CLASSI FI CAÇÃO CI TOI STOLÓGI CA,
I MUNOI STOQUÍ MI CA, LESÃO DE DNA,
MORFOMETRI A E Í NDI CE DE PROLI FERAÇÃO
CELULAR DOS LI NFOMAS EM CÃES
CLASSI FI CAÇÃO CI TOI STOLÓGI CA,
I MUNOI STOQUÍ MI CA, LESÃO DE DNA,
MORFOMETRI A E Í NDI CE DE PROLI FERAÇÃO
CELULAR DOS LI NFOMAS EM CÃES
Tese apresent ada à Faculdade de Medicina Vet erinária e Zootecnia da Universidade Est adual Paulist a “ Julio de Mesquit a Filho” , Cam pus de Bot ucat u, para obt enção do t ít ulo de Doutor em Medicina Veterinária. Orientador: Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Pessoa, Adriana Wanderley de.
Classificação citoistológica, imunoistoquímica, lesão de DNA, Morformetria e índice de proliferação celular dos linfomas em cães / Adriana Wanderley de Pinho Pessoa. – 2005.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu, 2005.
Orientador: Julio Lopes Sequeira Assunto CAPES: 50501062
1. Câncer em cão 2. Cão - Doenças
CDD 636.7089665
não há efeito sem causa. Procurai a causa de tudo que não é obra do
hom em , e vossa razão vos responderá∗” .
Torna- se difícil agora traduzir, em form a de palavras, todos os m om entos e experiências com partilhadas com as pessoas que fizeram parte de m inha vida durante estes quatro anos - pois m ais im portante que o fim é o processo, o m eio pelo qual se chega a esse fim . Com certeza, esses encontros não foram casuais. De qualquer form a, fica registrada m inha eterna gratidão por tudo que recebi de cada um de vocês.
Meu sincero obrigado ao m eu orientador Prof. Julio Lopes Sequeira. Mais que experiência profissional e ética, um ser hum ano íntegro, bom e que busca sem pre o lado m elhor das pessoas. Obrigada por toda paciência, incentivo e carinho durante essa im portante etapa de m inha vida.
À Profa. Noem e Sousa Rocha, exem plo de força, persistência, dedicação profissional e am iga querida.
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, em especial aos docentes ( e ex-docentes) do Serviço de Patologia – Prof. Julio Lopes Sequeira, Profa. Noem e Sousa Rocha e Profa. Renée Laufer Am orim , Prof. Enio Pedone Bandarra, Profa. Laura Álvares de Figueirêdo, pelos ensinam entos, carinho e agradável convivência desde
dos prim eiros passos e Maury Raul. Obrigada pelo apoio e aj uda sem pre nas horas certas.
À Universidade Estadual do Ceará, em especial a Faculdade de Veterinária, m inha casa de trabalho, por perm itir e estim ular o intercâm bio e aprim oram ento técnico-científico.
À Fundação de Am paro à Pesquisa do Estado de São Paulo ( FAPESP) , pela concessão do auxílio a pesquisa e à CAPES/ PI CD pela concessão da bolsa.
Agradecim ento m uito especial a Dra. Daisy Fávero Salvadori, m odelo de generosidade e seriedade profissional - sem pre nos auxiliando nos m om entos críticos da execução do trabalho - e aos funcionários e pós-graduandos do Núcleo de Avaliação Toxicogenética e Cancerígena ( TOXI CAN) da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu.
Aos Residentes ( que são ou serão pós-graduandos) na Patologia. Porque nestes quatro anos de convivência diária, os vi crescer (e cresci com eles tam bém ): Louisiane, Osim ar, Sara, Celm ira, Fabinho, Cam ilinha, Leandro, Marcela e Arlete e tam bém as m eninas da ornito Mércia, Edna, Aline e Silvinha. Obrigada pela força, convivência agradável e am izade.
À Sara Maria, m inha irm ã por parte de orientador, pela convivência e aj uda nos m om entos difíceis do desenvolvim ento dos nossos trabalhos.
Agradeço tam bém ao Fábio, sem pre disposto a nos aj udar, até m esm o quando tem m uitas tarefas designadas pela sua orientadora a cum prir.
À m inha fam ília botucatuense de coração, D. Édera e Eliana - sem pre afetuosas e solidárias - e D. José e Luciano, por sem pre m e proporcionarem o “ cheiro” do clim a fam iliar, m esm o há m ais de três m il km de casa.
Ao casal de am igos querido, Arnold e Neide, exem plos de am or e dedicação ao que fazem . Nossas alm as conseguem ver o tam anho da m inha grat idão.
Ao pessoal do Centro Cristão- Espírita “ Am or e Luz” , pelos preciosos m om entos de aprendizado, paz e alegria com partilhados.
Aos residentes das outras áreas da FMVZ, aos estagiários e dem ais docentes desta instituição, m eu m uito obrigado pela aj uda direta ou indireta. Ninguém faz nada sozinho.
“Você, Lua,
A luz nas várzeas desertas Do sertão que sou.”
R
ESUMOm alignidade das neoplasias. No entanto houve correlação entre os danos de DNA do sangue e os danos do DNA da m assa neoplásica no m esm o anim al ( P< 0,05) .
Malignant lym phom a are one of t he m ost com m on neoplasia of t he dogs.
Several aspect s like et iology, epidem iology, clinical signs, m orphology and,
im m unophenot ipy are quite sim ilar bet ween hum an and canine non- Hodgkin’s
lym phom as. The aim of this study was to investigate the citohistom orphologic
grade ( by Kiel, Working Form ulat ion’s and Fournel- Fleury classificat ions) ,
im m unophenot ype expression ( using CD3, CD79a, CD4 and, CD8 m arkers) ,
proliferat ion index ( argyrophil nucleolar organizer regions [AgNOR ]) and the
DNA dam age ( Com et Test ) in fift h t hree cases of canine lym phom as. The high
grade t um ors predom inat e in t he Kiel, Working Form ulat ion’s and
Fournel-Fleury classificat ions. The frequency of T lym phom as ( CD3+ / CD79a- ) and B
lym phom as( CD3- / CD79a+ ) was t he sam e, 41,5% each one. Am ong t he T
subtypes the CD4+ / CD8- phenot ype predom inates, 22,64% ( twelve cases)
and, while t he CD4- / CD8+ phenot ype was less com m on, 18,86% ( t en cases) .
The proliferation index det erm ined by AgNOR m et hod was larger in t he high
grade lym phom as. DNA dam age did not correlat e wit h t he lym phom a
cyt om orpological grade, but t he blood DNA dam age and t um oral m ass DNA
dam age shows correlat ion when com pared in each anim al ( P< 0,05) .
