Araraquara
2005
Colonização e I dent ificação de
St r e pt ococcu s gr u po m u t a n s
e
Ca n dida
spp
. em lesões de cárie associadas ou
Orientador: Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidorio
Colonização e Identificação de
Streptococcus
grupo
mutans
e
Candida
ssp
. em lesões de cárie associadas ou
não a Síndrome da Cárie de mamadeira.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas da Faculdade de Odontologia de Araraquara - Unesp, como pré-requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas, Área de Concentração em Odontopediatria.
Carvalho, Fabíola Galbiatti de
Colonização e identificação de Streptococcus grupo mutans e Candida ssp. em lesões de cárie associadas ou não a Síndrome da Cárie de mamadeira / Fabíola Galbiatti de Carvalho. – Araraquara : [s.n.], 2005.
138 f. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia.
Orientador: Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidório
1. Cárie dentária 2. Streptococcus mutans 3. Candida I. Título
COMISSÃO JULGADORA
Dissertação para obtenção do Título de Mestre
Presidente e Orientador: Prof
a. Dr
aDenise M. Palomari Spolidorio
2° Examinador: Prof
a. Dr
aRegina Maria Puppin Rontani
3° Examinador: Prof
a. Dr
aJosimeri Hebling
1°Suplente: Prof
a. Dr
aAngela Cristina Cilense Zuanon
2°Suplente: Prof
a. Dr
aAnna Tereza Sant’anna
Colonização e Identificação de
Streptococcus
grupo
mutans
e
Candida
ssp
. em lesões de cárie associadas ou
Fabíola Galbiatti de Carvalho
Nascimento: 30/11/1978 – São Paulo - SP
Filiação: Jefferson Baptista de Carvalho Junior Rose Mari Galbiatti de Carvalho
1997/2000 Graduação em Odontologia
Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP
2001/2003 Curso de Pós-graduação - Nível Especialização - em
Odontopediatria pela Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP
deixando muitas saudades... e a lição que devemos lutar até o fim pelos nossos
objetivos... Você estará sempre presente!!!
Minha querida mãe, que sempre está ao meu lado, amiga e batalhadora,
apoiando e orientando os meus passos...
Muito obrigada pelo amor, exemplo, dedicação, respeito e ajuda, sem tudo isso esta
vitória não estaria se realizando...
Amo muito vocês !!!
Ao meu irmão Marco,
Suas conquistas servem como exemplo para trilhar meus objetivos... Você é
muito especial !!!
Ao Hugo,
Companheiro e amigo. Obrigada pela adorável convivência, constante
incentivo, amor e força nos momentos difícies... Você me faz muito feliz!!!
À Deus,
À orientadora
Denise Madalena Palomari Spolidorio,
Agradeço por todos os momentos... o conhecimento transmitido, o carinho oferecido,
a confiança depositada e pela compreensão nos momentos difíceis, tornando-se um
exemplo profissional e pessoal. Obrigada por sua amizade, sinceridade e incentivo!
À professora
Josimeri Hebling,
Que me acompanhou durante a vida acadêmica, sempre meiga, agradável e disposta
a transmitir seus conhecimentos... Obrigada pela amizade, ajuda e aos valiosos
diretor, Prof. Dr.José Cláudio Martins Segalla.
À Coordenadora do Curso de Pós-Graduação em Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, Profa. Dra. Rita de Cássia Loiola Cordeiro.
Aos demais professores da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP: Ângela Cristina Cilense Zuanon, Cyneu Aguiar Pansani, Elisa Maria Aparecida Giro, Fabio César Braga de Abreu e Lima, Josimeri Hebling, Lourdes Aparecida dos Santos Pinto, pelos ensinamentos e convivência.
Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, pela atenção dedicada.
À Profa. Dra. Josimeri Hebling, pela disponibilidade e análise estatística deste trabalho.
Ao colega de turma Thiago “in memorian”, você foi uma grande perda, mas estará para sempre em meu coração...
Aos colegas de turma: Emi, Érika, Fabio, Jonas, Junia, Hermes, Murilo e Pedro e aos colegas de Pós-graduação: Cris Duque, Cris Motisuki, Renata, Ticiana, Paula, Célia, Juliana, Juçaira, Andreza e Luciana... pela amizade e experiências vividas.
Aos colegas Carina, Andréia e Danilo pela amizade e ajuda na parte microbiológica deste trabalho... Muito obrigada!!!
A todos os colegas do Laboratório de Microbiologia, especialmente as amigas Cris Duque e Taís Negrini... pela agradável convivência, companheirismo e amizade!!!
Às minhas queridas amigas de república: Alice, Ana Paula, Emi, Larissa e Myrelle... obrigada pela grande amizade de vocês, por respeitarem meus momentos de “estresse” e pela amável convivência... jamais esquecerei nossas boas risadas, vocês moram no meu coração!!!
Aos pacientes que aceitaram gentilmente a participação nesta pesquisa, sem vocês este trabalho não seria possível!
Aos Funcionários da Seção de Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, pela dedicação e orientação.
Aos Funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, pela gentileza e eficiência com que sempre me atenderam.
A Bibliotecária Odete Aparecida Camilopela revisão das referências.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.
como pombas. Talvez, então, se ouvirmos com atenção,
escutaremos, em meio ao estrépito de impérios e nações, um
discreto bater de asas, o suave acordar de vida e da esperança.
Alguns dirão que tal esperança jaz numa nação; outros, num
homem.
Eu creio, ao contrário, que ela é despertada,
revivificada, alimentada por milhões de indivíduos solitários,
cujos atos e trabalho diariamente, negam as fronteiras e as
implicações mais cruas da história.
Como
resultado,
brilha por um breve momento a
verdade, sempre ameaçada, de que cada e todo homem, sobre a
base de seus próprios sofrimentos e alegrias, constrói para todos!”
1.3- Aquisição e colonização de Streptococcus grupo mutans na cavidade
bucal... 23
1.4 - Streptococcus grupo mutans e a cárie de mamadeira... 26
2 - Histórico de Candida spp... 34
2.2 - Espécies de Candida... 39
2.3 - Aquisição e colonização de Candida spp. na cavidade bucal... 42
2.4 -Candida spp. e a cárie de mamadeira... 47
PROPOSIÇÃO ... 52
MATERIAL E MÉTODO... 53
1. Perfil da Amostra... 53
2. Procedimentos Clínicos... 55
3. Procedimentos Microbiológicos... 58
4. Identificação das espécies de Streptococcus grupo mutans... 59
5. Identificação das espécies de Candida spp... 67
6. Análise Estatística... 73
RESULTADOS... 74
DISCUSSÃO... 92
CONCLUSÃO... 109
REFERÊNCIAS... 110
RESUMO... 124
ABSTRACT... 125
ANEXOS... 126
Anexo 1 - Tabelas... 126
Anexo 2 - Questionário... 128
Anexo 3 - Comitê de Ética e Pesquisa... 130
Anexo 4 - Meios de Cultura utilizados... 132
1. Introdução
Em crianças de 1 a 5 anos de idade, a manifestação mais comum da doença cárie é chamada de “cárie de mamadeira” (RAMOS-GOMEZ et al., 2002). Sua etiologia é associada ao freqüente e prolongado consumo de líquidos açucarados na mamadeira (BERKOWITZ, 2003), principalmente ao hábito de dormir mamando leite açucarado, ou qualquer outra solução rica em sacarose (MILGROM et al., 2000) como também, ao prolongado aleitamento materno e hábitos de adoçar chupeta (WEERHEIJM et al.,1998).
