Comunidade de nemátodes do solo associada
a Quercus suber em declínio
Dissertação de Mestrado em
Engenharia Agronómica
Mário Rui Teixeira Maia da Silva
Orientadores:
Prof.ª Dra. Ana Maria Araújo de Beja Neves Nazaré Pereira
Prof.ª Dra. Maria Teresa da Silva Craveiro Martins de Almeida
Composição do Júri:
Vila Real, 2017
Prof. Dr. Virgílio Alexandre Cardoso e Falco da Costa
Prof. Dr. Luís Miguel Ferreira Pontes Martins
Agradecimentos
Finda esta jornada, estão em ordem diversos agradecimentos a todos que tiveram, de alguma forma, um impacto positivo no desenvolvimento desta dissertação.
Gostava, portanto, de agradecer à Herdade das Barradas da Serra, por permitir o desenvolvimento deste estudo na sua propriedade, ao Instituto de Ciências da Vida e da Saúde da Universidade do Minho (ICVS) e à Doutora Andreia Castro, pela cedência das culturas de C. elegans e de E. coli, fulcrais para o trabalho laboratorial. Ao Laboratório de Solos da UTAD, pela prontidão na realização das análises de solo. Aos colegas do Laboratório de Biodiversidade, por me terem acolhido e ajudado, sempre que necessitei. Um agradecimento especial à Daniela, à Isabel, ao Pedro e ao Arunava, por me aturarem com todas as minhas dúvidas no laboratório.
À Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro, pelas experiências proporcionadas e a Vila Real, por se ter tornado uma segunda casa. Ao CBMA e à Universidade do Minho, por me terem acolhido durante a realização deste trabalho, foi bom regressar.
Agradeço, também, à Professora Teresa Lino Neto, pela cedência das primeiras amostras e dos kits para a extração de DNA, e também pela oportunidade de ir a Grândola recolher mais solo e ver o montado pessoalmente, e à Daniela Costa, por toda a ajuda com o processo de extração e amplificação de DNA.
A todos os meus colegas e amigos do Mestrado, por todo o apoio. Em especial, à Adriana, à Cris e à Cristina. Sem vocês, Vila Real seria muito mais fria. Aos meus amigos de sempre, Zé, Rui, Ana Rita, André, Cibrão, João, Rita, Carina, Alice, Mila, Isa e Vanessa, por todas as palavras amigas e apoio, sei que posso sempre contar convosco, em qualquer ocasião. Obrigado por todos os cafés e jantares, por todas as conversas sobre o presente e o futuro, por sempre me dizerem que sou capaz. Obrigado. Aos meus afilhados, Daniela e Tiago, por me motivarem a ser um bom exemplo e por toda a força que me dão. À Estudantina de Braga, a minha tuna, por ser o meu escape e uma segunda família, não há como pôr em palavras o quanto é precioso para mim, o tempo que passo convosco. Obrigado a todos por estarem sempre lá para mim.
Um agradecimento muito especial às minhas orientadoras, Professora Ana Maria e Professora Teresa e ainda à Doutora Sofia Costa, cujo contributo foi imprescindível para este trabalho. À Doutora Sofia, por toda a disponibilidade, todo o conhecimento e toda a experiência partilhada tanto teórica como prática, sempre com boa disposição, e também por nutrir ainda mais o gosto que tenho pela ciência e pela Nematologia. Mesmo sem ser a sua área, a Professora Ana Maria aceitou orientar-me; todo o seu apoio e motivação, bem como a ajuda com a escrita, foram extremamente importantes para o meu sucesso nesta demanda. Agradeço-lhe toda a disponibilidade, apoio, motivação e boa disposição em todas as ocasiões.
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
O amor que tenho à Nematologia, descobri-o com a Professora Teresa, sempre incansável, motivando-me para fazer mais e melhor, ensinando com paixão e dedicação, o seu apoio em todo o processo moldou definitivamente o meu percurso académico. Resta-me agradecer-lhe por tudo o que fez e faz em prol do meu crescimento académico. O vosso contributo foi essencial para o desenvolvimento deste trabalho, mas também para o meu crescimento como biólogo e como nematologista. Foi uma honra poder trabalhar e aprender convosco. Guardarei, com amizade, todas estas experiências que me proporcionaram. Obrigado por acreditarem no meu trabalho e por tudo o que me ensinaram.
Finalmente, o maior agradecimento de todos, à minha Mãe, Manuela e à minha irmã, Inês, a quem este trabalho é dedicado. Sem vocês, nunca teria chegado aqui, nem saberia o que fazer no futuro. Obrigado por serem, indubitavelmente, a maior fonte de apoio e motivação que tenho na minha vida.
Resumo
O sobreiro, Quercus suber, tem sofrido um declínio acentuado nas últimas décadas. Tendo já sido alvo de diversos estudos, as causas para este fenómeno ainda não são totalmente compreendidas. A relação entre os diversos fatores que lhe podem estar associados é complexa, interessando conhecer diferenças entre sobreiros que apresentem percentagens de declínio distintas. A comunidade de nemátodes da rizosfera pode ser utilizada como um indicador da qualidade do solo e dos seus processos, podendo demonstrar inter-relações estabelecidas nas diferentes condições. Neste trabalho pretendeu-se conhecer a comunidade de nemátodes associada a sobreiros em diferentes estados de declínio numa área predominante de sobreiro em Portugal (região de Grândola).
Recolheram-se amostras de solo da rizosfera de sobreiros em diferentes estados de declínio, sujeitos a condições ambientais semelhantes, para extracção, identificação e classificação por grupos funcionais dos nemátodes (espetro colonizador-persistente), como base para o cálculo de índices ecológicos. Devido à abundância de nemátodes colonizados por fungos, procedeu-se ainda ao isolamento e identificação de fungos nematófagos através da sequenciação da região ITS.
Os indicadores das comunidades de nemátodes estudadas revelaram sistemas edáficos onde predominam canais de decomposição bacteriana. Nas amostras analisadas foram detetados nemátodes fitoparasitas dos géneros: Gracilacus, Helicotylenchus, Hemicycliophora, Hoplolaimus, Longidorus, Paratrichodorus, Pratylenchoides, Pratylenchus, Psilenchus, Rotylenchus, Tylenchorhynchus, Xenocriconemella e Xiphinema. A análise
estatística confirmou diferenças entre as comunidades de nemátodes e estabeleceu correlações altamente significativas entre a percentagem de declínio e diversos descritores da comunidade, destacando-se: a densidade populacional de nemátodes bacterívoros e carnívoros e a abundância de nemátodes fitoparasitas do género Xenocriconemella. As comunidades de nemátodes de sobreiros de percentagens de declínio baixa ou intermédia diferiram das comunidades de nemátodes de sobreiros de percentagem elevada. Foram obtidos quatro isolados a partir de nemátodes colonizados por fungos, tendo sido identificados dois fungos patogénicos: Cladosporium sp. e Cytospora sp. e dois fungos com actividade nematodicida: Trichoderma sp. e Penicillium bilaiae.
As comunidades de nemátodes diferiram entre sobreiros em classes de declínio distintas demonstrando indícios do envolvimento do género Xenocriconemella e da comunidade bacteriana neste processo. A comunidade de nemátodes poderá vir a constituir uma ferramenta útil na previsão e avaliação do estado sanitário de sobreiros.
Palavras chave: bioindicadores, ecologia do solo, grupos tróficos, índices ecológicos, nemátodes fitoparasitas
Abstract
The cork oak, Quercus suber, has suffered from an accentuated decline for the past decades. Having been subject to many studies, the causes for this phenomenon are not yet fully understood. The connections between the diverse factors associated with cork oak decline is complex, therefore it is of utmost interest to understand differences between trees that show distinct percentages of decline. The soil nematode community can be used as an indicator of soil quality and function, being able to demonstrate interactions established in different conditions. The aim of this study was the analysis of the soil nematode communities in the rhizosphere of trees of varying percentages of decline in a major cork oak area in Portugal (Grândola region).
Soil samples from the rhizosphere of cork oaks in different percentages of decline, subject to the same environmental conditions, were collected for nematode extraction, identification and classification according to functional groups (colonizer-persister spectrum), as basis for ecological index calculations. Due to an abundance in nematodes revealing fungal structures in their organisms, the isolation and identification of nematophagous fungi was attempted through ITS region sequencing.
