Thaís Alves Barbosa
Epidemiologia da colonização e infecção microbiana em
Unidade de Terapia Intensiva Neonatal: abordagem clínica
e molecular
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais.
Orientadora: Profª. Adj. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Coorientadora: Profª.Drª. Maria Regina Bentlin
Botucatu
2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
Thaís Alves Barbosa
Epidemiologia da colonização e infecção microbiana em
Unidade de Terapia Intensiva Neonatal: abordagem clínica
e molecular
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais.
Orientadora: Profª. Adj. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Coorientadora: Profª.Drª. Maria Regina Bentlin
Thaís Alves Barbosa
Epidemiologia da colonização e infecção microbiana em
Unidade de Terapia Intensiva Neonatal: abordagem clínica e
molecular
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista “ Júlio de Mesquita Filho”, Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais.
Orientadora: Profª. Adj. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha.
Comissão examinadora
Titular 01: Profª. Adj. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha.
Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
________________________________________________________
Titular 02: Prof. Assistente Doutor João César Lyra.
Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”.
________________________________________________________
Titular 03: Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari. Universidade Federal de São Paulo
________________________________________________________
“
Á minha vida,
pelo orgulho, realização,
alegria, determinação e coragem,
sentimentos inexplicáveis
que irão me acompanhar pela vida toda
A vida, em certos momentos, fez-me parar e seguir por outros caminhos.
No entanto, o desejo de realização deste sonho foi algo que nunca morreu. Mesmo
encontrando inúmeras barreiras no decorrer desta caminhada, sempre fui muito persistente.
Hoje, vivo uma realidade que parece um sonho, mas foi preciso muito esforço, dedicação,
persistência, coragem e flexibilidade, a fim de alcançar este objetivo, e nada disso eu
conseguiria sozinha. Minha eterna gratidão a todos aqueles que colaboraram para que este
sonho pudesse ser concretizado.
Sou grata a Deus pelo dom da vida, pelo seu amor infinito, sem Ele nada sou.
Agradeço por ter plantado em mim um sonho, que hoje se realiza, pelas oportunidades que me
foram dadas na vida, principalmente por ter conhecido pessoas e lugares interessantes, mas
também por ter vivido fases difíceis, que foram matérias-primas de aprendizado.
Minha gratidão é grande por ter me acompanhado nos momentos mais difíceis, por ter
fortalecido meus sonhos, por ter vigiado meus passos, por ter me colocado no colo, por ter me
proporcionado força e coragem, enfim... Por estar sempre presente em mim, em meus
pensamentos. Minhas lágrimas e meus sorrisos, hoje, são de felicidade e é para Ti, o meu
muito obrigado.
É imensa a gratidão que tenho pelos meus pais, Rosilene e Cláudio, instrumentos
necessários para concretizar o precioso dom que recebi do universo: “a vida”, meus maiores
exemplos. Vocês são e serão responsáveis por cada sucesso alcançado e cada passo avançado
pelo resto da minha vida. No decorrer destes anos, vocês representaram um grande exemplo
de força, perseverança e coragem infinita para persistir mediante ao primeiro empecilho
encontrado. Ambos são e serão a minha maior segurança, meu maior exemplo de vitória, meus
heróis, enfim... Aqueles que mais amo. Obrigada por estarem presentes na minha vida e
durante toda esta caminhada, vocês me ensinaram de forma direta e indireta lições para toda
a vida. Eu percebo que a felicidade nos invade e o brilho dos seus olhos manifesta a alegria
por eu ter realizado mais um sonho, meu e seus. Isto me enche de orgulho. Tenho certeza de
que subi mais um degrau para compensar tudo o que um dia nesta vida vocês fizeram por
mim. Quero agradecer a vocês do fundo do meu coração por terem me ensinado que na vida
À minha irmã Isabela, pelo entusiasmo, gestos de amor e carinho, pela ajuda nos
momentos que precisei e por ter sido muito mais que uma irmã, mas uma grande amiga.
Ao meu namorado Neylor, por ter vivenciado comigo passo a passo todos os detalhes
deste trabalho, ter me ajudado durante sua construção, por ter me dado todo o apoio que
necessitava nos momentos difíceis, todo carinho, respeito, compreensão, por ter me aturado
nos momentos de estresse e por tornar minha vida cada dia mais feliz.
Não poderia deixar de expressar minha gratidão a alguém muito especial, à pessoa
que fez-me enxergar que eu seria capaz de realizar este sonho e me mostrou o caminho, minha
professora da graduação, Inélia Albino Ribeiro. A sua presença marcou minha vida,
obrigada por acreditar em meus sonhos, mesmo sabendo que a realização destes dependia das
minhas asas. Vou guardar você para sempre dentro do meu coração.
À minha orientadora, Prof.ª Adj. Maria de Lourdes R. S. Cunha, por ter aceitado me
orientar, sem antes conhecer o meu trabalho, por todo apoio, amizade, além de sua dedicação
e competência. Obrigada por contribuir com tantos ensinamentos, tantas palavras de força e
ajuda. Carrego tudo isso comigo, juntamente com seu exemplo de profissionalismo. Espero,
um dia, conseguir chegar ao seu nível.
À minha coorientadora, Dra. Maria Regina Bentlin, por todo apoio e ensinamentos
que muito contribuíram para a conclusão desse projeto.
À Dra. Ligia Maria Suppo de Souza Rugulo, ao Dr. João César Lyra e a todos os
funcionários da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal por terem permitido a execução
deste trabalho e contribuído grandemente para a realização desta conquista.
O meu muito obrigado também se destina as minhas ex-professoras, que se tornaram
grandes amigas, Ana Paula Pinho Carvalheira e Thaís Mendes Gonçalves, que com seus
tempos valiosos sempre se prontificaram a me ensinar, ajudar-me e me valorizar, conseguiram
enxergar-me inúmeras vezes de forma melhor do que eu sou. Vocês contribuíram para o meu
futuro através de seu carinho, paciência, sabedoria, dedicação, atenção e confiança, obrigada
por vibrarem pelas minhas conquistas, sendo que estas não teriam sido alcançadas se não
existisse a presença de vocês em meu caminho, minha gratidão é infinita, amo vocês!
Serei eternamente grata aos meus amigos do Laboratório de Bacteriologia: Adilson,
toda ajuda, pelos ensinamentos e momentos divididos juntos. Em especial, ao meu parceiro
de projeto, Felipe, por toda colaboração; Lígia, Camila, Ana e Natália Benedetti, aos quais
aprendi a amar e construir laços eternos. Obrigada por todos os momentos em que fomos
estudiosos e brincalhões. Em vocês encontrei verdadeiros irmãos. Obrigada pela paciência,
pelo sorriso, pelo abraço, pela mão que sempre se estendia quando eu precisava. Esta
caminhada não seria a mesma sem vocês.
Aos funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia, em especial,
Larissa, Ivana, Luiz Alquati e Luiz Severino, por toda colaboração, carinho e amizade.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
–
FAPESP (Processo
–
2013/12482
–
0), pelo apoio financeiro referente à bolsa de mestrado.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
sonho.
Muito obrigada!!