Clinicamente, os primeiros dentes a serem afetados são os incisivos decíduos superiores, com lesões iniciais no terço cervical da superfície vestibular. Os molares decíduos são também atingidos, porém os incisivos inferiores geralmente não são acometidos pela doença, sendo esta uma característica clínica patognomônica. Possui evolução rápida podendo destruir toda a estrutura coronária (MILNES, 1996; ISMAIL e SOHN, 1999). Estudos sobre a microbiota da cárie de mamadeira iniciaram na década de 80 com o objetivo de pesquisar os agentes etiológicos microbianos relacionados com esse tipo de cárie, bem como ajudar a esclarecer o relacionamento entre dieta e composição do biofilme dentário (van HOUTE et al., 1982). Apesar de ser uma microbiota muito abrangente,
dos microrganismos encontrados nas lesões de cárie, manchas brancas e superfícies hígidas ao redor da lesão (MATEE et al., 1992; MARCHANT et al., 2001). Entretanto, Candida spp., Lactobacillus, Actinomyces, Veillonella e
outros também podem ser isolados neste tipo de cárie. (MARCHANT et al.,
2001; STARRet al., 2002).
As crianças durante a primeira infância apresentam maior predisposição à colonização da cavidade bucal por microrganismos oportunistas, principalmente C. albicans, devido ao sistema imune imaturo,
microbiota bucal não totalmente estabelecida, uso de chupetas e mamadeiras que favorecem a colonização (DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995) e transmissibilidade pelo contato com a vagina da mãe durante o parto (MONDIN, 2003), o que ressalta a importância de estudos relacionados à proliferação de Candida spp.
A maioria dos estudos investiga a microbiota da cárie de mamadeira no biofilme dental comparando com o de crianças livres de cárie, porém a dentina cariada não é freqüentemente coletada. Além disso, não existe nenhum relato na literatura comparando os microrganismos da cárie de mamadeira com os da cárie. Torna-se de grande importância investigar a colonização de Streptococcus grupo mutans e Candida spp. nestes dois tipos
2. Revisão da Literatura
1. Histórico de Streptococcus grupo mutans
A cárie é caracterizada pela desmineralização dos tecidos dentários, possuindo etiologia multifatorial dependente da microbiota, hospedeiro, dieta e tempo, além de ser considerada uma doença infecciosa e transmissível (FITZGERALD e KEYES, 1960; RAMOS-GOMES et al., 2002). A presença freqüente de carboidratos fermentáveis e a microbiota residente na cavidade bucal são fatores importantes para o seu desenvolvimento, em função da fermentação dos carboidratos e produção de ácidos pelas bactérias do biofilme presente sobre a estrutura dentária, formando um complexo ecossistema (HAMADA e SLADE, 1980; LOESCHE, 1986).
Apesar da grande diversidade de espécies de microrganismos que colonizam a cavidade bucal, os Streptococcus grupo mutans, destacam-se
desses microrganismos (ZINNER et al., 1965; SHKLAIR e KEENE, 1974; KRAL e DANEO-MOORE,1981; SPOLIDORIO et al., 2003).
Foram descritos pela primeira vez em 1924, quando Clarke isolou microrganismos de lesões de cárie de dentes humanos e os denominou de
Streptococcus mutans devido à morfologia mais ovalada das colônias,
aparentando ser uma forma mutante de estreptococos. Porém, por muitos anos nenhum outro estudo foi citado na literatura sobre este microrganismo. Todavia, a partir de 1956, esses microrganismos foram "redescobertos" e demonstraram ser capazes de causar cárie dental em roedores (FITZGERALD e KEYES, 1960). Como estas bactérias eram idênticas à descrita por Clarke em 1924, foram denominadas Streptococcus mutans. A
partir desta data, o S. mutans permaneceu relacionado à cárie dental como o
principal agente etiológico, podendo ser isolado de biofilmes dentais ou da saliva de indivíduos cárie-ativos (LOESCHE, 1986).
Estudos taxonômicos realizados com várias amostras dessas espécies demonstraram heterogeneidade correspondente a S. mutans (CARLSSON,
1968; DRUCKER e MELVILLE, 1971). Nesse sentido, o primeiro autor a demonstrar diferenças sorológicas entre cepas de S. mutans foi Zinner et al.
em 1965 em ratos e hamsters. Posteriormente, BRATTHAL (1970) estudando cepas de S. mutans, dividiu-as em 5 grupos baseados na
estabeleceu os grupos sorológicos a, b, c, d e e. Subsequentemente,
PERCH et al. (1974), com base também em estudos sorológicos, propuseram dois sorotipos adicionais (f, g).
Os estudos de taxonomia numérica propostos por CARLSSON (1968) e DRUCKER e MELVILLE (1971), demonstraram que cepas de S. mutans são
fenotipicamente homogêneas. No entanto, DUNNY et al. (1973), obtiveram variações na constituição de base do DNA entre cepas de S. mutans, o que
levou COYKENDALL (1974) por meio de análise da composição, seqüência de bases e reassociação do DNA, a demonstrar a existência de 4 grupos genéticos ou biotipos distintos (I a IV), propondo subespécies ou "genoespécies" de S. mutans. Posteriormente, também descreveu um novo
genótipo V, isolado da boca de ratos selvagens e correlacionou os genótipos com os sorotipos descritos por BRATTHALL (1970), afirmando que, dentre um genótipo, diferentes sorotipos e reações bioquímicas poderiam ocorrer.
Durante esse período, um novo esquema bioquímico foi proposto por SHKLAIR e KEENE (1974), para separação de S. mutans. A identificação foi
baseada em provas de fermentação de manitol (com e sem bacitracina), sorbitol, rafinose, melibiose e na produção de amônia pelo substrato da arginina. Assim, através de características bioquímicas, a existência de 5 grupos distintos (a - e) foram descritas, relacionados aos sorotipos a - e de
composições moleculares. As 5 espécies descritas foram: S. cricetus, S.
rattus, S. mutans, S. sobrinus e S. ferus. Entretanto, Hamada et al. em 1979
em estudo com 137 amostras clínicas isoladas de sorotipos c e e obtiveram
resultados similares na fermentação de melibiose para os grupos genéticos ou biotipos I e V. Porém, a fermentação deste açúcar-alcool é um ponto chave na diferenciação entre os biotipos I e V, pois o I (relacionado com o sorotipo c) é considerado melibiose positivo e o biotipo V (relacionado com o
sorotipo e) é melibiose negativo. Assim, os autores sugeriram que a
biotipagem não era correlacionada com a sorotipagem. Baseado neste e em outros estudos, em 1980 Hamada e Slade concluíram que a classificação bioquímica em sorotipos e grupos genéticos (biotipos) de S. mutans poderia
levar a uma confusão taxonômica, assim os autores sugeriram a utilização da denominação em sorotipos, pois já era uma identificação precisa utilizada em grupos de outros estreptococos.
KRAL e DANEO-MOORE (1981), propuseram mais um esquema bioquímico de diferenciação, constituindo a modificação do sistema API 50 L*, destinado à caracterização bioquímica de lactobacilos que, associado ao esquema de SHKLAIR e KEENE (1974), permite a diferenciação de espécies do grupo mutans. Com base em estudos de taxonomia, BEIGHTON et al.
(1981), isolaram da placa dental de macacos (Macaca fascicularis) o sorotipo
h - o qual estaria implicado no processo de cárie em macacos - foi intimamente relacionado ao grupo genético ou biotipo III (sorotipo a).
Posteriormente, BEIGHTON et al. (1984), propuseram mais uma espécie,
Streptococcus macacae.
A comprovação de que variações em características bioquímicas, sorológicas e genéticas entre estreptococos do grupo relacionam-se à espécie animal da qual foi isolado (BRATTHALL, 1970; COYKENDALL, 1974; PERCH et al, 1974), foi reconhecida pela última edição do Manual de BERGEY’S (HARDIE, 1986), que descreve o grupo mutans de
Streptococcus, composto pelas espécies S. cricetus, S. mutans, S. rattus, S.
sobrinus, S. ferus e S. macacae (ANEXO 1 – Tabela 1). WHILEY et al.
(1988), propuseram mais uma espécie, S. downei, sorotipo h, representando
uma espécie distinta, pertencente ao grupo mutans. No ano 2000, uma nova
espécie foi isolada de ratos, sendo chamada de S. orisratti sp. nov. (ZHU et
al., 2000).