Soil nematode community indicators revealed edaphic systems where bacterial channels of decomposition predominate. In the analysed samples, the following genus of plant parasitic nematodes were detected: Gracilacus, Helicotylenchus, Hemicycliophora, Hoplolaimus,
Longidorus, Paratrichodorus, Pratylenchoides, Pratylenchus, Psilenchus, Rotylenchus, Tylenchorhynchus, Xenocriconemella and Xiphinema. Statistical analysis confirmed
differences between nematode communities and established high significance correlations between the percentage of decline and numerous community descriptors, from which the populational density of bacterivores and carnivores and the abundance of Xenocriconemella sp. are most noteworthy. Differences were noted between the nematode communities within the rhizosphere of cork oaks in a low or intermediate percentage of decline when compared with communities of cork oaks of higher percentage. Four fungal isolates were obtained from nematodes bearing fungal structures, having two been identified as phytopathogenic fungi:
Cladosporium sp. and Cytospora sp. and two as nematicidal fungi: Trichoderma sp. and Penicillium bilaiae.
Soil nematode communities were different between cork oaks of different decline classes, hinting at the involvement of the genus Xenocriconemella and the bacterial community in the phenomenon. The nematode community could become a useful tool in the prediction and evaluation of the health status of cork oaks.
Keywords: bioindicators, ecological indexes, plant parasitic nematodes, soil ecology, trophic groups.
Índice Geral
Índice de Figuras ... I
Índice de Quadros ... III
Lista de Abreviaturas, Acrónimos e Siglas ... VI
Introdução ... 3
1. Estado da Arte ... 7
1.1 O Sobreiro ... 7
1.2 O Montado ... 9
1.3 Nemátodes do Solo ... 11
1.4 Índices Ecológicos da Comunidade de Nemátodes do Solo ... 16
1.4.1 Índice de Maturidade e Índice de Fitoparasitas ... 16
1.4.2 Índice de Canal, Índice de Estrutura, Índice de Enriquecimento e Índice Basal .... 17
1.4.3 Pegada Metabólica ... 18
1.4.4 Aplicação ... 19
1.5 Comunidades de Nemátodes Associadas a Quercus suber ... 19
1.6 Inimigos Microbianos dos Nemátodes ... 20
2. Material e Métodos... 25
2.1 Caracterização do Local de Amostragem do Solo ... 25
2.2 Análise das Comunidades de Nemátodes do Solo ... 26
2.2.1 Amostragem e Extração de Nemátodes do Solo... 26
2.2.2 Identificação e Contagem de Nemátodes ... 27
2.2.3 Cálculo de Índices Ecológicos da Comunidade de Nemátodes ... 28
2.3 Deteção e Identificação de Fungos Nematófagos ... 29
2.3.1 Cultura de Caenorhabditis elegans... 29
2.3.2 Sprinkle Plates ... 29
2.3.3 Baiting e Extração pelo Método do Tabuleiro ... 29
2.3.4 Identificação de Fungos Nematófagos ... 30
2.4 Meios de Cultura ... 31
2.4.1 Meio Nematode Growth ... 31
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2.4.3 Meio Luria-Bertani ... 31
2.4.4 Meio Water Agar ... 31
2.5 Análises dos Solos... 32
2.6 Análise Estatística ... 32
3. Resultados e Discussão... 35
3.1 Comunidades de Nemátodes do Solo ... 35
3.2 Índices Ecológicos ... 40
3.3 Correlações ... 43
3.4 Isolamento e Cultura de Fungos Nematófagos ... 46
4. Conclusões ... 41
Referências Bibliográficas ... 57
Índice de Figuras
Figura 1 - Quercus suber. Herdade das Barradas da Serra em Grândola, Portugal. T. Lino-Neto, maio de 2017. ... 7
Figura 2 - Inflorescência masculina (A) e flor feminina (B) de Quercus suber. Adaptado de Rocheta et al., 2014. ... 8
Figura 3 - Montado na primavera; Herdade das Barradas da Serra em Grândola, Portugal, maio de 2017. ... 9
Figura 4 - Região anterior de nemátodes de diferentes grupos tróficos: bacterívoro, Ba (A); fungívoro, Fu (B); parasita de plantas, Pp (C); carnívoro, Ca (D); omnívoro, Om (E). Barra: A, B e C – 15 µm; D e E – 30 µm. ...11 Figura 5 - Anatomia geral de um nemátode. Adaptado de Pechenik, 2015. ...12 Figura 6 - Diferentes tipos de esófagos nos nemátodes. Adaptado de Maggenti, 1981. ...13 Figura 7 - Designação e peso (números) dos grupos funcionais de nemátodes indicadores da condição da rede trófica para determinação de EI e SI. Adaptado de Ferris et al., 2001. ...17
Figura 8 - Abundância média temporal dos nemátodes do solo, classificados por grupos tróficos, em três locais: A – Montado com uso agrícola; B – Montado com pastoreio intensivo; C – Montado com uso silvícola. Adaptado de Arosa et al., 2016. ...20 Figura 9 - Sobreiros amostrados (A1-A5). Herdade das Barradas da Serra, Grândola, Portugal. Fotografia de satélite, Google Earth. ...25
Figura 10 - Sobreiro saudável (A) e com cerca de 90% de declínio (B). T. Lino-Neto, maio de 2017. ...26
Figura 11 - Abundância média de nemátodes por grupo trófico (A) e por grupo funcional (B), em 100 cm3 de solo. Em A, letras diferentes indicam diferenças significativas (p ≤ 0,05). C1 inclui os sobreiros A2, A3 e A4; C2 inclui os sobreiros A1 e A5. ...36
Figura 12 - Representação gráfica dos valores do Índice de Estrutura e Índice de Enriquecimento para as classes dos sobreiros amostrados (C1 e C2) num sistema de quadrantes, segundo Ferris et al., 2001. ...42
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II
Figura 13 - Valores médios da Pegada Metabólica das classes de declínio (C1 e C2). * Diferença significativa (p ≤ 0,05); ** diferença altamente significativa (p ≤ 0,01). ...42 Figura 14 - Nemátodes com estruturas fúngicas. A – Hifas (seta) atravessando a cutícula. B – Regiões anterior (a) e mediana (m) de C. elegans em estado avançado de deterioração. Barra: 30 µm. ...46
Figura 15 - Abundância média de nemátodes visivelmente colonizados por fungos, em 100 cm3 de solo da rizosfera de cada sobreiro (A1-A5). Letras diferentes (a, b) indicam diferenças estatisticamente significativas (p ≤ 0,05). ...47 Figura 16 - Fungos isolados a partir de C. elegans colonizados, detetados através do método de baiting direto. A1 – A3 e A5: sobreiros de cuja rizosfera foram isolados. ...47
Índice de Quadros
Quadro 1 - Grupos funcionais dos nemátodes dos diferentes grupos tróficos. Adaptado de Bongers & Bongers, 1998. ...15
Quadro 2 - Percentagens de declínio e localização dos sobreiros estudados (A1 – A5). ...26 Quadro 3 - Condições da PCR utilizadas para amplificação da região ITS do rDNA dos fungos isolados. ...30
Quadro 4 – Valores dos parâmetros físico-químicos dos solos da rizosfera dos sobreiros amostrados (A1 – A5)...32 Quadro 5 - Abundância média de nemátodes em 100 cm3 de solo da rizosfera dos sobreiros amostrados (A1-A5). ...35
Quadro 6 - Espécies de nemátodes Pp conhecidas como estando associadas ao género
Quercus. ...38
Quadro 7 - Valores médios de índices da comunidade de nemátodes por classe de declínio. ...40
Quadro 8 - Correlação de Pearson entre a percentagem de declínio dos sobreiros amostrados e as variáveis comunidade de nemátodes e parâmetros do solo. ...44
Lista de Abreviaturas, Acrónimos e Siglas
APCOR – Associação Portuguesa da Cortiça Ba – Bacterívoro
Ban – Bacterívoro de cp-n; n = [1,4]
BI – Índice basal
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool BOLD SYSTEMS – Barcode of Life Data Systems Ca – Carnívoro
Can – Carnívoro de cp-n; n = [3,5]
CI – Índice de canal CMA – Corn Meal Agar
cp – Escala colonizador - persistente EI – Índice de enriquecimento
F – Pegada metabólica Fu – Fungívoro
Fun – Fungívoro de cp-n; n = [2,4]
GBIF – Global Biodiversity Information Facility
ICNF – Instituto da Conservação da Natureza e Florestas INE – Instituto Nacional de Estatística
ITS – Internal Transcribed Spacer LB – Meio Luria-Bertani
MI – Índice de maturidade MO – Matéria orgânica
NCBI – National Centre for Biotechnology Information NGM – Meio Nematode Growth
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VII Om – Omnívoro
Omn – Omnívoro de cp-n; n = [4,5]
ONTA – Organization of Nematologists of Tropical America Pln– Fitoparasita de cp-n; n = [2,5]
Pp – Fitoparasita
PCR – Polymerase Chain Reaction PIB – Produto Interno Bruto
PPI – Índice de parasitas das plantas SI –Índice de estrutura
Taq pol – Thermus aquaticus polimerase VL – Vida livre
Introdução
O sobreiro (Quercus suber) é uma espécie arbórea mediterrânica de grande importância socioeconómica no País. Em termos mundiais, Portugal apresenta a maior área de sobreiro (50%) e produz a maior quantidade de cortiça (52%), sendo o principal produtor e transformador mundial de cortiça.
