UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
BRUNO AMORIM DO CARMO
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E POTENCIAL ANTIMICROBIANO, ANTIPARASITÁRIO E ANTIPROLIFERATIVO DE NOVOS PEPTÍDEOS
ANÁLOGOS DA STIGMURINA
NATAL / RN 2019
BRUNO AMORIM DO CARMO
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E POTENCIAL ANTIMICROBIANO, ANTIPARASITÁRIO E ANTIPROLIFERATIVO DE NOVOS PEPTÍDEOS
ANÁLOGOS DA STIGMURINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de Concentração: Bioanálises e Medicamentos
Orientador: Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
NATAL / RN 2019
3
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Carmo, Bruno Amorim do.
Caracterização estrutural e potencial antimicrobiano,
antiparasitário e antiproliferativo de novos peptídeos análogos da stigmurina / Bruno Amorim do Carmo. - Natal, 2019.
99f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2019.
Orientador: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa.
1. Tityus stigmurus - Dissertação. 2. Peptídeos análogos - Dissertação. 3. Peptídeos de escorpião - Dissertação. 4. Agente antimicrobiano - Dissertação. 5. Membrana bacteriana - Dissertação. I. Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 596.46
AGRADECIMENTOS
À Deus, por tudo que tens me proporcionado e por permitir que eu melhore e cresça a cada dia.
Aos meus pais por todo o amor, incentivo e apoio incondicional.
À UFRN e ao PPgCF pelas oportunidades de ensino, por toda estrutura para realização das pesquisas científicas e ainda pelo apoio financeiro na concessão de bolsas.
Ao Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TecBioFar), em especial aos professores Matheus e Arnóbio e a todos os integrantes, por me proporcionarem о conhecimento não apenas racional, mas а manifestação do caráter е afetividade da educação no processo de formação profissional, por tanto que se dedicaram а mim, não somente por terem me ensinado, mas por terem me feito aprender. Aos quais sem nominar terão os meus eternos agradecimentos.
Ao professor Matheus Pedrosa, meu orientador, pela amizade, auxílio, orientações e dedicação na execução desse trabalho. E ainda por ter me permitido fazer parte do seu grupo de pesquisa, e que contribuiu imensamente para minha formação como futuro pesquisador, minhas sinceras gratidões.
Ao grupo veneno que esteve comigo desde o primeiro dia, muito obrigado pelo carinho e por todas as discussões.
A todos os amigos que fiz na pós-graduação. E aos meus melhores amigos, Eden e Daniel, pelas melhores risadas fora da Faculdade de Farmácia. Finalmente, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
Na peçonha de escorpiões é possível encontrar uma rica fonte de componentes biologicamente ativos com elevado potencial para aplicação terapêutica e biotecnológica, podendo ainda serem utilizados como protótipos para obtenção de novos fármacos. O objetivo deste estudo foi caracterizar a conformação estrutural, avaliar as atividades antimicrobiana, antiparasitária, antiproliferativa e demonstrar o possível mecanismo de ação por trás dessas atividades, utilizando a dinâmica molecular de dois novos peptídeos análogos do peptídeo escorpiônico Stigmurina, denominados StigA25 e StigA31. As substituições de aminoácidos na sequência nativa por resíduos de lisina resultaram no aumento da carga superficial e momento hidrofóbico dos peptídeos análogos, com o aumento teórico na conformação helicoidal. Na análise por dicroísmo circular, os peptídeos análogos apresentaram a capacidade de modificar sua conformação estrutural dependendo do meio em que se encontram, apresentando estabilidade térmica a uma ampla variação de pH e temperatura, com resultados semelhantes para o peptídeo nativo. StigA25 e StigA31 demonstram amplo espectro de ação antimicrobiana e antiparasitária T. cruzi in vitro com efeito superior ao peptídeo nativo e a antibióticos de referência, com reduzido efeito hemolítico nas concentrações que apresentam atividade biológica e atividade antiproliferativa em células HeLa. Portanto, este estudo demonstra o potencial terapêutico desses peptídeos análogos e o efeito promissor da engenharia de peptídeos para o potencial desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
Palavras-chave: Tityus stigmurus, peptídeos análogos, peptídeos de escorpião, agente antimicrobiano, dinâmica molecular, membrana bacteriana.