Nessa caminhada aprendi… Que só uma coisa torna o sonho impossível: o medo de fracassar
“
Em meio à dificuldade, encontra-se a oportunidade
”
Resumo
Introdução: A necessidade de permanência em Unidade de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) simboliza um dos principais fatores desencadeantes de colonização e infecção. Sabe-se que logo após o nascimento, inicia-Sabe-se a colonização bacteriana do neonato pelo contato com a microbiota materna, dos profissionais de saúde ou a partir da exposição ambiental. Recém-nascidos (RNs), que permanecem em tratamento intensivo, possuem predisposição aumentada para infecção posteriormente à colonização. A maior sobrevida e o prolongamento do período de internação dos neonatos têm proporcionado uma elevação nas taxas de infecções, principalmente em UTINs.
Objetivos: Estudar a epidemiologia da colonização e infecção microbiana em uma coorte de neonatos admitidos em uma UTIN com abordagem clínica e molecular.
Metodologia: Foram incluídos no estudo todos os neonatos admitidos na UTIN, nascidos no HC da FMB, por um período de um ano. As amostras foram coletadas de aspirado traqueal,
como também por meio de swabs estéreis dos sítios nasal e anal e acompanhamento do
recém-nascido até o desfecho final (alta da UTIN ou óbito). Micro-organismos isolados foram submetidos à identificação e ao teste de sensibilidade às drogas antimicrobianas para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de E-test. Dentre os
Staphylococcus spp. que apresentarem resistência à meticilina foi determinado o tipo de
cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec). Para a pesquisa de clones prevalentes na
unidade, foi realizada a caracterização dos clusters pela técnica de eletroforese em gel de
campo pulsado (PFGE).
Resultados: Os resultados revelaram maior incidência de infecção (27,8%) e colonização por
Staphylococcus epidermidis principalmente na mucosa nasal (56,4%). Na mucosa anal
predominou a colonização por Serratia marcescens (26,8%). Os resultados evidenciaram
cepas de S. epidermidis resistentes a sulfametoxazol-trimetoprim, e S.epidermidis e
Enterococcus faecalis resistentes a quinopristina/dalfopristina. Das 402 amostras de
Staphylococcus spp. estudadas, 204 (50,7%) apresentaram o gene mecA, com uma maior
frequência de isolados provenientes da mucosa nasal, sendo detectados 47 isolados
albergando o SCCmec tipo I, 12 carreando o SCCmec tipo II, 77 carreando o SCCmectipo III
e 43 albergando o SCCmec tipo IV. A tipagem molecular para determinação dos clusters pela
comprovando que o micro-organismo que colonizava o RN no momento da coleta também era o agente infeccioso. A análise estatística revelou que o processo de colonização pode ser considerado fator de risco para infecção, com um risco de três vezes mais quando comparado com RNs não colonizados. Dentre os fatores de risco para colonização a utilização de nutrição parenteral e cateter central de inserção periférica (PICC) aumentaram o risco em seis vezes mais e quatro vezes mais, respectivamente.
Conclusão: Os achados deste trabalho podem auxiliar na escolha antimicrobiana adequada visto que o processo de colonização ocorre posteriormente ao nascimento e que a terapia empírica muitas vezes é necessária. O conhecimento do perfil microbiológico da unidade possibilita a criação de protocolos antimicrobianos adequados para prevenção e tratamento de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS), objetivando melhoria na qualidade da assistência prestada. Para tanto, salienta-se a importância de implementação de culturas de vigilância, que auxiliam a comissão de controle de IRAS, e a equipe assistencial na elaboração de medidas a serem adotadas.
ABSTRACT
Introduction: The need to stay in the Neonatal Intensive Care Unit (NICU) represents one of the main factors of colonization and infection. It is known that, soon after birth, bacterial colonization of the newborn starts from contact with maternal microbiota, health professionals, or from environmental exposure. Newborns (NBs) who remain in intensive care have a greater predisposition to infection after the colonization. The longer survival and prolonged hospitalization of NBs have led to an increase in infection rates, especially in NICUs.
Objectives: To study the epidemiology of colonization and microbial infection in a cohort of neonates admitted to a NICU with a clinical and molecular approach.
Methodology: All neonates born in the University Hospital of Botucatu Medical School admitted to the NICU for one year were included in the study. Tracheal aspirate samples were collected, as well as samples of the nasal and anal sites by using sterile swabs. The NBs were
followed up until the final outcome – ICU discharge or death. Isolated mircroorganisms were
submitted to identification and were tested for antimicrobial drug susceptibility in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) by the E-test. The type of
staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) was determined among the
methicillin-resistant Staphylococcus spp. For the research on prevalent clones in the unit, the
characterization of clusters was performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).
Results: The results showed higher incidence of infection (27.8%) and colonization by
Staphylococcus epidermidis mainly in the nasal mucosa (56.4%). The colonization by
Serratia marcescens was predominant in the anal mucosa (26.8%). The results showed S.
epidermidis resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole, and S. epidermidis and Enterococcus
faecalis resistant to quinopristin-dalfopristin. From the 402 samples of Staphylococcus spp.
studied, 204 (50.7%) had the mecA gene, more frequently isolated from the nasal mucosa.
There were 47 isolates harboring SCCmec type I, 12 carrying SCCmec type II, 77 carrying
SCCmec type III, and 43 harboring SCCmec type IV. Molecular typing to determine the
for infection with a three times greater risk compared to non-colonized NBs. Among the risk factors for colonization, the use of parenteral nutrition and peripherally-inserted central catheter (PICC) increased the risk six times and four times, respectively.
Conclusion: The findings of this study can assist in the appropriate antimicrobial choice as the colonization process occurs after the birth and the empirical therapy is often required. Knowing the microbiological profile of the unit allows to create proper antimicrobial protocols for preventing and treating healthcare-associated infections (HCAIs) aiming to improve the quality of the care provided. To this end, the implementation of surveillance cultures which help the HCAI control commission as well as the care team to develop the measures to be adopted is very important.
