water, and analyzed. The operation was repeated by adding 0.7, 1.0, 1.3, 1.5 and 2.0 volumes of acetone to the supernatant. These fractions were further purified by molecular sieving in Sephadex G-100 (140 × 2.6 cm). About 200 mg of each fraction, dissolved in 2 mL of water, was applied to the column and eluted with a solution of 0.2 M acetic acid and 0.15 M NaCl, and fractions of 1 mL were collected and assayed by the phenol/H2SO4 reaction [31] and by metachromatic assay using 1,9dimethylmethylene blue [32]. The fractions containing the sulfated polysaccharides were pooled, dialyzed against distilled water, and lyophilized. 3.3. Chemical Analysis and Monosaccharide Composition Total sugars were estimated by the phenol-H2SO4 reaction [31] using L-fucose as standard. Sulfate content was determined according to the gelatin-barium method [33], using sodium sulfate (1 mg/mL) as standard and after acid hydrolysis of the polysaccharides (4 M HCl, 100 °C, 6 h). Protein content was measured using Spector’s method [34].. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(44) 27 The polysaccharides were hydrolyzed with 0.5, 1, 2, and 4 M of HCl, respectively, for various lengths of time (0.5, 1, 2 and 4 h) at 100 °C. Reducing sugars were determined using the Somogyi-Nelson method [35]. After acid hydrolysis, sugar composition was determined by a LaChrom Elite® HPLC system from VWR-Hitachi with a refractive index detector (RI detector model L-2490). A LichroCART® 250-4 column (250 mm × 40 mm) packed with Lichrospher® 100 NH2 (5 μm) was coupled to the system. The sample mass used was 0.2 mg and analysis time was 25 min. The following sugars were analyzed as references: arabinose, fructose, fucose, galactose, glucose, glucosamine, glucuronic acid, mannose, and xylose. The amount of uronic acid was determinate as described by Leite et al. [10]. 3.4. Anticoagulant Activity All the Protrombin Time (PT) and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) coagulation assays were performed with a coagulometer as described earlier [12] and measured using citrate-treated normal human plasma. All assays were performed in duplicate and repeated at least three times on different days (n = 6). The results were expressed as APTT ratio, which was determined as follows: APTT control time/APTT sample time. 3.5. Antioxidant Activity To analyze the antioxidant activity of the sulfated polysaccharides obtained, three assays were performed: hydroxyl radical scavenging, superoxide radical scavenging, and ferric chelating, as described previously [9]. 3.5.1. Hydroxyl Radical Scavenging Activity Assay The scavenging activity of seaweed sulfated polysaccharides against the hydroxyl radical was investigated using Fenton´s reaction (Fe 2+ + H2O2  Fe3+ + OH− + OH.). These results were expressed as an inhibition rate. Hydroxyl radicals were generated using a modified method [17] in 3 mL sodium phosphate buffer (150 mM, pH 7.4), which contained 10 mM FeSO4.7H2O, 10 mM EDTA, 2 mM sodium salicylate, 30% H2O2 (200 µL) and varying sulfated polysaccharide concentration. In the control, a sodium phosphate buffer replaced H2O2. The solutions were incubated at 37 °C for 1 h, and the presence of the hydroxyl radical was detected by monitoring absorbance at 510 nm. 3.5.2. Superoxide Radical Scavenging Activity Assay The assay was based on the capacity of sulfated polysaccharides to inhibit the photochemical reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) in the riboflavin–light–NBT Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(45) 28 system. Each 3 mL reaction mixture contained 50 mM phosphate buffer (pH 7.8), 13 mM methionine, 2 μM riboflavin, 100 μM EDTA, NBT (75 μM), and 1 mL sample solution. The production of blue formazan was followed by monitoring the increase in absorbance at 560 nm after 10 min illumination from a fluorescent lamp. The entire reaction assembly was enclosed in a box lined with aluminum foil. Identical tubes with the reaction mixture were kept in the dark and served as blanks. 