Efeito do Lodo de Esgoto na Indução de Supressividade
in vitro a Phytophthora nicotianae*
C a r o lin a L e o n i1** & R a q u e l G h in i2**
'S ecció n P rotección Vegetal, E stación E xperim ental Las B rujas, Instituto N acional de Investigación A gropecuaria, C E P 90200, R incón dei C olorado, C anelones, U ruguay, fax: 5982 3677609, e-m ail: cleo n i@ in ia.o rg .uy ; 2E nibrapa
M eio A m biente, Cx. P ostal 69, C E P 13.820-000, Jag u ariú n a, SP, e-m ail: raquel@ cn p m a.em b rap a.b r
(Aceito para publicação em 26/09/2002)
A utor para correspondência: C arolina Leoni
LEONI, C. & GHINI, R. Efeito do lodo de esgoto na indução de supressividade in vitro a Phytophthora nicotianae. Fitopatologia Brasileira 28:067-075. 2003.
RESUM O Uma alternativa de manejo das doenças causadas por
Phytophthora spp. é o uso de m atéria orgânica. No presente
trabalho foi avaliada a potencialidade do lodo de esgoto na indução de supressividade in vitro a P. nicotianae. O efeito do lodo de esgoto incorporado ao solo na sobrevivência de P.
nicotianae foi avaliado mediante um experimento fatorial com
dois fatores: doses de lodo de esgoto (0, 10, 20 e 40% p/p) e concentrações de inóculo [0, 10 ou 20 g de grãos de trigo ( Triticum
aestivum) colonizados k g 1]. Aos 21 dias, quando aumentaram as
doses de lodo de esgoto, a sobrevivência de P. nicotianae e os pHs das m isturas dim inuíram , e as condutividades elétricas (CE) aum entaram. As correlações entre a CE e a sobrevivência do patógeno foram negativas e significativas (P>0,05). Para estudar o efeito dos compostos quimicos envolvidos na supressividade,
foram obtidos extratos em água, H ,S 0 4 2N e KOH 0,4N de misturas de areia - lodo de esgoto (20% p/p), e foram acrescentados ao meio de cultura e seu efeito avaliado no crescimento das colônias de P. nicotianae. O extrato ácido (H ,S 0 4 2N) do tratamento com 20% de lodo de esgoto inibiu significativam ente (P>0,05) o crescimento da colônia do patógeno. O efeito biológico foi estudado mediante isolamento de microrganismos em meio de cultura e seleção por antagonismo. No bioensaio com plântulas de alfafa
(Medicago sativa) destacaram-se os isolados F 9.1 (Aspergillus sp.)
e A12.1 (actinomiceto, não identificado); e no teste de culturas pareadas destacou-se um Trichoderma sp. e dois actinomicetos por antibiose, e um Trichoderma sp. e três Aspergillus sp. por hiperparasitism o.
Palavras-chave adicionais: matéria orgânica, biossólidos. ABSTRACT
Effect o f sewage sludge in vitro to suppress Phytophthora
nicotianae
Soil organic matter amendments may provide an alternative management practice for soil diseases caused by Phytophthora spp. In this paper we have evaluated the effectiveness o f residential sewage sludge to suppress P. nicotianae under laboratory conditions. The effect o f sewage sludge on P. nicotianae survival was evaluated by two experimental factors: sewage sludge doses (0, 10, 20 and 40% w/w) and inoculum level [0, 10 and 20 g infested wheat ( Triticum
aestivum) seeds per kg o f soil]. After maintaining the mixtures (soil -
sewage sludge - inoculum) at room tem perature for 21 days, treatments with higher organic matter had lower .P nicotianae survival, pH of the mixture, and higher electric conductivity (EC). Correlations
between pathogen survival and EC were negative and significant (P>0,05). In order to evaluate the chemical effects o f the sewage sludge on P. nicotianae, water, H ,S 04 2N e KOH 0,4N extracts were obtained from sand - sewage sludge (20% w/w) mixtures and each one o f them was added to culture medium. The H ,S 04 2N extract significantly (P>0,05) inhibited colony growth. The biological effect of the sewage sludge was evaluated by isolating microbial antagonists and testing them against P. nicotianae by bioassay and plate techniques. The bioassay technique selected one fungus (isolate F9.1, identified as
Aspeigillus sp.) and one actinomycete (isolate A12.1, not identified).
The plate technique selected one Trichodenna sp. and two actinomycetes for their antibiosis to P. nicotianae, and one Trichodenna sp. and three
Aspergillus sp. for their hyper-parasitism to the pathogen.
INTRODUÇÃO
E ntre as doenças fúngicas que afetam os citros (Citrus
spp.), o to m bam ento, a gom ose e a p odridão do pé e raízes ca u sa d as po r Phytophthora spp. estão d en tre as de m a io r * Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, a ser apresentada
à Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo. Apoio FAPESP
** Bolsista do CNPq
im p o r tâ n c ia e c o n ô m ic a o c o rr e n d o em to d a s as re g iõ e s produtoras. N o B rasil, as espécies de Phytophthora p red o m i n a n te s são P. n ico tia n a e B re d a de H aan (1 8 9 6 ) (sin . P. parasitica D astur (1913)) e P. citrophthora (R. E. Sm ith and
E. H. Sm ith) L eonian (1925) (Feichtenberger, 2001). O m anejo das doenças causadas p o r Phytophthora spp. inclui um conjunto de m edidas p reventivas e curativas. D entre elas d estacam -se as m edidas prev en tiv as nos viveiros para o btenção de m udas sadias; uso de porta-en x erto s resistentes;
C. Leoni & R. Ghini e m edidas de controle nos pom ares, com o a escolha de áreas
desfavoráveis à doença, adoção de práticas de co nservação de s o lo , u so d e a d u b o s o rg â n ic o s q u e f a v o re ç a m u m a m ic ro b io ta an tag ô n ic a ao pató g en o , m anejo da irrig ação e d ren ag em , m o n ito ra m en to s freq ü en tes e co n tro le q u ím ico (E rw in & R ibeiro, 1996; Feichtenberger, 2001). O controle quím ico pode ser m uito eficiente, porém , apesar da dificuldade de desenvolvim ento de resistência de fitopatógenos infectantes de raízes a fungicidas, h á relatos de resistência de P. parasitica
a m e talax il (F e rrin & K ab a sh im a , 1991). E sse p ro b lem a, asso cia d o aos p o ssív eis im pactos no ag ro eco ssistem a, tem levado à b u sc a de alternativas ao controle quím ico.
