I I I Envolvim ento generalizado dos linfonodos
3 MATERI AL E MÉTODOS
O presente trabalho foi aprovado pela Câm ara de Ét ica em Experim entação Anim al ( CEEA) , protocolo n0 13/ 2002- CEEA, da Faculdade de Medicina Vet erinária e Zootecnia de Bot ucatu/ SP, por estar de acordo com os Princípios Ét icos na Experim entação Anim al ( COBEA) .
3 .1 . Origem das Am ost ras
As am ostras estudadas foram provenient es de 53 cães, sem restrição quanto a idade, raça ou sexo, diagnosticados com o portadores de linfom a m ediant e punção aspirat iva por agulha fina ( PAAF) realizado pelo Serviço de Patologia do Hospital Vet erinário ( HV) da Faculdade de Medicina Vet erinária e Zoot ecnia da UNESP- Cam pus de Bot ucat u. As coletas foram realizadas durante o período de m arço de 2001 a j ulho de 2004. Dados clínicos e exam es com plem ent ares foram obt idos dos prontuários dos anim ais e anotados em fichas individuais ( anexo 01) .
3 .2 . Est adiam ent o Clínico e Classificação Anat ôm ica dos Linfom as
Foi adotado o protocolo estabelecido pela pela World Healt h
Organization ( WHO; TNM Classificat ion of Tum ors in Dom est ic Anim als,
Geneva, 1980) , para o estadiam ento dos linfom as e a classificação anat ôm ica inst it uída foi a est abelecida por JACOBS et al., ( 2002) . Os dados de identificação, form a anatôm ica, est adiam ent o, im unofenót ipo e graus de m alignidade de t odos os anim ais est udados encont ram - se no anexo 02.
3 .3 . Técnica Cit opat ológica e Processam ent o das Am ost ras
Os preparados citológicos obtidos pelo m étodo da PAAF dos cães diagnost icados com linfom a foram ut ilizadas para classificação citológica e im unocit oquím ica dos linfom as caninos ( SUZANO, 2004) , bem com o para est udo m orfom ét rico, det erm inação do índice de proliferação celular por m eio da técnica citoquím ica de AgNor e lesão do DNA através do teste do com eta.
Para t ais procedim ent os, foram ut ilizadas seringas de 10m l e agulhas descartáveis de até 22G, acopladas ao citoaspirador de Valeri. Após a anti- sepsia da região, foi realizada a punção local seguida da aplicação de pressão negativa, fazendo- se o reposicionam ento da agulha “ em leque” sem que a m esm a saísse do t ecido. At o cont ínuo, a pressão negativa era relaxada e a agulha retirada da m assa e desacoplada da seringa, aspirando para dentro da m esm a volum e de ar suficiente para expulsar o conteúdo da agulha sobre lâm inas de m icroscopia com extrem idade fosca, procedendo- se a extensão do m at erial (COWEL & TYLER, 1989) . I m ediat am ent e após a PAAF, pelo m enos 10 lâm inas ainda úm idas eram im ersas em et anol 95% para coloração pelo m étodo de Shorr, AgNor, enquant o out ras duas eram deixadas secar ao ar, fixadas em m etanol e coradas pelo m étodo de Giem sa, para a diagnóstico citom orfológico.
Um a segunda punção era realizada e a am ostra celular obtida era suspensa em ependorf cont endo 1,5m l de PBS livre de Ca+ + e Mg+ +. Foi t am bém colhido 1m l de sangue em vacut ainers cont endo EDTA. Todo esse m aterial era im ediatam ent e acondicionado em gelo e prot egido da luz, requisit os fundam entais e necessários para confecção das lâm inas para o teste do com eta.
3 .4 . Processam ent o Hist ológico
Os fragm entos colhidos e devidam ente ident ificados foram fixados em form alina neutra tam ponada a 10% . Em seguida foram subm et idos aos procedim entos de rot ina hist ológica e incluídos em parafina. Os cortes com espessura de 3µm foram corados pelo m étodo de Hem atoxilina & Eosina (LUNA, 1968) e exam inados ao m icroscópio ópt ico.
