KLIJAVOST POLENA SORTE ORAHA GAJZENHAJMSKI 286
NA RAZLIČITIM HRANLJIVIM PODLOGAMA
Dragan M. Janković1*, Slađana J. Janković1, Svetlana M. Paunović2 ,
Bratislav M. Ćirković1i Zoran M. Jovanović1
1Univerzitet u Prištini, Poljoprivredni fakultet, Kopaonička bb,
38228 Lešak, Kosovo i Metohija, Srbija
2
Institut za voćarstvo, Kralja Petra 19, 32000 Čačak, Srbija
Rezime: Polen sorte oraha Gajzenhajmski 286 naklijavan je na hranljivim
podlogama napravljenim kombinovanjem različitih koncentracija sledećih
supstanci: saharoze (10, 15 i 20%); agara (0,6 i 0,8%); borne kiseline (0, 300 i 600 ppm) i kalcijum hlorida (0, 50 i 100 ppm). Ukupno su testirane 54 različite kombinacije navedenih materija sa ciljem da se utvrdi najpogodnija podloga za ispitivanje klijavosti polena oraha in vitro. Promene koncentracija saharoze, borne
kiseline i kalcijum hlorida imale su značajan uticaj na klijanje polena, što nije bio
slučaj sa promenom koncentracije agara. Interakcije između koncentracija agara i
kalcijum hlorida, borne kiseline i saharoze, kalcijum hlorida i saharoze, kao i borne
kiseline, kalcijum hlorida i saharoze su bile statistički značajne. Najveća klijavost polena (27,8%) utvrđena je na podlozi koja je sadržala 15% saharoze, 0,8% agara,
600 ppm borne kiseline i 50 ppm kalcijum hlorida.
Ključne reči: Juglans regia, polen, in vitro, agar, saharoza, borna kiselina, kalcijum hlorid.
Uvod
Obični orah (Juglans regia L.) je jednodomna (monoecijska), herkogama
biljka, kod koje se oprašivanje vrši vetrom (Mišić, 2002). Orah je genetički autokompatibilna vrsta, ali se kod većine genotipova period prašenja polena ne
poklapa u potpunosti sa periodom receptivnosti ženskih cvetova (Polito, 1998). To je glavni razlog što je u komercijalnim zasadima oraha neophodno obezbediti
više genotipova koji se međusobno oprašuju. Za rad na utvrđivanju pogodnih oprašivača važno je definisati pouzdane metode za ispitivanje kliјаvosti
polena (Cerović et al., 1992). Pored toga, poznavanje funkcionalne sposobnosti
polena značajno je za izučavanje reproduktivne biologije oraha i oplemenjivanje ove vrste voćaka.
*
Autor za kontakt: e-mail: draganjankovickv@gmail.com
Postoji više metoda za ispitivanje klijavosti polena biljaka, među kojima su
najvažnije: 1) in vivo test, koji podrazumeva praćenje rasta polenovih cevi na žigu i
u stubiću; 2) in vitro test na odgovarajućoj hranljivoj podlozi; 3) bojenje polena fluoroscentnim materijama; 4) testiranje enzimske aktivnosti polena; 5) testovi
bojenja vegetativne ćelije polena (Galletta, 1983; Kearns i Inouye, 1993). Ispitivanje polena in vivo smatra se najverodostojnijim testom vitalnosti polena,
koji je, međutim, veoma zahtevan u pogledu vremena i neophodne tehničke opreme. Različite tehnike bojenja omogućavaju brzo dobijanje rezultata, ali one ne otkrivaju stvarnu klijavost polena, već enzimsku aktivnost polenovih zrna ili
integritet njihove membrane. U programima oplemenjivanja biljaka za ispitivanje vitalnosti polena najviše se koristi in vitro test jer je brz, jednostavan i pokazuje stvarnu klijavost polena u definisanim uslovima (Shivanna et al., 1991; Tuinstra i Wedel, 2000; Dantas et al., 2005).