2 . Revisão da Literat ura 2 2
2.1. Caracterização dos linfom as 2 2
2.2. Estudos histom orfológicos 2 9
2.3. Correlação clínico- patológica 3 3
2.4. Estudos Citom orfológicos 3 5
2.5. I m unofenotipagem dos linfom as 3 7
2.6. Avaliação da proliferação celular nos linfom as caninos
utilizando- se a técnica do AgNor 4 4
2.7. Teste do Com eta 5 3
3 . Mat erial e Método 6 0
3.1. Origem das am ostras 6 0
3.2. Estadiam ento clínico e classificação anatôm ica dos
linfom as 6 1
3.3. Técnica citopatológica e processam ento das am ostras 6 1
3.4. Processam ento histológico 6 3
3.5. I m unofenotipagem dos linfom as 6 4
3.5.1. Bloqueio da peroxidase endógena 6 5
3.5.2. Recuperação antigênica 6 6
3.5.3. Sistem a de detecção e am plificação de
sinais/ anticorpo secundário 6 7
3.5.4. Revelação e contracoloração 6 8
3.6. Técnica de coloração pela prata AgNors 7 0 3.6.1. Avaliação quantitativa de Agnors 7 1
3.7. Estudo m orfom étrico 7 3
4.2. Estadiam ento dos linfom as dos cães 8 2 4.3. Em prego das classificações de Kiel, Working
Form ulation e de FOURNEL-FLEURY et al., (1994) nos
linfom as não Hodgkin dos cães 9 0
4.3.1. Características citom orfológicas dos tipos de linfom a, segundo a classificação de Kiel e seus correspondentes nas classificações Working Form ulation e de FOURNEL-FLEURY et al., ( 1994) nos linfom as não Hodgkin
dos cães 9 1
4.3.1.1. Linfom as de grau baixo 9 1
4.3.1.2. Linfom as de grau alto 9 5
4.4. I m unofenotipagem dos linfom as 1 0 2
4.5. Avaliação qualitativa e quantitativa do AgNor 1 1 1 4.5.1. Área m édia por ponto de AgNor 1 1 4 4.5.2. Área m édia de AgNor no núcleo 1 1 7 4.5.3. Área m édia relativa de AgNor no núcleo 1 1 9
4.5.4. Área m édia do núcleo 1 2 1
4.5.5. Média do núm ero de pontos de AgNor por célula 1 2 3
4.6. Estudo m orfom étrico 1 2 5
4.7. Teste do com eta para avaliar danos de DNA nas células
dos linfom as dos cães 1 3 2
5 . Discussão 1 3 3
5.4. Avaliação do índice de proliferação celular utilizando- se
a técnica e AgNor 1 4 8
5.5. Estudo m orfom étrico 1 5 3
5.6. Teste do com eta 1 5 5
6 . Conclusões 1 6 2
7 . Referências Bibliográ ficas 1 6 4
Classification of Tum ors in Dom estic Anim als,
Geneva, 1980) 2 6
Tabela 2 Classificação anatôm ica dos linfom as caninos
segundo JACOBS et al., 2002 2 7
Tabela 3 Freqüência dos tipos histiocitológico de linfom as diagnosticados de acordo com a classificação de Kiel 3 2 Tabela 4 Freqüência dos tipos histiocitológico de linfom as
diagnosticados de acordo com a classificação da WF 3 3 Tabela 5 Painel dos anticorpos e etapas da técnica de
im unoistoquím ica no utilizadas para im unofenotipagem dos linfom as dos cães 6 9 Tabela 6 - Fórm ulas utilizadas para m ensurações de AgNors 7 2 Tabela 7 – Estadiam ento clínico dos cães com linfom a de
acordo com os padrões estabelecidos pela World
Health Organization (WHO; TNM Classification of
Tum ors in Dom estic Anim als 8 2
TABELA 8 Classificação anatôm ica dos 53 tipos de linfom a de
acordo com JACOBS et al., 2002 8 4
Tabela 9 Classificação e distribuição por sexo dos 53 casos de
linfom as de cão 8 6
Tabela 10 Distribuição racial dos 53 anim ais portadores de
linfom a 8 7
Tabela 11 Faixa etária e m édia de idade dos 53 casos de
linfom as estabelecidos de acordo com os critérios da
WF 9 0
Tabela 14 Correlação entre os graus de m alignidade e im unofenotipagem dos 53 linfom as caninos utilizando-se a classificação de Kiel e FF 1 0 2 Tabela 15 Correlação entre os graus de m alignidade e
im unofenotipagem dos 53 linfom as caninos utilizando-se a classificação da WF 1 0 4 Tabela 16 Correlação cit om orfológica e expressão dos
Figura 2 Estadiam ento clínico dos cães com linfom a de acordo com os padrões estabelecidos pela World Health
Organization ( WHO; TNM Classification of Tum ors in
Dom estic Anim als) . 8 4
Figura 3 Classificação anatôm ica dos linfom as caninos
segundo JACOBS et al., 2002. 8 6
Figura 4 Classificação e distribuição por sexo dos 53 casos de
linfom as de cão. 8 7
Figura 5 Distribuição por raça dos 53 anim ais portadores de
linfom a 8 8
Figura 6 Faixa etária e m édia de idade dos 53 casos de
linfom a 8 9
Figura 7 Linfom a Linfocítico de grau baixo ( Kiel e FF) equivalente ao linfom a linfocítico tam bém de grau
baixo na WF. H&E. 9 7
Figura 8 Linfom a Centrocítico de grau baixo (Kiel e FF) equivalente ao linfom a difuso de pequenas células clivadas de grau interm ediário na WF. H&E. 9 7 Figura 9 Linfom a Centrocítico-centroblástico de grau baixo
( Kiel e FF) equivalente linfom a difuso de pequenas células clivadas de grau interm ediário na WF. H&E. 9 8 Figura 10 Linfom a de células T pleom óficas de grau baixo ( Kiel
e FF) equivalente linfom a difuso de pequenas células
interm ediário na WF. H&E. 9 9 Figura 13 Linfom a I m unoblástico de grau alto nas classificações
de Kiel, Fournel- Fleury et al. ( 1994) e Working
Form ulation. I nfiltração na m edula óssea.
Megacariócito ( seta ) . H&E. 1 0 0 Figura 14 Linfom a Centroblástico de grau alto ( Kiel e FF)
equivalente ao linfom a de grandes células
não-clivadas de grau interm ediário na WF. H&E. 1 0 0 Figura 15 Linfom a Linfoblástico de grau alto nas classificações
de Kiel, Fournel- Fleury et al. ( 1994) e Working
Form ulation. Grande núm ero de m itoses. ( setas) .
H&E. 1 0 1
Figura 16 Linfom a de Grandes Células Anaplásicas de grau alto ( Kiel e FF) equivalente ao linfom a im unoblástico de
grau alto na WF. H&E. 1 0 1
Figura 17 Distribuição dos im unofenótipos e graus de m alignidade dos 53 casos de linfom a de acordo com
a classificação de Kiel e FF 1 0 4
Figura 18 Distribuição dos im unofenótipos e graus de m alignidade dos 53 casos de linfom a de acordo com
a classificação da WF 1 0 7
Figura 19 Linfom a de células T pleom ófico de grau baixo (Kiel e FF) apresentando intensa im unom arcação de
Figura 21 Linfom a I m unoblástico de grau alto ( Kiel e FF) . Subpopulações de linfócitos T neoplásicos apresentando im unom arcação de m em brana CD4+ 1 1 0 Figura 22 Linfom a de Zona T de grau baixo (Kiel e FF) .
Subpopulações de linfócitos T neoplásicos apresentando im unom arcação de m em brana CD8+ 1 1 0 Figura 23 PAAF. Linfom a I m unoblástico de grau alto ( Kiel e FF) .
Múltiplos AgNors (padrão de distribuição tipo I I )
espalhados nos núcleos das células neoplásicas. 1 1 3 Figura 24 PAAF. Linfom a I m unoblástico de grau alto ( Kiel e FF) .
Múltiplos AgNors (padrão de distribuição tipo I I )
espalhados nos núcleos das células neoplásicas. 1 1 3 Figura 25 Área m édia por ponto de AgNor ( µm2) observada nos
exam es citológicos dos 29 cães portadores de linfom a, de acordo com a classificação de Kiel e FF. 1 1 5 Figura 26 Área m édia por ponto de AgNor ( µm2) observada nos
exam es citológicos dos 29 cães portadores de linfom a, de acordo com a classificação da WF. 1 1 6 Figura 27 Área m édia de AgNors nuclear ( µm2) avaliado no
exam e citológico de cães com linfom a de acordo com
a classificação de Kiel e FF. 1 1 7
Figura 28 Área m édia de AgNors nuclear ( µm2) avaliado no exam e citológico de cães com linfom a de acordo com
1 1 9 Figura 30 Área m édia relativa de AgNors nuclear (µm2)
avaliado no exam e citológico de cães com linfom a de
acordo com a classificação da WF. 1 2 0 Figura 31 Área m édia do núcleo ( µm2) avaliado no exam e
citológico de cães com linfom a de acordo com a
classificação Kiel e FF. 1 2 1
Figura 32 Área m édia do núcleo ( µm2) avaliado no exam e citológico dos 29 cães com linfom a de acordo com a
classificação da WF na coloração pelo AgNor. 1 2 2 Figura 33 Área m édia do núm ero de pontos de AgNor por célula
avaliado no exam e citológico de cães com linfom a de
acordo com a classificação Kiel e FF. 1 2 3 Figura 34 Área m édia do núm ero de pontos de AgNor por célula
avaliado no exam e citológico de cães com linfom a de
acordo com a classificação da WF. 1 2 4 Figura 35 Área m édia do núcleo e citoplasm a ( µm2) das células
neoplásicas de acordo com a classificação de Kiel e
FF. 1 2 6
Figura 36 Área m édia do núcleo e citoplasm a ( µm2) das células
neoplásicas de acordo com a classificação da WF. 1 2 7 Figura 37 Média do diâm etro nuclear e citoplasm ático das
células neoplásicas de acordo com a classificação de
acordo com a classificação de Kiel e FF. 1 3 0 Figura 40 Relação núcleo: citoplasm a das células neoplásicas de
acordo com a classificação da WF. 1 3 1 Figura 41 Distribuição das am ostras de sangue e de m assa
tum oral dos linfom as dos cães utilizadas para realizar o estudo do teste do com eta classificados de acordo
com Kiel e FF. 1 3 3
Figura 42 Distribuição das am ostras de sangue e da m assa tum oral dos linfom as dos cães utilizadas para realizar o estudo do teste do com eta classificados de acordo
com WF. 1 3 3
Figura 43 Distribuição das am ostras de sangue e da m assa tum oral proveniente dos cães portadores de linfom a e utilizadas no teste do com eta, classificados de
acordo com os esquem as de Kiel e WF. 1 3 5 Figura 44 Avaliação de dano no DNA ou Tail m om ent (TM) das
am ostras de sangue e m assa tum oral dos linfom as dos cães utilizadas para realizar o estudo do teste do
Figura 46 Avaliação de dano no DNA ou Tail m om ent (TM) das am ostras pareadas de sangue e m assa tum oral dos linfom as dos cães utilizadas para realizar o estudo do
teste do com eta classificados de acordo com Kiel e FF 1 3 8 Figura 47 Avaliação de dano no DNA ou Tail m om ent (TM) das
am ostras pareadas de sangue e m assa tum oral dos linfom as dos cães utilizadas para realizar o estudo do teste do com eta classificados de acordo com a
classificação da WF. 1 3 9
Figura 48 Linfom a linfoblástico de grau alto ( Kiel e FF) . Células neoplásicas de linfonodo visualizadas em m icroscópio de fluorescência form ando com etas com tam anhos
diferentes de cauda. 1 4 0
Figura 49 Células individualizadas do sangue de cão portador de linfom a visualizadas em m icroscópio de fluorescência. As form ações das caudas de com eta
“ Am ar- t e é cult ivar flores Todo dia nascem
Cada dia fenecem .