O sobreiro tem sofrido um declínio acentuado nas últimas décadas, não sendo ainda totalmente compreendidas as causas deste fenómeno. A relação entre os fatores associados ao declínio é complexa, pelo que é do maior interesse, conhecer e compreender diferenças entre sobreiros que apresentem estados fitossanitários distintos. A comunidade de nemátodes da rizosfera pode ser utilizada como um indicador da qualidade do solo e dos seus processos, fornecendo informações sobre a rede trófica e a sua complexidade, bem como sobre as vias de decomposição que predominam no sistema e por que grupos de organismos são mediadas.
Este trabalho teve como principal objectivo o estudo da comunidade de nemátodes associada a sobreiros em diferentes estados de declínio numa das principais áreas de sobreiro em Portugal (concelho de Grândola), procurando descrever essas comunidades e perceber possíveis relações com o declínio; para tal foi avaliado não só o estado funcional do solo como também o potencial de parasitismo dos nemátodes nos sobreiros. Após o início do trabalho e perante a deteção de nemátodes colonizados por fungos, procurou-se também avaliar a presença e identificar possíveis fungos nematófagos.
1. Estado da Arte 1.1 O Sobreiro
O sobreiro (Quercus suber) (Figura 1) é uma árvore perene, esclerofila, adaptada a climas temperados e de influência atlântica, com precipitação anual mínima de 450 mm e temperaturas médias anuais entre os 13 e os 18 °C (Cowling et al., 2005; Jardim Botânico UTAD, 2017). O seu crescimento é lento, quase nulo no período estival devido à escassez de água. No entanto tem uma esperança de vida de cerca de 300 anos e atinge até 20 metros de altura. Prefere solos ácidos e derivados de rochas siliciosas, e apresenta intolerância ao cálcio (Natividade, 1950; Montero & Cañellas, 2003; Costa & Pereira, 2007).
Trata-se de uma espécie monóica que produz inflorescências unissexuais masculinas, os amentilhos, e femininas (Figura 2). Apresenta autoincompatibilidade polínica e floração assíncrona, isto é, as inflorescências masculinas e femininas surgem desfasadamente em cada indivíduo, entre março e junho, sendo a polinização anemófila (Natividade, 1950).
Entre os 15 e os 20 anos, o sobreiro atinge maturidade sexual, começando a produzir frutos de dois tipos: bolotas anuais, que atingem a maturidade no ano da polinização ou bolotas bianuais, que atingem a maturidade apenas no ano seguinte (Elena-Rossello et al., 1993). Segundo Pausas et al. (2009), a produção é variável no espaço, entre árvores, e no tempo, com anos de grande produção de bolotas seguidos de anos de pouca ou nenhuma produção, estando possivelmente na origem desta variação fatores como a diferença de dominância
Figura 1 - Quercus suber. Herdade das Barradas da Serra em Grândola, Portugal. T. Lino-Neto, maio de 2017.
1. Estado da Arte
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entre flores masculinas ou femininas em cada indivíduo, as condições ambientais, a densidade populacional e o posicionamento em vertentes a Norte ou a Sul. A queda das bolotas ocorre, naturalmente, entre outubro e fevereiro (Pérez-Ramos & Marañón 2008), podendo existir uma segunda produção, fora de época, condicionada por fatores ambientais. Este recurso representa uma fonte importante de nutrientes para a rede trófica do montado (Pausas et al., 2009).
O sobreiro é considerado património nacional, tendo sido distinguido como Árvore Nacional de Portugal, em dezembro de 2011 (Diário da República Nº 30 de 10 de fevereiro de 2012) e o seu abate é proibido desde 1997 ( Diário da República Nº 11 de 14 de janeiro de 1997).
Nativo da bacia do Mediterrâneo (Natividade, 1950; Aronson et al., 2009), ocorre mais intensamente na Península Ibérica (GBIF, 2017). Em Portugal, cerca de 23% da área florestal nacional corresponde a sobro, com cerca de 740 mil hectares, dispersos por todo o país, com maior expressão no Alentejo, onde se encontra cerca de 84% da população nacional (Uva, 2013; INE, 2015; APCOR, 2017), integrando a paisagem tradicional da região, em sistemas agro-silvo-pastorais: os montados (Pinto-Correia, 1993; Pereira & Pires da Fonseca, 2003).
O sobreiro produz uma casca altamente suberizada, a cortiça, de forma contínua ao longo da sua vida, podendo ser recolhida sem qualquer dano à árvore, uma vez que esta é capaz de se regenerar. A taxa de regeneração depende de diversos fatores bióticos e abióticos e pode variar entre 2 e 5 milímetros anuais, até atingir um máximo de cerca de 20 centímetros de espessura, possibilitando o descortiçamento a cada 9 anos (Pereira, 2011). A cortiça é altamente isolante, protegendo a árvore contra incêndios, temperaturas elevadas e contribuindo para a retenção de água (Pausas, 1997; Aronson et al., 2009; Catry et al., 2012). O descortiçamento é mais oportuno durante o fim da primavera ou no início do verão, enquanto o felogénio se encontra ativo, minimizando assim os problemas de stress
Figura 2 - Inflorescência masculina (A) e flor feminina (B) de Quercus suber. Adaptado de Rocheta
generalizado que poderão advir desta prática, com ênfase num agravamento do stress hídrico, na redução da proteção contra incêndios e na maior facilidade de infecção por patogénios (Pereira et al., 2009). Estas características permitem a sua aplicação em setores variados como o vinícola, têxtil e de construção, o que posiciona este produto como um dos de elevada relevância económica para o País (Natividade, 1950; Graça & Pereira, 2000). Portugal é o maior produtor, transformador e comercializador mundial de cortiça, produzindo cerca de 50% da cortiça e 63% dos produtos transformados (rolhas para vinhos, materiais de construção e vestuário). Estas actividades rendem cerca de 750 milhões de euros anuais, contribuindo para cerca de 3% do PIB e albergando 670 empresas e emprega cerca de 9000 trabalhadores directos (Tinoco et al., 2009; INE, 2015; APCOR, 2017).
1.2 O Montado
O montado surge na História como um sistema para criação de gado suíno, pelos romanos, estendendo-se mais tarde ao gado ovino e bovino (Campos & Martín, 1987; Fonseca, 2004; Coelho, 2007). Na formação deste tipo de ecossistema, os recursos naturais e processos biofísicos são tão importantes quanto a ação antrópica (Pereira & Pires da Fonseca, 2003), sendo esta absolutamente necessária para a manutenção da biodiversidade no montado (Bugalho et al., 2011).Este sistema é caracterizado por uma cobertura de árvores dispersas, predominando os sobreiros e as azinheiras (Q. ilex) e vegetação rasteira muito diversa no espaço e no tempo (ex.: Cistus, Lavandula, Ulex e Erica spp.) (Figura 3) (Joffre et al., 1999; Pinto-Correia & Mascarenhas, 1999; Pereira & Pires da Fonseca, 2003; Arosa et al., 2016).
O montado é também abrigo de extensa fauna, o que torna este sistema um verdadeiro
hotspot de biodiversidade (Pineda & Montalvo, 1995; Pereira & Pires da Fonseca, 2003; Arosa et al., 2016; APCOR, 2017), fornecendo diversos serviços como: estabilidade ecológica,
Figura 3 - Montado na primavera; Herdade das Barradas da Serra em Grândola, Portugal, maio de 2017.
1. Estado da Arte
10
paisagem, caça, turismo e cultura (Belo et al., 2009). Por isso, é considerado habitat protegido, integrando a Rede Natura 2000 (Comissão das Comunidades Europeias, 2004; APCOR, 2017), cuja conservação é do maior interesse (Myers et al., 2000).
Desde finais do século XIX, existem relatos de um crescente declínio do montado e dos sobreiros (Cabral et al., 1992; Costa et al., 2010). O declínio do montado está intimamente relacionado com o declínio dos sobreiros como indivíduos, partilhando possíveis causas e influenciando-se mutuamente. Este declínio é retratado na bibliografia como um fenómeno complexo cuja origem poderá estar no agravamento generalizado de stresses abióticos que vulnerabilizam as árvores, facilitando a ação de agentes patogénicos (Braisier, 1996; Oak et
al., 1996; Ferreira, 2000; Thomas et al., 2002; Fortín et al., 2008; Kabrick et al., 2008; Costa et al., 2010).