ABSTRACT
In the venom of scorpions, it is possible to find a rich source of biologically active components with high potential for therapeutic and biotechnological application, and can be used as prototypes to obtain new drugs. The objective of this study was to characterize the structural conformation, evaluate the antimicrobial, antiparasitic, antiproliferative activities and demonstrate the possible mechanism of action associated to these activities, using the molecular dynamics of two new analog peptides of the Stigmurina scorpion peptide, named StigA25 and StigA31. The amino acid substitutions in the native sequence for lysine residues resulted in peptides with higher positive net charge and hydrophobic moment, with an increase in the theoretical helical content. In the analysis by circular dichroism, the analog peptides presented the ability to modify their structural conformation depending on the medium in which they are found, presenting thermal stability at a wide pH and temperature variation, with similar results for the native peptide. StigA25 and StigA31 demonstrate a broad spectrum of antimicrobial and antiparasitic T. cruzi activity
in vitro with an effect superior to the native peptide and reference antibiotics, with a reduced
hemolytic effect at concentrations that present biological activity and antiproliferative activity in HeLa cells. Therefore, this study demonstrates the therapeutic potential of such analog peptides and the promising effect of peptide engineering for the potential development of novel therapeutic agents.
Keywords: Tityus stigmurus; analog peptides; scorpion peptides; antimicrobial agent;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Morfologia externa dorsal e ventral de um escorpião (Tityus aba) ... 14
Figura 2 - Escorpião Tityus stigmurus ... 15
Figura 3 - Alinhamento de sequência de 10 PAMs de escorpiões. (*) Resíduos conservados. (-) Gap;
... 19
Figura 4 - Estrutura tridimensional teórica pelo software UCSF Chimera para os peptídeos IsCT
(A) e Stigmurina (C). Em (B) e (D) superfície eletrostática dos peptídeos IsCT e Stigmurina, respectivamente. O azul claro e o azul escuro representam regiões hidrofílicas e hidrofóbicas, respectivamente. ... 22
Figura 5 - Peptídeos antimicrobianos visualizados usando PyMol. Em (A) e (C) a visão
tridimensional do peptídeo TsAP-1 e TsAP-S1, respectivamente. (B) e (D) são diferentes ângulos da superfície eletrostática criados por meio do Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS). A superfície carregada negativamente é mostrada em vermelho, a superfície carregada positivamente em azul e a neutra em branco. ... 25
Figura 6 - Esquema dos principais alvos moleculares de PAMs já descritos. PAM (peptídeo
antimicrobiano); TA (ácido teicóico); LTA (ácido lipoteicoico). ... 28
Figura 7 - Esquema dos principais mecanismos de ação propostos para PAMs na membrana celular
de microrganismos. ... 29
Figura 8 - Gráfico de Ramachandran para os peptídeos (A) StigA25, (B) StigA31 e Stigmurina (C)
... 41
Figura 9 - Estrutura tridimensional teórica construída por AIDA e visualizado pelo software UCSF
Chimera para os peptídeos Stigmurina, StigA25 e StigA31. ... 43
Figura 10 - Vista esquemática do sistema submetido as simulações por DM de membranas
Gram-negativas mimetizadas... 44
Figura 11 - Distância peptídeo-membrana ao longo do tempo por aminoácido durante 100 ns de
simulações DM para (A) Stigmurina, (B) StigA25 e (C) StigA31. A distância entre os átomos (exceto hidrogênio) de cada aminoácido dos peptídeos e átomo de fósforo (cabeça hidrofílica dos lipídios) foi considerada. ... 45
Figura 12 - Energia Potencial de Interação (kcal mol-1) entre resíduos dos peptídeos e a bicamada
lipídica nos últimos 50 ns de simulações DM. Stigmurina (preto), StigA25 (vermelho) e StigA31 (verde). ... 46
Figura 13 - Flutuações da raiz quadrática média (RMSF) por resíduo dos peptídeos acima de 100 ns
a partir de simulações DM. Stigmurina (preto), StigA25 (vermelho) e StigA31 (verde). ... 46
Figura 14 - Estrutura secundária dos peptídeos Stigmurina (A), StigA25 (B) e StigA31 (C) por
dos peptídeos Stigmurina (D), StigA25 (E) e StigA31 (F) em SDS 20 mM sob diferentes condições de pH (3,0-9,0). ... 49
Figura 15 - Avaliação da estabilidade térmica dos peptídeos Stigmurina (A), StigA25 (B) e StigA31
(C) por CD em 20 mM SDS no intervalo de 2 a 98 ° C. A elipticidade foi registrada a cada 0,1 °C durante o aquecimento e resfriamento no comprimento de onda de 222 nm em um espectropolarímetro JASCO J-810. ... 50