Am ar- t e é cult ivar flores E renascer cada dia
Am ar- t e é cult ivar flores É serviço de j ardineiro A const rução dest a casa Não é obra de arquitetos Não é obra de engenheiro.
Envolver a vida e você
Num só sent im ent o do m undo Am ar- te é cultivar flores E um sent im ent o sem fundo.”
“ O que vem os, não é o que vem os, senão aquilo que som os”
Agra decim ento Especialíssim o!
“ ...
E eu poderia suport ar, em bora não sem dor, que t ivessem m orrido t odos os m eus am ores, m as enlouqueceria se m orressem t odos os m eus am igos! At é m esm o aqueles que não percebem o quant o são m eus am igos e o quant o m inha vida depende de suas exist ências. A alguns deles não procuro, bast a- m e saber que eles exist em . Est a m era condição m e encoraj a a seguir em frent e pela vida...m as é delicioso que eu saiba e sint a que os adoro, em bora não declare e não os procure sem pre...”
O câncer é caracterizado pela capacidade que as células transform adas possuem de escaparem dos m ecanism os de controle do crescim ent o celular, invadirem os tecidos adj acentes e se espalharem pelo organism o. O com portam ento das células neoplásicas é determ inado por alterações genéticas as quais conferem as essas células a capacidade de ignorar os rígidos controles dos m ecanism os de crescim ent o. Ent retant o, o com portam ento agressivo das células tum orais não som ente refletem sua const it uição genét ica m as t am bém sua interação com o hospedeiro, estabelecendo que o m icroam bient e do tum or é um fator regulador im port ante para o com portam ento das células ( WALTERS, 1998) .
oncologia, vem ganhando cada vez m ais espaço, pois exist e grande interesse em correlacionar etiologia e características das neoplasias nos anim ais e no hom em ( GREENLEE et al., 1990) . O linfom a não- Hodgkin na espécie canina e hum ana é um exem plo disso. As sem elhanças desse t ipo de linfom a nest as espécies são suficientes para fundam entar a asserção de utilizar o cão com o m odelo experim ent al no est udo e descoberta de novas terapias e procedim entos clínico- cirúrgicos a ser im plem ent ados para o hom em , beneficiando am bas as espécies ( GREENLEE et al, 1990, TESKE, 1994, FOURNEL- FLEURY et al., 1997 e FOURNEL- FLEURYet al., 2002) .
Para se estabelecer o protocolo de trat am ent o dos linfom as não-Hodgkin ( LNH) na espécie hum ana é obrigatória a com binação do diagnóstico m orfológico com a im unofenotipagem ( Soares & Arias, 1999) . Na m edicina vet erinária, a im unofenot ipagem não é realizada com o rotina devido ao alto custo dos anticorpos e da lim itada quantidade de m arcadores específicos para os tecidos do cão.
Com base nessas considerações prelim inares, o present e est udo t em com o obj etivos:
• Determ inar as características citoistológicas e prevalência dos tipos celulares dos linfom as não- Hodgkin ( LNH) dos cães classificados de acordo com os esquem as de Kiel e Working Form ulation - Nacional Cancer I nst it ut e ( WF- NCI ) para os LNH hum anos e sua correlação com a classificação para os linfom as nos cães proposta por Fournel-Fleury ( 1997) ;
• Efetuar a im unofenotipagem dessas neoplasias no m at erial fixado em parafina, estabelecendo a origem T, B, ou m isto dessas células;
• Avaliar a eficiência da citologia por aspiração com agulha fina ( CAAF) associada aos m étodos de classificação citológica e de im unofenot ipagem com o crit ério de diagnóstico rápido e seguro dos LNH dos cães;
2 . Revisão de Lit erat ura
2 .1 Ca ract erizaçã o dos Linfom as Ca ninos
Linfom a é um a das neoplasias m ais freqüentes na espécie canina. Tam bém cham ado de linfossarcom a e linfom a m aligno, representa cerca de 7 a 24% de todas as neoplasias caninas e 83% dos tum ores de origem hem atopoiética. (CAPURRO et al., 1992;
TESKE, 1994 e TESKE et al., 1994; MI LNER et al., 1996; VONDEHAAR &
MORRI SON, 1998).
Na espécie canina a incidência é de seis a trinta casos em cada 100.000 cães/ ano ( VONDEHAAR & MORRI SON, 1998) , sendo m aior
que na espécie hum ana ( APPELBAUM et al., 1984; GREENLEE et al.,
1990; JACOBS et al., 2002) . Ocorre m ais freqüentem ente em
anim ais entre cinco e 11 anos, m as há relatos de casos em cães com m enos de um ano e acim a de 12 anos (VALLI , 1993; JONES et
al., 1997; JACOBS et al., 2002) .
Boxer, Scottish Terrier, Basset Hound, Airedale Terrier, Chow Chow, Pastor Alem ão, Poodle, São Bernardo, Beagle, Golden Ret riever e Bulldog. Raças com o Dachshund e Cocker Spaniel são pouco acom etidas (TESKE, 1994; VONDEHAAR & MORRI SON, 1998).
A etiologia deste tipo de neoplasia é desconhecida. A presença de agentes virais não foi com provada na espécie canina ao contrário do que acontece nos seres hum anos, felinos, bovinos, roedores, aves e alguns prim atas (SEQUEI RA & FRANCO, 1992; TESKE,
1994a e SEQUEI RA et al., 1999). Fatores am bientais, com o exposição
crônica a substâncias quím icas, são citados com o predisponentes ao desenvolvim ento de linfom a nos cães ( HAYES et al., 1991).
Recentem ente, GAVAZZA et al. (2001) , relacionam o aparecim ento
precoce da neoplasia em cães que habitam áreas industriais, com alta poluição am biental, e com o uso de produtos quím icos com o tintas e solventes pelos proprietários.
progressiva, caquexia, edem a local ou generalizado, apatia e em ese são os m ais com um ente encontrados. Anatom icam ente, os linfom as caninos são classificados em : m ulticêntrico, digestivo, tím ico, cutâneo e solitário ou extranodal, sendo a form a m ulticêntrica a m ais freqüente ( SEQUEI RA & FRANCO, 1992; JACOBS et al., 2002) .
Alterações hem atológicas são com uns, podendo ocorrer anem ia, trom bocitopenia, leucopenia ou leucocitose, e linfopenia ou linfocitose. I nfiltração na m edula óssea e leucem ização raram ente ocorrem . Hipercalcem ia é um a síndrom e paraneoplásica que pode ocorrer em cães com linfom a devido à produção, pelas células neoplásicas, de um a substância de ação sem elhante ao paratorm ônio (TESKE 1994; VONDEHAAR & MORRI SON, 1998) . Segundo
FOURNEL-FLEURY et al., ( 2002), há um a m aior incidência de
hipercalcem ia nos linfom as de origem T.