O declínio do sobreiro pode apresentar-se em dois tipos: a morte súbita das árvores, com uma secagem rápida e intensa da copa que se inicia nas partes mais altas da árvore e que resulta na eventual desfolha completa, ou um processo mais gradual, com desfoliação ao longo do tempo. Além disso, estes sintomas podem expressar-se de forma heterogénea na árvore, sendo frequentemente acompanhados de fissuras ao longo dos ramos e exsudações de seiva que provocam manchas escuras no tronco; descolorações e necroses (Brasier et al., 1993; Gallego et al., 1999; Perez et al., 2012).
A subida da temperatura, aliada à diminuição da precipitação primaveril e ao aumento de frequência e intensidade das secas, têm contribuído para uma crescente adversidade e imprevisibilidade ambiental (Miranda et al., 2002; Pausas, 2004), o que leva a episódios de mortalidade elevada entre os sobreiros, cada vez com mais frequência (Pereira et al., 2006). Esta mortalidade está intensamente associada a doenças como o cancro do sobreiro (Botryosphaeria stevensii e o seu anamorfo, Diplodia mutila), o carvão do entrecasco (Biscongiauxia mediterranea) e doenças radiculares (Armillaria melea e Phytophthora
cinnamomi) (Brasier et al., 1993; Franceschini et al., 1993; Brasier & Scott, 1994; Braisier,
1996; Gallego et al., 1999; Robin et al., 2001; Thomas et al., 2002; Moreira & Martins, 2005; Martins et al., 2006; Branco & Ramos, 2009; Camilo-Alves et al., 2013) e também a pragas como Curculio elephas e Cydia spp., que atacam bolotas Euproctis chrysrrhoea, Lymantria
dispar, Malacosoma neustria, Orchestes spp., Periclista andrei e Totrix viridiana, insetos
desfolhadores, e Cerambix spp., Coroebus spp. e Platypus cilindrus, que atacam a madeira, reduzindo a qualidade da cortiça (Ferreira & Ferreira, 1999; Branco & Ramos, 2009).
A interação destes fatores com o stress hídrico terá um papel crítico no declínio dos sobreiros (Desprez-Loustau et al., 2006; Pereira et al., 2009). Estes fatores, aliados a pastoreio intensivo, a má gestão silvícola e agrícola, a incêndios, a secas estivais e a baixa sobrevivência de plântulas e fraca dispersão de bolotas contribuem ativamente para a
diminuição da resiliência do sistema pela diminuição do recrutamento de novos indivíduos (Aronson et al., 2009; Arosa et al., 2015). Surgem então desequilíbrios que permitem a disseminação do fenómeno de declínio. Diversos estudos comprovam que a distribuição espacial dos sobreiros e a perturbação de uso dos terrenos também criam uma pré-disposição para o declínio (Cabral et al., 1992; Cadima et al., 1995; Costa et al., 2010).
A informação sobre o declínio do sobreiro é ainda incompleta, apesar dos diversos projetos de investigação e de diversos estudos sobre o envolvimento de patogénios e fatores abióticos e a sua importância, sendo que na bibliografia não se encontra um consenso entre a importância de P. cinnamomi, B. stevensii, D. corticola e B. mediterranea como agentes causais do declínio (Brasier, 1992; Brasier et al., 1993; Brasier & Scott, 1994; Braisier, 1996; Gallego et al., 1999; Ferreira, 2000; Jung et al., 2000; Oszako, 2000; Horta, 2007; Kabrick et
al., 2008; Costa et al., 2010; Souza, 2012; Camilo-Alves et al., 2013; Fernandes et al., 2014).
1.3 Nemátodes do Solo
“Habitando o solo em miríades (…), há um grupo de organismos conhecidos como nemátodes” – Cobb, 1915. De facto, os nemátodes são ubíquos (Bongers & Bongers, 1998) e a componente da mesofauna mais abundante do planeta (Cobb, 1915), desempenhando funções como consumidores primários e intermédios em todas as cadeias tróficas edáficas, o que os relaciona intimamente com os processos de decomposição e ciclagem de nutrientes (Bongers, 1990; Bardgett et al., 1999; Bongers & Ferris, 1999; Ferris & Bongers, 2006; Sánchez-Moreno & Talavera, 2013; Ravichandra, 2014). Pertencem ao filo Nematoda, que conta com cerca de 28.883 espécies descritas, de uma grande diversidade de funções tróficas (Figura 4) e ecológicas, cuja identificação é feita através de características morfológicas e bioquímicas (Goodey, 1963; Dropkin, 1980; Maggenti, 1981; Yeates et al., 1993; Yeates & Bongers, 1999; Decraemer & Hunt, 2006; GBIF, 2016).
Figura 4 - Região anterior de nemátodes de diferentes grupos tróficos: bacterívoro, Ba (A); fungívoro, Fu (B); parasita de plantas, Pp (C); carnívoro, Ca (D); omnívoro, Om (E). Barra: A, B e C – 15 µm; D e E – 30 µm.
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Os nemátodes são animais invertebrados, geralmente filiformes, (Figura 5) que habitam a película de água existente entre as partículas de solo (Cobb, 1915; Jenkins & Taylor, 1967; Dropkin, 1980; Decreamer & Hunt, 2006; Catry et al., 2012). As suas características morfológicas são de grande valor para o diagnóstico taxonómico (Goodey, 1963; Bongers, 1988; Mekete et al., 2012; Ravichandra, 2014). Possuem uma cutícula que define a sua forma, cuja complexidade difere entre grupos de nemátodes e que alberga diversos órgãos sensoriais como setae, papilas, anfídeos, deirídeos e fasmídeos (Dropkin, 1980; Maggenti, 1981; Decraemer & Hunt, 2006). Cada indivíduo experiencia, durante a sua vida, cerca de quatro mudas de cutícula, até que se torna adulto (Wallace et al., 1996; Decraemer & Hunt, 2006).
O seu sistema digestivo é constituído por três secções: stomodeum, que compreende a abertura bucal, o esófago e glândulas associadas, a faringe e cardia; mesenteron que corresponde ao intestino e proctodeum, que é constituído pelo recto e ânus, ou cloaca.
O esófago, bem como a posição das glândulas esofágicas em relação ao intestino, diferem entre grupos, sendo uma característica-chave para a identificação (Figura 6) (Dropkin, 1980): os nemátodes Pp e Fu possuem geralmente um esófago dividido em três partes e um estilete, enquanto os nemátodes Ba possuem apenas duas, com um bolbo terminal ou, então, à semelhança de nemátodes Ca e Om, possuem um esófago sem bolbos e sem grande distinção entre corpus e postcorpus (Goodey, 1963).
O sistema excretor é bastante heterogéneo entre grupos de nemátodes, sendo até, em alguns casos, inexistente. Pode cingir-se a uma única célula da hipoderme ou ser composto por tubos que se estendem pelo comprimento do organismo, dirigidos apenas posteriormente ou anterior e posteriormente (Dropkin, 1980; Maggenti, 1981).
O sistema reprodutor feminino (Figura 5) é constituído pela vulva, vagina, útero, quadricolumela, espermateca (nalguns casos) e ovários, nos quais se distingue a zona germinativa e a zona de crescimento celular. Tendo em conta a presença de um ou de dois ovários, o sistema reprodutor feminino pode dizer-se monodélfico ou didélfico, respectivamente (poderão também existir dois úteros, em casos de didelfia, bem como em situações de monodelfia, poderá existir um saco pós-uterino). O sistema reprodutor masculino (Figura 5) é constituído pelo testículo, vesícula seminal e vas deferens, possuindo estruturas associadas como as espículas, o gubernáculo e, nalguns nemátodes, a bursa (Dropkin, 1980; Maggenti, 1981; Pechenik, 2015).
O sistema sensorial é composto por um anel nervoso localizado na região esofágica e por gânglios associados, dois neurónios longitudinais (dorsal e ventral) situados nos cordões hipodérmicos e pelos órgãos sensoriais: quimiorrecetores como os anfídeos, pequenas aberturas na região labial que conduzem a uma bolsa com um neurónio sensorial, deirídeos, localizados acima do anel nervoso, e fasmídeos, na região posterior (Maggenti, 1981).