U m a a lte rn a tiv a é o uso de m a téria o rg â n ic a tan to in c o rp o rad a ao solo, q uanto em p re g ad a co m o c o b e rtu ra e com o veículo de agentes de biocontrole, a qual contribui no controle d os pató g en o s pelo estím ulo da atividade m icrobiana e m elhora das características físicas e quím icas do solo (C asale
et al., 1995; Erw in & R ibeiro, 1996; H oitink & B ohem , 1999). D iv e rs o s e s tu d o s têm sid o re a liz a d o s p a ra o m a n e jo de
Phytophthora spp. com a aplicação ao solo de inúm eras fontes de m a téria o rg ân ica (L u m sd en et al., 1983; C a sale et al.,
1995; E rw in & R ibeiro, 1996; W idm er et al., 1998; H oitink & B oehm , 1999).
A tu a lm e n te , u m a d as fo n te s de m a té ria o rg â n ic a d isp o n ív el em q u an tid ad e s cre sce n tes, é o lodo de esg o to p ro v en ien te das E stações de T ratam ento de E sgotos - ETEs. O lodo constitui um insum o de valor para a ag ricultura, pois fornece ao solo m atéria orgânica, m acro e m icro n u trien tes para as plantas, atua com o condicionador de solo e fertilizante, e d e s s a fo rm a , p o d e c o n trib u ir p a ra a o b te n ç ã o de u m a ag ricu ltu ra m ais sustentável (A ndreoli & P egorini, 2000).
O p resente trabalho teve o objetivo de avaliar os efeitos da in co rp o ração do lodo de esgoto ao solo na in d u ção de su p ressiv id ad e a P. nicotianae em condições de laboratório.
MATERIAL E M ÉTODOS
Isolado de Phytophthora nicotianae e produção de inóculo O iso lad o IA C 01/95 de P. nicotianae utilizad o foi fo rn e cid o p elo C e n tro de C itric u ltu ra “ S y lv io M o re ira ” - Instituto A g ronôm ico de C am pinas (C C S M - IA C ). O isolado foi m antido em ág u a d estilada esterilizada em tem p eratu ra am biente e ausência de luz até sua utilização.
O inóculo foi prod u zid o em grãos de trigo ( Triticum aestivum L.) au toclavados em sacos de p o lip ro p ilen o ac res cidos com o patógeno. N o prim eiro dia, sacos de polipropileno de 30 x 4 0 cm com 350 g de grãos de trigo e 200 m l de água d e s tila d a fo ra m a u to c la v a d o s a 121 °C , p o r 4 0 m in . N o segundo dia, foram acrescentados aos sacos m ais 150 ml de á g u a d e s t i l a d a e , f o r a m f e c h a d o s h e r m e t i c a m e n t e e auto clav ad o s p o r m ais 20 m in a 121 °C. N o terceiro dia, sob co n d içõ es de assepsia, cada saco recebeu 40 d iscos de 5 m m de d iâm etro de m eio de cultura [50 g cenoura (Daucus carotae
L .) co z id a e tritu rad a no liquificador; 10 g de dextrose; 16 g de ágar; água d estilada até co m pletar 1 litro) contendo m icélio do patógeno das bordas de um a colônia com sete dias de idade.
F inalm ente, os sacos foram incubados p o r q u atro o u cinco sem anas, em tem p eratu ra am biente, sendo feitas agitações q u an d o n e c e ssá ria s para h o m o g e n eiz ar a c o lo n iz a ç ã o dos grãos.
Lodo de esgoto e solo
O lodo de esgoto foi obtido da E stação de T ratam ento de E sgoto (E T E ) de F ranca, SR Esse lodo é o p ro d u to final do tratam ento biológico dos esgotos residenciais, e tem baixos teores de m etais pesados (Tabela 1).
O L atossolo v erm elho am arelo fase argilosa foi obtido no c a m p o e x p e r im e n t a l d a E m b r a p a M e io A m b ie n te (Jag u ariú n a, SP), com 25 g d m '2 de m atéria orgânica e pH em C a C l2 de 5,1.
Efeito do lodo de esgoto na sobrevivência in vitro de P.
nicotianae
O lo d o de e s g o to fo i m is tu r a d o ao s o lo ú m id o prev iam en te d esin festad o em forno de m icroondas de 900 W de p o tê n cia (600 g de solo po r 6 m in), nas proporções de 0, 10, 20 e 40 % p/p. C ad a um a das m isturas de solo - lodo de esgoto recebeu o equiv alen te a 0, 10 ou 20 g de inóculo de P. n ico tia n a e k g 1. A s m is tu ra s fo ra m c o lo c a d a s em sa co s plástico s de 30 x 40 cm e 100 (.im de espessura, fechados (m as não herm eticam en te) e m antidos a 27 °C ±2. A pós 21 dias, os sacos foram abertos e a sobrevivência de P. nicotianae
foi av a lia d a m ed ian te o teste de iscas de fo lh as de citros, d eterm in a n d o -se a rec u p eraçã o do p ató g en o (porcentagem
TABELA 1 - Análise química do lodo de esgoto empregado nos diferentes experim entos
A tributo Valores pH em água 6,4 Umidade (65 °C) 52,1 C (g k g 1) 374,4 N Kjeldal (g kg'1) 50,8 N-anioniacal (pg g'1) 119,5 N -Nitrato-Nitrito ((.igg1) 54,8 P (g kg'1) 21,3 K (g kg'1) 0,99 Ca (g kg'1) 16,8 Mg (g kg'1) 2,5 S (g k g 1) 13,3 B (mg kg'1) 7,1 Cu (mg kg"1) 359,2 Fe (mg kg'1) 31706 Mn (mg k g 1) 267,4 Zn (mg kg'1) 1590 Mo (mg kg'1) <1 Al (mg k g 1) 33550 Na (g kg'1) 0,6 Ar (mg kg"1) <1 Cd (mg k g 1) 2 Cr (mg kg'1) 1325 Hg (mg k g 1) <1 Ni (mg kg"1) 74,7 Pb (mg k g 1) 118,8 Se (mg k g 1) 0
Efeito do lodo de esgoto na indução de supressividade. de isc as co m z o o s p o râ n g io s n as b o rd a s) e o n ú m e ro de
zoosporângios form ados nas bordas das iscas. A condutividade elétrica e o pH das m isturas foram tam bém determ inados. O experim ento foi repetido duas vezes.