Outros métodos podem ser empregados para identificação de estreptococos grupo mutans, como a técnica de separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida, particularmente SDS-PAGE, a qual baseia-se em análise qualitativa e quantitativa para substâncias que apresentam carga elétrica, e ocorre migração destas em determinado campo elétrico. Este é um recurso disponível também para caracterização de microrganismos (SPOLIDORIO et al., 2003).
chamadas de mutacinas, são proteínas antibacterianas capazes de inibir o crescimento de bactérias genética e ecologicamente relacionadas, bem como o crescimento de outras espécies bacterianas Gram-positivas. Esse método permite agrupar cepas com perfis similares de produção e/ou sensibilidade as bacteriocinas, bem como demonstrar a heterogeneidade intra-espécie e intra-indivíduo (SPOLIDORIO et al., 2003).
Com o advento de técnicas modernas de Biologia Molecular, surgiram métodos de detecção pela seqüência de DNA. Os testes genéticos são considerados mais sensíveis e específicos e são denominados de AP-PCR
(Reação da Cadeia em Polimerase com Iniciadores Arbitrários), RAPD
(Random Amplified Polymrphic DNA – Polimorfismo do DNA Amplificado ao Acaso) capazes de gerar “impressão digital” (“fingerprinting”) de produtos de DNA, isolados de diferentes espécies. Resumidamente, através de ciclos de temperatura e presença do “primer” de seqüência arbitrária, o qual se anela aos segmentos complementares no DNA genômico, ocorre amplificação de tais segmentos anelados e posterior separação por eletroforese em gel de agarose, gerando padrões de AP-PCR ou “fingerprinting” de isolados. Os padrões podem ser comparados para análise filogenética (SPOLIDORIO et al., 2003). A Ribotipagem é outro método utilizado para relacionar isolados bacterianos, sendo possível demonstrar por esta técnica, por exemplo, que a cavidade bucal de crianças pode ser colonizada por mais de um sorotipo de
Com o objetivo de comparar a detecção de S. mutans e S. sobrinus
pelo método de fenotipagem (testes bioquímicos) e PCR, avaliando a sensibilidade e especificidade dos dois testes, AMOROSO et al. em 2004 investigaram também a transmissibilidade desses microrganismos entre pais e filhos. Os autores relataram que o PCR possui limites de detecção excelentes na maior parte das situações, mas apenas uma quantidade diminuta da amostra é empregada no processo típico de amplificação. Assim, a alíquota utilizada pode não conter o microrganismo alvo se esse estiver presente em baixas proporções. Por esse motivo, muitos autores submetem o produto amplificado a um novo ciclo de amplificação, aumentando a chance de detecção do microrganismo em estudo. Os resultados mostraram que as duas técnicas são eficazes na detecção de Streptococcus grupo
mutans, considerando que os testes bioquímicos são precisos na
identificação de microrganismos.
1.2 – Espécies deStreptococcus grupo mutans
Streptococcus mutans
Proposto por CLARKE (1924), foram sorologicamente denominados por reagirem com antisoro para S. mutans sorotipo c, e ou f (BRATTHALL,
1974). Fermentam manitol, inulina, lactose, sorbitol, melibiose, rafinose, trehalose. Não produz peróxido de hidrogênio (H2O2), amônia e não
fermentam xilitol e glicerol, porém hidrolizam a esculina, (HARDIE, 1986). Sintetizam polissacarídeos intracelulares e extracelulares, produzindo 3 glicosiltransferases (GTF-I, GTF-SI, GTF-S) e também fructosiltransferase,
as quais são enzimas extracelulares que agem sobre a sacarose (COLBY e RUSSEL, 1997). O primeiro habitat de S. mutans é a superfície dentária,
podendo ser encontrado também nas fezes (HARDIE, 1986). É cariogênico em modelos experimentais de ratos, hamsters e macacos, estando associado com a cárie dental em humanos (HAMADA e SLADE, 1980; LOESCHE, 1986; BERKOWITZ, 2003).
Streptococcus sobrinus
Este microrganismo foi originalmente isolado da cavidade bucal humana. Algumas cepas de S. sobrinus são alfa-hemolíticas, outras não
hemolíticas. Fermentam manitol, inulina e lactose, mas algumas cepas variam na habilidade de fermentar sorbitol, melibiose e rafinose. Produzem peróxido de hidrogênio (H2O2), não hidrolizam esculina, como também não
produzem amônia (HARDIE, 1986). Sorologicamente reagem usualmente com antisoro para S. mutans sorotipo d ou g (BRATTHALL, 1970). Não
polissacarídeos extracelulares com S. mutans, produzindo 4
glicosiltransferases (GTF-I, GTF-A, GTF-S, GTF-SB) e nenhuma
fructosiltransferase (COLBY e RUSSEL, 1997).
O habitat de S. sobrinus é a superfície dos dentes, sendo cariogênico
para animais experimentais e está associado à cárie dental humana (HIRASAWA e TAKADA 2003). Acredita-se que S. sobrinus possua uma
maior virulência e seja mais acidogênico e sacarose dependente que S.
mutans (COLBY e RUSSEL, 1997; HIRASAWA e TAKADA 2003).
Streptococcus rattus
O nome desta espécie foi dado por COYKENDALL (1977) e descrita originalmente como sorotipo b de S. mutans (BRATTHALL, 1970). A
Streptococcus cricetus
Originalmente isolados da cavidade bucal de hamster (COYKENDALL, 1977), e ocasionalmente em humanos. Algumas cepas de S. cricetus
produzem uma zona de alfa-hemólise, mas a maior parte é não hemolítica em agar sangue. As cepas desse microrganismo reagem com antisoro para
S. mutans sorotipo a (BRATTHALL, 1970).
Streptococcus ferus
Foram originalmente isolados da cavidade bucal de ratos que consumiam cana-de-açúcar como dieta alimentícia (COYKENDALL, 1974). Não são encontrados em humanos e não têm sido amplamente estudados. Estas cepas reagem com antisoro c de BRATTHAL (1970) e produzem
polissacarídeos extra e intracelulares. Fermentam manitol e sorbitol, mas não fermentam rafinose e são inibidos por bacitracina (2 unidades/mL) (HARDIE, 1986).
Streptococcus macacae
O termo S. macacae foi proposto por BEIGHTON et al., (1984), por ter
sido isolado de biofilme dental de macacos (Macaca fascicularis). Produz
manitol e rafinose, mas não inulina e são sensíveis a bacitracina. Sorologicamente, reagem com antisoro para S. mutans sorotipo c
hidrogênio, porém hidrolizam esculina. O habitat de S. macacae é a cavidade
bucal, predominantemente a superfície dos dentes e não foram ainda encontrados em humanos.
Streptococcus downei
Descrito por WHILEY et al. (1988), foi originalmente isolado do biofilme dental de macacos (Macaca fascicularis) e designado como sorotipo h. Essa
espécie forma colônias firmes, pequenas e rugosas. Fermentam manitol, glicose, sacarose, frutose, galactose, inulina, mas não fermentam melibiose, sorbitol, rafinose, arabinose, sorbose e xilitol. Não produzem amônia de arginina, nem peróxido de hidrogênio. Não crescem a 45ºC, e são inibidos por bacitracina (2 unidades/mL).
Streptococcus orisratti
Descrito por ZHU et al. (2000), foi originalmente isolado de ratos
(Sprague-Dawley). As colônias são brancas, circulares ou irregulares de 0,5
1.3 – Aquisição e Colonização deStreptococcus grupo mutans na
cavidade bucal
A cavidade bucal do ser humano inicia a colonização durante o nascimento e a sucessão de microrganismos continua por toda a vida. A aderência é o evento inicial, sendo caracterizada pela ligação das células bacterianas por meio de adesinas à película adquirida do esmalte dentário, composta por glicoproteínas salivares (HAMADA e SLADE, 1980). Durante os primeiros meses de vida, somente as superfícies mucosas (palato, rodete gengival, dorso da língua e mucosa jugal) são susceptíveis a colonização. Após o irrompimento dos dentes ocorre um aumento do número de sítios disponíveis para a aderência (sulco gengival, superfície dentária e restaurações) (RIPA, 1988).