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Os nemátodes desempenham uma enorme diversidade de funções tróficas nas redes edáficas (Bongers & Bongers, 1998; Bardgett et al., 1999; Yeates & Bongers, 1999; Neher, 2001; Ferris & Matute, 2003; Sánchez-Moreno et al., 2006; Ferris et al., 2012), onde surgem como bacterívoros (Ba), fungívoros (Fu), parasitas das plantas ou fitoparasitas (Pp), predadores de invertebrados ou carnívoros (Ca) e, também, omnívoros (Om) (Dropkin, 1980; Maggenti, 1981; Yeates et al., 1993). Esta diversidade trófica coloca a comunidade de nemátodes numa posição de regulação do sistema, controlando populações de microrganismos, plantas e animais, contribuindo ativamente para os ciclos de nutrientes e processos de decomposição (Wardle & Yeates, 1993; Ritz & Trudgill, 1999). Simultaneamente, a comunidade é moldada pelas condições do ecossistema no espaço e no tempo (Robertson & Freckman, 1995; Freckman & Virginia, 1997; Wardle & Yeates, 1993; Bardgett et al., 1999; Yeates et al., 1999; Barrios, 2007; Costa et al., 2012; Hu et al., 2015; Gebremikael et al., 2016). Por exemplo, os nemátodes bacterívoros regulam a comunidade de bactérias através do consumo direto, e também a comunidade de nemátodes carnívoros, dos quais são potenciais presas. Por seu lado, a comunidade bacteriana e os nemátodes carnívoros também moldam o número e diversidade de nemátodes bacterívoros presentes num dado sistema. A comunidade de nemátodes está sujeita a regulação top-down mediada pelos níveis tróficos superiores mas também a regulação bottom-up mediada pelos níveis tróficos inferiores (Hunt et al., 1987; de Ruiter et al., 1995; Moore et al., 2004; Costa et al., 2011b). Pressões ambientais como a disponibilidade de água e de nutrientes, vão determinar a composição da comunidade de nemátodes, favorecendo ou não a presença de certos grupos, consoante as suas estratégias de vida. Em suma, os comportamentos tróficos diversos e as distintas estratégias de vida, bem como o papel determinante nas redes tróficas edáficas, tornam os nemátodes excelentes indicadores dos processos do ecossistema
(Bongers, 1990; Bongers & Ferris, 1999; Ferris et al., 2001; Ferris, 2010a).
Para a definição da estrutura comunitária, e com um intuito de desenvolver índices que se possam basear nestas características da comunidade para a avaliação do sistema edáfico, Bongers (1990) posiciona as famílias de nemátodes numa de cinco classes de uma escala colonizador-persistente, (escala cp), baseada nas estratégias de vida de cada família (estratégias K e r) (Parry, 1981). Esta classificação tem sido alvo de alterações ao longo do tempo, com o melhor entendimento das dinâmicas populacionais, ciclos de vida e funções ecológicas dos nemátodes do solo (Yeates et al., 1993; Bongers & Bongers, 1998; Ferris et
al., 2001). A classe cp-1 corresponde a uma classe de nemátodes de gerações curtas, ovos
pequenos, alta fecundidade e na sua maioria, bacterívoros. São indicadores de enriquecimento do meio, apresentando formas de resistência (dauer larvae) quando a flora microbiana declina. A classe seguinte, cp-2, compreende nemátodes de gerações mais longas
e de menor fecundidade que cp-1. São nemátodes tolerantes a distúrbios e a stress induzido por poluentes, podendo tornar-se criptobióticos. Na classe cp-3 são incluídos nemátodes de gerações mais longas que cp-2, mas com maior sensibilidade a condições adversas. Em termos de grupos tróficos, esta classe compreende nemátodes fungívoros, bacterívoros, fitoparasitas e também predadores. A classe cp-4 compreende nemátodes de gerações longas e baixa fecundidade, com uma grande sensibilidade a perturbações. Finalmente, a classe cp-5, inclui nemátodes cujas gerações são mais longas e a fecundidade é mais baixa. São nemátodes de grandes dimensões, altamente sensíveis a perturbações. São predominantemente nemátodes omnívoros e predadores (Ferris et al. 2001). Com base na classificação cp, é ainda possível a divisão em grupos funcionais (Quadro 1) (Bongers & Bongers, 1998).
Quadro 1 - Grupos funcionais dos nemátodes dos diferentes grupos tróficos. Adaptado de Bongers & Bongers, 1998.
Grupo trófico Classes do espetro colonizador - persistente
cp-1 cp-2 cp-3 cp-4 cp-5 Parasitas das plantas - Pl2 Pl3 Pl4 Pl5 Bacterívoros Ba1 Ba2 Ba3 Ba4 - Fungívoros - Fu2 Fu3 Fu4 - Carnívoros - - Ca3 Ca4 Ca5 Omnívoros - - - Om4 Om5
Esta diversidade funcional tem influência nas sucessões ecológicas: após dado distúrbio, é favorecida a dominância de nemátodes bacterívoros oportunistas (Ba1 e/ou Ba2, dependendo do estado do solo em relação a nutrientes e actividade microbiana); ao longo do tempo, e em condições ideais, os grupos funcionais de classificação cp mais baixa vão sendo substituídos por grupos de classificação mais elevada (à excepção de Ba2 e Fu2, que vão perdurando no sistema, devido à sua resiliência) (Bongers & Bongers, 1998), refletindo mudanças nas redes tróficas e processos do solo de forma mais precisa que os grupos tróficos isoladamente (Cesarz et al., 2015).
Assume-se que duas espécies de nemátodes nunca terão propriedades ecológicas idênticas (Bongers & Bongers, 1998) e, portanto, a sua coexistência ou exclusão é potenciada pela sua capacidade de explorar, diferencialmente ou não, determinado nicho de recursos. A competitividade das espécies depende de diversos fatores como: a temperatura (Anderson & Coleman, 1982; Sohlenius, 1985), a humidade (Sohlenius, 1985), o tamanho do corpo (Yeates
et al., 1985; Yeates, 1986, 1987a), o comprimento do estilete (Yeates, 1986), a quantidade e
qualidade de folhada e exsudados fornecidos pela vegetação (Cesarz et al., 2013) e o padrão de colonização (Sohlenius, 1988).
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Em qualquer sistema, a dispersão de nemátodes (pelo vento, água ou através de vetores bióticos) é contínua (Bongers & Bongers, 1998), porém, o estabelecimento da comunidade depende da existência de nichos aptos à exploração. Encontradas condições favoráveis, a comunidade torna-se sucessivamente mais complexa, flutuando no espaço e no tempo e acompanhando a variação dos fatores ambientais até um pico de diversidade (Bongers & Bongers, 1998).
Através da identificação desta diversidade de nemátodes num dado sistema, é possível calcular índices que descrevem o estado de um sistema e os seus processos (Neher et al., 2004).
1.4 Índices Ecológicos da Comunidade de Nemátodes do Solo
1.4.1 Índice de Maturidade e Índice de Fitoparasitas
O Índice de Maturidade (MI) é uma medida de perturbação definida por Bongers (1990) como a média ponderada do valor de cp para os nemátodes de vida livre de dada amostra. Varia entre 1 e 5, correspondendo 1 a um sistema totalmente enriquecido e 5 a um sistema pristino. Este índice pode ser utilizado como uma ferramenta de monitorização da recuperação pós-distúrbio (Ettema & Bongers, 1993), de comparação de sistemas de produção agrícola (Neher & Campbell, 1994) ou de medição de stress induzido por poluentes (Korthals et al., 1996). Segundo Bongers (1990), os nemátodes fitoparasitas respondem de forma muito diferenciada ao enriquecimento, verificando a presença de nemátodes fitoparasitas persistentes em condições de stress que induzem aumentos na produção primária, como no caso da fertilização azotada. As estratégias de vida e respostas tróficas dos nemátodes fitoparasitas não são comparáveis às dos nemátodes de vida livre, devendo estes ser excluídos do cálculo de MI. Bongers (1990) propõe um Índice de Fitoparasitas (PPI) complementar a MI, e que estabelece uma relação inversa com este (Bongers et al., 1997). Contrariamente, Yeates (1994) argumenta que a inclusão dos nemátodes fitoparasitas acrescenta validade a MI, através de resultados obtidos em pastos permanentes, nos quais PPI e MI apresentam valores semelhantes, arguindo uma relação direta entre os dois índices, sob certas condições (Neher & Campbell, 1994). Existem diversas variações dos índices de maturidade, PPI e MI, que podem ser utilizadas para obter interpretações adicionais dos dados: MI (2-5) que exclui nemátodes da classe cp-1, reflete a presença de stress induzido por poluentes como metais pesados; e a razão PPI/MI, que é útil como indicador de fertilidade do solo (Bongers & Bongers, 1998).