O teste de isca de folhas de citros utilizado foi m o d i ficado a partir de G rim m & A lex an d er (1973). Em p lacas de Petri plásticas de 9 cm de diâm etro, p reviam ente desinfestadas com álcool 70°, foram colocados 5 g da m istura solo - lodo de esgoto, 30 ml de água d estilada e 20 fragm entos de folhas de citros de 3 x 3 m m d esinfestados com álcool 70°. A s placas foram m antidas a 27 °C ±2 e luz fluorescente continua por 48 h, quando realizou-se a avaliação das iscas. Para avaliação, as iscas foram observadas no m icroscópio óptico (aum ento de 100 vezes). As folhas em pregadas no teste foram obtidas de p la n ta s de la ra n ja q u e n ão tin h a m re c e b id o n e n h u m tratam ento quím ico.
Para determ in ar o pH e a condutividade elétrica, num E rlenm eyer de 100 m l de capacidade foram colocados 10 g da m istura solo - lodo de esgoto e 25 ml de água d estilada d eionizada. Foi rea liza d a ag itação a 120 rpm po r 15 m in. A pós deixar em repouso po r 30 m in, procedeu-se a leitura do pH e da condutividade elétrica do sobrenadante. P ara cada repetição foram feitas duas réplicas e três leituras de cada.
O s tratam e n to s se co n stitu íra m da c o m b in aç ão dos fatores doses de lodo (0, 1 0 ,2 0 e 4 0% p/p) e níveis de inóculo (0, 10 ou 20 g k g 1), com cinco repetições. Para a análise estatística, os dados de recuperação do patógeno (porcentagem de iscas com zoosporângios nas b ordas) foram tran sfo rm ad o s em arco sen o V x /1 0 0 . A s c o rre la ç õ e s e n tre as v a riá v e is recuperação do p atógeno, condutividade elétrica e pH foram estabelecidas.
Efeito dos extratos do lodo de esgoto no crescim ento in
vitro de P. nicotianae
O s e x tra to s fo ra m o b tid o s s e g u n d o o m é to d o de W idm er et al. (1998) m odificado. F oram feitas m isturas de 80 g de areia (lavada, esterilizad a e seca) e 20 g de lodo de esgoto (proporção de 20% p/p), com 100 ml da solução de H jS 0 4 2N , o u K O H 0,4 N ou água b idestilada esterilizada. C om o testem unha, foi em pregada areia (100 g) com 100 ml de cada um a das soluções. O s E rlenm eyers de 250 ml de cap a cidade contendo as m isturas areia - lodo com as soluções foram agitados m anualm ente, e a seguir, d eixou-se à tem p eratu ra am biente. A pós 6 h, filtraram -se as m istu ra s em algo d ão , seguido de filtragem a vácuo com papel de filtro W hatm an 41 e m em brana M illipore 0,22 (im de porosidade. O pH de cada um dos extratos o b tidos foi ajustado para valores entre 5,5 - 6 ,0 co m so lu ç õ e s de K O H 10 N ou H 2S 0 4 12 M . F inalm ente, p rep aro u -se m eio de cultura de cen o u ra contendo os d if e r e n t e s e x tr a to s n a p r o p o rç ã o 9 :1 , 50 m g l ' 1 de rifam p icin a e 50 m g l’1 de am picilina, e 15 m l do m eio foram v ertidos em p lacas de Petri de 9 cm de diâm etro. D iscos de 5 m m de d iâ m etro de m eio de cu ltu ra co n ten d o m ic élio do p ató g en o com sete dias de idade, foram transferidos para as p la ca s q u e foram m antidas a 27 °C ± 2 e lu z flu o re sc en te contínua. C om o testem u n h a u tiliza ra m -se p lacas co n ten d o
m eio de cultura com antibióticos e sem extratos. O efeito dos ex tra to s foi a v a lia d o m e d in d o -se d o is d iâ m e tro s p e rp e n dicu lares das colônias, a cada dois dias. A pós n ove dias de incubação, a área abaixo a cu rv a do crescim ento das colônias (A A C C ) foi calculada. O d elineam ento experim ental foi de p arcelas in teiram ente casualizadas, com oito repetições. Isolam ento de antagonistas a P. nicotianae
O iso lam en to dos m icro rg an ism o s do solo foi feito m ediante diluição seriada e plaqueam ento em m eios seletivos. T rinta dias após incorporado o lodo de esgoto nas parcelas no cam po, foram coletadas am ostras do solo dos tratam entos com 0; 5; 7,5; 10 e 15% v/v de lodo de esgoto e das parcelas com adubação m ineral, com e sem inóculo, resultando num total de 12 am ostras com postas. A s am ostras de solo foram m antidas po r dois dias a 25 °C, até sua utilização.