Lista de Figuras
Figura 1. Número de Recém-nascidos colonizados, infectados e com evolução para óbito em UTIN... 19
Figura 2. Frequência de isolamento de micro-organismos encontrados na mucosa nasal (MN), anal (MA) e aspirado traqueal (AT) de neonatos da UTIN do HC da FMB... 20 Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 2% (corado com SYBR® Safe) evidenciando
amostras de S. aureus, mecA positivas nos poços 1 a 8, sendo 7 isolados de colonização e
1 de infecção, poço 9 controle positivo (S. aureus ATCC 33591) e o poço 10 controle
negativo (S. aureus ATCC 25923)... 29
Figura 4. Dendrograma gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics Applied Maths)
de amostras de Staphylococcus epidermidis isoladas de colonização e infecção nos
Recém-nascidos estudados... 31
Figura 5. Dendrograma gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics Applied Maths)
de isolados de Staphylococcus aureus carreados por Recém-nascidos... 32
Figura 6. Dendrograma gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics Applied Maths)
de isolados de Enterococcus faecalis carreados por Recém-nascidos... 32
Figura 7. Dendrograma gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics Applied Maths)
de isolados de Serratia marcescens carreados por Recém-nascidos... 33
Figura 8. Dendrograma gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics Applied Maths)
Lista de Quadros
Quadro 1: Oligonucleotídeos para a detecção do gene mecA... 16
Lista de Tabelas
Tabela 1. Staphylococcus coagulase-negativa isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e
Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu... 21 Tabela 2. Staphylococcus aureus isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado
Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu... 21 Tabela 3. Enterococcus spp. isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado
Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu... 21 Tabela 4. Enterobactérias isoladas da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu... 22 Tabela 5. Bacilos Gram-negativos não fermentadores isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu... 22
Tabela 6. Leveduras isoladas da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu... 23 Tabela 7. Incidência de colonização por micro-organismos Gram-positivos, negativos e leveduras isolados da Mucosa Anal, Mucosa Nasal e Aspirado Traqueal de
Recém-nascidos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal... 23
Tabela 8. Incidência de colonização por micro-organismos isolados da Mucosa Anal, Mucosa Nasal e Aspirado Traqueal de Recém-nascidos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal ... 24 Tabela 9. Tempo em dias de colonização de neonatos por patógenos Gram-positivos, Gram-negativos e leveduras... 25 Tabela 10. Incidência de infecção por micro-organismos isolados de hemocultura,
aspirado traqueal e cultura de urina de Recém-nascidos da
UTIN... 26 Tabela 11. Determinação de quanto tempo (em dias) posteriormente à colonização pôde
Tabela 12. Determinação da suscetibilidade antimicrobiana em micro-organismos Gram-positivos pelo método de E-test... 28 Tabela 13. Determinação da suscetibilidade antimicrobiana em micro-organismos Gram-negativos pelo método de E-test... 28 Tabela 14. Presença do gene de resistência à meticilina em Staphylococcus spp. isolados
de neonatos... 29 Tabela 15. Classificação de SCCmec em Staphylococcus spp. isolados de neonatos... 30
Lista de Abreviaturas
AT - Aspirado traqueal
BGN - Bacilos Gram-negativos
BGNF - Bacilos Gram-negativos não fermentadores de glicose CIM - Concentração inibitória mínima
CU - Cultura de Urina
CVC - Cateter Venoso Central
ECN - Staphylococcus coagulase negativos
FMB - Faculdade de Medicina de Botucatu H - Hemocultura
HC - Hospital das Clínicas I - Incidência
ICS - Infecção da Corrente Sanguínea
IRAS - Infecção Relacionada à Assistência à Saúde ITU - Infecção do Trato Urinário
MA - Mucosa anal MN - Mucosa nasal
MRSA - Staphylococcus aureus resistente à meticilina
MSSA - Staphylococcus aureus sensível à meticilina
PAV - Pneumonia Associada à Ventilação Mecânica PFGE - Pulsed-field gel electrophoresis
PICC - Cateter Central de Inserção Periférica RN - Recém-nascido
SCCmec - staphylococcal cassette chromosome mec
Sumário
1. INTRODUÇÃO... 1 2. OBJETIVOS... 9 2.1 Objetivo Geral... 9 2.2 Objetivos Específicos... 9 3. METODOLOGIA... 10 3.1 Local de estudo... 10 3.2 Delineamento... 10 3.3 Definições... 12 3.4 Coleta de dados clínicos... 12
3.5 Coleta dos espécimes microbiológicos... 13
3.6 Identificação dos patógenos... 13
3.6. 1 Identificação fenotípica dos micro-organismos... 13
3.7 Medida da Incidência... 14
3.8 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pelo método de
E-test... 15 3.9 Extração do DNA bacteriano... 15
3.10 Amplificação do ácido nucléico (PCR) e detecção do gene mecA de
Resistência à Oxacilina em amostras de Staphylococcus spp... 16
3.11 Determinação do SCCmec... 16
3.12 Visualização dos produtos amplificados... 17
3.13 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)... 18
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS... 18
5. RESULTADOS... 19 5.1 Amostras... 19
5.2 Isolamento e Identificação dos Micro-organismos... 20
5.3 Determinação da colonização e infecção em recém-nascido... 23
5.3.1 Colonização... 23 5.3.2 Infecção... 25
5.4 Determinação da sensibilidade in vitro aos antimicrobianos... 26
5.5 Detecção do gene mecA e caracterização do SCCmec... 29
6. DISCUSSÃO... 37 7. CONCLUSÃO... 49
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 50
1. INTRODUÇÃO
Relatos da ocorrência de infecções adquiridas em ambientes destinados à prestação de cuidados remontam a Idade Média. Os riscos intrínsecos às assistências hospitalares, quanto à
morbidade e mortalidade, são descritos desde a origem dos hospitais, no século XVIII.1
Atualmente, o conhecimento sobre a incidência, os fatores relacionados, as repercussões e prevenção das infecções nosocomiais permite a identificação, vigilância e controle das infecções hospitalares. As infecções nosocomiais se manifestam de forma intensa e frequente em recém-nascidos (RNs) quando comparados a crianças ou adultos. Além das várias especificidades desta faixa etária, que os torna mais sensíveis à aquisição de infecção, inúmeros procedimentos invasivos, utilização de antimicrobianos de largo espectro, o prolongamento do período de permanência em Unidade de Terapia Intensiva Neonatal
(UTIN), são fatores desencadeantes de infecções hospitalares neonatais.2
A prevenção e o controle das infecções bacterianas em neonatos simbolizam um desafio para todos os profissionais da saúde. Surtos de infecção posteriormente à colonização
têm sido amplamente divulgados por causar proporção substancial de mortes neonatais.3
O processo de colonização caracteriza-se pela presença do micro-organismo no hospedeiro na ausência de manifestações clínicas e resposta imunológica no momento do
isolamento bacteriano.4
O feto em desenvolvimento está protegido da microbiota materna. O processo de colonização normal do RN inicia-se posteriormente ao rompimento das membranas amnióticas, prosseguindo através do contato com a mãe e com o ambiente até que seja estabelecida a microbiota do bebê. Diversos fatores podem influenciar no processo de colonização do neonato, dentre eles, a microbiota materna, a alimentação do RN, as pessoas que estabelecem contato direto com a criança e o ambiente em que ela nasce e permanece,
compreendendo objetos e microbiota de outros bebês que ocupam o mesmo espaço.5
Frequentemente, RNs que mantêm contato com a mãe e recebem aleitamento materno natural são colonizados posteriormente ao nascimento através da pele e superfícies mucosas,
como nasofaringe, orofaringe, conjuntivas, genitália externa e cordão umbilical. 4A presença
de microbiota pouco virulenta protege a criança da colonização por micro-organismos potencialmente patogênicos, pois as bactérias da microbiota proliferam-se nos diversos sítios, competindo com organismos patogênicos, com a evolução para doença em proporções
menores.2
colonização por micro-organismos em decorrência do tratamento com antibióticos, da nutrição parenteral total e da permanência em incubadoras, tais fatos podem atrasar ou dificultar o processo de colonização intestinal normal. A ausência ou aquisição tardia de
comensais do intestino como Bifidobacterium spp. e Lactobacillus spp., em decorrência das
restrições da alimentação por via oral, se traduz em uma elevação da sensibilidade à colonização intestinal anormal. Por todos esses fatos, o trato gastrintestinal pode ser colonizado por todos os tipos de patógenos servindo como fonte potencial para infecção invasiva.6
A infecção, caracterizada pela invasão de micro-organismos que se multiplicam e causam lesão, usualmente se manifesta pela extensão direta dos sítios de colonização ou por invasão da corrente sanguínea, resultando na disseminação do processo infeccioso dependendo da virulência do patógeno, do inóculo e da interação entre patógeno e
hospedeiro.2