1.4.2 Índice de Canal, Índice de Estrutura, Índice de Enriquecimento e Índice Basal
O Índice de Canal (CI), o Índice de Estrutura (SI), o Índice de Enriquecimento (EI) e o Índice Basal (BI) são medidas de diagnóstico do estado da rede trófica (Neher et al., 2004). O CI é uma medida indicadora da via de decomposição preferencial do sistema, em que valores mais altos correspondem a uma predominância de processos de decomposição mediados por fungos e valores mais baixos indiciam mediação bacteriana (Ferris et al., 2001; Berkelmans
et al., 2003). O SI traduz o estado de afetação por stress e a conectividade da rede trófica,
tendo em consideração os grupos funcionais de classe cp mais elevada (Ferris et al., 2001; Neher et al., 2004). Valores mais altos demonstram uma rede mais complexa e menos perturbada, onde efeitos top-down são menos severos devido à competitividade inter-específica (Berkelmans et al., 2003; DuPont et al., 2009). O EI demonstra o nível de enriquecimento de recursos alimentares através da abundância e presença dos grupos funcionais que melhor respondem a estes estímulos, Ba1 e Fu2 (Ferris et al., 2001). As trajetórias de estrutura e de enriquecimento que SI e EI traduzem respectivamente relacionam-se, posicionando o sistema analisado e caracterizando a rede trófica (Figura 7).
Uma rede trófica caracterizada na porção proximal da trajetória de estrutura demonstra dominância de Ba2 e Fu2, o que indica condições basais e um sistema em stress. Contrariamente, a alocação distal na trajetória de estrutura, indicia um sistema mais estável e
Figura 7 - Designação e peso (números) dos grupos funcionais de nemátodes indicadores da condição da rede trófica para determinação de EI e SI. Adaptado de Ferris et al., 2001.
1. Estado da Arte
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uma rede trófica mais conexa. A posição na trajetória de enriquecimento é independente da condição de estrutura do sistema (Ferris et al., 2001). A relevância dos grupos funcionais como indicadores varia com o aumento da estrutura da rede trófica, argumentando Ferris et
al. (2001) que em ambientes sucessivamente mais complexos, a classe de nemátodes cp-2
decresce de importância, devido à sua presença em todas as redes tróficas. No entanto, nemátodes de grupos funcionais de elevada classificação cp, como Ca5 e Om5, são indicadores de extrema relevância, devido à sua raridade, salvo em condições pristinas.
O BI é uma medida capaz de distinguir se determinada perturbação é devida a stress ou se será causada por limitação de recursos, através da análise da população basal (Ba1 Ba2 e Fu2) (Berkelmans et al., 2003).
1.4.3 Pegada Metabólica
A Pegada Metabólica (F) é definida por Ferris (2010b) como a quantificação da amplitude de utilização de carbono por diferentes grupos da rede trófica.
Este conceito conta com uma componente de produção, que contabiliza o carbono utilizado no crescimento ou na reprodução, durante o ciclo de vida e uma componente respiratória que contabiliza o carbono utilizado na actividade metabólica.
A importância da avaliação da pegada metabólica reside no facto de que os índices da família MI podem apresentar valores iguais para situações em que, embora a comunidade de nemátodes tenha diversidade funcional semelhante, a abundância de grupos funcionais difira dificultando a avaliação da magnitude ou a natureza das funções do ecossistema (Ferris, 2010b). A pegada metabólica pode ser calculada para cada grupo trófico, Ba, Fu, Pp, Ca e Om ou considerando apenas os grupos que indicam enriquecimento (Pegada de Enriquecimento), os grupos que indicam estrutura (Pegada de Estrutura) ou toda a comunidade (Pegada Composta), contabilizando o carbono assimilado para o sistema pelas respetivas vias (Ferris, 2010b). Rodríguez Martín et al. (2014) demonstram que perturbações como a poluição por metais pesados resultam em valores mais baixos de pegadas metabólicas do que em ambientes não afetados.
1.4.4 Aplicação
Os índices da comunidade de nemátodes do solo têm vindo a demonstrar a sua utilidade em diversas situações como:
• Na comparação de modos de produção agrícola (Freckman & Ettema, 1993; Neher & Campbell, 1994; Ferris et al., 1996; Arieira, 2012; Teixeira, 2016);
• Na avaliação dos efeitos de práticas culturais como fertilização e mobilização (Bongers et al., 1997; Sarathchandra et al., 2001; Zhang et al., 2012);
• Na avaliação da presença e efeito de poluentes (Neher, 2001; Pen-Mouratov et al., 2008; Rodríguez Martín et al., 2014; Gutiérrez et al., 2016);
• Na compreensão da dinâmica do sistema edáfico e da sua condição de saúde (Sánchez-Moreno et al., 2006; Sánchez-Moreno & Talavera, 2013; Zhang et al., 2015; Zhao et al., 2016).
1.5 Comunidades de Nemátodes Associadas a Quercus suber
Ainda são escassos os trabalhos de investigação realizados acerca das comunidades de nemátodes no montado e em associação a Quercus suber. Arosa et al. (2016) descrevem uma comunidade de nemátodes variável no tempo (Figura 8) de acordo com a variabilidade da actividade microbiana e da sazonalidade de recursos característica do montado (Costa et
al., 2013), com uma grande abundância de nemátodes fungívoros e bacterívoros.
Funcionalmente, as comunidades descritas indicam uma atividade microbiana equilibrada, com uma ligeira dominância de vias de decomposição fúngica na primavera e bacteriana no Inverno. Em termos de nemátodes fitoparasitas, Siddiqui et al. (1973) registam a presença de
Helicotylenchus erythrinae e Pratylenchus vulnus; Trocolli et al. (1997) reportam a presença
de Pratylenchoides hispaniensis; Vovlas et al. (1998) observaram a presença de Rotylenchus
magnusjaeni e Arias et al. (2005) reportaram a presença de Xiphinema pyrenaicum em
associação a Q. suber. Em Portugal, Santos et al. (1984) observaram Paratylenchus sp.,
Pratylenchus sp., Rotylenchus sp., Trichodorus sp., Tylenchorhynchus sp. e Xiphinema sp. na
rizosfera de sobreiros e pela primeira vez, registaram a presença da espécie
Xenocriconemella macrodora em território nacional; Almeida & Santos (1997) registaram a
presença de Trichodorus lusitanicus e Paratrichodorus allius em associação a Q. suber, sendo que T. lusitanicus foi observado com grande frequência. Costa et al. (2011a) referiram o sobreiro como tendo sido o hospedeiro preferencial dos géneros Rotylenchus,
Tylenchorhynchus e Xiphinema, estando os outros géneros de nemátodes fitoparasitas
1. Estado da Arte
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comunidade diversa, tendo registado a presença dos géneros Criconemella, Gracilacus,
Helicotylenchus, Hemicycliophora, Heterodera, Longidorus, Pratylenchus, Rotylenchus, Trichodorus, Tylenchorhynchus e Xiphinema.
1.6 Inimigos Microbianos dos Nemátodes
Assim como existem diversos organismos do ecossistema edáfico que atuam como fontes de carbono e energia para os nemátodes, também estes representam fontes de recursos para muitos outros (Hunt et al., 1987; Barrios, 2007). Existe uma grande diversidade de organismos que consomem nemátodes, exercendo pressão sobre a comunidade e moldando-a (Siddiqui & Mahmood, 1996; Costa, 2006; Ferris, 2010a). Os fungos capazes de colonizar nemátodes têm um grande interesse como agentes de controlo biológico em contexto agrícola (Stirling et
al., 1998; Liu et al., 2009; Li et al., 2014). Os fungos nematófagos são um grupo
taxonomicamente heterogéneo de fungos que parasitam nemátodes (Pramer & Kuyama, 1963; Kerry & Crump, 1977; Nordbring-Hertz, 2004) por meio de diversos mecanismos (Liu et
al., 2009). Estes fungos encontram-se amplamente distribuídos na Natureza, surgindo em
todo o tipo de ecossistemas e com grande diversidade, caracterizando-se segundo a sua estratégia de infeção (Hyde et al., 2014):
• Fungos que utilizam armadilhas adesivas ou mecânicas provenientes das hifas, como
Arthrobotrys olygospora, penetrando depois no nemátode através da cutícula
(Nordbring-Hertz, 2004);
Figura 8 - Abundância média temporal dos nemátodes do solo, classificados por grupos tróficos, em três locais: A – Montado com uso agrícola; B – Montado com pastoreio intensivo; C – Montado com uso silvícola. Adaptado de Arosa et al., 2016.