3.5.3. Ferric Chelating The ferrous ion chelating ability of samples was investigated according to previous studies [9]. Briefly, the reaction mixture, containing samples of FeCl 2 (0.05 mL, 2 mM) and ferrozine (0.2 mL, 5 mM), was well shaken and incubated for 10 min at room temperature. The absorbance of the mixture was measured at 562 nm against a blank. 3.6. Cell Proliferation Studies HeLa cells were grown in 75 cm2 flasks in DMEM medium. Cells were seeded into 96-well plates at a density of 5 × 103 cell/well and allowed to attach overnight in 300 μL medium incubated at 37 °C, 5% CO2. The sulfated polysaccharides fractions were added at a final concentration of 0.01; 0.1; 1.0 and 2.0 mg/mL, for 72 h at 37 °C and 5% CO2. After incubation, traces of sulfated polysaccharides fractions were removed by washing the cells twice with 200 μL PBS and applying 100 μL of fresh medium plus and 10 μL of 12 mM MTT dissolved in PBS to determine the effects of the algal sulfated polysaccharides on cell proliferation. Cells were then incubated for 4 h at 37 °C, 5% CO2. In order to solubilize the product of MTT cleavage, 100 μL of isopropanol containing 0.04 M HCl was added to each well and thoroughly mixed using a multichannel pipettor. Within 1 h of HCl-isopropanol addition, the absorbance at 570 nm was read using a Multiskan Ascent Microplate Reader (Thermo Labsystems, Franklin, MA). The percent inhibition of cell proliferation was calculated as follows: % Inhibition =. Abs. 570 nm Control—Abs. 570 nm sample X 100 Abs. 570 nm Control Each concentration of the respective sulfated polysaccharide was assayed in sevenfold. 3.7. Statistical Analysis All data were expressed as mean ± standard deviation. Statistical analysis was done by one-way ANOVA using the SIGMAStat version 2.01 computer software. StudentNewmans-Keuls post-tests were performed for multiple group comparison. In all cases statistical significance was set at p < 0.05.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(46) 29 4. Conclusions In conclusion, we have extracted six heterofucans from the brown seaweed D. delicatula which showed anticoagulant, antioxidant and antiproliferative activities at different levels of activity. However, it has become clear that at least some of these activities are not merely an effect of high charge density but have distinct structural specificities. Future conformational studies of well-defined fucan structures should lead to a better understanding of the biological properties of these fucans. Acknowledgements We wish to thank CNPq, CAPES and MCT for their financial support in the form of grants and fellowship awards. KD Magalhaes, RM Oliveira, RBG Camara, GP Fidelis, LTDB Nobre, SL Cordeiro, MSSP Costa, DA Sabry and N D-Santos thank CNPq and CAPES for fellowship support. References 1.. 2.. 3.. 4. 5. 6. 7.. 