O estadiam ento clínico dos linfom as caninos é realizado durante o diagnóstico clínico e serve com o guia para o prognóstico e tratam ento da neoplasia ( DOBSON et al., 2001). Este
hum anos, é tam bém utilizado para a espécie canina (SEQUEI RA &
FRANCO, 1992) , e segue o protocolo proposto pela Organização
Mundial de Saúde (WHO; TNM Classification of Tum ors in Dom estic
Anim als, Geneva, 1980) . Grande parte dos casos de linfom a canino
apresenta-se em estádio clínico avançado ( I V ou V) no m om ento diagnóstico (DOBSON & GORMAN, 1993), o que indica um a pior
resposta ao tratam ento e m enor sobrevida do anim al (DOBSON et
al., 2001) .
o que ocorre no linfom a m ulticêntrico. A form a solitária é aquela que envolve apenas um órgão não linfóide ( JACOBS et al., 2002).
Ta bela 1 - Estadiam ento Clínico dos Linfom as Caninos proposto pela Organização Mundial de Saúde (WHO; TNM
Classification of Tum ors in Dom estic Anim als, Geneva,
Owen, 1980)
ESTADI O CRI TÉRI O
I
Envolvim ento lim itado a um único linfonodo ou tecido linfóide de um único órgão (exceto m edula óssea)
I I
Envolvim ento de vários linfonodos regionais com ou sem envolvim ento das tonsilas
I I I Envolvim ento generalizado dos linfonodos
I V
Envolvim ento do fígado e/ ou baço, com ou sem envolvim ento generalizado dos linfonodos.
V
Envolvim ento do sangue, m edula óssea e/ ou outros órgãos.
Ta bela 2 - Classificação Anatôm ica dos Linfom as Caninos segundo JACOBS et al. ( 2002)
FORMA LOCALI ZAÇÃO
Multicêntrica
Linfonodos periféricos e profundos podendo envolver órgãos com o fígado, baço, rins, pulm ão, coração, trato gastrintestinal e m edula óssea.
Digestiva
Trato gastrintestinal e linfonodos regionais. Podendo envolver órgãos abdom inais com o fígado, baço e rins.
Tím ica Envolve o tim o e linfonodos regionais.
Cutânea
Envolve a pele sob a form a de m assas solitárias ou m últiplas, estas acom panhadas ou não de
Os linfom as não- Hodgkin ( LNH) do hom em apresentam várias características em com um com os linfom as dos cães, particularm ente com relação à epidem iologia, etiologia, clínica, m orfologia e fenotipagem . Graças a essas sem elhanças, os esquem as para classificação m orfológicos propostas para os LNH – com o as de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990) e Working Form ulation
( NCI , 1982) – são utilizadas com sucesso por diversos autores para diagnosticar os linfom as da espécie canina. De acordo com ASTER &
KUMMAR, (1999) ; MI LI TO et al., (2002) e MELLANY et al., (2002) as
características m orfológicas dos LNH do hom em servem com o base para o estabelecim ento do prognóstico e de protocolos de tratam ento. No cão, o tipo celular determ inado pela classificação de Kiel foi um im portante fator prognóstico para indicar o tem po de rem issão da doença em anim ais tratados, enquanto que a classificação dos linfom as pela Working Form ulation teve m aior im portância com relação ao prognóstico do tem po de sobrevida desses anim ais ( TESKE, 1994) .
im portância terapêutica e diagnóstica. Em term os práticos, nos seres hum anos, os linfom as de células T são m ais agressivos e de pior prognóstico que os linfom as de células B ( WAKAMATSU et al.,
1995) .
Os estudos com parativos dos linfom as não- Hodgkin nas espécies hum ana e canina evidenciaram sem elhanças suficientes para em basar a proposição de se em pregar a espécie canina com o m odelo experim ental para estudo dessa doença, inclusive para teste de terapias e procedim entos clínico-cirúrgicos contra os linfom as não-Hodgkin na espécie hum ana ( PARODI et al., 1988;
GREENLEE et al., 1990; RALLI S et al., 1992; TESKE, 1994; FOURNEL
-FLEURY et al., 1997 e FOURNEL-FLEURY et al., 2002) .
2 .2 . Est udos Histom orfológicos
Nos linfom as, a população polim orfa de linfócitos m aduros dos linfonodos é substituída por proliferação celular nonom órfica ou bim órfica, constituída por células m enos diferenciadas ( MI LLS,
na m aioria das vezes não é difícil. Freqüentem ente, quando os anim ais são encam inhados à necropsia, o diagnóstico j á foi feito m ediante PAAF ou biopsia (MI LLS, 1989) .
São poucos os estudos no cão que relacionam o tipo m orfológico do tum or linfóide com sua progressão. Eles assum em im portância quando visam os não só o diagnóstico do processo, m as tam bém o estabelecim ento de parâm etros para orientação clínica quanto ao prognóstico e tratam ento, com o é freqüentem ente feito nos linfom as hum anos.
JARRET & MACKEY (1974) . Os tum ores foram denom inados
linfossarcom a e classificados quanto à distribuição das lesões ( m ulticêntrica, digestiva, tím ica e outras) e quanto às características histocitológicas ( pouco diferenciado, linfoblástico, linfocítico, pró- linfocítico, histicocítico, histioblástico e histiolinfocítico) .
Alguns autores têm utilizado as classificações propostas para os linfom a não-Hodgkin do hom em para os cães, com obj etivo de averiguar se existe o m esm o tipo de correlação entre o tipo histiocitológico e o com portam ento da neoplasia. Utilizando o sistem a de classificação de Kiel, APPELBAUM et al., ( 1984) , PARODI et
al., ( 1988) e GREENLEE et al., ( 1990), obtiveram os resultados
Ta bela 3. Freqüência dos tipos histiocitológico de linfom as diagnosticados de acordo com a classificação de Kiel
Freqüência ( % ) na casuíst ica de: Tipo
de Linfom a Applebaum et al, ( 1984) Parodi et al., 1988 Greenlee et al., ( 1990)
Cent roblást ico 12,5% 51,3% 47,3%
I m unoblást ico 37,5% 27% 25,6%
Cent rocít
ico-cent roblást ico 37,5% 5,4 10,2%
Os autores que utilizaram a classificação da WF ( APPELBAUM et
al., 1984, CARTER et al., 1986; BARON et al., 1990; GREELNEE et al.,
1990; RALLI S et al., 1992) relataram a presença de arranj o
arquitetural difuso na m aioria dos casos. A freqüência de linfom as variou nas casuísticas e os tipos m ais freqüentes podem ser observados nas tabela 4.
Ta bela 4. Freqüência dos tipos histiocitológico de linfom as diagnosticados de acordo com a classificação da WF
Freqüência ( % ) da ca suíst ica de:
Tipo de Linfom a Appelbaum al., ( 1984) et Cart er et
al., (1986) Baron
et
al., ( 1990) Greenlee et al., ( 1990) Rallis
et al., ( 1992)
im unoblást ico 37,5 24,9 0,0 25,6 0,0 Céls. peq. não- clivadas 0,0 24,2 0,0 3,2 8,8
Difuso céls grandes 12,5 20,0 0,0 48,3 36,8
Nas casuística predom inaram os linfom as im unoblásticos e difuso de grandes células, de alto grau e grau interm ediário, respectivam ente.
2 .3 . Correlação clínico- pa tológica
Rem issões espontâneas de linfom as caninos não têm sido relatadas. Com o os tum ores são diagnosticados em fases tardias de evolução ( estádios I I I , I V e V), a estim ativa de sobrevida para os anim ais não tratados é de 2 a 6 m eses (BLOOM & MEYER, 1945;
SQUI RE et al., 1973; MACEWEN et al., 1987; GREENLEE et al., 1990).
Os sistem as de classificação utilizados para os linfom as hum anos fornecem subsídios para o prognóstico, o que nem sem pre é verdadeiro para os cães ( GREENLEE et al., 1990). É
os cães que apresentam tum ores de alto grau tendem a responder m elhor ao tratam ento quim ioterápico, exibindo período de rem issão m ais longo e tem po de sobrevida m aior ( GREENLEE et al., 1990)
Alguns dados da literatura dem onstram esse fato. Cães que receberam tratam ento quim ioterápico e que apresentavam linfom a difuso histiocítico m ostraram período de rem issão m ais longo do que os portadores de linfom a nodular histiocítico e difuso linfocítico pouco diferenciado ( WELLER et al., 1980). Linfom as difusos de
grandes células, centroblásticos e im unoblásticos, tipos com uns entre os cães, m ostraram com portam ento sem elhante aos equivalentes hum anos, apresentando bons índicies de rem issão após terapêutica quim ioterápica (GREENLEE et al., 1990)
Recentem ente foi publicada por VALLI, ( 2002) a classificação
não foi validada por estudos clínicos e nem am plam ente adotada pelos laboratórios de patologia veterinária (DOBSON, 2004) .