As am ostras da m edula óssea foram retiradas da crista ilíaca. Esse m aterial foi fixado em form ol neutro tam ponado 10% por 48h e posteriorm ente subm etido ao processo de descalcificação em ácido fórm ico. Um a vez descalcificadas, as am ostras foram processadas seguindo os m esm os procedim entos anteriores.
Todos os casos de linfom as foram classificados de acordo com o esquem a proposto por Kiel ( LENNERT & FELLER, 1990) , pela classificação elaborada pelo Nacional Cancer I nst it ut e - Working Form ulation ( NCI - WF, 1982) e com a Classificação apresentada por FOURNEL- FLEURY, et al., ( 1994) para os linfom as dos cães.
3 .5 . I m unofenot ipagem dos linfom as
Os est udos da linhagem celulares dos linfom as foram realizados ut ilizando- se as t écnicas padronizadas no Laboratório do Serviço de Pat ologia Vet erinária da FMVZ, baseada na m etodologia descrita por HSU et al, ( 1981) , com algum as m odificações e ut ilizando- se o seguint e painel de ant icorpos: Ant i- CD31, Ant i- CD42, Ant i- CD83, Ant i- CD79a4. Para os ant icorpos ant i- CD4 e anti- CD8 foi utilizado o protocolo descrito por Costa, ( 2000) . Todos os anticorpos, com exceção do anticorpo anti- CD3, foram diluídos em solução de 1% de album ina bovina5 em solução tam pão de Tris6 ( BSA) .
Todos os anticorpos foram testados e padronizados em linfonodo reativo de cão. A padronização obedeceu aos critérios descritos abaixo e foram os m esm os para os casos de linfom a.
Um bloco de cada caso foi selecionado e cortes de 3µm de espessura foram colocados sobre lâm inas previam ent e desengorduradas
1 Anti-CD3, policlonal, código A0452, Dako Co, EUA
2 Anti-CD4, anti-cão, monoclonal, código DH29A, VMRD Pullman, USA 3 Anti-CD83, anti-cão, monoclonal, código CAD046A, VMRD Pulman, USA 4 Anti-CD79a4, monoclonal, código HM57, Dako Co, USA
5 albumin bovine, Sigma, código A-7906, 100g
e tratadas com solução de organosilano7 em álcool absoluto. Os cortes foram m ant idos em est ufa a 580C, por 24horas e subm etidos à desparafinação em xilol seguida de reidratação através da im ersão das lâm inas em gradiente decrescent e de álcool, até a concent ração de 70% . Cada passagem ou banho foi feit o com duração de cinco m inut os, at é lavagem final com água corrente por 10 m inutos e dois banhos em água dest ilada com duração de cinco m inut os cada.
3 .5 .1 . Bloqueio da Peroxidase Endógena
Foram ut ilizados t rês t ipos de bloqueios: o prim eiro foi im ersão do m at erial em peróxido de hidrogênio 3% em m et anol, em duas etapas com 15 m inutos de duração cada, seguido de lavagem em água corrente por 10 m inutos e dois banhos com tam pão fosfato salino ( PBS) , pH 7,6. Est e t ipo de bloqueio foi utilizado por COSTA, ( 2000) para uso dos ant icorpos anti- CD4 e ant i- CD8. O segundo t ipo foi a ut ilização do peróxido de hidrogênio ( 20 volum es) , diluído 1: 1, em água dest ilada na hora do uso e ao abrigo da luz; e o terceiro utilizou- se peróxido de hidrogênio ( 10 volum es) , puro, em dois banhos de 15 m inut os cada, ao abrigo da luz, seguido de lavagem em água corrente por 10 m inutos. Os resultados obtidos com os três tipos de bloqueio foram sem elhant es
para todos os anticorpos testados e devido à praticidade da operação, optou- se pela utilização do peróxido de hidrogênio ( 10 volum es) .
Dois tipos de solução tam pão para o banho das lâm inas foram utilizados: o tam pão fosfato salino pH 7,6 ( PBS) , utilizado por COSTA, ( 2000) , e o t am pão Tris, pH 7,2. A lavagem foi feit a com t am pão PBS para os anticorpos CD4 e CD8 ( COSTA, 2000) e tam pão Tris para os anticorpos CD3 e CD 79a.