Para o isolam ento dos m icrorganism os foram p rep a radas susp en sõ es solo - água nas diluições 10 ', 10'2, 10 •1e
10'4- e 100 |_il de suspensão foram transferidos para m eio de cultura. P ara o isolam ento de b actérias foi em pregado o m eio de cultura N u trien te ágar - N A (N A O xoid, 28 g 1 ') e as d iluições 10'3e 10'4. Para o isolam ento de actinom icetos foi em p reg ad o o m eio A m ido caseína - A C (10 g am ido; 0,3 g de c a s e ín a ; 2 g K N 0 3; 2 g N a C l; 2 g K , H P 0 4; 0 ,0 5 g M g S 0 4.7 H 20 ; 0,01 g F e S 0 4. 7 H 20 ; 16 g^ágar e 11 ág u a destilada) e as diluições 10'3e 10'4. Para o isolam ento de fungos foi e m p re g a d o o M e io de M a rtin (1 g K 2H P 0 4 ; 0 ,5 g M g S 0 4.7 H ,0 ; 5 g peptona; 10 g dextrose; 0,03 g R osa de B engala; 16 g ágar e 11 água d estilada) e as diluições 10'2e 10o . F oram feitas três repetições para cada com binação m eio - d ilu iç ã o , e as p la c a s f o ra m m a n tid a s a 25 °C a té o cre scim en to das colônias. F oram co n tad as as co lô n ias po r placa, após dois, três ou seis dias para bactérias, fungos e actinom icetos, respectivam ente; e foi feita um a seleção po r m orfo lo g ia (tam anho, cor e crescim ento) das colônias a serem transferidas a tubos de ensaio contendo 5 m l de m eio batata d ex tro se ágar (B D A ) e p reservadas a 5 °C até avaliação do an tag o n ism o ao patógeno.
Avaliação de antagonistas: bioensaio
F oram testados 35 isolados de bactérias, 32 de ac tin o m icetos e 52 de fungos, segundo o bio en saio descrito po r H an d e lsm a n et al. (1991) m o dificado. S em entes de alfa fa
(M ed ica g o sa tiva L .) p re v ia m e n te d e s in fe s ta d a s fo ra m colocadas p ara g erm in ar em caixas contendo papel de g e r m inação um edecido. A pós quatro ou cinco dias, as plântulas foram tran sferid as aos co m partim entos das p lacas de cultura de c é lu la s (C o rn in g co m 24 c o m p a rtim e n to s ). E m c a d a c o m p a rtim e n to fo ra m c o lo c a d o s 1 m l de á g u a d e s tila d a esterilizada, um a p lântula de alfafa, um disco de 5 m m de d iâm etro m eio de cultura com m icélio de P. nicotianae e um d is c o d e m e io d e c u ltu r a c o n te n d o in ó c u lo d o fu n g o , actin o m iceto ou b actéria a ser testado quanto à sua p o te n c ia lidade com o antagonista. A s testem unhas foram constituídas p o r p lâ n tu la s de alfafa em com p artim en to s co n ten d o água esterilizada, e p lântulas em água esterilizad a e P. nicotianae.
C. Leoni & R. Ghini A s p la c a s fo ra m m a n tid a s p o r trê s d ia s a te m p e r a tu ra
am biente. A avaliação foi feita sob m icroscópio óptico, onde as raízes das p lântulas foram avaliadas pela p resença ou não de m icélio e zoosporângios de P. nicotianae. Para cada isolado ( fu n g o , b a c té r ia ou a c tin o m ic e to ) fo ra m fe ita s q u a tro repetições.
O c re sc im e n to dos m ic ro rg a n ism o s foi o b tid o em p lacas a te m p eratu ra am biente e com diferentes m eios: as bactérias em NA e incubadas po r 48 h; os fungos em BD A e incubados por um a sem ana e os actinom icetos em m eio A C e incubados po r um a sem ana.
P ara d eterm in a r a potencialid ad e de um isolado com o a n t a g o n i s t a , f o ra m f e it a s d u a s e s c a la s d e n o ta s q u e d isc rim in a ra m níveis de in festação com P. nicotianae das p lâ n tu la s de alfa fa c re sc e n d o na p re se n ç a dos d ife re n te s isolados. P ara a presença de zoosporângios as notas foram 0
= sem zo o sp o rân g io s, 1 = entre 1 e 5, 2 = entre 6 e 10; 3 = entre 11 e 50, e 4 = m ais de 5 1 . Para a p rese n ça de m icélio as notas foram 0 = sem m icclio, 1 = pouco, 2 = m édio, 3 = m uito (F igura 1).
A v a lia ç ã o d e a n ta g o n is ta s : te ste de c u ltu r a s p a r e a d a s F oram testados sete isolados de fungos, três de actino m icetos e dois de bactérias selecionados no bioensaio quanto ao p o te n cia l a n tag ô n ic o a P. nicotianae. A s co n d içõ e s de crescim en to dos m icrorganism os foram iguais as em pregadas no item anterior.
P ara o te ste em p la c a s Petri de 9 cm de diâm etro co n ten d o m eio BDA foram transferidos um disco de m eio de cultura de 5 m m de d iâm etro com m icélio de P. nicotianae
em pleno d esenvolvim ento e um disco de 5 m m de diâm etro de m eio de cultura com m icélio do fungo ou actinom iceto, ou
Z=0, M=0
F I G 1 - E sca la de n o ta s e m p re g a d a n a av a lia ç ã o d a p o te n c ia lid a d e d os isolados de fungos, a c tin o m i ce to s e b a c té r ia s q u a n to ao a n ta g o n is m o a P hytophthora n icotianae, pelo m é to d o de in fe sta ç ã o de p lâ n tu la s d e a lfa fa (M edicago sativa). P a r a a p re s e n ç a d e z o o s p o râ n g io s (Z) as n o ta s f o ra m 0= sem z o o s p o râ n g io s , 1= e n tre 1 e 5, 2= e n tre 6 e 10, 3= e n tr e 11 e 50, 4= m a is d e 50. P a r a a p re s e n ç a d e m icélio (M ) as n o ta s fo ra m 0= sem m icélio, 1= p o u co , 2= m éd io , 3= m u ito . A se ta in d ic a os pelos a b s o rv e n te s d a s ra íz e s d a s p lâ n tu la s de a lfa fa .
Efeito do lodo de esgoto na indução de supressividade. um a estria do crescim ento da b ac té ria selecionada. A s p lacas
foram m antidas a tem p eratu ra am b ien te até sua avaliação. F oram feitas três repetições p o r isolado. A avaliação foi feita quanto ao hiperparasitism o (crescim ento do antag o n ista sobre o m icélio do p atógeno) ou antib io se (inibição do crescim en to do p a tó g e n o ) .