Embora todas as infecções adquiridas por neonatos nascidos no hospital possam ser classificadas como hospitalares, considera-se infecção precoce de provável origem materna aquela cuja evidência diagnóstica (clínica/laboratorial/microbiológica) ocorreu nas primeiras 48 horas de vida, com fator de risco materno para infecção. Infecção Relacionada à Assistência à Saúde (IRAS) são aquelas com evidência diagnóstica detectada posteriormente
as primeiras 48 horas de vida, de provável origem ambiental.7
Os fatores de risco primordiais para infecção em RNs podem ser divididos em intrínsecos e extrínsecos. Fatores intrínsecos englobam características como gênero, peso ao
nascer, idade gestacional, grau de desenvolvimento imunológico e gravidade da doença.8
Fatores extrínsecos compreendem duração da hospitalização, uso de procedimentos invasivos (cânulas traqueais, cateteres arteriais e venosos, sonda gástrica ou duodenal, derivações
ventrículo-peritoneais, drenos torácicos, etc.),9 peculiaridades da exposição ao ambiente
hospitalar e à equipe multidisciplinar e o método de utilização de antimicrobianos da
unidade.10
veiculação de organismos patogênicos e a utilização de forma prolongada e rotineira de antimicrobianos, cuja pressão seletiva proporciona a colonização com micro-organismos resistentes. As infecções causadas por micro-organismos multirresistentes é uma adversidade severa em neonatos admitidos em UTIN, estabelecendo relação com a elevação das taxas de mortalidade, morbidade, aumento do período de internação hospitalar e do risco de sequelas
neurológicas em longo prazo.16Assim, o prolongamento do período de permanência em UTIN
favorece a colonização com micro-organismos gram-negativos potencialmente patogênicos
pertencentes ao ambiente favorecendo o desenvolvimento de IRAS.2
As principais infecções hospitalares incluem sepse, pneumonia e infecção
urinária.11Morbidade e mortalidade associadas à sepse é uma preocupação crescente em todas
as UTINs, pois as incidências são elevadas independente das melhorias na qualidade da
assistência prestada.12 Pode ser conceituada como uma síndrome clínica com sinais e sintomas
sistêmicos e bacteremia. Classificada como de início precoce, que se manifesta no decorrer
das primeiras 48 horas de vida e/ou como tardia posteriormente às 48 horas de vida.13
Neonatos gravemente doentes submetidos à ventilação mecânica têm elevado risco de desenvolver pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) e consequentemente sepse. PAV representa um desafio para as UTINs, prejudicando RNs que necessitam de suporte ventilatório para sobrevivência e por consequência é responsável pelo prolongamento do
período de utilização do respirador.6 Segundo os critérios do Centro de Controle e Prevenção
de Doenças (CDC), PAV é um episódio que se manifesta posteriormente a 48 horas da
instalação do tubo endotraqueal.14 O principal mecanismo para aquisição de PAV se relaciona
com a aspiração de secreções colonizadas da nasofaringe e traqueia.15
Dentre os patógenos mais comumente associados a infecções em UTIN estão as
espécies do gênero Staphylococcus, dentre as quais, Staphylococcus aureus é considerado o
patógeno mais importante do gênero, sendo membro da microbiota normal da pele do homem
e outros animais.17 S. aureus é considerado um dos agentes virulentos predominantes,
habilitados para ocasionar inúmeros processos infecciosos que se manifestam com diversas
sintomatologias clínicas, englobando patologias localizadas até quadro sistêmico.18,19,20
Morfologicamente, Staphylococcus spp. apresentam-se como cocos Gram-positivos reunidos
em estruturas semelhantes a cachos de uva. Dentro do gênero, aproximadamente 15 das 52 espécies conhecidas são capazes de ocasionar um processo infeccioso em humanos. Para a
diferenciação dos demais integrantes do gênero, Staphylococcus aureus podem ser
identificados por meio da produção de coagulase.21
cepas resistentes à meticilina representou uma problemática clinicamente grave, pois o antimicrobiano, utilizado para o controle das infecções tornou-se ineficaz. Esse problema fez com que vários pesquisadores elucidassem possíveis mecanismos de resistência para tratar corretamente as infecções, evitando que o paciente seja tratado de forma desnecessária e que este venha a conduzir a seleção de cepas resistentes, visto que esses micro-organismos podem ser diagnosticados de forma errônea, pois, apresentam-se como contaminantes de amostras e materiais. 23
A resistência à meticilina pode ser detectada utilizando a técnica genotípica de reação de cadeia em polimerase (PCR), conhecida como padrão ouro para detecção do gene
mecA.24,25 Tal resistência é mediada pela produção de uma proteína ligadora de penicilina
(PBP) suplementar (PBP 2’ ou PBP 2a), que apresenta baixa afinidade às penicilinas semissintéticas, sendo o determinante genético desta proteína de natureza cromossômica, o
gene mecA. O gene mecA é idêntico em todas as linhagens de Staphylococcus e, portanto, é
um marcador molecular útil de resistência à meticilina. 26,27 O gene mecA encontra-se
localizado em um elemento genético móvel denominado de Staphyloccocal Cassette
Chromossome mec (SCCmec).28 O elemento SCCmec contém o complexo gênico mec (o gene
mecA e seus reguladores) e o complexo gênico ccr, que codifica recombinases
sítio-específicas responsáveis pela mobilidade do SCCmec.29 São classificados em tipos I, II, III,
IV, V e VI de acordo com os complexos do gene mec e ccr. Os tipos I, II, III e VI
encontram-se distribuídos nas IRAS e a disencontram-seminação desencontram-ses tipos ocorrem principalmente pela pressão seletiva da exposição ao antimicrobiano relacionado ao tempo de utilização. Os tipos IV e V são amplamente distribuídos nas cepas pertencentes à comunidade e são facilmente
transferidos dos ECN para o S. aureus por apresentarem pequenas dimensões (21– 28 kbp)
em relação aos demais.28
Como parte integrante deste grupo inclui-se Staphylococcus aureus resistente à
meticilina (MRSA), responsável por 19 mil óbitos anualmente.30 MRSA foi isolado pela
primeira vez no ano de 1961 por serviços hospitalares localizados no Reino Unido. Desde a descrição do primeiro caso, este micro-organismo tornou-se cada vez mais evidente como
causa progressiva de infecções em todo o mundo.31 Após aproximadamente vinte anos da
descrição do primeiro caso, foi detectada infecção por MRSA em uma UTIN. A partir de então, este patógeno tornou-se evidente em processos infecciosos prejudicando neonatos
prematuros e gravemente comprometidos.32 Estas infecções não se restringem apenas a
endocardite, que ocasionam aumento do tempo de internação, elevação dos gastos com
assistência e altos índices de mortalidade e morbidade.33
Estudos revelam casos de transmissão vertical de MRSA.35 Pesquisas demonstram que
a taxa de colonização vaginal por MRSA em gestantes é de 2,8%, fato que evidencia a possibilidade destas mulheres atuarem como depósito de MRSA transmitindo a seus
sucessores no decorrer do parto.34 A transmissão vertical de MRSA pode ocorrer por
diferentes métodos como canal do parto, corioamnionite materna,36 colonização nasal 37e
amamentação.38,39 Algumas situações podem expor os recém-nascidos à colonização
bacteriana por cepas resistentes como a admissão de pacientes portadores destes patógenos e prolongamento do processo de internação. Esse fato se justifica pela possibilidade das bactérias sensíveis desenvolverem mecanismos de resistência em decorrência das mutações genéticas ou por meio do compartilhamento de genes de resistência, como também é o caso
da resistência por meio da indução e seleção de bactérias resistentes.40
O mecanismo de resistência aos antimicrobianos desenvolvidos por Estafilococos coagulase negativos (ECN), especialmente pelos beta-lactâmicos, tem se elevado
anualmente.41 O gene mecA está evidente em mais de 80% dos ECN isolados de sepse
tardia.42 O aumento dos índices de mecanismo de resistência aos antibióticos e suas
capacidades de desenvolvimento de biofilme possivelmente possibilita que ECN permaneça na UTIN, se manifestando de forma predominante em relação aos micro-organismos mais sensíveis.41
Os Enterococcus spp. têm se tornado agentes prevalentes nas infecções nosocomiais
em UTIN. A fonte predominante é o trato gastrintestinal do neonato, sendo possível a colonização através da boca, trato respiratório, lesões cutâneas e contaminação de objetos e
superfícies do ambiente.44 RNs prematuros que permanecem em tratamento intensivo por mais
de 30 a 60 dias, com a utilização prolongada de cateteres venosos e exposição a diversos
antimicrobianos, são particularmente predispostos à aquisição de infecções por Enterococcus
spp., como enterocolite necrosante, sepse, pneumonia, meningite e endocardite.43
Bacilos Gram-negativos (BGN) são considerados os principais problemas no ambiente hospitalar, em decorrência da elevação das taxas de resistência aos antimicrobianos, podendo
ser classificados em dois grandes grupos.45
Os Bacilos Gram-negativos, não fermentadores de glicose (BGNF), são evidentes frequentemente em processos infecciosos, particularmente em infecções do trato respiratório.