3 .5 .2 . Recuperação Ant igênica
Para a recuperação antigênica foi utilizada a solução de EDTA 10µM, pH 8,0, previam ent e aquecida a 950C, em banho- m aria, durant e 30 m inut os. Após bloqueio da peroxidase endógena e lavagem em água corrente e solução tam pão, as lâm inas acondicionadas em berços histológicos eram colocadas em cubas cont endo água dest ilada pré- aquecida ( 1m im 50Seg. ao m icro- ondas, pot ência m áxim a) , para evit ar o choque t érm ico. Em seguida, os berços foram im ersos em EDTA, pH 8,0 e deixado em banho- m aria durant e 30 m inut os.
Retirado do banho- m aria, o m aterial foi resfriado à tem peratura am bient e por 20 m inut os, subm et ido à lavagem em água corrente por 10 m inut os e duas lavagens com t am pão, cinco m inut os cada. Em seguida, para evitar m arcações inespecíficas, os cortes foram incubados com o bloqueador de avidina- biot ina8, em câm ara úm ida a 370C, durant e 15 m inut os cada et apa. Após incubação por 18h ( overnight ) em geladeira ( 40C) , o m aterial foi lavado com t am pão em dois banhos de cinco m inut os.
3 .5 .3 . Sist em a de Det ecção e Am pliação de Sinais/ ant icorpo secundário
Para os ant icorpos ut ilizados neste trabalho, foram testados os seguint es sist em as: LSAB9, CSA10 e o EnVision11 .
8 DAKO Biotin Blocking System, código X0590, Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA 9 DAKO LSAB+ kit, peroxidase, código K0690. Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA
10 Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, código K1500. DakoCytomation Denmark A/S.
3 .5 .4 . Revelação e cont racoloração
Para a revelação e visualização da reação utilizou- se o crom ógeno 3’- 3’ diam inobenzidina12 líquido, na diluição recom endada pelo fabricant e, com tem po variando entre 30 segundos a 1 m inut o ( Tabela 6) , ao abrigo da luz, seguindo- se a lavagem das lâm inas durant e dez m inut os em água corrente. A contracoloração foi realizada com hem atoxilina de Harris por um m inuto, seguindo- se de lavagem em água corrent e, desidratação progressiva em álcoois, diafanização em xilol e m ont agem em Perm ount13.
11 DakoCytomation EnVision + Dual Link System, Peroxidase. Código K4061. Dako Corporation,
Carpinteria, CA, USA.
12 DAB líquido Dako. DakoCytomation. Carpinteria, CA, USA. 13 Fischer, EUA.
TABELA 5 - Painel dos ant icorpos e et apas da t écnica de
im unoist oquím ica no ut ilizadas para im unofenot ipagem dos linfom a dos cães
AN TI CORPO AN TI- CD3 AN TI- CD4 AN TI- CD8 AN TI- CD7 9 a
CLONE/CÓDIGO N1580 DH29A CA046A HM57
TI PO policlonal m onoclonal m onoclonal m onoclonal
CONCENTRAÇÃO Pré- diluído 1: 500 1: 500 1: 50
BLOQUEI O DA PEROXI DASE ENDÓGENA (ÁGUA OXI GENADA 10 VOLUMES)
TEMPO 2x15
m inut os
2x15
m inut os 2x15 m inut os 2x15 m inut os
RECUPERAÇÃO ANTI GÊNI CA
TAMPÃO EDTA EDTA EDTA EDTA
PH 8,0 8,0 8,0 8,0
LOCAL Banho-
m aria Banho-maria Banho- m aria Banho-maria TEMPO 30 m inut os 30 m inut os 30 m inut os 30 m inut os
BLOQUEI O DA AVI DI NA/ BI OTI NA AVI DI NA/ BI OTI NA 2 x 15 min, cada 2 x 15 min,
cada 2 x 15 min, cada 2 x 15 min, cada LOCAL Câmara úmida Câmara úmida Câmara úmida Câmara úmida TEMPERATURA 370C 370C 370C 370C
INCUBAÇÃO
TEMPO overnigth overnigt h overnigth overnigth
TEMPERATUR
A 4oC 4oC 4oC 4oC