• Fungos endoparasitas que utilizam esporos que são ingeridos, como Harposporium
anguilulae; aderem e germinam através da cutícula, como Hirsutella rhossiliensis; ou
zoósporos que utilizam as aberturas naturais do nemátode, como Myzocytiopsis
vermicola (Glockling & Beakes, 2006);
• Fungos que colonizam ovos, como Paecilomyces lilacinus (Khan et al., 2004); • Fungos que utilizam toxinas, como Trichoderma virens (Sharon et al., 2007).
Podem também ser parasitas obrigatórios ou facultativos, quando subsistem como saprófitos (Liu et al., 2009), podendo no entanto, ambos os tipos de fungo ser isolados e crescidos em meio de cultura (Li et al., 2014). Diversos estudos têm mostrado a eficiência destes fungos no controlo de nemátodes Pp em contexto agrícola (Siddiqui & Mahmood, 1996; Spiegel & Chet, 1998; Jaffee, 2000; Khan et al., 2004; Kiewnick & Sikora, 2006; Sharon et al., 2007; Askary, 2016). Siddiqui et al. (2000), utilizando uma combinação Paecylomyces
lilacinus e Pseudomonas aeruginosa em culturas de tomateiro, obtêm percentagens de cerca
de 50% de fêmeas e 25% de ovos de Meloidogyne javanica infetados em micro parcelas de 2x1 m.
2. Material e Métodos
2.1 Caracterização do Local de Amostragem do Solo
A amostragem do solo foi realizada em abril de 2016, num conjunto de sobreiros que apresentam diferentes percentagens de declínio, localizados na Herdade das Barradas da Serra, em Grândola, Portugal (Quadro 2). Os sobreiros em estudo (Figura 9) foram escolhidos de uma parcela destinada apenas a fins silvícolas e de pastoreio, tendo sido registadas as coordenadas de cada um dos sobreiros, designados por A1, A2, A3, A4 e A5. Estes sobreiros foram selecionados devido às suas diferentes percentagens de declínio, avaliadas através da percentagem de desfoliação e do aspeto de secura da árvore (Martins et al., 2006) (Figura 10). A sua proximidade garante condições ambientais similares entre as árvores. O terreno no local era bastante heterogéneo, com uma altitude média de 160m, estando os sobreiros A1, A2 e A3 numa superfície mais ou menos plana e A4 e A5 localizados numa vertente exposta a Sul, numa área quente e de baixa precipitação anual.
As árvores foram agrupadas em duas classes, C1 e C2, em função das suas percentagens de declínio. A classe C1 engloba as árvores de declínio baixo a intermédio: A2, A3 e A4; a classe C2 engloba os sobreiros de declínio elevado: A1 e A5.
Figura 9 - Sobreiros amostrados (A1-A5). Herdade das Barradas da Serra, Grândola, Portugal. Fotografia de satélite, Google Earth.
2. Material e Métodos
26
Quadro 2 - Percentagens de declínio e localização dos sobreiros estudados (A1 – A5).
Sobreiro Declínio Coordenadas (WGS84)
% Classe A1 100 C2 38º 11’32.1699"N 8º37’11.9900"W A2 20 C1 38º 11’32.9172"N 8º37’11.5940"W A3 60 C1 38º 11’31.8909"N 8º37’10.9001"W A4 10 C1 38º 11’30.2649"N 8º37’8.32320"W A5 90 C2 38º 11’29.2945"N 8º37’7.82740"W
C1 – árvores com declínio baixo a intermédio C2 – árvores com declínio elevado
O coberto vegetal é muito variado, composto por misturas de diversas espécies: Asparagus
aphyllus, Cirsium vulgare, Cistus ladanifer, C. psilosepalus, C. salvifolia, Cynara cardunculus
e Taraxacum officinalis.
2.2 Análise das Comunidades de Nemátodes do Solo
2.2.1 Amostragem e Extração de Nemátodes do Solo
Foram amostradas quatro zonas da rizosfera de cada sobreiro, a cerca de quinze centímetros de profundidade. A partir de solo colhido em torno de cada sobreiro, posteriormente misturado, obteve-se uma amostra composta. O solo de cada amostra foi crivado com um crivo de abertura de 0,5 cm, com o objectivo de remover partículas de maiores dimensões. Após a crivagem, foram recolhidas três repetições de 100 cm3 de solo crivado por cada uma das cinco amostras correspondentes aos cinco sobreiros estudados. A extração dos nemátodes do solo foi efectuada segundo o método do tabuleiro de Whitehead e
Hemming modificado (Abrantes et al., 1976). O solo foi espalhado uniformemente sobre a camada fina de um lenço de papel (utilizando sempre a mesma marca), suportado por uma grelha de malha larga, dentro de um tabuleiro, distanciada do fundo. De seguida, foi vertida água no tabuleiro até à altura da grelha, de forma a humedecer o solo. Este sistema foi deixado em repouso durante 48h, parcialmente coberto de forma a preservar a humidade. Após este período e depois da rede que suportava o solo ter sido retirada cuidadosamente, sem agitar, a suspensão de nemátodes no tabuleiro foi vertida num copo de vidro; esta suspensão foi seguidamente crivada através de um crivo de poro de 20 μm, tendo sido recolhido o conteúdo do crivo para um copo de vidro graduado, de forma a obter uma suspensão final de nemátodes com um volume de cerca de 10 ml.
2.2.2 Identificação e Contagem de Nemátodes
As suspensões de nemátodes foram observadas ao microscópio invertido (Olympus CK40) com ampliações de 40x, 100x e 200x, em placas de contagem da Universidade de Wageningen® de forma a proceder à quantificação por grupo taxonómico. A identificação dos nemátodes foi feita até ao nível taxonómico da família, com base nas suas características morfológicas e, no caso dos nemátodes fitoparasitas, até ao género, recorrendo a chaves de identificação para o efeito (Goodey, 1963; Bongers, 1988; Mai & Mullin, 1996). Quando necessária uma observação mais pormenorizada para a identificação, recorreu-se a um microscópio óptico (Leitz Biomed), tendo sido extraídos os nemátodes para observação com recurso a uma pestana aderente a uma vareta de vidro, e seguidamente colocados numa lâmina de vidro escavada com água e, posteriormente, transferidos, ao microscópio estereoscópio (Leica ZOOM 2000), para uma gota de água entre uma lâmina de vidro e uma lamela.
Os nemátodes de cada suspensão foram quantificados na sua totalidade, contabilizando-se também os nemátodes que apresentavam estruturas fúngicas no seu interior e distinguindo-os como de vida livre ou como fitoparasitas, e não identificados aqueles em que já não foi possível a distinção devido ao estado avançado de deterioração por fungos, em que se encontravam. Foram ainda fotografados nemátodes em campo-claro, com recurso a um microscópio óptico (Leica DM5000B).
2. Material e Métodos
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2.2.3 Cálculo de Índices Ecológicos da Comunidade de Nemátodes
Os índices e descritores da comunidade de nemátodes foram calculados através do
software NINJA (Sieriebriennikov et al. 2014), com base em metodologia descrita na
bibliografia (Bongers, 1990; De Goede et al., 1993; Bongers et al., 1997; Bongers & Bongers, 1998; Ferris et al., 2001; Neher, 2001; Neher, 2004; Neher et al., 2005; Ferris & Bongers, 2006; Ferris, 2010b; Neher & Weicht, 2013; Zhao & Neher, 2013; Zhao et al., 2016).
O MI foi calculado através da fórmula:
𝑀𝐼 = ∑
𝑣
𝑖∗ 𝑓
𝑖𝑛
Em que vi corresponde à classe cp da família, fi corresponde à frequência observada de
indivíduos da família e n corresponde ao número total de indivíduos presentes na amostra. O PPI foi calculado segundo a mesma expressão, contando apenas com nemátodes fitoparasitas.
Os índices EI, SI e BI foram calculados pelas fórmulas:
𝐸𝐼 = 100 ∗
𝑒
𝑒 + 𝑏
; 𝑆𝐼 = 100 ∗
𝑠
𝑠 + 𝑏
; 𝐵𝐼 = 100 ∗
𝑏
𝑏 + 𝑒 + 𝑠
Em que: 𝑏 = (Ba2 + Fu2) x W2; 𝑒 = (Ba1 x W1) + (Fu2 x W2);𝑠 = (Ban x Wn) + (Can x Wn) + (Fun x Wn) + (Omn x Wn) n = [3,5];
W1 = 3,2; W2 = 0,8; W3 = 1,8; W4 = 3,2; W5 = 5,0
O CI foi calculado através da formula:
𝐶𝐼 = 100 ∗
𝐹𝑢
2∗ 𝑊
2𝐵𝑎
1∗ 𝑊
1+ 𝐹𝑢
2∗ 𝑊
2A Pegada Metabólica (F) foi calculada através da fórmula:
𝐹 = ∑(𝑁
𝑡(0,1(
𝐿
3a
21,6 x 10
6𝑚
𝑡) + 0,273(
𝐿
3a
21,6 x 10
6 0,75)))
Em que:
Nt= Número de indivíduos no taxon t;
L = comprimento do nemátode;
a = razão entre o comprimento e o diâmetro máximo; mt= classe cp do taxon t.