Ao nascimento, os estreptococos grupo mutans não estão presentes na cavidade bucal da criança, podendo estabelecer-se no momento em que a erupção do primeiro dente decíduo ofereça condições propícias para o seu desenvolvimento, devido ao aparecimento de uma superfície dura e não descamante, sendo a mãe a principal fonte de transmissão deste microrganismo por meio da saliva (RIPA, 1988; BERKOWITZ, 1996; BERKOWITZ, 2003). Entretanto, existem trabalhos onde a colonização de S.
mutans ocorre em crianças edêntulas, relatando que esta é influenciada por
de mamadeira com solução açucarada, providenciando um substrato para a proliferação dessa bactéria (MILGROM et al., 2000; RAMOS-GOMES et al., 2002), colocando em dúvida a necessidade de uma superfície não descamante para a colonização de S. mutans (BERKOWITZ, 2003).
Estudos sobre a colonização bacteriana em superfície de esmalte hígido revelaram que os primeiros colonizadores orais são constituídos por
Streptococcus sanguinis e Streptococcus grupo mitis (NYVAD e KILIAN,
1990). Além de participarem da colonização inicial, estes microrganismos podem se tornar predominantes dependendo das condições ambientais. Uma condição favorável para emergência de colonizadores primários é a manutenção de alto pH na cavidade bucal. Quando ocorre queda devido ao consumo de açúcares fermentáveis o número de S. sanguinis diminui e o
número de S. mutans aumenta consideravelmente, chegando ao predomínio
populacional (NYVAD e KILIAN, 1990).
A espécie S. sanguinis participa da microbiota indígena humana e é
reconhecida por seu papel antagonista na cárie dental e na doença periodontal, apresentando reduzido potencial cariogênico (LOESCHE, 1986). Segundo Nyvad e Kilian (1990), Marchant et al., (2001) indivíduos com cárie são mais propensos à colonização por estreptococos grupo mutans (principalmente S. mutans) ao contrário dos indivíduos livres de cárie, os
quais possuem uma colonização mais persistente de S. Sanguinis, sendo
Em indivíduos com baixa ou nenhuma experiência de cárie, S.mutans
compreende menos de 1% da microbiota do biofilme dentário (HAMADA e SLADE, 1980; BERKOWITZ et al., 1984; COLBY e RUSSEL, 1997; BERKOWITZ, 2003). Porém, em indivíduos com cárie, Streptococcus grupo
mutans é o microrganismo predominante, principalmente Streptococcus
mutans c,f e Streptococcus sobrinus (HAMADA e SLADE, 1980; LOESCHE,
1986).
Amostras do biofilme dental de crianças na superfície interproximal de dentes com mancha-branca mostrou maior colonização de S. mutans, S.
sobrinus e Lactobacillus spp. na região abaixo do ponto de contato, a
freqüência de isolamento nesta região de S. mutans sorotipo c foi 81%, S.
sobrinus 44% e Lactobacillus spp. 8% (BABAAHMADY et al., 1998).
Spolidorio et al. (2004), avaliaram a prevalência de Streptococcus
grupo mutans presente na saliva de 200 crianças brasileiras com cárie de 6 a
8 anos de idade, identificando espécies pelo método de SHKLAIR e KEENE (1974). Concluindo que a maior freqüência foi de S. mutans sorotipo c,
seguida de S. sobrinus,S. rattus, S. mutans sorotipo e, S. cricetus.
sendo que S. mutans estão mais relacionados com o início da lesão de cárie
e Lactobacillus spp. com a progressão da doença (van HOUTE et al., 1982;
BERKOWITZ et al., 1984; BERKOWITZ, 2003).
1.4 - Streptococcus grupo mutans e a Cárie de mamadeira
O primeiro estudo sobre a microbiota da cárie de mamadeira foi realizado por van Houte et al. em 1982, identificando S. mutans, S.
sanguinis, S. salivarius e Lactobacillus spp. de crianças portadoras de cárie
de mamadeira. Foram coletadas amostras de biofilme de incisivos superiores nas regiões de cárie, mancha-branca nas margens da lesão e área clinicamente hígida no terço cervical da coroa de outro incisivo superior ou do mesmo, porém 3mm distante da lesão, como também de biofilme nas regiões clinicamente hígidas da superfície vestibular, lingual ou proximal de molares e amostras de saliva. A porcentagem média de S. mutans presente
no biofilme dentário de lesões de cárie, mancha-branca ao redor da lesão e áreas clinicamente hígidas foi 61% nos dentes anteriores e 27% nos posteriores. Na saliva S. mutans foi presente em 10% da microbiota. Os
autores sugerem que o principal microrganismo envolvido na cárie de mamadeira é o S. mutans, necessitando de estudos adicionais para verificar
Baseando-se no estudo de van Houte et al. (1982), Berkowitz et al. em 1984 investigaram a presença de S. mutans e Lactobacillus spp. em
crianças de 20 a 37 meses de idade, apresentando cárie de mamadeira. Amostras de biofilme foram coletadas de lesões de cárie, mancha-branca ao redor das mesmas e do terço cervical de dentes livres de cárie. Todos os sítios colonizaram altas proporções de S. mutans, os níveis de Lactobacillus spp. foram significantemente maiores no sítio de lesão de cárie, sendo
consistente com o conceito que este microrganismo está relacionado com a progressão da doença e não com o início. Os autores acreditam que a cárie de mamadeira é caracterizada por uma microbiota específica e também enfatizam que S. mutans é um importante agente etiológico para o
desenvolvimento da doença e apenas as crianças que colonizam essa bactéria são consideradas de risco para a cárie.
Com o objetivo de tornar mais amplo o estudo da microbiota da cárie de mamadeira desde o esmalte hígido até a formação da lesão de cárie, detectando espécies de Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces e
Veillonella, Milnes e Bowden (1985) examinaram amostras de biofilme de
susceptíveis que não desenvolveram lesão de cárie e a dos sítios que desenvolveram foi estatisticamente semelhante, sugerindo que outros fatores além do estabelecimento de uma microbiota patogênica estão envolvidos no desenvolvimento da doença. Veillonella foi encontrada em quantidade
significantemente maior nos sítios susceptíveis. S. mutans foi identificado
pelo método de Shklair e Keene (1974), o sorotipo c,f foi presente em todas
as amostras positivas e S. sobrinus foi detectado em 4 das 5 crianças que
desenvolveram cárie.
A fim de comparar a microbiota do biofilme dental em lesões de cárie pigmentadas (escurecidas) e não pigmentadas de crianças com cárie de mamadeira, Boue et al. (1987) coletaram amostras de biofilme da superfície vestibular de incisivos superiores e inferiores (na região cervical para crianças livres de cárie e no centro da lesão de cárie para os demais grupos) de 24 crianças de 1 a 5 anos de idade. Os autores utilizaram meios de cultura para crescimento bacteriano suplementados com certos antibióticos e antimicrobianos (metronidazol, vancomicina, clorexidina, nistatina) para melhorar a seletividade das espécies a serem identificadas. Os resultados mostraram que S. mutans foi presente em altos níveis no biofilme de crianças
com cárie de mamadeira, independente do estágio de desenvolvimento da lesão (crônica ou aguda) quando comparados com crianças livres de cárie, as quais foram mais colonizadas por outros estreptococos não mutans (S.
