FORMA LOCALI ZAÇÃO

Multicêntrica

Linfonodos periféricos e profundos podendo envolver órgãos com o fígado, baço, rins, pulm ão, coração, trato gastrintestinal e m edula óssea.

Digestiva

Trato gastrintestinal e linfonodos regionais. Podendo envolver órgãos abdom inais com o fígado, baço e rins.

Tím ica Envolve o tim o e linfonodos regionais.

Cutânea

Envolve a pele sob a form a de m assas solitárias ou m últiplas, estas acom panhadas ou não de

envolvim ento sistêm ico. Solitária Envolve apenas um órgão

Os linfom as não- Hodgkin ( LNH) do hom em apresentam várias características em com um com os linfom as dos cães, particularm ente com relação à epidem iologia, etiologia, clínica, m orfologia e fenotipagem . Graças a essas sem elhanças, os esquem as para classificação m orfológicos propostas para os LNH – com o as de Kiel (LENNERT & FELLER, 1990) e Working Form ulation ( NCI , 1982) – são utilizadas com sucesso por diversos autores para diagnosticar os linfom as da espécie canina. De acordo com ASTER & KUMMAR, (1999) ; MI LI TO et al., (2002) e MELLANY et al., ( 2002) as características m orfológicas dos LNH do hom em servem com o base para o estabelecim ento do prognóstico e de protocolos de tratam ento. No cão, o tipo celular determ inado pela classificação de Kiel foi um im portante fator prognóstico para indicar o tem po de rem issão da doença em anim ais tratados, enquanto que a classificação dos linfom as pela Working Form ulation teve m aior im portância com relação ao prognóstico do tem po de sobrevida desses anim ais ( TESKE, 1994) .

No hom em , um a vez estabelecido o diagnóstico de linfom a, procura- se determ inar além da m orfologia celular, a linhagem à qual pertencem as células neoplásicas, o que geralm ente é de

im portância terapêutica e diagnóstica. Em term os práticos, nos seres hum anos, os linfom as de células T são m ais agressivos e de pior prognóstico que os linfom as de células B ( WAKAMATSU et al., 1995) .

Os estudos com parativos dos linfom as não- Hodgkin nas espécies hum ana e canina evidenciaram sem elhanças suficientes para em basar a proposição de se em pregar a espécie canina com o m odelo experim ental para estudo dessa doença, inclusive para teste de terapias e procedim entos clínico-cirúrgicos contra os linfom as não-Hodgkin na espécie hum ana ( PARODI et al., 1988; GREENLEE et al., 1990; RALLI S et al., 1992; TESKE, 1994; FOURNEL- FLEURY et al., 1997 e FOURNEL-FLEURY et al., 2002) .

2 .2 . Est udos Histom orfológicos

Nos linfom as, a população polim orfa de linfócitos m aduros dos linfonodos é substituída por proliferação celular nonom órfica ou bim órfica, constituída por células m enos diferenciadas ( MI LLS, 1989) . O diagnóstico histopatológico dessas neoplasias, portanto,

na m aioria das vezes não é difícil. Freqüentem ente, quando os anim ais são encam inhados à necropsia, o diagnóstico j á foi feito m ediante PAAF ou biopsia (MI LLS, 1989) .

São poucos os estudos no cão que relacionam o tipo m orfológico do tum or linfóide com sua progressão. Eles assum em im portância quando visam os não só o diagnóstico do processo, m as tam bém o estabelecim ento de parâm etros para orientação clínica quanto ao prognóstico e tratam ento, com o é freqüentem ente feito nos linfom as hum anos.