Sastav podloge za naklijavanje može da utiče značajno na metabolizam polena (Taylor i Hepler, 1997). Polen oraha teško klija na veštačkim podlogama i zahteva, pored agara i saharoze, prisustvo borne kiseline i kalcijuma (Griggs et al., 1971). Iako su definisane hranljive podloge za naklijavanje polena velikog broja kulturnih biljaka, još ne postoji usaglašen stav o optimalnom sadržaju podloge za
naklijavanje polena oraha. U različitim ogledima, optimalan sadržaj agara u
podlozi iznosio je od 0,65% (Luza i Polito, 1985) do1% (Galletta, 1983;Parihar i Bajpai, 1992), sadržaj saharoze od 10% (Wu et al., 2008) do 20% (Luza i Polito, 1985), sadržaj borne kiseline od 10 ppm (Wu et al., 2008) do 200 ppm (Sağlam i Gülcan, 1995) i sadržaj kalcijum hlorida od 40 ppm (Wu et al., 2008) do 111 ppm
(Cerović et al., 1992).
Cilj ovog rada je utvrđivanje optimalnog odnosa agara, saharoze, borne kiseline i kalcijum hlorida u podlozi za naklijavanje polena običnog oraha.
Materijal i metode
Istraživanja su vršena u proleće 2012. godine. Za ispitivanje je korišćen polen
nemačke sorte Gajzenhajmski 286 (G-286), sakupljen u privatnom zasadu oraha u
selu Lazac, koje se nalazi u blizini Kraljeva. Sakupljanje polena je vršeno između osam i deset časova ujutro, u vreme kada rese počinju da praše. Uzorci resa su uzeti sa više stabala, iz različitih delova krošnje. U laboratorijskim uslovima rese su ostavljene tri do četiri časa na crnom papiru da oslobode polen.
Naklijavanje polena vršeno je u Petri posudama prečnika 35 mm, sa po 3 ml podloge za naklijavanje pripremljene na bazi agara. Pored agara, u podlogu su
dodati saharoza, borna kiselina i kalcijum hlorid. Ogled je izveden kao četvoro
U skladu sa preporukama koje je dao Taylor (1972), pre zasejavanja polena Petri posude sa hranljivim supstratom držane su 24 časa na temperatuuri 4°C da
agar dovoljno očvrsne. Time se sprečava da polen pri zasejavanju preduboko
potone u supstrat, što bi moglo da oteža klijanje ili da dovede do pucanja polenoviih cevi usled prevelike hidratacije. Zasejavanje polena vršeno je finom
četkicom, sa ciljem da se postigne što ujednačeniji raspored polenovih zrna po supstratu. Na značaj ravnomernog rasporeda polena na supstratu skrenuli su pažnju Giulivo i Ramina (1974), otkrivši da je klijavost polena bila veća na mestima gde
su polenova zrna bila gušće grupisana. Inkubacija je vršena 24 časa, u mraku, na temperaturi od 22°C. Po završetku inkubacije, Petri posude sa naklijalim polenom prenete su u komoru za zamrzavanje sa temperaturom od -18°C, radi zaustavljanja
rasta polenovih cevi i čuvanja materijala do momenta dalje obrade. Jedan dan pre
planiranog posmatranja pod mikroskopom, Petri posude su iz komore za zamrzavanje prenesene u frižider na 4°C, radi odmrzavanja, kao što su to opisali Hedhly et al. (2005).
Posude sa zasejanim polenom posmatrane su pod svetlosnim mikroskopom sa
uvećanjem od 100 puta, radi prebrojavanja klijalih i neklijalih polenovih zrna.
Polen je smatran klijalim ako je dužina polenove cevi bila veća od prečnika polenovog zrna. Po svakoj Petri posudi posmatrano je 15 slučajno odabranih vidnih polja iz različitih delova posude. Svako vidno polje sadržalo je prosečno 20-50 polenovih zrna i smatrano je jednim ponavljanjem. Po jednoj Petri posudi posmatrano je oko 400-600 polenovih zrna.
Dobijeni podaci su obrađeni statistički, metodom analize varijanse, a testiranje razlika između srednjih vrednosti utvrđeno je pomoću Takijevog (Tukey) testa za
verovatnoću 0,05.