Figura 16 - MEV de S. aureus tratado com diferentes concentrações de Stigmurina, StigA25 e
StigA31 após 18 h. As setas indicam as alterações morfológicas promovidas na superfície das células de S. aureus pelos peptídeos, com protuberâncias e fissuras na parede celular ... 54
Figura 17 - Percentual de atividade hemolítica dos peptídeos Stigmurina, StigA25 e StigA31 ... 55
Figura 18 - Atividade antiparasitária de StigA25 e StigA31 em formas epimastigotas de T. cruzi
após 12 h (A) e 24 h (B) de incubação. ... 57
Figura 19 - Atividade antiparasitária de StigA25 e StigA31 em formas tripomastigota de T. cruzi
após 12 h (A) e 24 h (B) de incubação ... 58
Figura 20 - Análise topográfica por MEV na forma epimastigota do Trypanosoma cruzi Cepa Y
após 24 h de incubação. As setas indicam as alterações morfológicas causadas pelos peptídeos StigA25 e StigA31. ... 59
Figura 21 - Mapa da composição atômica das amostras de MEV por EDS (Espectroscopia por
Energia Dispersiva) na forma epimastigota do Trypanosoma cruzi Cepa Y após 24 h de incubação. A cor vermelha representa os átomos de carbono e o verde os átomos de silício. ... 60
Figura 22 - Atividade antiproliferativa dos peptídeos análogos em linhagem celular normal e
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características físico-químicas dos peptídeos análogos da Stigmurina (hidrofobicidade,
momento hidrofóbico e carga superficial) e estrutura secundária teórica predita. ... 40
Tabela 2 - Pontuações máximas e mínimas obtidas para os modelos computacionais dos peptídeos
análogos da Stigmurina ... 42
Tabela 3 - Porcentagem de estrutura secundária por dicroísmo circular em Stigmurina, StigA25 e
StigA31 ... 48
Tabela 4 - Porcentagem de estrutura secundária dos peptídeos por CD em diferentes pHs ... 50
Tabela 5 - Determinação da atividade antimicrobiana dos peptídeos por concentração inibitória
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 14
2.1 Os escorpiões ... 14
2.2 Composição molecular da peçonha de escorpiões ... 15
2.3 Peptídeos antimicrobianos (PAMs) ... 16
2.4 Diversidade estrutural de peptídeos antimicrobianos ... 17
2.5 Determinantes estruturais associados a atividade antimicrobiana de peptídeos ... 18
2.5.1 Sequência e Conformação ... 18
2.5.2 Amidação da região C-terminal ... 20
2.5.3 Anfipaticidade (A) ... 21
2.5.3 Hidrofobicidade (H) ... 22
2.5.4 Momento Hidrofóbico (µH) ... 23
2.5.2 Carga superficial (Z) ... 24
2.5.6 Ângulo Polar (θp) e Ângulo Hidrofóbico (θh) ... 25
2.6 Alvos moleculares de peptídeos antimicrobianos ... 26
2.7 Engenharia de peptídeos antimicrobianos ... 30
3 OBJETIVOS ... 32
3.1 Objetivo Geral ... 32
3.2 Objetivos Específicos... 32
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 33
4.1 Obtenção do peptídeo sintético ... 33
4.2 Análise in silico ... 33
4.3. Modelagem molecular ... 33
4.4 Dinâmica molecular (DM) ... 33
4.5 Estrutura secundária por Dicroísmo Circular ... 35
4.6 Estabilidade estrutural por Dicroísmo Circular ... 35
4.7 Microrganismos ... 36
4.8 Atividade antimicrobiana in vitro ... 36
4.9 Atividade antiparasitária em Trypanosoma cruzi ... 37
4.10 Atividade hemolítica ... 37
4.11 Atividade antiproliferativa ... 38
4.12 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 38
4.13 Análise estatística ... 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40
5.1 Análise do peptídeo in sílico ... 40
5.2 Modelagem Molecular ... 40
5.3 Dinâmica Molecular ... 43
5.5 Estabilidade dos peptídeos por Dicroísmo Circular (CD) ... 49
5.6 Atividade antimicrobiana ... 51
5.7 Mecanismo associado ao efeito antimicrobiano dos peptídeos em S. Aureus... 53
5.8 Atividade hemolítica ... 54
5.9 Atividade antiparasitária in vitro ... 56
5.10 Mecanismo associado ao efeito antiparasitário dos peptídeos em T. cruzi ... 58
5.11 Atividade antiproliferativa ... 60
6 CONCLUSÃO ... 63
1 INTRODUÇÃO
A peçonha de escorpiões consiste em uma fonte complexa de substâncias biologicamente ativas com potencial para serem utilizadas na terapêutica (ALMEIDA et al., 2012; ALVARENGA et al., 2012; CAO; LI; et al., 2012). Peptídeos presentes na sua peçonha com atividade inseticida, antiviral, antimicrobiana, hemolítica, antiproliferativa, potencializador da bradicinina e imunomodulador têm sido descritos na literatura, sendo alvos para a prospecção de novas moléculas de interesse biotecnológico (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; DU et al., 2014; DUFOURC et al., 2012; ERDEŞ et al., 2014; MIYASHITA et al., 2010; ZHAO et al., 2012).