Diferentes tipos de classificações têm sido propostas para os linfom as não- Hodgkin hum anos, nas quais são considerados o padrão de crescim ento ( folicular ou difuso), constituição celular ( células pequenas ou grandes, clivadas ou não clivadas, diferenciação plasm ocitária) e grau de m alignidade (baixo, m édio ou alto) . Atualm ente as classificações m ais utilizadas para os linfom as hum anos são a Kiel, Working Form ulation, Real e WHO. Para os anim ais dom ésticos um a das prim eiras tentativas de unificação da term inologia para tum ores linfóides foi proposta por

JARRET & MACKEY (1974) . Os tum ores foram denom inados linfossarcom a e classificados quanto à distribuição das lesões ( m ulticêntrica, digestiva, tím ica e outras) e quanto às características histocitológicas ( pouco diferenciado, linfoblástico, linfocítico, pró- linfocítico, histicocítico, histioblástico e histiolinfocítico) .

Alguns autores têm utilizado as classificações propostas para os linfom a não-Hodgkin do hom em para os cães, com obj etivo de averiguar se existe o m esm o tipo de correlação entre o tipo histiocitológico e o com portam ento da neoplasia. Utilizando o sistem a de classificação de Kiel, APPELBAUM et al., ( 1984) , PARODI et al., ( 1988) e GREENLEE et al., ( 1990), obtiveram os resultados evidenciados na tabela abaixo. Na casuística desses autores predom inaram os tipos m ais agressivos de linfom as.

Ta bela 3 . Freqüência dos tipos histiocitológico de linfom as diagnosticados de acordo com a classificação de Kiel

Freqüência ( % ) na casuíst ica de: Tipo

de Linfom a Applebaum et al, ( 1984) Parodi et al., 1988 Greenlee et al., ( 1990)

Cent roblást ico 12,5% 51,3% 47,3%

I m unoblást ico 37,5% 27% 25,6%

Cent rocít ico-

cent roblást ico 37,5% 5,4 10,2%

Os autores que utilizaram a classificação da WF ( APPELBAUM et al., 1984, CARTER et al., 1986; BARON et al., 1990; GREELNEE et al., 1990; RALLI S et al., 1992) relataram a presença de arranj o arquitetural difuso na m aioria dos casos. A freqüência de linfom as variou nas casuísticas e os tipos m ais freqüentes podem ser observados nas tabela 4.

Ta bela 4 . Freqüência dos tipos histiocitológico de linfom as diagnosticados de acordo com a classificação da WF

Freqüência ( % ) da ca suíst ica de:

Tipo de Linfom a Appelbaum et al., ( 1984) al., ( 1986)Cart er et al., ( 1990)Baron et Greenlee et al., ( 1990) al., ( 1992)Rallis et

im unoblást ico 37,5 24,9 0,0 25,6 0,0

Céls. peq. não- clivadas 0,0 24,2 0,0 3,2 8,8 Difuso céls grandes 12,5 20,0 0,0 48,3 36,8

Linfoblást ico 7,5 17,2 57,1 0,6 0,0

Nas casuística predom inaram os linfom as im unoblásticos e difuso de grandes células, de alto grau e grau interm ediário, respectivam ente.

2 .3 . Correlação clínico- pa tológica

Rem issões espontâneas de linfom as caninos não têm sido relatadas. Com o os tum ores são diagnosticados em fases tardias de evolução ( estádios I I I , I V e V), a estim ativa de sobrevida para os anim ais não tratados é de 2 a 6 m eses (BLOOM & MEYER, 1945; SQUI RE et al., 1973; MACEWEN et al., 1987; GREENLEE et al., 1990).

Os sistem as de classificação utilizados para os linfom as hum anos fornecem subsídios para o prognóstico, o que nem sem pre é verdadeiro para os cães ( GREENLEE et al., 1990). É im portante ressaltar que os protocolos quim ioterápicos utilizados para o hom em são m uito m ais agressivos do que o dos cães, o que pode explicar as diferenças verificadas na correlação entre m orfologia e com portam ento clínico. Entretanto, com o no hom em ,

os cães que apresentam tum ores de alto grau tendem a responder m elhor ao tratam ento quim ioterápico, exibindo período de rem issão m ais longo e tem po de sobrevida m aior ( GREENLEE et al., 1990)