Rezultati i diskusija
Ukupna prosečna klijavost polena sorte G-286 na svim ispitivanim
kombinacijama hranljivih podloga iznosila je 6,8%. Najveća klijavost (27,8%) utvrđena je na podlozi koja je sadržala 0,8% agara, 15% saharoze, 600 ppm borne
kiseline i 50 ppm kalcijum hlorida. Analiza varijanse eksperimentalnih podataka
pokazala je statistički značajan uticaj koncentracije saharoze, borne kiseline i
kalcijum hlorida na klijavost polena oraha sorte G-286 (tabela 1), a uočeni su i
značajni interakcijski efekti između različitih komponenti hranljive podloge.
Uticaj agara
Koncentracija agara nije imala statistički značajan uticaj na klijavost polena
podloga sa 0,65% agara bila najpogodnija za naklijavanje polena 21 testirane sorte
oraha, Cerović et al. (1992) ustanovili su najbolju klijavost polena oraha na podlozi
koja sadrži 0,75% agara. Galletta (1983) iznosi podatak da za naklijavanje polena oraha najviše odgovara podloga sa 1% agara. Luza i Polito (1985) smatraju da
sadržaj agara u hranljivoj podlozi predstavlja značajan faktor u obezbeđivanju
neophodnih uslova za dobru hidrataciju i klijanje polena oraha.
Tabela 1. Uticaj agara, saharoze, borne kiseline i kalcijum hlorida na klijanje polena in vitro sorte oraha G-286.
Table 1. Effect of agar, boric acid, sucrose and calcium chloride on in vitro pollen
germination of the walnut cultivar ‘G-286’.
Sastojak/Ingredient Koncentracija/Concentration Klijavost/Germination (%)
Agar (A) 0,6% 6,9 a
0,8% 6,8 a
H3BO3 (B)
0 ppm 2,4 a
300 ppm 8,6 b
600 ppm 9,6 b
CaCl2 (C)
0 ppm 6,0 a
50 ppm 8,8 b
100 ppm 5,7 a
Saharoza/Sucrose (D)
10% 5,6 a
15% 8,7 b
20% 6,2 a
Prosek/Average 6,8
ANOVA
Faktor/Factor p
Agar (A) 0,706
H3BO3 (B) 0,000
CaCl2 (C) 0,000
Saharoza/Sucrose (D) 0,000
A × B 0,718
A × C 0,014
A × D 0,760
B × C 0,259
B × D 0,022
C × D 0,000
A × B × C 0,209
A × B × D 0,075
A × C × D 0,431
B × C × D 0,000
A × B × C × D 0,635
Srednje vrednosti označene istim slovom unutar kolone ne razlikuju se statistički značajno prema Takijevom testu za P≤0,05.
Mean values followed by the same letter within a column do not differ significantly according to
Uticaj borne kiseline
Kod hranljivih podloga koje su sadržale bornu kiselinu zabeležena je značajno veća klijavost polena nego kod podloga bez nje. Klijavost polena na podlogama sa
600 ppm borne kiseline nije bila značajno veća u odnosu na podloge sa 300 ppm.
Prema Wu et al. (2008) optimalna hranljiva podloga za sortu Yunxin sadržala je 10
ppm borne kiseline, dok Cerović et al. (1992) navode da dodavanje borne kiseline
u hranljivu podlogu nije ispoljilo značajan pozitivan efekat na klijavost polena šest ispitivanih sorti.
U našem ogledu dodavanje borne kiseline podlogama sa 15% saharoze imalo
je značajno veći pozitivan efekat na klijavost polena nego kada je borna kiselina dodata podlogama sa 10% i 20% saharoze (slika 1-b). Prema Pfahleru (1967) bor
reaguje sa saharozom, stvarajući saharozno-boratni kompleks, koji omogućava brže
aktiviranje šećera na membranama. Bor ima važnu ulogu u sintezi pektina, što predstavlja jednu od neophodnih komponenti rasta polenove cevi (Richards, 1986).
Uticaj kalcijum hlorida
Klijavost polena na podlogama koje su sadržale 50 ppm kalcijum hlorida
značajno je bila veća nego na podlogama sa 100 ppm kalcijum hlorida i podlogama
bez njega. Između dve poslednje navedene varijante nisu utvrđene značajne razlike
u klijavosti polena. Wu et al. (2008) navode da je u njihovim ogledima optimalna koncentracija kalcijum hlorida za klijanje polena sorte Yunxin iznosila 40 ppm.