O escorpião Tityus stigmurus corresponde à espécie predominante na região Nordeste do Brasil, sendo o principal responsável por acidentes escorpiônicos (ALBUQUERQUE et al., 2013). Pesquisas com peptídeos isolados a partir da peçonha de animais têm sido realizadas por constituírem modelos moleculares interessantes para indústrias farmacêuticas, através do desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas (KLINT et al., 2013). Dentre essas estratégias, as substituições de aminoácidos na cadeia curta de peptídeos nativos podem ser realizadas, a fim de aprimorar as características destes peptídeos, potencializar sua atividade biológica e reduzir a toxicidade, sendo esta uma abordagem promissora para o desenvolvimento de novas moléculas com alto potencial biotecnológico (FJELL et al., 2012; NGUYEN; HANEY; VOGEL, 2011).
Na avaliação do transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus stigmurus, foi observado um amplo repertório molecular, constituído principalmente por peptídeos aniônicos, peptídeos ricos em cisteínas, metaloproteases, bloqueadores de canais para sódio e potássio e os peptídeos antimicrobianos (PAMs) (ALMEIDA et al., 2012). A Stigmurina, é um PAM com 17 resíduos de aminoácidos sem ponte dissulfeto identificado a partir do transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus stigmurus, e demonstrou atividade antibacteriana contra cepas Gram-positivas com baixa atividade hemolítica, bem como, ação antiproliferativa em células de câncer cervical humano - SiHa (IC50 212,54 μg/mL) e renais de macaco verde africano - Vero E6 (IC50 275,67 μg/mL), demonstrando características promissoras como protótipo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (MELO et al., 2015). Diante do exposto, o estudo consistiu em caracterizar a conformação estrutural
in silico e por dicroísmo circular de novos peptídeos obtidos a partir do desenho racional de
fármacos, que utilizou como protótipo a estrutura primária da Stigmurina e avaliou suas atividades antibacteriana, antifúngica, antiparasitária e antiproliferativa in vitro, visando sua aplicação terapêutica.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Os escorpiões
Os escorpiões pertencem à classe Arachnida, da ordem Scorpiones e correspondem a um dos mais antigos aracnídeos do planeta, surgindo há mais de 450 milhões de anos, com poucas modificações morfológicas observadas ao longo da sua evolução (JERAM, 1997; WADDINGTON; RUDKIN; DUNLOP, 2015).
Esses animais apresentam-se morfologicamente divididos em duas regiões principais (Figura 1), o prossoma (cabeça) da qual partem um par de pedipalpos, estruturas utilizadas para contenção das presas, e quatro pares de pernas; e o opistossoma que compõem o mesossoma (corpo) e metassoma (cauda). Ao final do metassoma encontra-se um aparato articulado que permite a inoculação da peçonha, denominado de télson, que além de possuir um par de glândulas produtoras de peçonha, tem um ferrão, estrutura responsável pela picada (BRASIL, 1999; BRAZIL; PORTO, 2010).
Fonte: Brazil et al., 2010.
Legenda: es) par de estigmas respiratórios do sexto segmento mesossomal; et) esterno; ps) prossoma; ms) mesossoma; mt) metassoma; pe) perna; pd) pedipalpo; pn) pentes; ql) quelícera; tl) télson.