Alguns dados da literatura dem onstram esse fato. Cães que receberam tratam ento quim ioterápico e que apresentavam linfom a difuso histiocítico m ostraram período de rem issão m ais longo do que os portadores de linfom a nodular histiocítico e difuso linfocítico pouco diferenciado ( WELLER et al., 1980). Linfom as difusos de grandes células, centroblásticos e im unoblásticos, tipos com uns entre os cães, m ostraram com portam ento sem elhante aos equivalentes hum anos, apresentando bons índicies de rem issão após terapêutica quim ioterápica (GREENLEE et al., 1990)

Recentem ente foi publicada por VALLI, ( 2002) a classificação da WHO para tum ores hem atopoiéticos nos anim ais dom ésticos. Essa classificação é baseada na classificação da WHO hum ana para esse m esm o tipo de tum or. Os linfom as dos cães são subdivididos por im unofenótipo e graus e tendem a m im etizar sua contrapartida hum ana em term os de com portam ento biológico e resposta a terapia. Entretanto, o valor prognóstico dessa classificação ainda

não foi validada por estudos clínicos e nem am plam ente adotada pelos laboratórios de patologia veterinária (DOBSON, 2004) .

2 .4 . Est udos Cit om orfológicos

A m aioria dos estudos citom orfológicos dos linfom as caninos utiliza m aterial incluído em parafina, sendo escassos os trabalhos que em pregam m étodos de diagnóstico citológicos ( FI SHER et al., 1995; TESKE & VAN HEERDE, 1996) .

A Punção Aspirativa por Agulha Fina (PAAF) tem sido em pregada, tanto no hom em quanto nos anim ais, com o m étodo de diagnóstico de lesões das m ais diversas origens, inclusive neoplásicas (OERTEL et al., 1988; SNEI GE et al., 1990, ROCHA et al., 2001) . As vantagens deste m étodo estão relacionadas à rapidez do diagnóstico, ao baixo custo e à sua eficácia ( RASKI N & NI PPER, 1992; ROCHA et al., 1998) . Além disso, causa desconforto m ínim o ao paciente, perm itindo que se realizem m últiplas colheitas e am ostragens em série, particularm ente interessantes quando

surgem resultados inconclusivos ou quando existe suspeita de recidiva da lesão (VERNAU et al., 2001) . Nos casos de linfadenopatia, este exam e perm ite a diferenciação rápida entre processos reacionais benignos e neoplásicos (FOURNEL- FLEURY et al., 1994) . Quando há suspeita de lesão ou alteração em órgãos internos, com o vísceras abdom inais ou torácicas, a PAAF tam bém pode ser realizada com auxílio da ultra-sonografia (CI VARDI et al., 2001).

Segundo FI SHER et al. ( 1995) , existe um a excelente correlação entre os resultados obtidos pela PAAF e por biopsias, tanto na classificação m orfológica com o na im unofenotipagem dos linfom as.

Os m étodos de obtenção para exam e citológico, particularm ente a PAAF, apresentam com o principal lim itação a im possibilidade de serem obtidos dados sobre a arquitetura da lesão. No entanto, nos linfom as dos cães, este tipo de exam e tem sido aceito com o um a eficiente técnica de diagnóstico, visto que a grande m aioria dos tum ores, nesta espécie, apresenta a form a difusa, sendo a form a folicular bastante rara ( CARTER et al., 1986).

CARTAGENA et al. ( 1992), sugeriram com o principais indicações da PAAF: punções em m assas internas de pacientes com grandes riscos cirúrgicos, que não apresentem m assas superficiais um a vez que esta técnica não necessita de qualquer tipo de sedação do paciente, nas avaliações de novas m assas e no estadiam ento da doença. A acurácia da PAAF nos casos de linfom as não- Hodgkin chega a 85% e quando com binada a citom orfom etria com outros exam es com o, por exem plo, im unocitoquím ica, esta eficácia chega a 91% .