2.3 Deteção e Identificação de Fungos Nematófagos
2.3.1 Cultura de Caenorhabditis elegans
De forma a obter nemátodes para utilização como isco de fungos nematófagos, foram mantidas culturas do nemátode Caenorhabditis elegans, gentilmente cedidas pela Escola de Medicina da Universidade do Minho. A manutenção destas culturas foi feita em Nematode
Growth Medium (NGM) e utilizando, como alimento, a bactéria Escherichia coli OP50 (também
cedida pela Escola de Medicina), mantida em meio líquido Luria-Bertani (LB) (Sulston & Hodgkin, 1998)
2.3.2 Sprinkle Plates
Para a prospeção de fungos nematófagos, colocaram-se, em placas de Water Agar (WA) a 10 g/L, 0,5 g de solo, suspensos em 0,5 mL de WA a 0,05%, e C. elegans em suspensão em água (o equivalente a aproximadamente 1000 indivíduos) para que atuassem como isco para os fungos presentes no solo (Eren & Pramer, 1965; Costa, 2006). Prepararam-se duas repetições correspondentes a cada árvore utilizada.
2.3.3 Baiting e Extração pelo Método do Tabuleiro
Com vista à obtenção de indivíduos com sinais da presença de fungos para posterior tentativa de cultura, foram adicionados 6mL de suspensão de C. elegans (cerca de 13500 indivíduos) a copos de vidro com cerca de 25 cm3 de solo. Findas 72h, o solo foi submetido ao método do tabuleiro, já anteriormente descrito para extração dos nemátodes (secção 2.2.1). Os indivíduos de interesse foram recolhidos das suspensões obtidas, com o auxílio de uma pestana numa haste, e passando sucessivamente por duas lâminas de vidro escavadas com água estéril e posteriormente colocados em placas de petri com meio de cultura Corn
Meal Agar (CMA) e antibióticos (cloranfenicol, estreptomicina e clortetraciclina). As placas
2. Material e Métodos
30 2.3.4 Identificação de Fungos Nematófagos
Após a prospeção, os fungos obtidos foram isolados em placas de petri com meio CMA e antibióticos (cloranfenicol, estreptomicina e clortetraciclina), que foram mantidas numa estufa a 25ºC. Quando atingida uma colonização de cerca de 60% da placa, procedeu-se à identificação molecular através da sequenciação da região Internal Transcribed Spacer (ITS) do DNA ribossomal (rDNA). Para o efeito, foi extraído o DNA fúngico, com recurso a um kit de extração ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (Zymo Research). Foram colocados 600 µL de solução de lise e 10 mg de micélio, em suspensão aquosa num tubo de lise incluído no kit, tendo este sido submetido a 5 min de agitação num Bead Beater (Retsch Mixer Mill MM 400). A extração foi realizada segundo o protocolo incluído no kit, fornecido pelo fabricante.
Após a extração do rDNA, procedeu-se à amplificação, através de PCR, utilizando os
primers ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) e ITS2 (GCTGCGTTCTTCATCGATGC),
para amplificação da região ITS (White et al., 1990; Gardes & Bruns, 1993) e a enzima Taq DNA polimerase com as condições de PCR descritas no Quadro 3. Através de eletroforese em gel de agarose (1%) foram confirmados os resultados da amplificação, tendo o produto da mesma sido enviado para sequenciação, pelos serviços fornecidos pela Macrogen (Amsterdão, Holanda). As sequências foram analisadas com recurso ao software Sequence
Scanner v1.0 para a identificação dos fungos com recurso ao algoritmo blastn, disponibilizado
na página web da base de dados UNITE (www.unite.ut.ee), ao algoritmo BLAST disponibilizado na página web do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e ao algoritmo disponibilizado na página web da base de dados BOLD SYSTEMS (www.boldsystems.org).
Quadro 3 - Condições da PCR utilizadas para amplificação da região ITS do rDNA dos fungos isolados.
Etapas Temperatura (ºC) Tempo Ciclos
Desnaturação inicial 94 4 min 1
Desnaturação inicial 94 30 s
35
Annealing 52 30 s
Extensão 72 30 s
Extensão final 72 10 min 1
2.4 Meios de Cultura
2.4.1 Meio Nematode Growth
O NGM para manutenção de culturas de nemátodes foi produzido segundo Sulston & Hodgkin (1988). Para 1L de NGM foram pesados 2,9 g de NaCl; 2,5 g de peptona e 17 g de agar que foram posteriormente adicionados a frascos Schott e o volume prefeito com água desionizada. O meio foi autoclavado e de seguida, depois de ligeiramente arrefecido, foram adicionados, numa câmara de fluxo laminar vertical (Faster – Bio 48), 1 mL de solução stock de MgSO4 (1M), 1 mL de solução stock de CaCl2 (1M), 25 mL de solução stock KH2PO4 (1M, pH: 6) e 1 mL de solução alcoólica (etanol 95%) de colesterol (5 µg/mL). As soluções stock foram preparadas e autoclavadas previamente.
2.4.2 Meio Corn Meal Agar
O meio CMA foi preparado usando, para 1 L e uma concentração de 17 g/L, 17 g de Corn
Meal Agar (Oxoid) e 1 L de água desionizada. Foram posteriormente adicionados antibióticos
ao meio, nas quantidades de 0,0125 g de clortetraciclina, 0,0125 g de estreptomicina e 0,0125 g de cloranfenicol, de modo a impedir o crescimento de bactérias no meio.
2.4.3 Meio Luria-Bertani
Para a manutenção das culturas de E. coli, foi preparado meio LB, segundo o protocolo disponibilizado online pela Cold Spring Harbor (2006). Para a preparação de 1 L de meio LB foram adicionados a um frasco Schott: 5 g de extrato de leveduras (Panreac), 10 g de bacto-triptona (Sigma-Aldrich), e 5,84 mL de solução stock de NaCl 1M. Após ter sido adicionada água desionizada de forma a perfazer o volume total, o meio foi autoclavado.
2.4.4 Meio Water Agar
Para utilização como suporte físico para os nemátodes e para o solo nas sprinkle plates, foi preparado um meio de agar, WA, a 10 g/L, utilizando agar bacteriológico (Sigma-Aldrich).
Foi também preparado um meio de agar a 0,05%, para suspensão dos pequenos volumes de solo vertidos e colocados nas sprinkle plates.
2. Material e Métodos
32 2.5 Análises dos Solos
As amostras de solo foram analisadas pelo Laboratório de Solos da Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro quanto aos parâmetros: pH (água e KCl), percentagem de matéria orgânica, P extraível, K extraível, N total e razão carbono/azoto. Os resultados fornecidos encontram-se registados no Quadro 4.
Quadro 4 – Valores dos parâmetros físico-químicos dos solos da rizosfera dos sobreiros amostrados (A1 – A5).
pH água pH KCl % Matéria Orgânica P extraível (mg P2O5kg-1) K extraível (mg K2Okg-1) N total (g Nkg-1) C/N A1 5,10 4,30 4,53 6,00 188,00 2,35 11,20 A2 5,10 4,30 3,06 3,00 169,00 1,56 11,40 A3 5,00 4,00 3,53 8,00 162,00 1,78 11,50 A4 5,40 4,70 5,95 13,00 259,00 2,78 12,40 A5 5,00 4,20 5,20 19,00 290,00 2,56 11,80 2.6 Análise Estatística
A análise estatística foi efetuada com o auxílio do software IBM SPSS Statistics®20. Os dados obtidos da identificação da comunidade de nemátodes e os descritores calculados pelo
software NINJA foram submetidos ao teste de homogeneidade de variâncias de Levene, tendo
sido seguidamente analisados através de ANOVA multifatorial com probabilidade de 5%. Diferenças significativas entre as comunidades de nemátodes foram verificadas através do teste LSD de Fisher. Todos os dados foram ainda submetidos ao teste de correlação de Pearson a 0,05%, com o objectivo de conhecer possíveis relações entre os diferentes parâmetros estudados.