Análises estatísticas
N o p rese n te trab a lh o , as an á lises e statístic as foram realizadas em pregando o p ac o te estatístico S A S for W indow s, V ersão 6.12 do S .A .S Institute, C ory N C , U S A
RESULTADOS
Efeito do lodo de esgoto na sobrevivência in vitro de P.
nicotianae
N as condições do laboratório, a sobrev iv ên cia de P. nicotianae foi m e n o r q u an d o as d o se s de lodo de e sg o to au m en taram nas diferentes m isturas solo - lodo de esgoto avaliadas, para os diferentes níveis de inóculo em pregados, indicando um possível efeito supressivo do lodo (F ig u ra 2 e T abela 2). O s valores de pH das m isturas d im inuíram quando os níveis de lodo em au sên cia de inóculo aum entaram ; m as na p rese n ça de inóculo, prim eiro au m entaram e depois dim i nuíram . Os valores de condutividade elétrica m ostraram u m a resp o sta positiva aos increm entos nos n íveis de lodo, in d ep en d en te da presença ou não do inóculo (F igura 3 e T abela 2).
O s coeficientes de co rrelação (r) da recu p eração do p ató g en o e o núm ero de zoosporângios p rese n tes nas bordas das iscas foram sig n ificativ o s ao 5% p ara a co n d u tiv id ad e elétrica, m as não p ara o pH . O s valores de r foram de - 0 ,4 9 0 p ara a porcentagem de recuperação e de -0 ,4 8 7 p ara o n úm ero de zoosporângios p o r b o rd a de isca.
Efeito dos extratos do lodo de esgoto no crescim ento in
vitro de P. nicotianae
D os extratos avaliados, o extrato ácido do tratam en to c o m 2 0 % d e lo d o d e e s g o to a p r e s e n to u u m a r e d u ç ã o sig n ific a tiv a n o c re sc im e n to da c o lô n ia de P. nicotianae
(Tabela 3).
Isolam ento de antagonistas a P. nicotianae.
O n ú m e ro m é d io de c o lô n ia s iso la d a s do so lo das parcelas do cam po foi da ordem de 106, 105 e 104 colônias p o r g r a m a d e s o lo p a r a b a c té ria s , a c tin o m ic e to s e fu n g o s , respectivam ente. O s tratam entos com e sem lodo tiv eram em m é d ia v a lo re s s e m e lh a n te s p a ra os d ife re n te s g ru p o s de m icro rg an ism o s isolados (Tabela 4).
Avaliação de antagonistas a P. nicotianae.
D o s iso la d o s te s ta d o s no b io e n s a io , só u m fu n g o (isolado F 9 .1, do g ênero Aspergillus\ obtid o das p arcelas com a d u b o m in e r a l e in o c u la d a s c o m P. n ic o tia n a e) e u m a c tin o m ice to (iso la d o A 12.1, n ão id e n tifica d o ; o b tid o das parcelas com 15% de lodo e in oculada) tiv e ram u m controle to ta l de P. nicotianae, sem elh an te à te ste m u n h a co m ág u a
A
F IG 2 - Sobrevivência de Phytophthora nicotianae avaliada por meio da porcentagem de recuperação em iscas de folhas de citros (C itrus spp.) e núm ero de zoosporângios por borda de isca, nas diferentes m isturas solo - lodo de esgoto, para os diferentes níveis de inóculo (0 10 e 20 - A - g kg-1 de m istura), sob condições de laboratório em dois experim entos (gráficos A e B, exp erim en to 1; gráficos C e D, experim ento 2).
C. Leoni & R. Ghini
TABELA 2 - Análise de variância e teste F para as variáveis sobrevivência de Phytophthora nicotianae avaliada por meio da porcentagem de recuperação em iscas de folhas de citros (Citrus spp.) e número de zoosporângios por borda de isca, pH e condutividade elétrica (CE) nas diferentes misturas solo - lodo de esgoto (0, 10, 20 e 40% p/p), para os diferentes níveis de inóculo (0, 10 e 20 g kg'1 de ____________ m istura), sob condições de laboratório em dois experim entos_________________________________
C ausa da variação
QM
GL R ecuperação ('/o) Zoosporângios po r b o rd a (N°) Experim ento 2
Exp. 1 Exp.2 Exp. 1 Exp.2 PH CE
Lodo 3 8749,8 * 4058,5 * 120,8 * 143,4 * 1,49 * 927405,4 * Inóculo 2 13061,5 * 4933,6 * 154,6 * 151,3 * 1,95* 168352,0 * Lodo x inóculo 6 2675,0 * 2400,8 * 38,9 * 69,5 * 0,72 * 32558,5 * Resíduo 36 224,7 67,3 1,9 1,7 0,0001 18,3 C V (%) 56,1 42,8 48,8 39,7 0,65 0,86 R2 0,86 0,94 0,91 0,95 0,99 0,99
* significativo pelo teste de F, ao nível de 1% de probabilidade.
Lodo de esgoto p/p (%)
FIG. 3 - Efeito do lodo de esgoto no pH em água e na con dutividade elétrica (CE) da solução das misturas solo - lodo de esgoto, nas diferentes misturas solo - lodo de esgoto, para os diferentes níveis de inóculo (0 10 e 20 - A - g kg'1 de m istura), sob
condições de laboratório, no experimento 2.
destilad a esterilizada, onde as plântulas de alfafa não ap resen ta ra m n em z o o s p o râ n g io s n em m ic élio . S ete iso la d o s de fungos, três de actinom icetes e dois de b actérias perm itiram o desenv o lv im en to de m icélio, m as não dos zoosporângios. A lg u n s isolados tiv eram um co m p o rtam en to se m elh an te à testem u n h a com água e P. nicotianae (Tabela 5).