2 .4 . Est udos Cit om orfológicos
A m aioria dos estudos citom orfológicos dos linfom as caninos utiliza m aterial incluído em parafina, sendo escassos os trabalhos que em pregam m étodos de diagnóstico citológicos ( FI SHER et al.,
1995; TESKE & VAN HEERDE, 1996) .
A Punção Aspirativa por Agulha Fina (PAAF) tem sido em pregada, tanto no hom em quanto nos anim ais, com o m étodo de diagnóstico de lesões das m ais diversas origens, inclusive neoplásicas (OERTEL et al., 1988; SNEI GE et al., 1990, ROCHA et al.,
2001) . As vantagens deste m étodo estão relacionadas à rapidez do diagnóstico, ao baixo custo e à sua eficácia ( RASKI N & NI PPER, 1992;
ROCHA et al., 1998) . Além disso, causa desconforto m ínim o ao
surgem resultados inconclusivos ou quando existe suspeita de recidiva da lesão (VERNAU et al., 2001) . Nos casos de linfadenopatia,
este exam e perm ite a diferenciação rápida entre processos reacionais benignos e neoplásicos (FOURNEL- FLEURY et al., 1994) .
Quando há suspeita de lesão ou alteração em órgãos internos, com o vísceras abdom inais ou torácicas, a PAAF tam bém pode ser realizada com auxílio da ultra-sonografia (CI VARDI et al., 2001).
Segundo FI SHER et al. ( 1995) , existe um a excelente correlação
entre os resultados obtidos pela PAAF e por biopsias, tanto na classificação m orfológica com o na im unofenotipagem dos linfom as.
CARTAGENA et al. ( 1992), sugeriram com o principais indicações
da PAAF: punções em m assas internas de pacientes com grandes riscos cirúrgicos, que não apresentem m assas superficiais um a vez que esta técnica não necessita de qualquer tipo de sedação do paciente, nas avaliações de novas m assas e no estadiam ento da doença. A acurácia da PAAF nos casos de linfom as não- Hodgkin chega a 85% e quando com binada a citom orfom etria com outros exam es com o, por exem plo, im unocitoquím ica, esta eficácia chega a 91% .
2 .5 . I m unofenot ipagem dos Linfom a s Caninos
O com portam ento biológico do linfom a é o fator determ inante para resposta terapêutica. Algum as diferenças observadas no com portam ento biológico tem sido atribuída a fatores com o a localização anatôm ica, grau histológico e im unofenotipagem ( TESKE
et al., 1994) . A im unofenotipagem identifica um grupo seleto de
glicoproteínas de superfície conhecidas com o clusters of
differentiation (CD) . Para identificação desses antígenos é
necessário o uso de anticorpos específicos. As glicoproteínas de superfície dos linfócitos apresentam m últiplas funções incluindo a sinalização intracelular, com unicação célula a célula e tráfego de linfócitos. Para a im unofenotipagem dos linfom as são utilizados dois tipos de anticorpos: o anti- CD3 e o anti- CD79a. O CD3 é um com plexo de cinco peptídeos associados com o receptor de células T ( TCR) . A dem onstração do antígeno CD3 em linfócitos m alignos identifica o linfom a com o de origem T. Sim ilarm ente, o CD79 se caracteriza por um heterodím ero associado com o receptor de célula B (BCR). A dem onstração desse antígeno nos linfócitos m alignos representa que a população linfóide do tum or é de origem B ( JEGLUN et al., 1987; TESKE et al., 1994b; MOORE et al., 1996;
o CD3 ou CD79. Quando isso ocorre, a origem das células não pode ser determ inada e esse tipo de linfom a é classificado com o sendo form ado por células “ nulas” ( MOORE et al., 1996; MORRI SSON &
NEUBERGER, 2001) .
Estudos dem onstram que os linfom as de origem T tendem a ser biologicam ente m ais agressivos que os linfom as de origem B e resultam em m enor tem po de rem issão e sobrevida ( GREELEE et al.,
1990; TESKE, et al., 1994a)
Os prim eiros trabalhos de pesquisa que procuraram caracterizar as populações de linfócitos que constituíam os linfom as caninos esbarraram em algum as dificuldades relacionadas à m etodologia utilizada. Nestes estudos pioneiros, as células que apresentavam capacidade de form ar rosetas com hem ácias hum anas eram classificadas com o T ( HOLMBERG et al., 1976; ONI ONS,
anticorpos Anti-I a que pudessem ser em pregados nos linfom as caninos, ou m esm o nos linfom as hum anos para os quais eram de im portância capital (APPELBAUM et al., 1984) .
Posteriorm ente, a utilização de um painel de anticorpos, incluindo aqueles capazes de identificar células B ( SI g) e células T ( McAb DT2), em pregando- se técnicas de citofluorim etria, dem onstrou que a freqüência de neoplasias T e B, em cães, eram m uito próxim as às das encontradas no hom em ( APPELBAUM et. al.
1984) .
GREENLEE et al., ( 1990), efetuaram a im unofenotipagem de
A utilização de um painel de anticorpos am plo e as técnicas de im unoperoxidase em cortes de congelação foi relatada por TESKE
et al., ( 1994c). De acordo com estes autores os linfom as foram
considerados com o de células B quando apresentavam positividade para CD21, ant i-I gM, ant i-I gG, anti-I gA e negatividade para os m arcadores de células T. Os linfom as foram considerados com o de células T quando apresentavam positividade para CD3, CD4, CD8, Thy-1, CD49 e negatividade para os m arcadores de células B. A m aioria dos linfom as ( 58% ) foi caracterizado com o de células B. O em prego de técnicas im unológicas no estudo e classificação das desordens linfoproliferativas tem se m ostrado particularm ente im portante no estabelecim ento de um diagnóstico preciso ( CANI ATTI
et al., 1996 e DOBSON et al., 2001).
com as classificações m ais atuais, Kiel ( LENNERT & FELLER, 1990) ,
Real ( HARRI S et al., 1994) e WHO (JAFFEet al., 2001) .
Durante m uito tem po a determ inação do im unofenótipo dos linfom as caninos foi dificultada pela falta de m arcadores específicos. Entretanto, os m étodos im unoistoquím icos têm sido aplicados com sucesso em cortes histológicos de tecido incluído em parafina, utilizando o anticorpo policlonal anti- CD3 para m arcar linfom as de células T e o anticorpo m onoclonal anti- m b1 (CD79a) para m arcar linfom as de células B ( MI LNER et al., 1996; FOURNEL-FLEURY et al.,
1997; FOURNEL-FLEURY et al., 2002) . Em trabalho de pesquisa
recente, tivem os a oportunidade de padronizar a m arcação im unofenotípica de linfom as caninos utilizando m aterial incluído em parafina e os m esm os anticorpos citados acim a (DE MOURA et al.,
2000) .
entanto, algum as diferenças ocorrem dentro de cada um destes grupos no que diz respeito à apresentação clínica, resposta ao tratam ento e prognóstico ( KI UPEL et al., 1999) .
A utilização de m étodos im unológicos nos estudos histopatológicos deu um grande increm ento ao diagnóstico das neoplasias hum anas e atualm ente está definitivam ente incorporado à rotina dos laboratórios de patologia ( SOARES & ARI AS, 1999).
A definição do im unofenótipo dos linfom as, por m étodos im unocitoquím icos, auxilia na tipificação da neoplasia e perm ite estabelecer protocolos clínicos de tratam ento de m aneira rápida e eficiente (CANI ATTI et al., 1996) .
De acordo com estudos j á realizados, os linfom as caninos apresentam m uitas sem elhanças com os linfom as não Hodgkin hum anos, do ponto de vista epidem iológico, m orfológico e im unofenotípico. Portanto, aplicar as classificações citoistológicas e im unofenotípicas nos linfom as caninos, além de adicionar dados aos estudos dessa neoplasia canina ⎯ relacionando- as com a clínica para m elhor determ inar o tratam ento, prognóstico e tem po de vida dos anim ais ( CARTER et al., 1986; FI SHER et al., 1995; KI UPEL et al.,
1999) ⎯ perm itirá que estes resultados possam ser incorporados ao m odelo experim ental da doença hum ana.