As crianças que são amamentadas no peito, também podem desenvolver “cárie de mamadeira”, porque sob condições dietéticas normais, o leite não é considerado cariogênico, mas exposições repetidas e prolongadas levam a uma queda do pH bucal. Além disso, tanto o leite bovino quanto o humano possuem a lactose (4% e 7%, respectivamente) tornando-se cariogênicos se permanecerem estagnados na superfície dentária por longo período (RIPA, 1988; WEERHEIJM et al., 1998). Com o intuito de analisar microrganismos cariogênicos presentes em crianças com cárie de mamadeira, nas quais a amamentação materna foi a principal fonte de alimentação, Matee et al. (1992) investigaram a prevalência de S. mutans
e Lactobacillus em 34 crianças de 1 a 2,5 anos de idade, com (n=17) e sem
cárie de mamadeira (n=17), pela coleta de amostras de saliva e biofilme do sítio da lesão e do esmalte hígido distante 3mm da cavidade de incisivos superiores. A contagem de S. mutans das amostras de biofilme e saliva foi
maior em crianças com cárie de mamadeira comparada com as livres de cárie, sem existir diferença estatisticamente significante entre os sítios de lesão e esmalte hígido ao redor para as amostras de biofilme. Este estudo mostrou que a cárie de mamadeira pode ocorrer em crianças que são amamentadas no peito na ausência da mamadeira.
que estas foram colonizadas por diferentes ribotipos de S. mutans
comparados com crianças livres de cárie, demonstrando que indivíduos com maior atividade de cárie apresentaram maior diversidade genética de estreptococos cariogênicos. Segundo estes autores, as crianças com cárie de mamadeira não estão apenas pesadamente colonizadas por estreptoccocos grupo mutans, mas também freqüentemente colonizadas por mais de um genótipo. Nestas crianças para a aquisição de tais genótipos, o consumo freqüente de açúcar torna o ambiente propício para o crescimento de espécies cariogênicas. Provavelmente a ação simultânea de várias cepas, com diferentes potenciais cariogênicos aumentaria o risco de cárie.
Em contrapartida, achados de Kreulen et al. (1997), sugeriram que genótipos específicos de S.mutans são selecionados em crianças com cárie
de mamadeira. Neste estudo, avaliou-se a diversidade genética de S.mutans
isolados de amostras de biofilme dental e saliva associada ou não à cárie de mamadeira (pela técnica de AP-PCR e UFC/mL) de 7 famílias que continham 2 irmãos cada, dos quais um apresentava cárie de mamadeira (grupo experimental) e o outro não era afetado (grupo controle), apesar de fazer uso da mamadeira. Apenas um padrão genético de S. mutans foi encontrado em
mamadeira, em decorrência de alteração na homeostase, possivelmente devido à redução de pH na cavidade bucal. Sugerindo ainda que sendo o processo cariogênico desenvolvido por um único tipo de cepa, futuramente poder-se-ia desenvolver uma terapia antimicrobiana específica bem sucedida.
O estudo da microbiota em dentina cariada não é freqüente. Na literatura encontra-se com maior freqüência coleta de amostras do biofilme depositado sobre a lesão de cárie e de saliva. Motisuki et al. (2004) compararam três métodos de detecção de S. mutans e Lactobacillus spp. na
cavidade bucal de 30 crianças pela coleta de saliva com swab, saliva estimulada e biofilme. Os resultados apresentaram contagem similar de S.
mutans no biofilme e na saliva estimulada, entretanto o método mais eficaz
para determinar Lactobacillus ssp. foi a saliva estimulada.
Deste modo, Marchant, et al. (2001), avaliaram a microbiota predominante na dentina cariada de lesões de cárie de mamadeira de 14 crianças entre 3 e 5 anos de idade, comparando com amostras de biofilme de 15 crianças livres de cárie. S. mutans apresentou proporção
significativamente maior nas lesões de cárie, enquanto S. oralis, S. sanguis,
S. gordonii apresentaram proporção significativamente maior no biofilme. As
espécies de Candida albicans, Lactobacillus spp. e Veillonella spp. também
genética em uma simples lesão de cárie, pelo método de PCR, demonstrando que dentes cariados na mesma criança colonizaram diferentes genótipos (2 a 5 genótipos) de S. mutans e Lactobacillus spp. Os
autores concluem que a composição microbiana da cárie de mamadeira possui diversidade genética e suportam a hipótese que diferentes genótipos podem ter diferentes propriedades fisiológicas determinantes no processo da doença.
Estreptococos grupo mutans possuem um papel chave na colonização da cárie dental, principalmente na cárie de mamadeira, estando presente em altas proporções. Estudos foram realizados relacionando fatores dietéticos e a presença deste microrganismo na cárie de mamadeira. Como Milgrom et al. (2000) que avaliaram a associação entre cárie, colonização de S. mutans,
hipoplasia de esmalte e dieta de 199 crianças de 6 a 36 meses de idade, nas quais foram coletadas amostras de biofilme e do dorso da língua. S. mutans
foi detectado em 25% e S. sobrinus em 60% das amostras da língua de
crianças edêntulas. Crianças que utilizavam mamadeira com soluções açucaradas e apresentavam hipoplasia foram 7,8 e 9,6 vezes, respectivamente, mais prováveis de desenvolverem mancha-branca e cavitação. Com relação a microbiota, crianças com altos níveis de S. mutans
Da mesma maneira, Ramos-Gomes et al., 2002, investigaram a associação entre a presença de cárie, hábitos dietéticos e níveis de S.
mutans e Lactobacillus a partir da coleta de saliva de 146 crianças de 3 a 55
meses de idade. Não houve associação estatisticamente significante entre dieta, uso de mamadeira e a presença de cárie. Entretanto, o número de S.
mutans e Lactobacillus foi maior em crianças com cárie comparado com as
livres de cárie. Foi encontrado S. mutans em crianças edêntulas de 3 meses
de idade. Apesar de não ter existido correlação entre a presença de cárie, exposição de dieta cariogênica e uso de mamadeira, bactérias cariogênicas estavam presentes antes mesmo da erupção dentária, sugerindo que as bactérias iniciam a colonização e desmineralização dentária e os fatores dietéticos contribuem para o desenvolvimento da cárie, mas não iniciam o processo.
2. Histórico de Candida spp.
O gênero Candida pertence ao Reino Fungi, divisão Eumicetos
(fungos verdadeiros) e compreende microrganismos eucariotos, diplóides simples, que não apresentam ciclo sexual, possuindo vida saprofítica ou parasitária no organismo humano (McCULLOUG et al., 1996; PARDI, 2002). Suas espécies constituem os fungos mais prevalentes encontrados em indivíduos saudáveis ou imunocomprometidos, o principal habitat é o trato gastro-intestinal, porém colonizam também a cavidade bucal, orofaringe, dobras da pele, virilha, ânus e canal vaginal de indivíduos saudáveis (MONDIN, 2003).
Um dos primeiros fungos estudado e reconhecido como patógeno em infecções no homem foi a levedura hoje conhecida como Candida albicans.
Lodder em 1971 relatou que a doença conhecida na língua inglesa como
thrush (candidose pseudomembranosa aguda) era causada por este fungo e
Existem oito espécies de Candida de grande importância médica,
sendo a principal e mais freqüentemente isolada, inclusive na cavidade
bucal, a Candida albicans, porém outras espécies são encontradas em
infecções humanas como: Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida
krusei, Candida glabrata, Candida stellatoidea, Candida kefyr e Candida
dubliniensis (McCULLOUG et al., 1996; SULLIVAN et al., 2004). Todas são
caracterizadas principalmente através da morfologia colonial, assimilação de carbono e capacidade de fermentação (McCULLOUG et al., 1996; PARDI, 2002).
O meio mais utilizado para isolamento de Candida das amostras
clínicas é o ágar Sabouraud Dextrose (SDA), entretanto este não é um meio diferencial de espécies e as colônias que crescem não são distinguidas umas das outras facilmente (ODDS e BERNAERTS, 1994), sendo recomendado que seja utilizado um segundo meio para diferencia-las (BEIGHTON et al., 1995). Em SDA as colônias da maioria das espécies, incluindo C. albicans,
C. tropicalis, C. glabrata, C. stellatoidea, C. dubliniensis e C.guilliermondii
apresentam coloração branca ou branco-amarelada, forma convexa, aparência lisa e brilhante, úmida e cremosa, diâmetro em média de 4 a 8 mm, com odor característico (SANDVEN, 1990)
A associação das características morfológicas e bioquímicas pode ser utilizada para identificação das espécies de Candida (SANDVEN, 1990). O
identificar C. albicans, envolvendo a indução de crescimento de hifas (tubos
germinativos) de leveduras cultivadas em soro por 2-4 horas a 37°C (MONDIN, 2003).