Naša istraživanja su otkrila postojanje statistički značajnih interakcija koncentracije kalcijum hlorida u podlozi sa koncentracijom agara i koncentracijom saharoze, kao i vrlo značajne interakcije između koncentracija kalcijum hlorida, saharoze i borne kiseline.
Povećanje koncentracije agara sa 0,6% na 0,8% kod podloga bez kalcijum hlorida imalo je za posledicu smanjenje klijavosti polena, dok je kod podloga sa kalcijum hloridom povećanje koncentracija agara povećalo klijavost polena.
Povećanje sadržaja saharoze sa 10% na 15% kod podloga sa 100 ppm kalcijum hlorida imalo je za posledicu sporiji porast klijavosti polena nego kod podloga sa nižim sadržajem kalcijum hlorida. Kada je količina saharoze povećana sa 15% na 20%, na podlogama koje su sadržale kalcijum hlorid došlo je do drastičnog smanjenja klijavosti, dok je na podlogama u kojima nije dodat kalcijum hlorid klijavost polena bila više nego duplirana (slika 1-c).
Slika 1. Uticaj interakcija između koncentracija agara, saharoze, borne kiseline i kalcijum hlorida u hranljivoj podlozi na klijavost polena in vitro sorte oraha G-286: a) borna kiselina × saharoza; b) agar × kalcijum hlorid; c) kalcijum hlorid × saharoza; d) borna kiselina × kalcijum hlorid (saharoza 10%); e) borna kiselina × kalcijum hlorid (saharoza 15%); borna kiselina × kalcijum hlorid (saharoza 20%). Figure 1. Effects of some interactions among agar, sucrose, boric acid and calcium chloride in the germination medium on pollen germination in vitro of the walnut
cultivar ‘G-286’: a) boric acid × sucrose; b) agar × calcium chloride; c) calcium
Osmotska ravnoteža između podloge i citoplazme polenovog zrna presudna je
za integritet polenovog zrna. Ona može da bude uspostavljena pravilnim odnosom koncentracija saharoze i materija kao što su borna kiselina i kalcijum. Višak ili
nedostatak bilo koje od ovih materija može da spreči ili prekine klijanje polenovog
zrna (Silva et al., 1999).
Zaključak
Sadržaj saharoze, borne kiseline i kalcijum hlorida u hranljivoj podlozi uticao
je značajno na klijavost polena sorte oraha G-286. Interakcije između koncentracija agara i kalcijum hlorida, borne kiseline i saharoze, kalcijum hlorida i saharoze, kao i borne kiseline, kalcijum hlorida i saharoze bile su značajne. Najveća klijavost polena (27,8%) utvrđena je na podlozi koja je sadržala 0,8% agara, 15% saharoze, 600 ppm borne kiseline i 50 ppm kalcijum hlorida.
Literatura
Cerović, S., Korać, M., Ninić-Todorović, J. (1992): Klijavost i čuvanje polena domaćeg oraha (Juglans regiaL.). Jugoslovensko Voćarstvo 26:17-22.
Dantas, A.C.D.M., Peixoto, M.L., Nodari, R.O., Guerra, M.P. (2005): Viabilidade do pólen e desenvolvimento do tubo polínico em macieira (Malus spp). Revista Brasileira de Fruticultura 27:356-359.
Galletta, G.J. 1983. Pollen and seed management. In: Moore J.N., Janick J. (Eds.), Methods in fruit breeding. Purdue University Press, West Lafayette, Indiana, USA, pp. 23-47.
Giulivo, C., Ramina, A. (1974): Effetto di massa ed azione del calcio sulla germinazione del polline di alcune specie arboree da frutto. Rivista Ortoflorofrutticoltura Italiana 58:3-13.
Griggs, W.H., Forde, H.L., Iwakiri, B.T., Asay, R.N. (1971): Effect of subfreezing temperature on the viability of Persian walnut pollen. HortScience 6:235-237.
Hedhly, A., Hormaza, J.I., Herrero, M. (2005): Influence of genotype-temperature interaction on pollen performance. Journal of Experimental Biology18:1494-1502.