Correspondem principalmente a cepas de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp.,
infecções do trato respiratório pelo fato de possivelmente estarem presentes nos aparatos de
ventilação mecânica que necessitam de água para seu funcionamento.45
As Pseudomonas spp. são um dos principais agentes patogênicos Gram-negativos
responsáveis pelas infecções em UTIN.46 A sua capacidade de sobrevivência e replicação em
uma vasta variedade de nichos ecológicos é muitas vezes hostil a outros patógenos.47 Relatos
de diminuição da sensibilidade das Pseudomonas spp. aos antimicrobianos vêm sendo
relatados, destacando-se a redução de susceptibilidade aos antibióticos de maior espectro de
ação como os carbapenêmicos e as cefalosporinas.48 Colonização e infecção por Pseudomonas
spp. em neonatos prematuros frequentemente são oriundas do ambiente, apesar dos
profissionais de saúde serem considerados reservatórios e veículos de transmissão.49
Dentre as 205 espécies de Pseudomonas existentes, a Pseudomonas aeruginosa é
considerada a de mais relevância clínica, bactéria oportunista com capacidade para colonizar diversos tecidos em decorrência da presença de fimbria e de alginato (biofilme). Em relação à sua habilidade de invasão tecidual, os fatores de virulência fosfatase, alginato, exoenzima S, citotoxinas, elastases, exotoxina A e ramnolipídeos são os produtos extracelulares
fundamentais relacionados a esse processo.50
O gênero Acinetobacter é um grupo de BGNF imóveis, aeróbicos, evidenciados no
solo e água doce.51Acinetobacter spp. apresenta resistência a diversos antimicrobianos,
representa e causa inúmeros processos infecciosos.52 Especificamente, tem capacidade para
ocasionar infecções do trato respiratório inferior, infecções do trato urinário, bacteremia e
meningite.53
As enterobactérias se relacionam com grande maioria das infecções em UTIN, particularmente infecções respiratórias e urinárias, apresentando capacidade de produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) e consequentemente resistência elevada às quinolonas, beta-lactâmicos e aminoglicosídeos. Os principais patógenos que fazem parte
deste grupo incluem Enterobacter spp., E.coli, Klebsiella spp., Serratia spp. Citrobacter spp.,
Proteus spp., dentre outros.45
Assim como os patógenos Gram-negativos, as infecções fúngicas têm se tornado frequente em UTIN e também estabelecem relação com a utilização prolongada a antibióticos, hiperalimentação parenteral, intubação traqueal e infusão de emulsão intravenosa de lipídios.
Espécies de Candida (C. albicans, C. tropicalis e C.parapsilosis) são as responsáveis pela
maioria das IRAS. A apresentação comumente evidenciada é a fungemia, podendo ocasionar
meningite, abscessos esplênicos ou renais, endoftalmite, osteomielite ou dermatite invasiva.54
inúmeras cepas circulantes em um mesmo ambiente.55 A transmissão, possivelmente, ocorre através de pacientes colonizados durante o contato com a equipe de saúde ou resultante de
uma fonte ambiental de transmissão dentro da unidade.56A genotipagem de cepas tem se
tornado cada vez mais relevante para verificar se os patógenos associados com determinadas doenças, surtos hospitalares ou em eventos de transmissão cruzada, como resistência a
antimicrobianos, possuem possível relação clonal.57 A ferramenta de tipagem molecular
comumente utilizada é a técnica de tipagem por PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis).58
Um grande benefício do PFGE é a possibilidade de grandes fragmentos de DNA serem separados, contrariamente ao convencional gel de agarose. O cromossomo bacteriano é, portanto, submetido à análise, possibilitando ao método PFGE a capacidade para descrever claramente as cepas e evidenciar a relação genética entre os isolados com elevada reprodutibilidade. É possível que alguns clones bacterianos sejam mais predispostos que
outros a determinar doença de maior gravidade.57
Nos últimos anos, a caracterização de cepas tem se tornado cada vez mais frequente por inferir níveis de parentesco entre as estirpes e a reconstrução de eventos evolutivos. A detecção dessas linhagens demonstra uma oportunidade para controle da disseminação de micro-organismos multirresistentes. Esse controle só poderá ser alcançado com um grande esforço multidisciplinar, incluindo, além de outras medidas, a detecção precoce de neonatos
colonizados, implementação de precauções de contato e de tratamento adequado.51
Deste modo, a incorporação de medidas de controle de infecção é preponderante bem como culturas ativas de triagem, implementação de precauções de isolamento e realização de sistema de coorte entre pacientes e profissionais. A implementação de educação continuada para equipe enfatizando métodos de higienização das mãos e utilização de precauções padrão
e de contato é fundamental,58 bem como proceder à desinfecção concorrente e terminal da
unidade de acordo com protocolo da instituição visando à redução da transmissão de infecção cruzada.59
Em consequência da fundamental importância da evolução da resistência antimicrobiana e da necessidade de um controle das infecções em áreas de cuidados intensivos, é fundamental a análise destes micro-organismos através de um processo ativo, contínuo e sistemático para detecção e o controle da propagação destas espécies de patógenos em decorrência de seu impacto negativo na sobrevivência de neonatos.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar a epidemiologia da colonização e infecção microbiana em uma coorte de neonatos admitidos em uma UTIN com abordagem clínica e molecular.