O perfil de assimilação de carboidratos pode ser obtido por observação da zona de crescimento ao redor de discos impregnados com vários açucares (galactose, glicose, sacarose, maltose, lactose) sobre meio basal. Por outro lado, os testes de fermentação são geralmente realizados em meio líquido e são baseados na demonstração da produção de ácido ou gás (SULLIVAN e COLEMAN, 1998).
Um meio de rápida identificação de Candidaspp. foi relatado por Odds
e Bernaerts (1994) denominado CHROMagar Candida, baseado na incorporação de substâncias cromogênicas ao meio de cultura, as quais são ativadas por enzimas secretadas pelas espécies de Candida, sendo que
cada espécie possui uma coloração no meio (IYAMPILLA et al., 2004).
O meio CHROMagar Candida é considerado presuntivo, porém confiável e de rápida identificação, possuindo 99% de especificidade e sensibilidade para identificação das espécies C. albicans (coloração verde),
C. tropicalis (azul-escuro e metálico), C. Krusei (rosa-rugosa) (ODDS e
necessários outros testes, nem mesmo a produção do tubo germinativo (ODDS e BERNAERTS, 1994).
Em amostras coletadas da cavidade bucal, 450 colônias de coloração verde identificadas no CHROMagar Candida foram testadas também para atividade β-N-acetilgalactosaminidase (enzima produzida pela C. albicans) e
todas foram positivas, confirmando que o CHROMagar Candida é preciso na identificação de C. albicans (BEIGHTON et al., 1995). Embora o teste de
produção de tubo germinativo seja utilizado para identificação, 15% das espécies C. albicans isoladas não o produzem, indicando que a
diferenciação pelo CHROMagar Candida é mais confiável (IYAMPILLA et al., 2004).
PFALLER et al., (1996) relatam que o CHROMagar Candida também é capaz de identificar C. glabrata com níveis similares de precisão (94%)
comparados com C. albicans (95%), C.tropicalis (100%), C. krusei (100%). A
sensibilidade e especificidade do CHROMagar Candida, respectivamente, foi avaliada para C. albicans (99,4% - 100%), C.tropicalis, C. krusei, C. glabrata
(90,9% - 100%) (YÜCESOY e MAROL, 2003).
sendo o CHROMagar Candida ideal para esses requisitos (IYAMPILLA et al., 2004).
Métodos baseados na variabilidade genética podem também ser utilizados, como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLPs – Restriction Fragment Length Polymorphisms), que demonstra quais
seqüências de rDNA diferem entre as espécies de Candida, sendo útil na
diferenciação de C. albicans e C. dubliniensis (SULLIVAN et al., 2004).
A reação em cadeia de polimerase (PCR – Polymerase Chain
Reaction) também pode ser utilizado, oferecendo um sensível e rápido
método para identificação de espécies de Candida e a amplificação por PCR
é capaz de distinguir as espécies de Candida tropicalis, Candida krusei,
Candida glabrata e Candida dubliniensis. O RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA) é um método simples que confere uma discriminação
confiável para estudos clínicos epidemiológicos de infecções por Candida
(HOSSAIN et al., 2003).
Os métodos disponíveis para identificação de espécies de Candida
2.1 - Espécies de Candida
Candida albicans
Na forma de levedura apresenta-se como células globosas, ovóides ou alongadas, algumas vezes irregularmente formadas, medindo aproximadamente 3,5 a 6µm de largura por 6 a 10µm de comprimento. A reprodução geralmente é por gemulação, possuindo crescimento em duas formas, como levedura e hifa (PARDI, 2002). A grande maioria produz tubo germinativo, sendo esta uma característica diferencial (IYAMPILLA et al., 2004). C. albicans pode apresentar hifas em cultivos mais velhos e também
formar clamidósporos de parede celular espessa, às vezes em grande número (PARDI, 2002). É a principal espécie de Candida encontrada na
cavidade bucal de humanos (McCULLOUG et al., 1996).
Candida dubliniensis
Foi identificada por SULLIVAN et al. (1995) como uma nova espécie de levedura, filogeneticamente distinta das outras. C. dubliniensis é
a única espécie não albicans que produz tubo germinativo (SULLIVAN et al., 2004). Não apresenta crescimento a 42°C e 45°C, diferentemente da C.
albicans (PINJON et al., 1998).
Candida stellatoidea
Apresentam células ovais, às vezes alongadas, medindo entre 2,5 a 6µm de largura por 5 a 12µm de comprimento. Diferencia-se morfologicamente de C. albicans apenas pela escassa produção de
clamidósporo, que quando presentes encontram-se dispostos em cadeias de 2 a 3 células (STENDERUP, 1990).
Candida tropicalis
Apresentam células esféricas, ovais ou alongadas, medindo 2,5µm de largura por 3 a 4µm de comprimento. Raramente apresentam hifas em microcultivo (PARDI, 2002).
Candida parapsilosis
ramificado, possuindo em suas constrições poucos blastoporos (BUSCHELMAN et al., 1999).
Candida guilliermondii
Apresentam células curtas, ovóides e cilíndricas, medindo entre 2 a 4,5µm de largura por 2,5 a 7µm de comprimento. A formação de micélio é variável, sendo geralmente muito fino e em menor número (STENDERUP, 1990).
Candida krusei
Apresentam células ovóides e predominantemente cilíndricas, com tamanho variável, medindo aproximadamente 3 a 5µm de largura por 6 a 20µm de comprimento. Apresenta micélio constituído de células alongadas e delgadas, que se ramificam (BUSCHELMAN et al., 1999).
Candida glabrata
2.3- Aquisição e colonização de Candida spp.na cavidade bucal
O conhecimento sobre as fontes de aquisição de leveduras para a colonização primária da cavidade bucal de bebês é limitado. O canal vaginal da mãe tem sido sugerido como a fonte inicial de Candida durante o parto
normal. Outras possíveis fontes de transmissão são mãos, pele e saliva dos pais ou de pessoas que cuidam do bebê (MONDIN, 2003).
A aderência de espécies do gênero Candida às superfícies do
hospedeiro é requerida para a colonização inicial e contribui para a sua persistência dentro do hospedeiro, sendo de fundamental importância durante a progressão do estado de colonização para infecção (SEN et al., 1997).
Células de Candida aderem a diferentes células do hospedeiro, como
o epitélio, endotélio e células fagocíticas (SEN et al., 1997), apresentando também capacidade de aderir a hidroxiapatita e superfície acrílica de próteses e aparelhos ortodônticos (NIKAWA et al., 2003). A aderência das espécies de Candida ocorre pelas adesinas, as quais são compostas por
A presença de Candida na cavidade de recém-nascidos foi avaliada
por meio de um estudo longitudinal do dia do nascimento até completarem um ano de idade por Russell e Lay (1973). As amostras foram coletadas com swab na região sublingual e mucosa vestibular. No dia do nascimento 5,7% dos recém-nascidos apresentavam Candida, na quarta semana 96% dos
bebês com culturas inicialmente negativas, se tornaram positivas, declinando para 50% com um ano de idade. C. albicans foi a espécie predominante
(56%) e em menor proporção colonizaram C. tropicalis e C.parapsilosis. Os
autores concluíram que ocorreu transmissão do microrganismo por pessoas portadoras que entraram em contato com a criança.
O hábito de chupar chupeta também está relacionado com a presença
de Candida spp. na cavidade bucal e pode perturbar o ecossistema
microbiano, resultando em um aumento desta levedura. Sio et al. (1987), relataram que crianças que faziam uso de chupeta possuíam o dobro de colonização de Candida spp. comparadas com as que não faziam uso e a
porcentagem da levedura em chupetas com bico de silicone foi estatisticamente menor do que a de látex (22% e 75%, respectivamente).
Estudos sobre a presença e prevalência de Candida na cavidade
bucal de crianças variam com a idade e os resultados dependem do método usado para determiná-la. Com o propósito de avaliar a prevalência de
Candida em crianças saudáveis, Berdicevsky et al. (1984) coletaram
6 e 12 anos. Foi obtida uma alta prevalência em ambas as faixas de idade, 45% para crianças menores e 65% para as maiores, sendo estatisticamente significante. Não ocorreu diferença estatística nem para o sexo nem para a composição salivar entre crianças portadoras e não portadoras.