2 .5 . I m unofenot ipagem dos Linfom a s Caninos

A classificação im unom orfológica dos linfom as caninos é feita em pregando-se técnicas de im unoistoquím ica, utilizando- se m arcadores celulares específicos para cada caso. Em Medicina Veterinária, esta técnica é ainda pouco utilizada devido ao alto custo e à ausência de m arcadores específicos em alguns casos ( CHABANNE et al., 1994; FI SHER et al., 1995; MI LNER et al., 1996) .

O com portam ento biológico do linfom a é o fator determ inante para resposta terapêutica. Algum as diferenças observadas no com portam ento biológico tem sido atribuída a fatores com o a localização anatôm ica, grau histológico e im unofenotipagem ( TESKE et al., 1994) . A im unofenotipagem identifica um grupo seleto de glicoproteínas de superfície conhecidas com o clusters of differentiation (CD) . Para identificação desses antígenos é necessário o uso de anticorpos específicos. As glicoproteínas de superfície dos linfócitos apresentam m últiplas funções incluindo a sinalização intracelular, com unicação célula a célula e tráfego de linfócitos. Para a im unofenotipagem dos linfom as são utilizados dois tipos de anticorpos: o anti- CD3 e o anti- CD79a. O CD3 é um com plexo de cinco peptídeos associados com o receptor de células T ( TCR) . A dem onstração do antígeno CD3 em linfócitos m alignos identifica o linfom a com o de origem T. Sim ilarm ente, o CD79 se caracteriza por um heterodím ero associado com o receptor de célula B (BCR). A dem onstração desse antígeno nos linfócitos m alignos representa que a população linfóide do tum or é de origem B ( JEGLUN et al., 1987; TESKE et al., 1994b; MOORE et al., 1996; MORRI SSON & NEUBERGER, 2001) . Raram ente o linfom a não expressa

o CD3 ou CD79. Quando isso ocorre, a origem das células não pode ser determ inada e esse tipo de linfom a é classificado com o sendo form ado por células “ nulas” ( MOORE et al., 1996; MORRI SSON & NEUBERGER, 2001) .

Estudos dem onstram que os linfom as de origem T tendem a ser biologicam ente m ais agressivos que os linfom as de origem B e resultam em m enor tem po de rem issão e sobrevida ( GREELEE et al., 1990; TESKE, et al., 1994a)

Os prim eiros trabalhos de pesquisa que procuraram caracterizar as populações de linfócitos que constituíam os linfom as caninos esbarraram em algum as dificuldades relacionadas à m etodologia utilizada. Nestes estudos pioneiros, as células que apresentavam capacidade de form ar rosetas com hem ácias hum anas eram classificadas com o T ( HOLMBERG et al., 1976; ONI ONS, 1977) . Esta m etodologia m ostrou- se inadequada, j á que 40% a 60% das células com esta capacidade tam bém eram SI g+ , ou sej a, possuía im unoglobulinas de superfície, característica associada às células B (ATKI NSON et al., 1980) . Na realidade, ainda não havia

anticorpos Anti-I a que pudessem ser em pregados nos linfom as caninos, ou m esm o nos linfom as hum anos para os quais eram de im portância capital (APPELBAUM et al., 1984) .

Posteriorm ente, a utilização de um painel de anticorpos, incluindo aqueles capazes de identificar células B ( SI g) e células T ( McAb DT2), em pregando- se técnicas de citofluorim etria, dem onstrou que a freqüência de neoplasias T e B, em cães, eram m uito próxim as às das encontradas no hom em ( APPELBAUM et. al. 1984) .

GREENLEE et al., ( 1990), efetuaram a im unofenotipagem de linfom as caninos em pregando o m étodo de citom etria de fluxo am pliando o painel de anticorpos pela inclusão de anticorpos pan- T ( LQ1, DT- 2 E Thy- 1), m arcadores de linfócitos T supressores ( T811) e linfócitos T ativados (Anti- Tac) e m arcadores de im unoglobulinas de superfície para a caracterização de células B com o o SI g+ B ( Goat- F ab 2 antidog) e o SI g M+ B ( I gM) .