2.2 Objetivos Específicos
Identificar as espécies de micro-organismos;
Verificar a incidência de colonização e infecção em RNs admitidos em uma UTIN;
Investigar quanto tempo após a colonização este micro-organismo evolui para
infecção;
Identificar os fatores de risco para colonização e infecção por micro-organismos
Gram-negativos e Gram-positivos no RN admitido em uma UTIN;
Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) para micro-organismos
Gram-positivos e Gram-negativos pela técnica de E-test;
Detectar o gene mecA de resistência à meticilina nos isolados de Staphylococcus spp.;
Determinar o tipo de SCCmec nos isolados de Staphylococcus spp. positivos para o
gene mecA;
Pesquisar clusters de micro-organismos Gram-negativos e Gram-positivos pela técnica
3. METODOLOGIA
3.1 Local de estudo
UTIN pertencente ao Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB). Centro universitário terciário de alta complexidade, atualmente com 15 leitos, representa referência regional para atendimento de pacientes do Sistema Único de Saúde (SUS) provenientes da região sudoeste do Estado de São Paulo e de outros Estados vizinhos.
3.2Delineamento
Recém-nascidos UTIN
Coletados: aspirado traqueal, swabs anal e nasal (duas vezes por semana durante um ano) e dados clínicos.
Isolamento dos micro-organismos e
identificação
Seguimento prospectivo
Infecção
Isolamento e Identificação em materiais clínicos
Alta/ Óbito Estudo de coorte
Não Sim
3.3 Definições
Colonização: presença do micro-organismo no hospedeiro na ausência de
manifestações clínicas e resposta imunológica no momento do isolamento bacteriano. 4
Infecção: Evidência diagnóstica (clínica/laboratorial/microbiológica) posteriormente as primeiras 48/ 72 horas de vida. Foi considerada como IRAS de origem hospitalar, aquela infecção diagnosticada enquanto o paciente esteve internado na unidade. Para diagnóstico
laboratorial foi utilizado o Escore de Rodwell.13
Para diagnóstico de Infecção da Corrente Sanguínea (ICS) foi utilizado um dos seguintes critérios:
Critério 1: Uma ou mais hemoculturas positivas por micro-organismos não contaminantes da pele e que o micro-organismo não esteja relacionado à infecção em outro sítio;
Critério 2: Pelo menos um dos seguintes sinais e sintomas sem outra causa não infecciosa reconhecida e sem relação com infecção em outro local: Instabilidade térmica, bradicardia, apneia, intolerância alimentar, piora do desconforto respiratório, intolerância à glicose, instabilidade hemodinâmica, hipoatividade/letargia.
E pelo menos um dos seguintes:
Micro-organismos contaminantes comuns da pele (ECN, Proprionebacterium spp.,
Bacillus spp., ou micrococos) cultivados em pelo menos duas hemoculturas colhidas em dois locais diferentes, com intervalo máximo de 48 horas entre as coletas;
ECN cultivado em pelo menos 01 hemocultura periférica de paciente com cateter
venoso central (CVC).
3.4 Coleta de dados clínicos
Sexo.
Tipo de Parto.
Idade gestacional (IG) no parto.
Peso ao nascimento.
Cateterização venosa central ou periférica.
Intubação endotraqueal (ventilação mecânica).
Procedimentos cirúrgicos.
Nutrição parenteral.
Antibioticoterapia prévia.
3.5 Coleta dos espécimes microbiológicos
Amostras da mucosa nasal e anal de neonatos foram coletadas simultaneamente
através de swabs. Os espécimes foram obtidos das narinas anteriores e da superfície dos
tecidos supracitados, utilizando um swab para cada sítio. A técnica de coleta nasal consistiu
na umidificação do swab com soro fisiológico 0,9% (técnica estéril) e introdução em ambas às
narinas e rotação da haste pressionando gentilmente a extremidade contra a mucosa. Na
região anal, foi realizada também com swab embebido em solução fisiológica uma fricção (de
forma suave) sobre a superfície do tecido do RN.
O aspirado traqueal foi coletado a partir do processo de aspiração, com esterilidade total da sonda de aspiração, luvas estéreis, máscara, avental apropriado e frasco estéril objetivando quantificar o provável patógeno.
3.6 Identificação dos patógenos
3.6.1 Identificação fenotípica dos micro-organismos
A identificação fenotípica dos micro-organismos isolados dos sítios nasais, anal e aspirado traqueal ocorreu simultaneamente à coleta das amostras, no período de novembro de 2013 a novembro de 2014.
coloração específica inerente à espécie, seguida de séries de provas bioquímicas específicas
para cada grupo de bactérias.60
Os cocos Gram-positivos foram submetidos à prova de catalase para diferenciação
entre os gêneros Staphylococcus e Streptococcus ou Enterococcus. A identificação das
espécies do gênero Staphylococcus foi feita através de uma série de provas bioquímicas, tais
como: coagulase, sacarose, maltose, trealose, xilose, manitol, crescimento em tioglicolato de
sódio, e, se, necessárias, provas de frutose e sensibilidade à novobiocina.61
A identificação fenotípica de Streptococcus spp. consistiu na análise do tipo de
hemólise ou ausência de hemólise ao redor das colônias isoladas em meio sólido, sensibilidade à optoquina, sensibilidade à bacitracina, prova de bile esculina e CAMP teste. Os bacilos Gram-negativos fermentadores de glicose foram submetidos às provas bioquímicas manuais associadas, um sistema denominado EPM/MILi/citrato com testes de liberação de
gás, produção de H2S, produção de urease, produção de L-triptofano desaminase; prova de
motilidade, indol, produção de lisina descarboxilase e crescimento em citrato.62
Os bacilos Gram-negativos não fermentadores de glicose foram identificados de acordo com a prova de oxidação e fermentação (OF), oxidase, motilidade, capacidade de
crescimento em temperatura de 42ºC e produção de pigmentos.63
Todas as leveduras isoladas e as bactérias que não puderam ser identificadas pelos métodos bioquímicos tradicionais foram submetidas à identificação por Espectrometria de
Massa (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight) no
equipamento VITEK MS (bioMérieux).
3.7 Medida da Incidência
A incidência mede o número de casos novos de uma doença, episódios ou eventos na população dentro de um período definido de tempo (dia, semana, mês, ano); é um dos melhores indicadores para avaliar se uma condição está diminuindo, aumentando ou permanecendo estável. O coeficiente de incidência é a razão entre o número de casos novos de uma doença que ocorre em uma comunidade, em um intervalo de tempo determinado, e a população exposta ao risco de adquirir essa doença no mesmo período. Esse coeficiente pode ser multiplicado por uma constante, pois, assim, torna-se um número inteiro fácil de interpretar (essa constante pode ser 100, 1.000 ou 10.000). A incidência pode ser cumulativa
Incidência cumulativa = número de casos no decorrer do período x 100
3.8 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pelo método de E-test
A sensibilidade in vitro das amostras de micro-organismos Gram-positivos foram
testadas para os antimicrobianos: Oxacilina, Vancomicina, Linezolida,
Trimetoprim/Sulfametoxazol, Daptomicina, Tigeciclina e Quinupristina/dalfopristina. Para os patógenos Gram-negativos foram testados: Gentamicina, Tigeciclina, Ciprofloxacina, Ceftazidime, Cefepime, Imipenem e Polimixina B. Para tanto, foi determinada a CIM dessas drogas, através do E-test. O procedimento utilizou tira de plástico inerte, na qual, é incorporado um gradiente de concentração estabilizado do antimicrobiano a ser pesquisado. Os parâmetros técnicos envolvidos na realização do E-test foram: meio de cultura de Mueller-Hinton adicionado de 2% de NaCl, inóculo com concentração final semelhante à turvação correspondente a escala 0,5 de MacFarland e incubação a 35°C por 24 ou 48 h conforme as recomendações do fabricante.