2 .6 . Avalia çã o da Prolifera çã o Celular nos Linfom a s Caninos
ut ilizando a t écnica cit oquím ica de AgN or
Vários autores têm sugerido que a coloração pela prata para observar as regiões organizadoras nucleolares ( AGNOR) dos núcleos é adequado para este fim ( VAJDOVI CH et al., 2004). A
técnica de coloração das Regiões Organizadoras Nucleolares Argirofílicas (AgNor) através da prata tem sido utilizada nas últim as décadas com o um m arcador tum oral eficiente na m edicina hum ana ( DERENZI NI & PLOTON, 1991) .
Segundo PLOTON (1994) , as AGNORs são definidas com o sítios
onde estão localizados genes rRNA durante a interfase e durante a m itose. As AGNORs são alças de DNA que ocorrem no nucléolo das células e possuem genes RNA ribossom ais (DERENZI NI et al., 1994).
Esses genes RNA ribossom ais possuem papel im portantes durante a síntese protéica, crescim ento e diferenciação celular e tam bém na transform ação m aligna (EGAN & CROCKER, 1988). O núm ero de
AGNORs, de acordo com DERENZI NI et al., ( 1994) , reflete a atividade
a proteínas com alta afinidade pela prata, daí ser cham adas de proteínas AgNors e a coloração que perm ite visualizá- las é tam bém denom inada de AgNors (CROCKER et al., 1989). Segundo DERENZI NI &
PLOTON, ( 1991), a m aior expressão e AgNors está relacionada única
e diretam ente com a proliferação celular e esta é um a característica m ais m arcante das células neoplásicas.
O nucléolo é a organela m ais visível no núcleo de um a célula em interfase o que, para PLOTON, ( 1994), significa a expressão
m orfológica da transcrição e processam ento do rRNA. O nucléolo é um a estrutura com plexa. É form ado por frações de DNA ocupadas pelos genes RNA, as quais associam -se às proteínas para processam ento, com pactação e form ação final de partículas pré-ribossôm icas. Em síntese, o nucléolo é um a organela contendo alças de DNA que em ergem de vários crom ossom os, cada um dos quais contém um agrupam ento de genes rRNA e cada grupam ento representa um a AGNOR ( ALBERTS et al., 1997) .
De acordo com VERDUN, ( 1983) e GOENSSENS, (1984) , pode- se
denso fibrilar; o granuloso; o interstício nucleolar e a crom atina nucleolar. A região centro fibrilar é com posta por pequenas quantidades de DNA e de proteínas AgNors; o com ponente denso fibrilar é form ado por fibras associadas à região centro fibrilar que contém m oléculas de pré- RNA (AgNORs positiva) e de pequenas quantidades de proteínas associadas as AGNORs.
A im pregnação pela prata é a técnica citoquím ica que perm ite a visualização dos com ponentes centro fibrilares na interfase, os quais representam a contrapartida das AGNORs na m etáfase ( DERENZI NI & PLOTON, 1991; DERENZI NI & TRERÈ, 1994). Para
revelação das AGNORs pela prata, é necessário que as proteínas argirofílicas associem -se aos sítios de crom atina ribossôm ica, onde é inicializada a produção de grânulos ribossom ais ( DERENZI NI &
PLOTON, 1991; PLOTON, 1994) . Diversas técnicas têm perm itido
a leitura pela enzim a RNA- polim erase. Por últim o tem os a nucleolina ou proteína C23, um a fosfoproteína de m aior expressão na fase de crescim ento celular associada ao processam ento de pré-RNA e a proteína B23 ou num atrina, que tam bém participa da biossíntese ribossom al e foi um a das prim eiras proteínas identificadas com o associadas às AGNORs. Assim , a técnica de im pregnação pela prata m arca som ente as proteínas relacionadas aos genes ribossom ais que estão localizadas nas AGNORs em atividade de transcrição ( DERENZI NI & PLOTON, 1991)
As células neoplásicas apresentam nucléolo com significativas alterações quanto a sua form a, coloração e tam anho. Entretanto, essas características não são suficientes para diferenciar células m alignas das benignas. RÜSHOFF et al., ( 1989) E DERENZI NI & PLOTON,
( 1991) observaram que a m edida do tam anho, distribuição e quantidade das AgNors no nucléolo revelou- se um bom indicador para diferenciar neoplasias benignas das m alignas. Entretanto, conform e afirm am DERENZI NI & TRERÉ, (1994) , em alguns tipos de
m alignas, m as a m aior parte dos relatos m ostram que a determ inação do núm ero de AgNors nas células m alignas foi superior ao das benignas e das células de tecidos norm ais (TRERÈ,
1993) .
CROCKER & NAR ( 1987) estudaram o uso da técnica de AgNor
em linfom as, linfonodos reativos e em tonsilas. Esses autores encontraram significativa diferença entre o núm ero de AgNor no núcleo dos linfom as de grau alto e de grau baixo e concluíram que esse m étodo é de grande aplicabilidade no cam po da histopatologia dos tum ores.
TRERÈ et al., ( 1989) com pararam o uso de AgNors com outros
m arcadores de proliferação (Ki-67, PCNA , Tim idina e Brom odeoxy-Uridina) e encontraram forte correlação entre quantidade de AgNors e duplicação celular bem com o entre AgNors e tem po de duplicação da população de células neoplásicas. Para CROCKER et al.,
( 1988) ; DERENZI NI & PLOTON, ( 1991) ; DERENZI NI & TRERÉ, ( 1991b) ;
proliferação celular é a causa prim ária do efeito das variações dos parâm etros de AgNors.
Ao tentar estabelecer a correlação entre a m orfologia do linfom a de Hodgkin com o antígeno de proliferação celular (PCNA) e o AgNor, FREEMAN (1993) , encontrou, em m édia, m ais de 15 AgNors
nos núcleos das células de Reed- Sternberg e em torno de sete a 10 AgNors por núcleo nas células m ononucleares de Hodgkin. Estes dados, segundo o autor, suportam a idéia de que a doença de Hodgkin pode ser designada com o um linfom a de grau alto e que as células de Hodgkin e de Red- Sternberg encontravam -se em alta atividade proliferativa.
Ao estudar a contagem de AgNor e de PCNA em anim ais portadores de linfom a com e sem tratam ento quim ioterápico, com obj etivo de estabelecer o prognóstico, KI UPEL et al., ( 1998)
Mais recentem ente, VAJDOVI CH et al., ( 2004) avaliaram e
com pararam a técnica de AgNors em espécim es citológicos e histológicos de linfonodos de cães sadios e portadores de linfom a. A contagem de AgNors nos linfom as das am ostras citológicas foi m ais alta que nas am ostras histológicas. Do m esm o m odo, o resultado da contagem de AgNors nos linfom as de grau baixo e de grau alto foram significativam ente diferentes quando se utilizou am ostras citológicas e histológicas, além de ser m aior nos linfom as de grau alto. Os autores concluíram que em bora tenha ocorrido diferença na contagem de AgNors entre as duas técnicas, a m édia dos valores de AgNors obtidos revelam sensibilidade suficiente para diferenciar os graus de linfom as.
A técnica de coloração de AgNors é altam ente específica e pode ser utilizada em tecidos fixados em form ol e em bebidos em parafina, frescos ou de arquivo, tecidos congelados, esfregaços citológicos e preparados citocentrifugados ( CROCKER, 1992a) . A
Vários experim entos têm dem onstrado que o núm ero de AgNors é significativam ente m aior nos tum ores m alignos que nos processos fisiológicos, reativos ou benignos. Foi dem onstrado ainda que o núm ero de AgNors por núcleo pode ser considerado com o um indicador de proliferação e que a m édia da contagem de AgNors é um excelente indicador do grau de m alignidade para os linfom as não-Hodgkin hum anos ( SPECTOR, et al., 1984; MOURAD, et al., 1992;
FREEMAN, et al., 1993; BETHWAI TEet al., 1995) .
A literatura está repleta com descrições de resposta aos diferentes tratam entos de cães com linfom a e outros tipos de neoplasia. Clinicam ente, essas respostas são ainda confusas devido a falta de critérios de prognósticos confiáveis (CAPURRO et al.,
Na m edicina veterinária, os benefícios do uso de AgNOR no prognóstico de tratam ento de cães com linfom a são indiscutíveis. Os estudos com esta técnica dem onstram que não som ente o núm ero de AgNOR, m as tam bém a m édia da área de AgNor têm im portância no prognóstico. I sso indica a im portância e a necessidade do uso do analisador de im agens para avaliação desta técnica citoquím ica. Adem ais, características qualitativas de AgNor tais com o seu tipo podem fornecer um a ferram enta sim ples para avaliação prognóstica dos linfom as na rotina laboratorial (KI UPEL et
al., 1999) .