8.. Barroso, E.M.A.; Costa, L.S.; Medeiros, V.P.; Cordeiro, S.L.; Costa, M.S.S.P.; Franco, C.R.C.; Nader, H.B.; Leite, E.L.; A non-anticoagulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo. Planta Med. 2008, 74, 712–718. Rocha, H.A.O.; Franco, C.R.C.; Trindade, E.S.; Carvalho, L.C.M.; Veiga, S.S.; Leite, E.L.; Dietrich, C.P.; Nader, H.B. A fucan from the brown seaweed Spatoglossum schröederi inhibits Chinese hamster ovary cell adhesion to several extracellular matrix proteins. Braz. J. Med. Biol. Res. 2001, 34, 621–626. Hyun, J.H.; Kim, S.C.; Kang, J.I.; Kim, M.K.; Boo, H.J.; Kwon, J.M.; Koh, Y.S.; Hyun, J.W.; Park, D.B.; Yoo, E.S.; Kang, H.K. Apoptosis inducing activity of fucoidan in HCT–15 colon carcinoma cells. Biol. Pharm. Bull. 2009, 32, 1760– 1764. Ohta, Y..; Lee, J.B.; Hayashi, H.; Hayashi, T. Isolation of galactan from Codium fragile and its antiviral effects. Biol. Pharm. Bull. 2009, 32, 892–898. Bilan, M.I.; Usov, A.I. Structural analysis of fucoidans. Nat. Prod. Commun 2008, 3, 1639–1648. Jiao, G.; Yu, G.; Zhang, J.; Ewart, H.S. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae. Mar. Drugs 2011, 9, 196–223. Michel, G.; Nyval-Collen, P.; Barbeyron, T.; Czjzek, M.; Helbert, W. Bioconversion of red seaweed galactans: a focus on bacterial agarases and carrageenases. Appl Microbiol Biotechnol 2006, 71, 23–33. Cunha, P.L.R.; Paula, R.C.M.; Feitosa, J.P.A. Polysaccharides from brazilian biodiversity: an opportunity to charge knowledge into economic value. Quim. Nova 2009, 32, 649–660.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

(47) 30 9.. 10.. 11.. 12.. 13.. 14.. 15.. 16.. 17. 18. 19.. 20.. Costa, L.S.; Fidelis, G.P.; Cordeiro, S.L.; Oliveira, R.M.; Sabry, D.A; Câmara, R.B.G.; Nobre, L.T.D.B.; Costa, M.S.S.P.; Almeida-Lima, J.; Farias, E.H.C.; Leite, E.L.; Rocha, H.A.O. Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds. Biomed. Pharmacother. 2010, 64, 21–28. Leite, E.L.; Medeiros, M.G.L.; Rocha, H.A.O.; Farias, G.G.M.; Silva, L.F.; Chavante, S.F.; Abreu, L.D.; Dietrich, C.P.; Nader, H.B. Structure and pharmacological activities of a sulfated xylofucoglucuronan from the alga Spatoglossum schröederi . Plant Sci. 1998, 132, 215–228. Dietrich, C.P.; Farias, G.G.M.; Abreu, L.R.D.; Leite, E.L.; Silva, L.F.; Nader, H.B. A new approach for characterization of polysaccharides from algae: Presence of four main acidic polysaccharides in three specie of the class Phaeophycea. Plant Sci. 1995, 108, 143–153. Albuquerque, I.R.L; Queiroz, K.C.S.; Alves, L.G.; Santos, E.A.; Leite, E.L.; Rocha, H.A.O. Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity. Braz. J. Med. Biol. Res. 2004, 37, 167–171. Silva, T.M.A.; Alves, L.G.; Queiroz, K.C.S.; Santos, M.G.L.; Marques, C.T.; Chavante, S.F.; Rocha, H.A.O.; Leite, E.L. Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed Padina gymnospora. Braz. J. Med. Biol. Res. 2005, 38, 523–533. Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies. Carbohydr. Res. 2003, 338, 153–165. Bilan, M.I.; Zakharova, A.N.; Grachev, A.A.; Shashkov, A.S.; Nifant'ev, N.E.; Usov, A.I. Polysaccharides of algae: 60. Fucoidan from the Pacific brown alga Analipus japonicus (Harv.) Winne (Ectocarpales, Scytosiphonaceae). Bioorg Khim 2007, 33, 44–53. Chevolot, L.; Mulloy, B.; Ratiskol, J.; Foucault, A.; Colliec-Jouault, S. A disaccharide repeat unit is the structure in fucoidans from two species of brown algae. Carbohydr. Res. 2001, 330, 529–535. Marais, M.F.; Joseleau, J.P. A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum. Carbohydr. Res. 2001, 336, 155–159. Hussein, M.M.; Abdel, A.; Salem, H.M. Sulfated heteropolysaccharides from Padina pavoia. Phytochemistry 1980, 19, 2131–2132. Duarte, M.E.R.; Cardoso, M.A.; Noseda, M.D.; Cerezo, A.S. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum. Carbohydr. Polym. 2001, 333, 281-293. Kloareg, B.; Quatrano, R.S. Structure of cell wall of marine algae and ecophysiological function of matrix polysaccharides. Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev. 1988, 26, 259–315.. Magalhães, K.D.. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.