Com o mesmo objetivo de investigar a colonização por Candida na
cavidade bucal de crianças e associar a idade, sexo, amamentação e uso de chupeta, Darwazeh e Al-Bashir (1995) avaliaram 206 bebês saudáveis entre 2 e 11 meses de idade. A relação entre a história de candidose vaginal materna e colonização desta levedura na cavidade bucal dos bebês também foi avaliada. Foram coletadas amostras do dorso da língua, mucosa bucal e palato. Espécies de Candida foram isoladas de 48% dos bebês, sem relação
significativa com a idade, sexo ou entre as crianças que mamavam no peito materno ou em mamadeira. Similarmente, mães com história de candidose vaginal, não apresentaram relação significante com a colonização bucal das crianças por Candida. Quando a densidade do isolamento da levedura foi
comparada entre o grupo que utilizava chupeta e outro que não utilizava, houve alta proporção de isolados (> que 50 colônias) no grupo que usava chupeta, embora não significativa (p=0,22). C.albicans foi a espécie mais
freqüentemente isolada (30,6%), seguida por C. parapsilosis (5,8%).
Fatores de risco (tipo de amamentação, uso de chupetas, infecções respiratórias e terapia antibiótica) para a colonização de Candida e
idade de 1-4 anos por Ollila et al. (1997). Lactobacillus colonizaram em 18%
das amostras salivares das crianças e Candida em 24%. O uso de chupetas
obteve uma associação estatisticamente significante entre a colonização de
Lactobacillus e Candida, como também, o uso de mamadeira noturna e
terapia antibiótica. O uso de mamadeira noturna apresentou menor influência sobre a colonização por Candida do que o uso de chupeta. A associação
entre o uso de chupeta e mamadeira noturna aumentou a prevalência desta levedura em crianças menores de 2 anos de idade. Os autores sugerem que o uso de chupeta aumenta a colonização salivar de Lactobacillus e Candida
em crianças.
A prevalência de Candida spp. na cavidade bucal e canais radiculares
de 33 crianças foi avaliada por Akdeniz et al. em 2002. O grupo experimental foi composto por 13 crianças cárie ativas de 4-9 anos que necessitavam de tratamento endodôntico. Vinte eram livres de cárie e tinham entre 5 e 8 anos de idade. Amostras dos canais foram coletadas com cones de papel, como também o pH salivar e amostras de vários sítios da cavidade bucal também foram realizados. Os resultados mostraram uma alta prevalência de Candida
nestas crianças (69,2% na cavidade bucal e 61,5% nos canais radiculares). Não houve associação significante entre portadores e não portadores de
Candida com o pH salivar, o uso de mamadeira ou chupeta e hábitos
teoria que materiais de plástico ou borracha presentes no bico servem como substrato para estes microrganismos. Os autores ressaltam que fatores ambientais tais como a presença de altas concentrações de açúcar na dieta e a cárie de mamadeira são os principais fatores associados com a alta prevalência de Candida na cavidade bucal de crianças.
Informações sobre a possível relação de C. albicans e a cárie dental
são escassas na literatura internacional, apesar de existir evidência do potencial cariogênico deste microrganismo. Além disso, C. albicans possui
atividade colagenolítica, e se adere tanto ao colágeno intacto como ao desnaturado por diferentes mecanismos. Este processo pode contribuir para a persistência de C. albicans na superfície da hidroxiapatita dissolvida,
devido ao colágeno exposto e a alta capacidade de aderência a ele, servindo como um sítio de aderência e colonização (NIKAWA et al., 2003).
A prevalência de cárie relacionada com fluxo salivar, capacidade tampão e contagem de S. mutans, Lactobacillus e Candida albicans foram
avaliados por Gábris et al. (1999) em coleta de saliva de 349 adolescentes hungarianos de 14 - 16 anos de idade. A porcentagem livre de cárie foi de 4,6%; o valor de CPOD foi de 7,24; a média de fluxo salivar foi 0,84 mL/min e a capacidade tampão foi considerada baixa em 6,3% dos adolescentes. A colonização de S. mutans, Lactobacillus e Candida albicans foi 89,7%, 73,9%
colonização por C. albicans. Os três microrganismos apresentaram
correlação altamente significante (p<0,001) com valores de CPOD.
2.4 – Candida ssp. e a Cárie de mamadeira
As espécies de Candida são bastante citadas na literatura em
associação com indivíduos portadores de doenças imunossupressoras, incluindo AIDS, diabetes, câncer, justamente porque nesta população aparece com maior freqüência a candidose, em decorrência do tratamento específico e da debilidade do organismo, sendo maior a prevalência de
Candida spp. na cavidade bucal destes pacientes (McCULLOUG et al., 1996;
STARR et al., 2002; SULLIVAN et al., 2004).
Apesar do considerável volume de pesquisas sobre a cárie dentária, há poucos relatos sobre Candida na sua microbiota. Esta levedura é
encontrada em maior prevalência na saliva e biofilme dental de indivíduos cárie-ativos comparados com livres de cárie (HODSON e CRAIG, 1972; GÁBRIS et al., 1999; RADFORD et al., 2000). Entretanto, não está estabelecido se desempenham algum papel na etiologia da doença.
Devido a pouca informação na literatura sobre a incidência de C.
albicans em crianças e sua relação com a cárie dentária, Russell e Lay
com pobre higiene bucal e alta incidência de cárie, associando o uso de chupetas embebidas em substâncias açucaradas e aleitamento artificial. Os pais foram questionados sobre hábitos de ingestão de açúcar e de adoçar chupeta (composição, quantidade e freqüência) das crianças. Três esfregaços foram realizados na superfície vestibular de incisivos superiores para examinar formas de levedura. Adicionalmente, investigaram histologicamente a presença de leveduras em 30 cavidades de cárie de dentes extraídos destas crianças. Os resultados mostraram alta prevalência de leveduras nas lesões de cárie e incidência de C. albicans no biofilme de
29%. Os autores concluíram que a influência da lesão de cárie sobre a proliferação de leveduras na cavidade bucal parece ser superior que o consumo de doces e o hábito de adoçar chupeta pelas crianças.
Com o intuito de avaliar a associação de freqüência de isolamento de
S. mutans, Lactobacillus, leveduras e o nível socioeconômico de crianças
com 1 ano de idade, Radford et al. (2000) coletaram amostras de saliva de 1393 crianças. Destas, 39 foram diagnosticadas com cárie de mamadeira e foram comparadas com crianças livres de cárie quanto à freqüência de isolamento destes microrganismos, a qual foi significativamente maior, exceto para S. sobrinus nas crianças com cárie. O nível sócio-econômico foi
O efeito do tratamento dental na redução da densidade de Candida spp. na cavidade bucal foi avaliado por Starr et al., em 2002. Os autores
investigaram a prevalência e o número de Candida albicans em 150 crianças
de 8-11 anos, durante 3 anos. As amostras foram coletadas utilizando swab na região da mucosa jugal e gengiva antes do tratamento odontológico, pós-tratamento e 12, 24 e 36 meses após. A cada visita, respectivamente, 47, 32, 21, 27 e 28% das crianças foram C. albicans positivo, resultando uma
redução de quase 50% na prevalência do início ao fim do estudo. Apesar disso, 42% permaneceram colonizadas por Candida nos três anos de
acompanhamento e os autores sugerem que esta não é uma evidência definitiva que estas crianças foram colonizadas durante todo este período, podendo ter ocorrido outras exposições ou reinfecção do microrganismo. Neste estudo também foi observado que crianças colonizadas por
Lactobacillus foram provavelmente colonizadas por C. albicans. Deste modo,
a prevalência de C. albicans diminuiu de 47% para 27% após tratamento
dentário e algumas permaneceram colonizadas por este microrganismo mesmo sob tratamento odontológico.
Com o mesmo objetivo de investigar o tratamento dental sobre a prevalência de Candida ssp., porém em crianças portadoras de cárie de
dental e saliva) foram coletadas para determinação da contagem (UFC/mL) e identificação pelo CHROMagar e testes bioquímicos. Houve maior prevalência de Candida spp. em crianças com cárie de mamadeira e a
espécie predominante foi C. albicans, seguida por C. tropicalis. O tratamento
restaurador diminui a contagem de microrganismo nas crianças com cárie de mamadeira, mas não o eliminou completamente.