Brasil, Equador, Colômbia e Peru são os países de maior diversidade de escorpiões do mundo, sendo registrado importante aumento na quantidade de estudos sobre estes
animais nestas regiões nos últimos anos (CARDOSO et al., 2003). As regiões Norte e Nordeste são as principais responsáveis pela elevada riqueza de espécies de escorpiões do Brasil. São registradas 68 espécies para a região Norte, o que representa 52% das espécies de escorpiões do país, e 34 espécies para a região Nordeste, o que representa 26% da fauna de escorpiões brasileira. Dentre as espécies de escorpiões já descritas, aproximadamente 25 espécies apresentam potencial risco para os seres humanos, sendo o Tityus serrulatus, Tityus
bahiensis e Tityus stigmurus as principais espécies de importância médica encontradas no
Brasil (BUCARETCHI et al., 2014; LOURENÇO et al., 1996).
O escorpião Tityus stigmurus é predominantemente encontrado na região Nordeste do Brasil, estando presente no estado da Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco, Piauí, Paraíba, Sergipe e Rio Grande do Norte, sendo o principal responsável por acidentes escorpiônicos nessa região (SAÚDE, 2009). O T. stigmurus (Figura 2) é caracterizado morfologicamente pela sua coloração amarela, medindo cerca de 6 a 7 cm de comprimento, com a presença de uma faixa longitudinal escura na sua região dorsal, seguido de um triângulo no seu prossoma e apresentando uma serrilha no terceiro e quarto segmento do metassoma (ALBUQUERQUE et al., 2013; SAÚDE, 2009).
Figura 2 - Escorpião Tityus stigmurus
Fonte: Ministério da Saúde, 2009
2.2 Composição molecular da peçonha de escorpiões
Na literatura, tem sido relatada variações interespecíficas e intraespecíficas do repertório molecular da peçonha de diferentes espécies de escorpiões, com alteração na composição e abundância dos componentes da peçonha daqueles que habitam diferentes regiões geográficas, com o objetivo de proporcionar melhor adaptação do artrópode ao
ambiente, resultando na ampla diversidade de compostos bioativos (ABDEL-RAHMAN et al., 2009; RUIMING et al., 2010). A peçonha, portanto, é resultante de uma complexa composição de moléculas como nucleotídeos, mucoproteínas, aminas biogênicas, neurotoxinas, fosfolipases, hialuronidases, metaloproteinases, lectinas, peptídeos com e sem ligações dissulfeto, e outros componentes com atividade não elucidada, desenvolvidas ao longo de um processo evolutivo para predação e defesa (ALMEIDA et al., 2012; MILLE et al., 2015). Estima-se que existam 300.000 peptídeos na peçonha de diferentes espécies de escorpiões, contudo, menos de 1% destes têm sido caracterizados, se fazendo necessário estudos que visem o potencial biotecnológico e terapêutico desta rica fonte de componentes biologicamente ativos (DE LA VEGA; VIDAL; POSSANI, 2013).
Os peptídeos presentes na peçonha de escorpiões podem ser divididos em dois grupos: peptídeos com pontes dissulfeto (PPDs) e peptídeos sem pontes dissulfeto (PSPDs) (ZENG, X. C.; CORZO; HAHIN, 2005). PPDs estão associados a atividade neurotóxica da peçonha, podendo atuar em canais de sódio, potássio, cloro ou cálcio, bloqueando ou reduzindo o potencial de ação proveniente desses canais iônicos (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014). Os PSPDs consistem em peptídeos curtos (13-56 resíduos de aminoácidos), relativamente hidrofóbicos, apresentando geralmente estrutura helicoidal e carga positiva entre 1 e 9 (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014).
Então, a fim de avaliar o repertório molecular contido na peçonha do escorpião
T. stigmurus, foi realizado por nosso grupo de pesquisa o transcriptoma da glândula de
peçonha desse animal, no qual foram identificados diversos genes codificantes para hipotensinas, moléculas semelhantes à lectinas, bradicininas, neurotoxinas, metaloproteinases, peptídeos ricos em cisteína, peptídeos aniônicos, peptídeos antimicrobianos (PAMs) e outras substâncias com função não elucidada, sendo que 25,19% do total de transcritos correspondem a PAMs (ALMEIDA et al., 2012).