D os isolados avaliados m ediante o teste de p aream ento de colônias, d estacaram -se cinco fungos e dois actinom icetos. U m fungo do gênero Trichoderma (isolado F 8.3/4; obtido das p arc ela s co m adubo m ineral e in o cu lad a) d estac o u -se p o r
antibiose com form ação de halo de inibição de 1 cm ; e os outros quatro, um Trichoderma sp. (isolado F 12.3; obtido das p arc ela s co m 15% de lodo e in oculada) e três Aspergillus
spp. (isolado F 8.10 obtido das parcelas co m adubo m ineral e inoculada; e isolados F 9 .1, F 11.1; obtidos das p arcelas com 5 e 10% d e lo d o e in o c u la d a s , r e s p e c t i v a m e n t e ) p o r hip erp arasitism o , com crescim ento m icelial recobrindo toda a placa em 72 h. O s dois actinom icetos (isolados A 2 .1 e A 12.1; o btid o das parcelas com adubo m ineral e sem inóculo, e com 1 5 % d e lo d o e i n o c u la d a , r e s p e c t i v a m e n t e ) ta m b é m d esen v o lv eram halos de inibição de 1 cm . O s isolados que n ã o in te r f e r ir a m n e m c o m o c r e s c im e n to n e m c o m a e sp o ru la çã o de P. nicotianae foram as b a c té ria s (iso lad o s B 10.6 e B 1 1 .1 ),u m a c tin o m ic e to ( is o la d o A 9 .7 ) e d o is fungos (F 10.4 e F IO .8).
DISCUSSÃO
A s u p r e s s iv id a d e a P. nicotianae fo i d ire ta m e n te p ro p o rcio n al à concen tração de lodo de esgoto incorporado no solo (F igura 2). E sses resultados são coincidentes com os o btidos p o r outros autores, tanto p ara o m anejo das doenças causadas p o r Phytophthora spp. C om o po r outros patógenos, e m d iv e rs a s c u ltu r a s (L u m sd e n et al., 1983; B e ttio l & K ru g n e r, 1984; L e w is et al., 1992; C a sa le e t.a l., 1995; W idm er et al., 1998; H oitink & B oehm , 1999).
D entre os fatores que p odem ex p lica r a supressividade a P. nicotianae, a p resen ça de com postos tóxicos devido aos p ro cesso s de decom posição da m atéria orgânica adicionada ao solo é u m a delas. E sses efeitos têm sido reportados por v ário s au to re s p ara d iv e rso s p ató g en o s, u sa n d o d iferen tes fontes de m atéria orgânica (H oitink et al., 1977; C asale et al., 1995; B lo k et al., 2000). N o p resen te trabalho, foram o b tid a s in ib iç õ e s do c re sc im e n to in vitro de c o lô n ia s do p a tó g e n o q u a n d o c o lo c a d o a c re sc e r em m eio de c u ltu ra ac rescentado com extratos ácidos (Tabela 3), co incidente com os resu ltad o s o btidos p o r W idm er et al. (1998), su gerindo um p ossível efeito quím ico na indução de supressividade.
N o s ex p e rim en to s realizados, q uando se u sa ra m as doses de inóculo m aiores, os valores de rec u p eraçã o da P.
Efeito do lodo de esgoto na indução de supressividade. T A B E L A 3 - D iâ m e tr o s m é d io s d as c o lô n ia s de
Phytophthora nicotianae isolado IAC 01/
95 aos quatro e nove dias após repicagem, e área abaixo da curva de crescim ento das co lô n ia s aos nove d ia s (A A C C ), crescendo em meio de cenoura (Dauern
carotae) (M C) contendo extratos aquosos,
ácidos (H2S 0 4) ou básicos (KOH) de lodo de esgoto (LE) em areia
Tratamento ---Dias após repicagem AACC
4 9 Testemunha (MC) 5,43' abJ 9,00' a 52,56 a Areia + água 5,40 ab 9,00 a 52,18 a Areia + KOH 4,41 c 8,82 a 44,61 b Areia + H2S 0 4 4,63 c 8,65 a 45,52 b Areia + LE + água 4,89 bc 8,73 a 47,86 b Areia + LE + KOH 5,68 a 9,00 a 53,44 a Areia + LE + H2S 0 4 2,05 d 2,27 b 17,28 c 1 Diâm etro m édio das colônias em cm.
2 D ados seguidos da m esm a letra, na coluna, não diferem significativam ente
(Teste de Duncan, ao nível de 5% de probabilidade).
nicotianae foram m enores, contrariam ente ao esperado (Figura 2). Isto p o d eria ser ex plicado p elo tipo de inóculo em pregado, grãos de trigo colonizados, os quais ao serem incorporados ao solo tam bém são d egradados e po d em lib erar substâncias tó x ic a s à P. nicotianae, in c id in d o n e g a tiv a m e n te em su a sobrevivência.
U m segundo fato r que p o d e ex p lica r a supressividade a P. nicotianae são os valores de condutividade elétrica obtidos q u an d o o lodo de esgoto foi incorporado ao solo ou substrato ( F ig u r a 2 ). L a p e n a e t al. ( 2 0 0 0 ) o b s e rv a ra m q u e so b condutividade elétrica de até 5 dS n r 1 p o r 24 h, a viabilidade, e consequentem ente a capacidade de infetar, dos zoosporângios de P. citrophthora dim inuiu. S em elh an tem en te ao p resen te trab a lh o , W orkneh et al. (1993) estab e lec eram co rrelaçõ es n e g a tiv a s e n tre c o n d u tiv id a d e e lé tr ic a e p r e s e n ç a d e P. parasitica ou incidência da d oença em p lan tas de tom ateiro
(Lycopersicon esculentum M ill.).
U m terceiro fator que p ode ex p lica r a supressividade a
P. nicotianae, é o aum ento da atividade m icro b ian a do solo, onde as p opulações m icrobianas estab eleceriam u m controle b iológico m ediante os m ecanism os de com petição, antibiose, parasitism o e indução de resistência (H oitink & B oehm , 1999).
M a la c jz u c k
(1983)
su g e re que os p rin c ip a is m e c a n ism o s envolvidos no controle de Phytophthora spp. são com petição p o r nutrientes e antibiose. D ow ner et al.(2001)
sugerem que a produção de celulase e lam inarinase é o principal m ecanism o envolvido n a supressividade a P. cinnamomi Rands, no sistem a A sh b u rn er, d e s tru in d o z o ó sp o ro s e o u tro s p ro p á g u lo s do p ató g en o ; e a firm a m que as en zim as são p ro d u zid a s p ela com unidade de fungos, entre eles Penicillium sp. c Aspergillussp., e que essa atividade en zim ática é favorecida p o r valores de pH baixos.
A incorporação do lodo de esgoto ao solo não alterou as com unidades de fungos, actinom icetos e bactérias do solo, qu ando av aliad a m ediante a contagem de colônias em placas (Tabela 4), resultado co incidente com L ew is et al.