A utilização de um painel de anticorpos am plo e as técnicas de im unoperoxidase em cortes de congelação foi relatada por TESKE et al., ( 1994c). De acordo com estes autores os linfom as foram considerados com o de células B quando apresentavam positividade para CD21, ant i-I gM, ant i-I gG, anti-I gA e negatividade para os m arcadores de células T. Os linfom as foram considerados com o de células T quando apresentavam positividade para CD3, CD4, CD8, Thy-1, CD49 e negatividade para os m arcadores de células B. A m aioria dos linfom as ( 58% ) foi caracterizado com o de células B. O em prego de técnicas im unológicas no estudo e classificação das desordens linfoproliferativas tem se m ostrado particularm ente im portante no estabelecim ento de um diagnóstico preciso ( CANI ATTI et al., 1996 e DOBSON et al., 2001).

As determ inações do im unofenótipo T ou B e do grau de m aturação das células linfóides neoplásicas auxiliam no diagnóstico dos linfom as e no m onitoram ento da recidiva destes tum ores na espécie hum ana. Atualm ente a im unofenotipagem é indispensável para determ inar o diagnóstico de linfom a não-Hodgkin de acordo

com as classificações m ais atuais, Kiel ( LENNERT & FELLER, 1990) , Real ( HARRI S et al., 1994) e WHO (JAFFE et al., 2001) .

Durante m uito tem po a determ inação do im unofenótipo dos linfom as caninos foi dificultada pela falta de m arcadores específicos. Entretanto, os m étodos im unoistoquím icos têm sido aplicados com sucesso em cortes histológicos de tecido incluído em parafina, utilizando o anticorpo policlonal anti- CD3 para m arcar linfom as de células T e o anticorpo m onoclonal anti- m b1 (CD79a) para m arcar linfom as de células B ( MI LNER et al., 1996; FOURNEL-FLEURY et al., 1997; FOURNEL-FLEURY et al., 2002) . Em trabalho de pesquisa recente, tivem os a oportunidade de padronizar a m arcação im unofenotípica de linfom as caninos utilizando m aterial incluído em parafina e os m esm os anticorpos citados acim a (DE MOURA et al., 2000) .

Nos cães, assim com o no hom em , o im unofenótipo T dos linfom as tem sido associado a um prognóstico ruim , com sobrevida m enor e períodos de rem issão m ais curtos, quando com parado aos linfom as de células B (KI UPEL et al., 1999; DOBSON et al., 2001). No

entanto, algum as diferenças ocorrem dentro de cada um destes grupos no que diz respeito à apresentação clínica, resposta ao tratam ento e prognóstico ( KI UPEL et al., 1999) .

A utilização de m étodos im unológicos nos estudos histopatológicos deu um grande increm ento ao diagnóstico das neoplasias hum anas e atualm ente está definitivam ente incorporado à rotina dos laboratórios de patologia ( SOARES & ARI AS, 1999).

A definição do im unofenótipo dos linfom as, por m étodos im unocitoquím icos, auxilia na tipificação da neoplasia e perm ite estabelecer protocolos clínicos de tratam ento de m aneira rápida e eficiente (CANI ATTI et al., 1996) .

São escassos os estudos em que se associam m étodos citológicos ⎯ com o a PAAF ⎯ e im unocitoquím icos na avaliação dos linfom as caninos, no entanto, estes exam es podem se m ostrar eficazes na identificação do tipo citológico e do im unofenótipo das neoplasias, assim com o é realizado para os casos hum anos ( Suzano, 2004) .