2.3 Peptídeos antimicrobianos (PAMs)
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são produtos da expressão gênica que ocorre nos ribossomos de forma constitutiva (PETERS; SHIRTLIFF; JABRA-RIZK, 2010; SOLIMAN et al., 2013). Se apresentam em todas as formas de vida, atuando no sistema imune inato, como defesa contra microrganismos patogênicos, apresentando baixa ou nenhuma toxicidade às células animais (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; GOPAL et al., 2013). Estes peptídeos já foram identificados em uma grande diversidade de organismos vivos, como microrganismos unicelulares, invertebrados, plantas, anfíbios, aves, peixes e
mamíferos, incluindo seres humanos, demonstrando sua importância no processo de sobrevivência destes animais (BROGDEN; BROGDEN, 2011; FJELL et al., 2012).
Estes peptídeos apresentam ainda atividade contra células tumorais (CRACK et al., 2012), vírus (LUPLERTLOP et al., 2011) e protozoários (TORRENT et al., 2012), destacando-os muitas vezes como peptídeos multifuncionais (ZENG et al., 2013). Essas atividades não são necessariamente excludentes e os peptídeos também podem atuar de forma sinérgica em mais de uma atividade (CONLON et al., 2010; GONG et al., 2010; ZENG et al., 2013). PAMs catiônicos sem pontes dissulfeto presente em escorpiões já demonstraram ação multifuncional, como antifúngico, antiviral, antiparasitário e antiproliferativo, sendo a formação de poros na membrana celular de patógenos o principal mecanismo de ação relatado, o que acarreta na redução da capacidade de desenvolvimento de resistência pelos microrganismos (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; ORTIZ et al., 2015; PARACHIN; FRANCO, 2014).
2.4 Diversidade estrutural de peptídeos antimicrobianos
Diante da diversidade de PAMs identificados na natureza, torna-se difícil categorizá-los, portanto a classificação é baseada na estrutura secundária, associada à composição de aminoácidos na molécula peptídica (JENSSEN; HAMILL; HANCOCK, 2006). Assim, os PAMs podem ser divididos em quatro classes distintas de estruturas secundárias: α-hélice, β–folha, estrutura mista de α-hélice e β–folha e estrutura randômica ou desordenada.
Os peptídeos estruturados em α-hélice são os mais bem caracterizados em nível de estrutura e função dos PAMs, devido à notável presença de resíduos polares e apolares, bem distribuídos ao longo da cadeia (MIHAJLOVIC; LAZARIDIS, 2012). Esses peptídeos apresentam um padrão de hélice, sendo estabilizado por ligações de hidrogênio intramoleculares. Nessa estrutura, há um arcabouço fortemente espiralado formando a parte interna com as cadeias laterais se projetando externamente ao eixo principal helicoidal. Esse tipo de arranjo tridimensional permite que as cadeias laterais estejam disponíveis para interação com membranas celulares, onde grande parte dos peptídeos bioativos exerce suas atividades biológicas (HUANG, Y.; HUANG; CHEN, 2010).
As β-folha são estabilizadas por ligações de hidrogênio entre filamentos de peptídeos, conhecidos como fitas-β. Apresenta duas ou mais porções da cadeia peptídica devido a interações de diferentes fitas-β. Essa fita é quase que totalmente distendida, onde as cadeias laterais situam-se alternadamente acima e abaixo do plano da fita. Quando as fitas-β adjacentes se apresentam no mesmo sentido forma-se uma β-folha paralela e cada resíduo
de aminoácido de uma fita interage a um resíduo de outra fita por ligação de hidrogênio. Quando as fitas-β adjacentes estão em sentido contrário, forma-se uma β-folha antiparalela, onde cada resíduo de aminoácido interage com apenas um resíduo de aminoácido da outra fita por ligações de hidrogênio (STRYER; BERG; TYMOCZKO, 2006).
Apesar de compor diferentes classes, os PAMs apresentam características em comum, como o tamanho de aproximadamente 10 kDa, carga positiva, número variável de pontes dissulfeto e um comportamento anfipático (HALE; HANCOCK, 2007). Moléculas anfipáticas apresentam uma região hidrofílica, solúvel em meio aquoso, e uma hidrofóbica, solúvel em meios apolares, como é o caso dos lipídeos. Devido à sua característica anfipática e à sua carga positiva, os PAMs interagem principalmente com as membranas celulares dos microrganismos (ZASLOFF, 2002).