3.9 Extração do DNA bacteriano
O DNA total foi extraído a partir de amostras de Staphylococcus spp. cultivadas em
ágar sangue e inoculadas individualmente em caldo Infusão de Cérebro e Coração (BHI) e
incubadas a 37oC por 24 h.
A extração foi realizada com o Kit Illustra (GE Healthcare), que consiste na digestão inicial das células de estafilococos com lisozima (10 mg/ml) e proteinase K (20 mg/ml). A
seguir, 500 μl da solução de extração foram adicionados à mistura e esta foi centrifugada a
5.000 x g por 1 min. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para a coluna GFX e
centrifugado a 5.000 x g por 1 min. O líquido coletado foi descartado e 500 μl de solução de
extração foram adicionados novamente à coluna. Após a centrifugação e descarte do líquido
coletado, 500 μl da solução de lavagem foram adicionados à coluna e esta submetida à
centrifugação a 14.000 x rpm por 3 min. A seguir, a coluna foi transferida para um tubo de 1,5
ml e 200 μl de água Milli Q aquecida a 70oC foram utilizados para a eluição. As amostras
foram centrifugadas a 5000 x g por 1 minuto, e a coluna GFX desprezada. O DNA extraído foi guardado sob refrigeração a -20°C.
3.10 Amplificação do ácido nucleico (PCR) e detecção do gene mecA de Resistência à
Oxacilina em amostras de Staphylococcus spp.
As reações de PCR foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml em
volumes totais de 25 μl contendo 10pmol de cada primer (Quadro 1), 2,5 U de Taq DNA
polimerase, 200 μM de desoxiribonucleotídeos trifosfatados, 20 mM de Tris-HCl (pH 8,4),
0,75 mM de MgCl2 e 3 μL da amostra. A incubação foi realizada em termociclador
apropriado, empregando os parâmetros descritos por Murakami et al.65 que consistem de: 40
ciclos de desnaturação a 94oC por trinta segundos, anelamento dos primers a 55,5oC por trinta
segundos e extensão a 72oC por um minuto. Após completar os 40 ciclos, os tubos foram
incubados a 72oC por cinco minutos antes de resfriar a 4oC. Em todas as reações realizadas
foram utilizadas linhagens de referência internacional com controle positivo (S. aureus ATCC
33591) e negativo (S. aureus ATCC 25923).
Quadro 1: Oligonucleotídeos para a detecção do gene mec A
Função Nome Sequência de nucleotídeos 5’a 3’ Produto amplificado
Primer mecA1 AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG 533 bp
Primer mecA2 AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG 533 bp
Fonte: Murakami et al., 1991. 65
3.11 Determinação do SCCmec
A determinação do tipo de SCCmec foi realizada utilizando o método de reação PCR
Multiplex conforme descrito por Milheiriço et al.,66 com os primers descritos no Quadro 2. As
reações de PCR multiplex foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml em
volumes totais de 50 μl contendo 5μl de DNA; PCR Buffer 1x contendo 1,5mM de MgCl2;
40μM de cada desoxiribonucleotídeos trifosfatados; 0,2μM dos primers kdp F1 e kdp R1;
0,4μM dos primers CIF2 F2, CIF2 R2, RIF5 F10, RIF5 R13, SCCmec III J1F, SCCmec III
J1R, SCCmec V J1 F e SCCmec V J1 R; 0,8 μM dos primers mecI P2, mecI P2, dcs F2, dcs
R1, mecA P4, mecA P7, ccrB2 F2, ccrB2 R2, ccrC F2 e ccrC R2; e 1,25 U de Taq polimerase.
em gel de agarose 2% e corado com Syber safe.
Quadro 2. Primers utilizados na técnica de PCR multiplex para caracterização do SCCmec
em MRSA.
Primer Sequencia do Primer 5´-> 3´ Pares de base (pb)
CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG 495
CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC 495
ccrC F2 GTACTCGTTACAATGTTTGG 449
ccrC R2 ATAATGGCTTCATGCTTACC 449
RIF5 F10 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG 414
RIF5 R13 ATGGAGATGAATTACAAGGG 414
SCCmec V J1 F TTCTCCATTCTTGTTCATCC 377
SCCmec V J1 R AGAGACTACTGACTTAAGTGG 377
dcs F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC 342
dcs R1 CTAAATCATAGCCATGACCG 342
ccrB2 F2 AGTTTCTCAGAATTCGAACG 311
ccrB2 R2 CCGATATAGAAWGGGTTAGC 311
kdp F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC 284
kdp R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG 284
SCCmec III J1 F CATTTGTGAAACACAGTACG 243
SCCmec III J1 R GTTATTGAGACTCCTAAAGC 243
mecI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC 209
mecI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC 209
mecA P4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG 162
mecA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG 162
Fonte: Milheiriço et al.,2007, 66
3.12 Visualização dos produtos amplificados
3.13 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)
O PFGE das amostras cultivadas foi feito segundo o protocolo modificado por
McDougal et al.67
As amostras foram colocadas em caldo BHI onde cresceram por 24h. Em um microtubo previamente pesado, 1 ml da amostra crescida foi centrifugada à 12.000 rpm por 50s. Depois de desprezado o sobrenadante, o microtubo foi novamente pesado e foram
adicionados 300μl de solução TE (10mM de Tris, 1mM EDTA [pH 8,0]) mais a diferença
entre o peso final e inicial em ml. As amostras foram deixadas em banho-maria por 10min. a
37°C. Após agitação em vortex foram adicionados 5μl de Lisostafina (1mg/ml em 20mM de
acetato de sódio [pH 4,5]) e 300μl de agarose low melt. As amostras foram despejadas nos
moldes para plugues até endurecerem e, então, colocadas em 2ml de solução EC (6mM Tris-HCl, 1M NaCl, 100mM EDTA, 0,5% Brij-58, 0,2% deoxicolato de sódio, 0,5% laurilsarcosil sódico) e incubadas a 37°C por pelo menos 4h. O EC foi retirado e os plugues foram lavados com 2ml de TE quatro vezes à temperatura ambiente por meia hora. A restrição enzimática foi
feita em meio plugue com enzimas específicas em 50μl de tampão de restrição, sendo que
para micro-organismos Gram-positivos foi utilizada a enzima SmaI, para Gram-negativos
fermentadores a enzima XbaI e para os não fermentadores SpeI .68 Um gel de agarose a1% foi
preparado com TBE 0,5X onde os plugues foram colocados e cobertos com agarose low melt. A corrida será feita a 6V/cm e 14°C por 21h.
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
Os dados pessoais e clínicos dos RNs colonizados e diagnosticados com infecção foram submetidos à análise univariada e, posteriormente, foi utilizado modelo de regressão logística multivariada para determinar os fatores de risco para ocorrência de colonização com variáveis referentes ao RN como explanatórias (full-model). Para análise univariada foram
5. RESULTADOS 5.1 Amostras
Foram estudados 179 neonatos da UTIN do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade
de Medicina de Botucatu (FMB), destes, 144 RNs foram colonizados e 18 infectados (Figura
1). As amostras foram coletadas de 3 sítios em cada recém-nascido incluído no estudo:
mucosa nasal (MN), mucosa anal (MA) e aspirado traqueal (AT). Durante o período do estudo foram obtidas 1.571 amostras positivas de colonização, com crescimento de micro-organismos. Destas amostras 760 (48,4%) foram coletadas da MN, 767 (48,8%) da MA e 44
(2,8%) de AT (Figura 2).