De acordo com estudos j á realizados, os linfom as caninos apresentam m uitas sem elhanças com os linfom as não Hodgkin hum anos, do ponto de vista epidem iológico, m orfológico e im unofenotípico. Portanto, aplicar as classificações citoistológicas e im unofenotípicas nos linfom as caninos, além de adicionar dados aos estudos dessa neoplasia canina ⎯ relacionando- as com a clínica para m elhor determ inar o tratam ento, prognóstico e tem po de vida dos anim ais ( CARTER et al., 1986; FI SHER et al., 1995; KI UPEL et al., 1999) ⎯ perm itirá que estes resultados possam ser incorporados ao m odelo experim ental da doença hum ana.

2 .6 . Avalia çã o da Prolifera çã o Celular nos Linfom a s Caninos

ut ilizando a t écnica cit oquím ica de AgN or

A capacidade para avaliar o prognóstico de um a doença neoplásica através de técnicas sim ples com o a cito e histopatologia é de fundam ental im portância. Entretanto não é um a tarefa fácil.

Vários autores têm sugerido que a coloração pela prata para observar as regiões organizadoras nucleolares ( AGNOR) dos núcleos é adequado para este fim ( VAJDOVI CH et al., 2004). A técnica de coloração das Regiões Organizadoras Nucleolares Argirofílicas (AgNor) através da prata tem sido utilizada nas últim as décadas com o um m arcador tum oral eficiente na m edicina hum ana ( DERENZI NI & PLOTON, 1991) .

Segundo PLOTON (1994) , as AGNORs são definidas com o sítios onde estão localizados genes rRNA durante a interfase e durante a m itose. As AGNORs são alças de DNA que ocorrem no nucléolo das células e possuem genes RNA ribossom ais (DERENZI NI et al., 1994). Esses genes RNA ribossom ais possuem papel im portantes durante a síntese protéica, crescim ento e diferenciação celular e tam bém na transform ação m aligna (EGAN & CROCKER, 1988). O núm ero de AGNORs, de acordo com DERENZI NI et al., ( 1994) , reflete a atividade proliferativa da célula. Assim , quanto m ais elevada a freqüência de AGNORs, m aior a atividade de proliferação das células. As AgNors são ainda responsáveis pelo desenvolvim ento do RNA nucleolar ( UNDERWOOD & GI RI, 1988) . Os segm entos de rRNA estão associados

a proteínas com alta afinidade pela prata, daí ser cham adas de proteínas AgNors e a coloração que perm ite visualizá- las é tam bém denom inada de AgNors (CROCKER et al., 1989). Segundo DERENZI NI & PLOTON, ( 1991), a m aior expressão e AgNors está relacionada única e diretam ente com a proliferação celular e esta é um a característica m ais m arcante das células neoplásicas.

O nucléolo é a organela m ais visível no núcleo de um a célula em interfase o que, para PLOTON, ( 1994), significa a expressão m orfológica da transcrição e processam ento do rRNA. O nucléolo é um a estrutura com plexa. É form ado por frações de DNA ocupadas pelos genes RNA, as quais associam -se às proteínas para processam ento, com pactação e form ação final de partículas pré- ribossôm icas. Em síntese, o nucléolo é um a organela contendo alças de DNA que em ergem de vários crom ossom os, cada um dos quais contém um agrupam ento de genes rRNA e cada grupam ento representa um a AGNOR ( ALBERTS et al., 1997) .

De acordo com VERDUN, ( 1983) e GOENSSENS, (1984) , pode- se distinguir pelo m enos cinco regiões no nucléolo: o centro fibrilar; o

denso fibrilar; o granuloso; o interstício nucleolar e a crom atina nucleolar. A região centro fibrilar é com posta por pequenas quantidades de DNA e de proteínas AgNors; o com ponente denso fibrilar é form ado por fibras associadas à região centro fibrilar que contém m oléculas de pré- RNA (AgNORs positiva) e de pequenas quantidades de proteínas associadas as AGNORs.

A im pregnação pela prata é a técnica citoquím ica que perm ite