2 .7 . Teste do Com et a
iniciação de um processo carcinogênico ( RAMEL, 1984; TUCKER &
PRESTON, 1996). A iniciação ocorre pela ação de um agente
cancerígeno genotóxico, capaz de provocar danos irreversíveis na m olécula de DNA ( m utações). Caso estes danos resultem na ativação de oncogenes e/ ou perda ou inativação de genes supressores de tum or, células norm ais tornam -se iniciadas, isto é, potencialm ente neoplásicas.
A prom oção, por outro lado, envolve a proliferação das células iniciadas, por m ecanism o epigenético, acelerando o crescim ento celular e possibilitando, eventualm ente, a ocorrência de alterações genéticas adicionais. A célula iniciada pode perm anecer em latência por longos períodos até sofrer exposição a um agente prom otor e, a partir disso, evoluir para um a neoplasia. A progressão é caracterizada m orfologicam ente por anaplasia e biologicam ente por crescim ento autônom o ( PI TOT, 1989). Quando
A correlação observada entre m utagenicidade e a carcinogenicidade é consistente com a teoria de que o câncer sej a causado por m utações som áticas. Substâncias provenientes do m eio am biente pode interagir com o sistem a genético do hom em e de anim ais, levando às m utações. Os três tipos principais de alterações genéticas pode ocorer por: ( 1) alterações no DNA, conhecidas com o m utações de ponto; ( 2) alterações da estrutura de crom ossom os, tais com o quebras e arranj os e ( 3) separação desigual dos crom ossom os durante a divisão celular conhecida com o aneuploidias ( ZAKRZEWSKY, 1997, COHEN & ELLWEI N, 1991) .
Um a vez que os danos induzidos ao DNA são freqüentem ente célula e tecido- específicos, e que as células divisíveis no estado quiescente, isto é, células com longo ciclo interm itótico, podem sobreviver por anos ou décadas na presença de vários tipos de dano ao DNA ( KREJA et al., 1995) é de sum a im portância a
utilização de m etodologias que perm itam a detecção de danos em um a única célula (TI CE, 1995). Assim , o teste do com eta tem sido
pode ser utilizada em estudos de reparo de DNA, de toxicogenética, m onitoram ento ocupacional e am biental e de epidem iologia hum ana.
O teste do com eta é bastante sensível para a detecção de agentes genotóxicos, tanto in vivo com o in vitro ( HARTAMAN & SPEI T,
1997) . Essa técnica apresenta um a série de vantagens que inclui a possibilidade de utilização tanto de células sangüíneas com o de outros tecidos ( SASAKI et al., 1997) ; é altam ente sensível, de fácil
reprodutibilidade e sim plicidade, além de utilizar am ostras celulares extrem am ente pequenas, perm itindo a verificação de danos em células individuais ( FARBAI N et al., 1994; TI CE, 1995, ROJAS et al.,
1999) .
Levando-se em consideração que a m aioria dos agentes genotóxicos induz m ais quebra de fita única e lesões álcali-lábeis do que quebra de fita dupla, SI NGH et al., ( 1988) utilizaram a técnica
com eta baseia- se, portanto, na lise, eletroforese e m arcação fluorescente do DNA de pequena quantidade de células suspensas em um a fina cam ada de agarose e colocadas sobre um a lâm ina de m icroscópio. A corrente elétrica faz com que os fragm entos de DNA do núcleo m igrem m ais rapidam ente para um dos pólos, resultando em im agens com aparência de “ com etas” , as quais são m edidas a fim de determ inar a extensão do dano ( SPEI T et al., 1996) .
A detecção de danos pelo teste do com eta parte do princípio de que o DNA das células eucarióticas encontra- se organizado em estruturas espiraladas e que tanto as quebras de fita sim ples quanto as de fita dupla causam um a desorganização m olecular, levando ao relaxam ento na estrutura da crom atina. Assim , a eletroforese perm itiria que essas estruturas pudessem ser distendidas em direção ao pólo positivo ( FAI RBAI N et al., 1995) .
O tam anho da cauda do com eta é proporcional à quantidade de danos ( TI CE, 1995) . Entretanto, a sensibilidade dessa m edida
sensibilidade e o poder do teste destacam -se a concentração da agarose, com posição da solução de lise, a com posição e o pH do tam pão de eletroforese e as condições de voltagem , am peragem e duração da eletroforese. Com o quaisquer com binações dessas variáveis são possíveis, a seleção do m étodo a ser utilizado depende do obj etivo do estudo, ou sej a, do tipo de célula e do tipo de dano a ser avaliado (FAI RBAI N et al., 1995) .
A técnica utilizada para quantificar os danos detectados pelo teste do com eta envolve a utilização de softwares específicos para análise de im agens de células individuais, perm itindo a avaliação da proporção de DNA que m igra para form ar a cauda do com eta ( FARBAI N et al., 1995; KLAUDE et al., 1996).
Segundo TI CE (1995) , os agentes m utagênicos podem form ar
caudas distintas pela sua atuação sobre a m olécula de DNA. Em bora o com prim ento da cauda do com eta sej a um a m edida válida, a m aioria dos estudos tem utilizado o parâm etro de tail
m om ent ( TM) ou quantidade de DNA na cauda, que é obtido
fluorescência. O TM considera as duas principais variações na m edida do com eta, ou sej a, quando a cauda se apresenta curta com alto conteúdo de DNA e quando o com eta apresenta cauda longa com baixa quantidade de fragm entos. Nesses casos, a leitura som ente do com prim ento da cauda conduziria a erros na avaliação de danos causados por agentes genotóxicos (ASHBYet al., 1995) .
O dano no DNA tem sido am plam ente detectado nas células hum anas, norm ais ou não, usando-se o teste do com eta. Entretanto, essa tecnologia tem sido pouco aplicada na m edicina veterinária. A literatura sobre o assunto é ainda escassa.
HEATON & RANSLEY, (2001) utilizaram o teste do com eta para
utilizando-se o teste do com eta pode reduzir a suscetibilidade desses anim ais a doenças degenerativas, inclusive do envelhecim ento, através da redução do dano e potencialização dos níveis de reparo do DNA.
ALVES ( 2001) e ALVES et al., (2004) utilizaram o teste do
3 . MATERI AL E MÉTODOS
O presente trabalho foi aprovado pela Câm ara de Ét ica em Experim entação Anim al ( CEEA) , protocolo n0 13/ 2002- CEEA, da Faculdade de Medicina Vet erinária e Zootecnia de Bot ucatu/ SP, por estar de acordo com os Princípios Ét icos na Experim entação Anim al ( COBEA) .
3 .1 . Origem das Am ost ras
3 .2 . Est adiam ent o Clínico e Classificação Anat ôm ica dos Linfom as
Foi adotado o protocolo estabelecido pela pela World Healt h Organization ( WHO; TNM Classificat ion of Tum ors in Dom est ic Anim als, Geneva, 1980) , para o estadiam ento dos linfom as e a classificação anat ôm ica inst it uída foi a est abelecida por JACOBS et al., ( 2002) . Os dados de identificação, form a anatôm ica, est adiam ent o, im unofenót ipo e graus de m alignidade de t odos os anim ais est udados encont ram - se no anexo 02.
3 .3 . Técnica Cit opat ológica e Processam ent o das Am ost ras
Para t ais procedim ent os, foram ut ilizadas seringas de 10m l e agulhas descartáveis de até 22G, acopladas ao citoaspirador de Valeri. Após a anti- sepsia da região, foi realizada a punção local seguida da aplicação de pressão negativa, fazendo- se o reposicionam ento da agulha “ em leque” sem que a m esm a saísse do t ecido. At o cont ínuo, a pressão negativa era relaxada e a agulha retirada da m assa e desacoplada da seringa, aspirando para dentro da m esm a volum e de ar suficiente para expulsar o conteúdo da agulha sobre lâm inas de m icroscopia com extrem idade fosca, procedendo- se a extensão do m at erial (COWEL & TYLER, 1989) . I m ediat am ent e após a PAAF, pelo m enos 10 lâm inas ainda úm idas eram im ersas em et anol 95% para coloração pelo m étodo de Shorr, AgNor, enquant o out ras duas eram deixadas secar ao ar, fixadas em m etanol e coradas pelo m étodo de Giem sa, para a diagnóstico citom orfológico.