Figura 1. Número de Recém-nascidos colonizados, infectados e com evolução para óbito em Unidade de Terapia Intensiva Neonatal.
179 Neonatos
Colonizados (n= 144)
Não colonizados (n=35)
Infecção (n=18)
Não Infectados (n=126) Óbito (n=2)
Óbito (n=12)
Infecção (n=0)
Não Infectados (n=35)
Óbito (n=0)
Figura 2. Frequência de isolamento de micro-organismos encontrados na mucosa nasal (MN), anal (MA) e aspirado traqueal (AT) de neonatos da UTIN do HC da FMB.
5.2 Isolamento e Identificação dos Micro-organismos
A identificação das 1.571 amostras obtidas dos RNs incluídos no estudo revelou 600 (38,2%) bactérias Gram-negativas, 942 (60,0%) bactérias Gram-positivas e 29 (1,8%) leveduras.
A partir da coleta foram identificados 942 cocos Gram-positivos (CGP), destes 807
(85,7%) foram positivos para a prova da catalase, caracterizando o gênero Staphylococcus.
Dentre as 942 bactérias Gram-positivas isoladas, 478 foram identificadas em nível de
espécie, revelando 361 (75,5%) do grupo dos Estafilococos coagulase-negativa (ECN), 41
Tabela 1. Estafilococos coagulase-negativa isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Total de Isolados
Mucosa Nasal Mucosa Anal Aspirado Traqueal
N (%) N (%) N (%) N (%)
Staphylococcus epidermidis 218 (60,4) 138 (62,6) 75 (57,7) 5 (45,4)
Staphylococcus haemolyticus 55 (15,2) 29 (13,2) 25 (19,2) 1 (9,1)
Staphylococcus hominis 35 (9,7) 25 (11,4) 6 (4,6) 4 (36,4)
Staphylococcus simulans 16 (4,4) 9 (4,1) 6 (4,6) 1 (9,1)
Staphylococcus warneri 14 (3,9) 9 (4,1) 5 (3,8) - -
Staphylococcus capitis 4 (1,1) 3 (1,4) 1 (0,9) - -
Staphylococcus cohnii 13 (3,6) 3 (1,4) 10 (7,7) - -
Staphylococcus saprophyticus 5 (1,4) 3 (1,4) 2 (1,5) -
Staphylococcus schleiferi 1 (0,3) 1 (0,4) - -
TOTAL 361 (100) 220 (60,9) 130 (36,1) 11 (3,0)
N: número de amostras
Tabela 2. Staphylococcus aureus isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado
Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Total de Isolados Mucosa Nasal Mucosa Anal Aspirado Traqueal
N N N N
Staphylococcus aureus 41 35 5 1
TOTAL 41 35 5 1
N: número de amostras
Tabela 3. Enterococcus spp. isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de
neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Total de
Isolados Mucosa Nasal Mucosa Anal Aspirado Traqueal
N % N % N % N %
Enterococcus faecalis 74 (97,4) 18 (94,7) 52 (98,1) 4 (100)
Enterococcus faecium 2 (2,6) 1 (5,3) 1 (1,9) - -
TOTAL 76 (100,0) 19 (25,0) 53 (69,7) 4 (5,3)
As 600 bactérias Gram-negativas isoladas foram submetidas ao teste de OF para a diferenciação entre fermentadores e não fermentadores de glicose. Foram obtidos 548 (91,3%) bacilos Gram-negativos (BGN) fermentadores de glicose e 51 (8,5%) BGN não fermentadores. Destes, 336 foram submetidos ao processo de identificação em nível de
espécie (Tabelas 4 e 5).
Tabela 4. Enterobactérias isoladas da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Total de Isolados Mucosa Nasal Mucosa Anal Aspirado Traqueal
N (%) N (%) N (%) N (%)
Serratia marcescens 132 (46,3) 39 (62,0) 85 (41,3) 8 (50,0)
Enterobacter cloacae 60 (21,1) 9 (14,3) 49 (23,8) 2 (12,5)
Escherichia coli 45 (15,8) 14 (22,2) 29 (14,1) 2 (12,5)
Enterobacter aerogenes 17 (6,0) 1 (1,6) 16 (7,7) - -
Klebsiella oxytoca 12 (4,2) - - 10 (4,8) 2 (12,5)
Citrobacter freundii 7 (2,5) - - 7 (3,4) - -
Klebsiella pneumoniae 5 (1,8) - - 3 (1,4) 2 (12,5)
Citrobacter diversus 2 (0,7) - - 2 (1,0) - -
Proteus vulgares 2 (0,7) - - 2 (1,0) - -
Raoultella plantícola 1 (0,3) - - 1 (0,5) - -
Raoultella ornithinolítica 1 (0,3) - - 1 (0,5) - -
Cedecea neteri 1 (0,3) - - 1 (0,5) - -
TOTAL 285 (100,0) 63 (22,1) 206 (72,3) 16 (5,6)
N: número de amostras
Tabela 5. Bacilos Gram-negativos não fermentadores isolados da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Total de
Isolados Mucosa Nasal Mucosa Anal Aspirado Traqueal
N % N % N % N %
Pseudomonas aeruginosa 27 (52,9) 12 (48,0) 14 (56,0) 1 (50,0)
Acinetobacter baumannii 18 (35,3) 10 (40,0) 8 (32,0) 0 -
Acinetobacter lwoffii 6 (11,8) 2 (8,0) 3 (12,0) 1 (50,0)
TOTAL 51 (100,0) 24 (47,0) 25 (49,1) 2 (3,9)
Entre as Leveduras, 6 (23,1%) foram isoladas da mucosa nasal e 20 (76,9%) da
mucosa anal (Tabela 6).
Tabela 6. Leveduras isoladas da Mucosa Nasal, Mucosa Anal e Aspirado Traqueal de neonatos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Total de Isolados Mucosa Nasal Mucosa Anal Aspirado Traqueal
N % N % N % N %
Candida albicans 24 (92,4) 6 (100) 18 (90,0) - -
Candida tropicalis 1 (3,8) - - 1 (5,0) - -
Candida krusei 1 (3,8) - - 1 (5,0) - -
TOTAL 26 (100,0) 6 (23,0) 20 (77,0) - -
N: número de amostras
5.3 Determinação da colonização e infecção em recém-nascido 5.3.1 Colonização
Foi realizada a determinação da colonização do RN pelos micro-organismos isolados nas coletas.
Através deste processo, pode ser constatada maior incidência de colonização por organismos Gram-positivos principalmente na MN (79,3%), enquanto os micro-organismos Gram-negativos e as leveduras apresentaram maior taxa de incidência de
colonização na mucosa anal (59,2%) e (7,8%), respectivamente (Tabela 7).
Tabela 7. Incidência de colonização por micro-organismos Gram-positivos, negativos e leveduras isoladas da Mucosa Anal, Mucosa Nasal e Aspirado Traqueal de Recém-nascidos da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal.
RN Colonizados
RN I RN I RN I
% % %
Mucosa Nasal 142 79,3 48 26,8 3 1,7
Mucosa Anal 113 63,1 93 51,9 13 7,2
Aspirado Traqueal 11 6,1 13 7,3 0 0,0
RN: recém- nascido; MN: mucosa nasal; MA: mucosa anal; AT: aspirado traqueal; I: incidência.