(1992).
E ntretan to , M illn er et al. (1981) constataram o aum ento das com u n id ad es de bactérias e actinom icetos com o resp o sta à inco rp o ração de lodo de esgoto, e P ascual et al.(2000)
das c o m u n id a d e s de b a c té ria s e fu n g o s q u an d o in c o rp o ra ra m com p o sto de lixo urbano, com aum ento das po p u laçõ es de p se u d o m o n as fluorescentes e Trichoderma spp. D o w n er et al. (2001) o b tiveram um a resposta v ariável d ependendo do m e io d e c u ltu ra em p re g a d o p a ra a v a lia r as c o m u n id a d e s m ic ro b ia n a s dos so lo s com e sem co b e rtu ra , c o n sta ta n d o m u d a n ç a s n a s p o p u la ç õ e s de fu n g o s s a p ró f ita s q u a n d o av a lia d as em m eio com R o sa de B en g ala, e id e n tifica ram b asid io m iceto s crescendo sobre a cob ertu ra que não foram iso lad o s em n en h u m dos m eios de cultu ra. O s so lo s com c o b e rtu ra tiv e ra m u m a m a io r d iv e rsid a d e d e g ê n e ro s de fungos, d entre eles Penicillium, Aspergillus, Trichoderma (o qual não foi isolado dos solos sem cob ertu ra ).D iv ersa s esp éc ies do g ên e ro Trichoderma são b em conh ecid as com o agentes de controle b io ló g ico de doenças causadas p o r Phytophthora spp. (M alajczuk,
1983;
C asale et al.,1995
; C osta et al.,1996;
A hm ed et al,1999),
m as tam bém fungos do gênero Aspergillus (S ztejnberg & Tsao,1986
citado p o r F an g & Tsao,1995)
e actinom icetos p o ssu em capacidade de p ro d u çã o de an tib ió tico s (M alajczu k ,1983;
You et al.,1996).
D evido à com plexidade dos processos envolvidos, para d e te rm in a r o im p a c to p o te n c ia l do a g re g a d o d e m a té ria o rgânica ao solo na indução de supressividade aos diferentes p ató g en o s, são n ecessários estudos locais, nos solos e com as fontes de m atéria orgânica d isponíveis na região. E m b o ra o
TABELA 4 - Comunidades de fungos, actinomicetos e bactérias (unidades formadoras de colonias - ufc) isoladas do solo das parcelas do campo com e sem inóculo de Phytophthora nicotianae isolado IAC 01/95, aos 28 dias após inoculação, nos diferentes tratam entos de solo sem lodo e com adubo mineral (0+A), ou com incorporação de lodo de esgoto nas proporções 0; 7,5; 10 e 15% v/v
O rganismo Tratamentos do solo (% lodo v/v)
0+A 0 5 7,5 10 15
Fungos Sem inóculo 4,17 4,94 4,57 4,67 4,42 4,01
(ufc . g solo'1) Com inóculo 4,75 4,97 4,43 4,62 4,49 4,49
Actinomicetos Sem inóculo 5,27 5,60 5,41 5,43 5,31 5,39
(ufc . g solo'1) Com inóculo 5,47 4,11 5,42 5,17 5,26 5,44
Bactérias Sem inóculo 6,35 7,21 7,24 7,17 7,67 7,31
(ufc . g solo'1) Com inóculo 6,84 7,32 6,82 6,89 6,98 7,44
C. Leoni & R. Ghini
TABELA 5 - Potencialidade de alguns isolados de fungos, actinomicetos e bactérias quanto ao antagonismo a Phytophthora
nicotianae, pelo m étodo de infestação de plântulas de alfafa (M edicago sativa) Nível de infestação
com P. nicotianae das plântulas de alfafa
Isolados
Fungos Actinomicetos Bactérias
Z=0 e M = 0 '2 F9.13 A 12.1
Z=ü F9.1, F l l . l , F10.4. F10.8. F8.3/4,
F 12.3, F8.I0 A 12.1, A9.7.A2.1 B 11.1. B 10.6
Z<0,75 e M< 1,0 F9.1.F10.4, F4.1.F2.1, F8.10, F 7.1, FIO. 1, FS.3/2
A 12.1, A3.2, A4.2. A6.6, A4, lb,
A 6 .1, A9.7, A 2 .1, A6.5, A6.4 B 11.5. BI 1.1, BI 1.3, B 10.10
Z > 3,0 F5.3, F2.2. F3.5, F 10.5, F4.7, F 10.9, F4.4, F 10.3 > U J > C \ B I0 .2 , B I 0.3, BI 1.2 , B I.6, B10.11,B11.4, BI 1.8 , BI 1.6, B1.I0, Bl . l , B1.13, B I 0.4, B I 0.1. B I 0.12 , B1.8, B1.5, B I 0.9
1 Z = N ° de zoosporângios por plântula, 0= sem zoosporângios, l = l a 5 ; 2 = 6 a l 0 ; 3 = l l a 5 0 , 4 = > 5 1 ;M = presença de m icélio de Phytophthora nicotianae nas plântulas, 0 = sem m icélio, 1 = pouco, 2= m édio, 3= muito.
2 m édias de quatro repetições
3 A prim eira letra do nom e do isolado corresponde ao grupo de m icrorganism o (F: fungos, A: actinom icetos e B: bactérias). O prim eiro núm ero do nom e do isolado corresponde ao tratam ento: 1= parcelas sem lodo e sem inóculo de Phytophthora nicotianae, 2= com adubo m ineral e sem inóculo, 3= com 5% de lodo e sem inóculo, 4= com 7,5% de lodo e sem inóculo, 5= com 10% de lodo e sem inóculo, 6= com 15% de lodo e sem inóculo, 7= sem lodo e com inóculo, 8= com adubo m in e ra le c o m inóculo, 9= com 5% de lodo e com inóculo, 10= com 7,5% de lodo e com inóculo, l l = c o m 10% de lodo e com inóculo, 12= com 15% de lodo e com inóculo.
b io e n saio em p reg ad o no p rese n te trab alh o te n h a m o strad o capacid ad e na seleção de isolados, não se deve esq u ecer a necessid ad e de testar estes isolados em p lan ta e sob diferentes co n d içõ e s de c re scim en to d as m esm as, assim co m o a su a so b rev iv ên cia no solo.