3 .4 . Processam ent o Hist ológico
Os fragm entos colhidos e devidam ente ident ificados foram fixados em form alina neutra tam ponada a 10% . Em seguida foram subm et idos aos procedim entos de rot ina hist ológica e incluídos em parafina. Os cortes com espessura de 3µm foram corados pelo m étodo de Hem atoxilina & Eosina (LUNA, 1968) e exam inados ao m icroscópio ópt ico.
As am ostras da m edula óssea foram retiradas da crista ilíaca. Esse m aterial foi fixado em form ol neutro tam ponado 10% por 48h e posteriorm ente subm etido ao processo de descalcificação em ácido fórm ico. Um a vez descalcificadas, as am ostras foram processadas seguindo os m esm os procedim entos anteriores.
3 .5 . I m unofenot ipagem dos linfom as
Os est udos da linhagem celulares dos linfom as foram realizados ut ilizando- se as t écnicas padronizadas no Laboratório do Serviço de Pat ologia Vet erinária da FMVZ, baseada na m etodologia descrita por HSU et al, ( 1981) , com algum as m odificações e ut ilizando- se o seguint e painel de ant icorpos: Ant i- CD31, Ant i- CD42, Ant i- CD83, Ant i- CD79a4. Para os ant icorpos ant i- CD4 e anti- CD8 foi utilizado o protocolo descrito por Costa, ( 2000) . Todos os anticorpos, com exceção do anticorpo anti-CD3, foram diluídos em solução de 1% de album ina bovina5 em solução tam pão de Tris6 ( BSA) .
Todos os anticorpos foram testados e padronizados em linfonodo reativo de cão. A padronização obedeceu aos critérios descritos abaixo e foram os m esm os para os casos de linfom a.
Um bloco de cada caso foi selecionado e cortes de 3µm de espessura foram colocados sobre lâm inas previam ent e desengorduradas
1 Anti-CD3, policlonal, código A0452, Dako Co, EUA
2 Anti-CD4, anti-cão, monoclonal, código DH29A, VMRD Pullman, USA 3 Anti-CD83, anti-cão, monoclonal, código CAD046A, VMRD Pulman, USA 4 Anti-CD79a4, monoclonal, código HM57, Dako Co, USA
5 albumin bovine, Sigma, código A-7906, 100g
e tratadas com solução de organosilano7 em álcool absoluto. Os cortes foram m ant idos em est ufa a 580C, por 24horas e subm etidos à desparafinação em xilol seguida de reidratação através da im ersão das lâm inas em gradiente decrescent e de álcool, até a concent ração de 70% . Cada passagem ou banho foi feit o com duração de cinco m inut os, at é lavagem final com água corrente por 10 m inutos e dois banhos em água dest ilada com duração de cinco m inut os cada.
3 .5 .1 . Bloqueio da Peroxidase Endógena
Foram ut ilizados t rês t ipos de bloqueios: o prim eiro foi im ersão do m at erial em peróxido de hidrogênio 3% em m et anol, em duas etapas com 15 m inutos de duração cada, seguido de lavagem em água corrente por 10 m inutos e dois banhos com tam pão fosfato salino ( PBS) , pH 7,6. Est e t ipo de bloqueio foi utilizado por COSTA, ( 2000) para uso dos ant icorpos anti- CD4 e ant i- CD8. O segundo t ipo foi a ut ilização do peróxido de hidrogênio ( 20 volum es) , diluído 1: 1, em água dest ilada na hora do uso e ao abrigo da luz; e o terceiro utilizou- se peróxido de hidrogênio ( 10 volum es) , puro, em dois banhos de 15 m inut os cada, ao abrigo da luz, seguido de lavagem em água corrente por 10 m inutos. Os resultados obtidos com os três tipos de bloqueio foram sem elhant es
para todos os anticorpos testados e devido à praticidade da operação, optou- se pela utilização do peróxido de hidrogênio ( 10 volum es) .
Dois tipos de solução tam pão para o banho das lâm inas foram utilizados: o tam pão fosfato salino pH 7,6 ( PBS) , utilizado por COSTA, ( 2000) , e o t am pão Tris, pH 7,2. A lavagem foi feit a com t am pão PBS para os anticorpos CD4 e CD8 ( COSTA, 2000) e tam pão Tris para os anticorpos CD3 e CD 79a.
3 .5 .2 . Recuperação Ant igênica
Para a recuperação antigênica foi utilizada a solução de EDTA 10µM, pH 8,0, previam ent e aquecida a 950C, em banho- m aria, durant e 30 m inut os. Após bloqueio da peroxidase endógena e lavagem em água corrente e solução tam pão, as lâm inas acondicionadas em berços histológicos eram colocadas em cubas cont endo água dest ilada pré-aquecida ( 1m im 50Seg. ao m icro- ondas, pot ência m áxim a) , para evit ar o choque t érm ico. Em seguida, os berços foram im ersos em EDTA, pH 8,0 e deixado em banho- m aria durant e 30 m inut os.
Retirado do banho- m aria, o m aterial foi resfriado à tem peratura am bient e por 20 m inut os, subm et ido à lavagem em água corrente por 10 m inut os e duas lavagens com t am pão, cinco m inut os cada. Em seguida, para evitar m arcações inespecíficas, os cortes foram incubados com o bloqueador de avidina- biot ina8, em câm ara úm ida a 370C, durant e 15 m inut os cada et apa. Após incubação por 18h (overnight ) em geladeira ( 40C) , o m aterial foi lavado com t am pão em dois banhos de cinco m inut os.
3 .5 .3 . Sist em a de Det ecção e Am pliação de Sinais/ ant icorpo secundário
Para os ant icorpos ut ilizados neste trabalho, foram testados os seguint es sist em as: LSAB9, CSA10 e o EnVision11 .
8 DAKO Biotin Blocking System, código X0590, Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA 9 DAKO LSAB+ kit, peroxidase, código K0690. Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA
10 Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, código K1500. DakoCytomation Denmark A/S.
3 .5 .4 . Revelação e cont racoloração
Para a revelação e visualização da reação utilizou- se o crom ógeno 3’- 3’ diam inobenzidina12 líquido, na diluição recom endada pelo fabricant e, com tem po variando entre 30 segundos a 1 m inut o ( Tabela 6) , ao abrigo da luz, seguindo- se a lavagem das lâm inas durant e dez m inut os em água corrente. A contracoloração foi realizada com hem atoxilina de Harris por um m inuto, seguindo- se de lavagem em água corrent e, desidratação progressiva em álcoois, diafanização em xilol e m ont agem em Perm ount13.
11 DakoCytomation EnVision + Dual Link System, Peroxidase. Código K4061. Dako Corporation,
Carpinteria, CA, USA.
TABELA 5 - Painel dos ant icorpos e et apas da t écnica de
im unoist oquím ica no ut ilizadas para im unofenot ipagem dos linfom a dos cães
AN TI CORPO AN TI- CD3 AN TI- CD4 AN TI- CD8 AN TI- CD7 9 a
CLONE/CÓDIGO N1580 DH29A CA046A HM57
TI PO policlonal m onoclonal m onoclonal m onoclonal
CONCENTRAÇÃO Pré- diluído 1: 500 1: 500 1: 50
BLOQUEI O DA PEROXI DASE ENDÓGENA (ÁGUA OXI GENADA 10 VOLUMES)
TEMPO 2x15
m inut os
2x15
m inut os 2x15 m inut os 2x15 m inut os
RECUPERAÇÃO ANTI GÊNI CA
TAMPÃO EDTA EDTA EDTA EDTA
PH 8,0 8,0 8,0 8,0
LOCAL
Banho-m aria Banho-maria Banho- m aria Banho-maria TEMPO 30 m inut os 30 m inut os 30 m inut os 30 m inut os BLOQUEI O DA AVI DI NA/ BI OTI NA
AVI DI NA/ BI OTI NA
2 x 15 min, cada
2 x 15 min,
cada 2 x 15 min, cada 2 x 15 min, cada LOCAL Câmara úmida Câmara úmida Câmara úmida Câmara úmida
TEMPERATURA 370C 370C 370C 370C
INCUBAÇÃO
TEMPO overnigth overnigt h overnigth overnigth
TEMPERATUR
A 4
oC 4oC 4oC 4oC
SI STEMA DE DETECÇÃO E AMPLI FI CAÇÃO
EnVision CSA CSA EnVision
CROMÓGENO ( DAB)
![Referências técnicas para atuação de psicólogas(os) em Programas de Atenção à Mulher em situação de Violência [2013] - CREPOP CREPOP](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)