2.5 Determinantes estruturais associados a atividade antimicrobiana de peptídeos
Vários determinantes estruturais são responsáveis pela atividade antimicrobiana e citolítica de peptídeos antimicrobianos. Estudos demonstram que o aumento da conformação em α-hélice, do caráter catiônico, da hidrofobicidade e do momento hidrofóbico de peptídeos antimicrobianos nativos tem efeito no espectro de ação antibiótico (NGUYEN et al., 2011; WANG; LI; WANG, 2008; ZHAO et al., 2009). Outro fator importante para a utilização dessas moléculas é a sua amidação na região C-terminal, pois tem demonstrado uma maior proteção à proteólise e uma maior estabilidade estrutural das hélices anfipáticas (SFORÇA et al., 2004). E que uma compreensão mais clara da influência dessas características na estrutura de peptídeos pode auxiliar na elucidação dos mecanismos empregados pelos peptídeos antimicrobianos em combater uma infecção, e além disso, desenvolver novas estratégias que facilitarão a criação de novos agentes farmacológicos que melhorem ou otimizam mecanismos de suprimir a capacidade de patógenos de gerar resistência, bem como, melhorar o potencial terapêutico desses peptídeos. Portanto, as características que devem ser levadas em consideração são:
2.5.1 Sequência e Conformação
Peptídeos antimicrobianos de escorpiões são cadeias curtas de aminoácidos, e tem sido sugerido que o comprimento da sequência pode ser significativo. Por serem peptídeos geralmente curtos, torna-os metabolicamente mais econômicos de produzir e são mais facilmente armazenados em grandes quantidades (JACKWAY et al., 2011). O tamanho reduzido também é importante para a função de defesa, uma vez que eles são mais facilmente
penetráveis na membrana citoplasmática, aumentando assim a atividade antimicrobiana (FJELL et al., 2012).
Esses peptídeos antimicrobianos são ricos em aminoácidos hidrofóbicos e básicos; no entanto, encontra-se alta diversidade em suas sequências com nenhuma ou mínima sequência conservada. Apesar da diversidade encontrada, esses peptídeos apresentam propriedades físico-químicas semelhantes, tais como, anfipaticidade e carga líquida positiva, que são importantes para sua interação com as membranas microbianas, assim, a atividade antibiótica (LEITE et al., 2015; NGUYEN et al., 2011). A única modificação pós-traducional observada para os peptídeos antimicrobianos é a amidação na região C-terminal, que é altamente importante não apenas para proteger os peptídeos da proteólise, mas também para desempenhar um papel em sua atividade antimicrobiana, estabilizando a interação peptídeo-membrana (DENNISON et al., 2015; MURA et al., 2016).
Apesar de sua sequência altamente variável, uma sequência conservada curta pode ser encontrada em alguns peptídeos. Na figura 3 um alinhamento de sequências entre os peptídeos antimicrobianos de diferentes espécies de escorpiões é mostrado, nos quais os resíduos conservados podem ser observados ao longo da sequência. No centro da sequência há um domínio G-L-I/V-S-A indicando que devido a conservação, esses aminoácidos podem ser importantes para a interação com a membrana lipídica, assim, por sua atividade, ou mesmo pela manutenção da estrutura peptídica.
Figura 3 - Alinhamento de sequência de 10 PAMs de escorpiões. (*) Resíduos conservados. (-) Gap;
Fonte: autoria própria
Os peptídeos antimicrobianos de escorpiões não apresentam resíduos de cisteína, que formam ligações dissulfeto, o que confere maior flexibilidade a esses peptídeos. Eles são capazes de fazer a transição de sua conformação de acordo com o ambiente. Em solventes hidrofílicos eles apresentam conformação aleatória, mas quando em solventes hidrofóbicos
eles mostram conformação de α-hélice, sendo essas características confirmadas por experimentos in vitro e in silico (MELO et al., 2015; PARENTE et al., 2018). Essa alteração na conformação pode ser devido ao seu mecanismo de ação, principalmente pela ruptura das membranas, de modo que quando no meio aquoso extracelular apresentam conformação randômica, mas quando em contato com o ambiente hidrofóbico da membrana bacteriana, assumem a conformação de α-hélice (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; NGUYEN et al., 2011). Assim, tanto a sequência quanto a conformação do peptídeo são importantes para sua inserção na membrana e atividade. Como a informação da sequência não é clara, mais estudos sobre a influência dos resíduos de aminoácidos são necessários.