Kearns, C.A., Inouye, D.W. (1993): Techniques for pollination biologists. University Press of Colorado, Niwot, Colorado, USA, p. 98.
Luza, J.G., Polito, V.S. (1985): In vitro germination and storage of English walnut pollen. Scientia Horticulturae 27:303-316.
Mišić, P. (2002): Specijalno oplemenjivanje voćaka. Partenon, Institut za istraživanja u poljoprivredi
„Srbija”, Beograd.
Parihar, M.C., Bajpai, P.N. (1992): Studies on pollen morphology, viability and germination in walnut (Juglans regia L.). Indian Journal of Agricultural Research 26(1):30-34.
Pfahler, P.L. (1967): In vitro germination and pollen tube growth of maize (Zea mays L.) pollen: I. Calcium and boron effects. Canadian Journal of Botany 45(6):839-845.
Polito, V.S. (1998): Floral biology: flower structure, development, and pollination. In: Ramos, D.E. (Ed.), Walnut production manual. University of California, Oakland, California, USA, pp. 127-132.
Richards, A.J.(1986): Plant breeding systems. George Allen & Unwin, London, England.
Sağlam, H., Gülcan, R. (1995): Bazi meyve türlerinde çiçek tozu saklama yöntemleri Turkiye II.
Shivanna, K.R., Linskens, H.F., Cresti, M. (1991): Pollen viability and pollen vigor. Theoretical and Applied Genetics 81:38-42.
Silva, M.M., Brucner, C.H., Picanço, M., Cruz, C.D. (1999): Fatores que afetam a germinação do grão de pólen do maracujá: meios de cultura e tipos de agrotóxicos. Pesquisa Agropecuária Brasileira 34:347-352.
Stanley, R.G., Linskens, H.F. (1974): Pollen: biology, biochemistry, management. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.
Sütyemez, M. (2007): Determination of pollen production and quality of some local and foreign walnut genotypes in Turkey. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 3:109-114.
Taylor, R.M. (1972): Germination of cotton (Gossypium hirsutum L.) pollen on the artificial medium. Crop Science 12:243-244.
Taylor, P.L., Hepler, P.K. (1997): Pollen germination and tube growth. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48:461-491.
Tuinstra, M.R., Wedel, J. (2000): Estimation of pollen viability in grain sorghum. Crop Science 40:968-970.
Wu, K.Z., Xiao, Q.W., Liao, Y.H., Zhou, L.Y., Pu, G.L. (2008): Study on culture medium for walnut pollen germination in vitro. Journal of Fruit Science6:941-945.
POLLEN GERMINATION OF THE WALNUT CULTIVAR
‛GEISENHEIM 286’ ON DIFFERENT CULTURE MEDIA
Dragan M. Janković1*, Slađana J. Janković1, Svetlana M. Paunović2 ,
Bratislav M. Ćirković1and Zoran M. Jovanović1
1
University of Priština, Faculty of Agriculture, Kopaonička bb, 38228 Lešak, Kosovo and Metohia, Serbia
2
Fruit Research Institute, Kralja Petra 19, 32000 Čačak, Serbia
A b s t r a c t
Pollen of the walnut cultivar ‛Geisenheim 286’ was cultured on germination media containing all possible combinations of sucrose (10, 15 and 20%); agar (0.6 and 0.8%); boric acid (0, 300 and 600 ppm) and calcium chloride (0, 50 and 100 ppm). A total of 54 different combinations of germination media were tested in an attempt to establish a suitable culture media for studying in vitro pollen germinability of the walnut. Significant differences in pollen germination were observed in response to changing concentrations of sucrose, boric acid and calcium chloride, but germination was not affected by changes in agar concentration. The interactions of the concentrations of agar and calcium chloride, boric acid and sucrose, calcium chloride and sucrose, as well as those of boric acid, calcium chloride and sucrose were significant. Pollen germination was maximized (27.8%) when the germination medium contained 0.8% of agar, 15% of sucrose, 600 ppm of boric acidand 50 ppmofcalcium chloride.
Key words: Juglans regia, pollen, in vitro, agar, sucrose, boric acid, calcium chloride.
Received: January 12, 2014 Accepted: February 8, 2014
*
Corresponding author: e-mail: draganjankovickv@gmail.com