REFER ÊN C IA S B IBLIO GR Á FICA S
AHMED, A.S., PEREZ-SANCHEZ, C., EGEA, C. & CANDELA, M.E. Evaluation o f Trichoderma harzianum for controlling root rot caused by Phytophthora capsici in pepper plants. Plant Pathology 48:58-65. 1998.
ANDREOLI, C. V. & PEGORINI, E.S. Gestão pública do uso agrícola do lodo de esgoto, ln: Bettiol, W. & Camargo, O. A. (Eds). Impacto ambiental do uso agrícola do lodo de esgoto. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente. 2000. pp: 281-312.
BETTIOL, W. & KRUGNER, T.L. Influência do lodo de esgoto na severidade da podridão de raiz do sorgo causada por Pythium
arrhenomanes. Summa Phytopathologica 10:243-251. 1984.
B LO K , W .J., L A M ER S, J.G., T E R M O R S H U IZ E N , A .J. & BOLLEN, G.J. Control o f soilbome plant pathogens by incorporating fresh organic ammendments followed by tarping. Phytopathology 90:253-259. 2000.
CASALE, W.L., MINASSIAN, V., MENGE, J.A., LOVATT, C.J., POND, E„ JOHNSON, E. & GUILLEMET, F. Urban and agricultural wastes for use as mulches on avocado and citrus and for delivery o f microbial biocontrol agents. Journal o f Horticultural Science 70:315- 352. 1995.
COSTA, J.L. da; MENGE, J.A. & CASALE, W.L. Investigations on some o f the mechanisms by wich bioenhaced mulches can supress Phytophthora root rot o f avocado. Microbiological Research 151:183- 192. 1996.
DOW NER, A .J., MENGE, J.A. & POND, E. A ssociation o f
cellulolytic enzyme activities in eucalyptus mulches with biological control o f Phyophthora cinnamomi. Phytopathology 91:847-855.
2001.
ERWIN, D.C. & RIBEIRO, O.K. Phytophthora diseases worldwide. St. Paul: APS Press, 1996.
FANG J G. & TSAO, P.H. Efficacy o f Penicillum funiculosum as a biological control agent against phytophthora root rots o f azalea and citrus. Pyhtopathology 85:871-878. 1995.
FEICHTENBERGER, E. Doenças incitadas por Phytophthora em citros. In: Luz, E.D.M.N., Santos, A.F., Matsuoka, K. & Bezerra, J.L. (E ds.). D oenças causadas po r P hytophthora no Brasil. Campinas. Livraria Rural. 2001. pp.283-342.
FERRIN, D.M. & KABASHIMA, J.N. In vitro insensitivity to metalaxyl o f isolates o f Phytophthora citricola and P. parasitica from ornamental hosts in southern California. Plant Disease 75:1041 - 1044. 1991.
GRIMM, GR. & ALEXANDER, A.F. Citrus leaf pieces as traps for Phytophthora parasitica from soil slurries. Phytopathology 63:540-541. 1973.
HANDELSMAN, J., NESMITH, W.C. & RAFFEL, S.J. Microassay for biological control o f infection o f tobacco by Phytophthora
parasitica var. nicotianae. Current M icrobiology 22:317-319.
1991.
HOITINK, H.A.J., VAN DOREN, D.M. & SCHMITTHENNER, A.F. Suppression o f Phytophthora cinnamom i in a compostes hardwood bark potting medium. Phytopathology 67:561-565. 1977. HOITINK, H.A.J. & BOEHM, M.J. Biocontrol within the context o f soil microbial comunities: a substrate dependent phenomenon. Annual Review o f Phytopathology 37:427-446. 1999.
LA PEN A , I., TUSET, J.J., H IN A R EJO S, C. & M IRA, J.L. Interacción entre la conductividad eléctrica de la solucióndel suelo y la infección de Phytophthora citrophthora en plântulas de cinco portainjertos de cíticos. Resúmenes, 10° Congreso de la Sociedad
Efeito do lodo de esgoto na indugäo de supressividade. Espanola de Fitopatologia, Valencia. 2000. p.218.
LEWIS, J.A., LUMSDEN, R.D., MILLNER, P.D. & KEINATH, A.P. Suppression o f damping-off o f peas and cotton in the field with composted sewage sludge. Crop Protection 11:260-266. 1992. LUMSDEN, R.D., LEWIS, J.A. & M ILLNER, P.D. Effect o f composted sewage sludge on several soilbome pathogens and diseases. Phytopathology 73:1543-1548. 1983.
MALAJCZUK, N. Microbial antagonism to Phytophthora. In: Erwin, D.C., Bartnicki - Garcia, S. & Tsao, PH. (Eds). Phytophthora. Its biology, taxonomy, ecology and pathology. St. Paul, APS Press. 1983. pp. 197-218.
MILLNER, P.D., LUMDSEN, R.D. & LEWIS, J.A. Controlling plant disease with sludge compost. BioCycle 22:50-52. 1981
PASCUAL, J.A., HERNANDEZ, T„ GARCIA, C„ DE LEU,
RA.A.M . & LYNCH, J.M. Long-term suppression o f Pyhium
ultimum in arid soil using fresh and composted municipal wastes.
Biology and Fertility o f Soils 30:478-484. 2000.
WIDMER, T.L., GRAHAM, J.H. & MITCHELL, D.J. Composted m unicipal w aste reduces in fec tio n o f citru s se ed lin g s by
Phytophthora parasitica. Plant Disease 82:683-688. 1998.
WORKNEH, F., VAN BRÜGGEN, A.H.C., DRINKWATER, L.E. & SHENNAN, C. Variables associates with corky root and Phytophthora root rot o f tomatoes in organic and conventional farms. Phytopathology 83:581-589. 1993.
Y O U, M.P., S1VASITHAM PARAM , K., KU RTBÖ K E. Actinomycetes in organic mulch used in avocado plantations and their ability to supress Phytophthora cinnamomi. Biology and Fertility o f Soils 22:237-242. 1996.
02012