A presença de Candida spp. em lesões de cárie tem sido pouco
investigada, mas a maior concentração de leveduras são encontradas nas cavidades, providenciando um significante nicho ecológico para colonização e disseminação deste microrganismo no organismo. Hossain et al., em 2003, avaliaram a associação de genótipos entre C. albicans que colonizavam
lesões de cárie e fezes pelo método de RAPD em 108 crianças (52 sem cárie e 56 com cárie). Amostras de saliva, biofilme dental, cárie e fezes foram coletadas e identificadas pelo CHROMagar, para posterior análise genética. Todas as espécies foram C. albicans. A maior prevalência foi encontrada na
cárie, concordando com Marchant et al. (2001), que também encontraram
que Candida albicans possuiu proporção significativamente maior nas lesões
de dentina do que nas amostras de biofilme. Forte correlação foi observada entre a presença de C. albicans na saliva, biofilme, cárie e fezes. Pelo RAPD,
65,2% de cepas foram idênticas para a cavidade bucal e fezes, indicando que a colonização gastrointestinal de C. albicans é proveniente das lesões
Apesar de poucos relatos sobre Candidaspp. e a cárie de mamadeira,
3. Proposição
A proposta deste estudo foi:
1. Quantificar a presença de Streptococcus grupo mutans e Candida spp. no biofilme dental supragengival de crianças livres de cárie,
com cárie e cárie de mamadeira, e na dentina cariada de crianças com cárie e cárie de mamadeira.
2. Avaliar a prevalência das espécies identificadas bioquimicamente
de Streptococcus grupo mutans e Candida spp., nos três grupos do
estudo (sem cárie, cárie e cárie de mamadeira) e nos sítios coletados (biofilme e dentina cariada).
4. Material e métodos
1 . PERFIL DA AMOSTRA
A amostragem envolveu pacientes que procuraram atendimento na Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP. Foram selecionadas 56 crianças na faixa etária de 2 a 5 anos de idade, de ambos os gêneros, sem distinção de raça, cor e classe social.
Os voluntários foram divididos em 3 grupos de acordo com os seguintes critérios de inclusão:
GRUPO 1:
Crianças com síndrome da cárie de mamadeira (n=24), as quais apresentavam apenas dentadura decídua e pelo menos 1 incisivo superior cariado com lesão em esmalte e dentina, de característica circunferencial no terço cervical da superfície vestibular, apresentando tecido amolecido e estrutura coronária ainda presente (DRURY et al., 1999; ISMAIL e SOHN, 1999). A superfície proximal e a fossa palatina poderiam estar envolvidas, porém em continuidade com a lesão da superfície vestibular (MILNES, 1996);
Devem ter recebido ou receberem, aleitamento materno e/ou mamadeira contendo solução açucarada, várias vezes ao dia e principalmente à noite, por um período superior a 12 meses (MILNES, 1996).
GRUPO 2:
Crianças com cárie (n=11), apresentando apenas dentadura decídua e no mínimo 1 incisivo superior com lesão em esmalte e dentina, sendo cavidades estritamente proximais e com tecido amolecido;
Boa saúde geral;
Podem ou não receber ou terem recebido mamadeira e/ou aleitamento materno.
GRUPO 3:
Crianças livres de cárie (n=21), apresentando apenas dentadura decídua;
Boa saúde geral;
As crianças que apresentaram problema de saúde com comprometimento sistêmico e utilização de medicamentos antimicrobianos um mês antes de iniciar o estudo não foram incluídos. Para apuração destes dados foi utilizado um questionário, criteriosamente preenchido previamente ao exame clínico (ANEXO 2).
Após autorização dos responsáveis e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido aprovado pelo CEP desta Faculdade (protocolo 12/04) (ANEXO 3), as crianças foram examinadas.
2. PROCEDIMENTOS CLÍNICOS
2.1. Exame clínico
O exame clínico foi realizado na Clínica Infantil do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, por um único examinador treinado, utilizando espelho clínico, luva descartável e prévia secagem dos dentes com jatos de ar, objetivando-se a visualização da estrutura dentária hígida e cariada.
2.2. Coleta do biofilme e dentina cariada
nestes casos o dente 51 foi escolhido. A coleta foi realizada com auxílio de palito de madeira esterilizado. Nos GRUPOS 1 e 2 a coleta foi realizada no esmalte ao redor da lesão de cárie e no GRUPO 3 no esmalte da região cervical (Figura 1). Imediatamente após a coleta, cada haste de madeira foi colocada em tubos esterilizados contendo 1 mL de solução salina com pérolas de vidro.
As amostras de dentina cariada foram coletadas no centro da lesão do mesmo incisivo superior, com um escavador de dentina n° 11,5 (Duflex - SS.WHITE) esterilizado (Figura 2). Imediatamente após a coleta, a dentina foi dispensada em tubos esterilizados contendo 5 mL de BHI caldo (ANEXO 4).
Todas as amostras foram processadas no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Fisiologia e Patologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP. O tempo decorrido desde a coleta das amostras até o processamento não excedeu 4 horas (BENTLEY et al., 1988).
Figura 1:Local de coleta do biofime nos três grupos do estudo, utilizando palito de
madeira.
Figura 2: Local de coleta da dentina cariada no grupo cárie e cárie de mamadeira,
utilizando escavador de dentina.
Cárie Livres de
cárie Cárie de
mamadeira
Cárie Cárie de
3. PROCEDIMENTOS MICROBIOLÓGICOS
3.1. HOMOGENEIZAÇÃO E DILUIÇÃO
As amostras de biofilme dental coletadas foram submetidas a 1 minuto de vibração em agitador de tubos (Phoenix - AT 56), visando a obtenção de uma suspensão uniforme para a diluição em série decimal de 10-1 a 10-4 em solução salina estéril 0,9%.
As amostras de dentina coletadas foram mantidas em microaerofilia, utilizando-se a jarra de anaerobiose, em estufa a 37o C por 24 horas.
Posteriormente, o mesmo procedimento de diluição descrito acima foi realizado.
3.2. Semeadura do material
Para o cultivo de Streptococcus grupo mutans e Candida spp.,
alíquotas de 25µL de cada diluição foram inoculadas, em duplicata, em placas de Petri contendo respectivamente meio de cultura Ágar Sacarose Bacitracina - SB-20 (DAVEY e ROGERS, 1984) e meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose, acrescidos de 0,1mg/ mL de cloranfenicol (Quemicetina Succinato/ Carlos Erba) (SANDVEN, 1990) (ANEXO 4). Todas as placas foram incubadas a 37o C por 48 horas, sendo que as placas contendo SB-20
4. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Streptococcus grupo
mutans
4.1 - MORFOLOGIA COLONIAL
Após 48 horas de incubação, havendo crescimento nas placas inoculadas com as amostras, as colônias com características pertencentes
ao Streptococcus grupo mutans, foram observadas sob luz refletida com o
auxilio de um microscópio esteroscópico (Zeiss), seguindo os padrões descritos para o meio SB20 segundo DAVEY e ROGERS (1984), os quais caracterizam as colônias como firmes e opacas, de coloração branco-acinzentada ou creme-amarelada, com superfície granular semelhante ao vidro moído e circundadas por um halo branco leitoso. Apresentam com freqüência uma gotícula cintilante de polissacarídeo no topo e quando tocadas com a agulha de platina não se desintegram, apenas deslocam-se facilmente (Figura 3).
A seguir foram contadas utilizando um contador eletrônico digital (Phoenix) (Figura 4). Posteriormente, cerca de seis colônias com morfologia típica, crescidas em diferentes pontos da superfície do meio, foram coletadas e transferidas individualmente para tubos contendo 5 mL de caldo de BHI esterilizado. Estes foram incubados em jarras de anaerobiose em 37o C por 24 horas para posterior identificação bioquímica das espécies.