2.5.2 Amidação da região C-terminal
Os peptídeos podem ser rapidamente hidrolisados na presença de proteases presentes em nosso organismo (BRINCKERHOFF et al., 1999). Por esta razão, é que eles podem apresentar baixa atividade oral e plasmática. Este conhecimento tem impulsionado a realização de estudos que através de deleção, adição e modificação racional da sequência de aminoácidos, grupos ionizáveis e/ou esqueleto peptídico visam desenvolver análogos de peptídeos biologicamente ativos com propriedades físicas e químicas capazes de aumentar ou diminuir as suas potências e alterar as suas estabilidades frente a proteases e/ou seletividades.
Dentro do vasto grupo de peptídeos antimicrobianos extraídos de diversos organismos, destaca-se a importância da amidação do C-terminal, pois a maioria dos peptídeos bioativos conhecidos possui uma porção C-terminal amidada, estabelecendo que em geral essa característica é importante para sua atividade. Por esse motivo, estudos avaliaram o efeito da amidação da região C-terminal de peptídeos frente a sua estabilidade, eficácia e toxicidade, onde foi demonstrado que os peptídeos amidados eram mais resistentes a proteases (BRINCKERHOFF et al., 1999). Além disso, outros estudos observaram que a amidação in vitro de peptídeos naturalmente não amidados pode aumentar sua potência (MERKLER, 1994). Paralelamente, também foi visto que alguns peptídeos amidados tem considerável aumento na atividade hemolítica muitas vezes maior do que os que apresentam o C-terminal sem o grupo amida (DEGRADO et al., 1982; RAGONA et al., 1996). Um estudo que comparou diversos peptídeos com amidação e sem amidação mostrou claramente que a toxicidade dos peptídeos de defesa para as células procariontes e eucariontes podem não ser afetada pela presença ou ausência da porção C-terminal amidada, indicando que a amidação tem um efeito variável sobre sua atividade. Além do mais, a amidação não afeta a
seletividade para células microbianas em relação às células eucarióticas. Por isso, diante das divergências é que a amidação na região C-terminal precisa ser considerada no contexto da estrutura do peptídeo e sua célula-alvo ao se projetar um novo agente antimicrobiano (DENNISON, SARAH RACHEL et al., 2009).
2.5.3 Anfipaticidade (A)
O caráter anfipático dos peptídeos antimicrobianos α-helicoidais é diretamente dependente da sequência de aminoácidos e tem sido extensivamente estudado (BRUL, 2018; DENNISON, SARAH R et al., 2005; RIAHIFARD et al., 2018; WIRADHARMA et al., 2011; ZHANG et al., 2016). Hélices anfipáticas são relatadas por apresentar de 40 a 60% de aminoácidos hidrofóbicos, o que confere a classificação de uma molécula anfipática (TOSSI; SANDRI; GIANGASPERO, 2000). Em hélices anfipáticas, os resíduos hidrofóbicos são distribuídos periodicamente a cada três ou quatro resíduos polares, o que permite que a hélice apresente dois lados quimicamente distintos: um hidrofóbico e outro hidrofílico (GIMÉNEZ-ANDRÉS; ČOPIČ; ANTONNY, 2018).
Além disso, os resíduos hidrofóbicos se inserem na membrana e interagem por forças hidrofóbicas, causando a permeabilização da membrana (SHAI, 1999). Inicialmente, a hélice catiônica anfipática se une à membrana em uma orientação plana com os resíduos hidrofóbicos interagindo com a membrana e a face polar interagindo com o solvente. Então, esse complexo alcança um equilíbrio entre o PAM ligado à membrana, antes da atividade de formação de poros dos PAMs que atuam por esse mecanismo (GAGNON et al., 2017).
A figura 4 ilustra a anfipaticidade do PAM α-helicoidal, a estrutura do IsCT, que é um peptídeo do escorpião Opisthacanthus madagascariensis e a Stigmurina do escorpião
Tityus stigmurus. É possível observar o caráter anfipático dessas estruturas através das
regiões hidrofóbicas e hidrofílicas bem distribuídas ao longo da cadeia peptídica, com a Stigmurina exibindo maior hidrofobicidade que o peptídeo IsCT.
Embora a anfipaticidade seja muito importante para a atividade antimicrobiana, seu incremento parece não aumentar a atividade antibacteriana (YAN et al., 2003). Tossi et al., (2000) também observou que a atividade antimicrobiana de PAMs é pouco afetada por uma mudança de anfipaticidade. Porém, a anfipaticidade superficial dos peptídeos está relacionada à seletividade ao tipo celular, como observado por Wiradharma et al., (2011). Os autores descobriram que os peptídeos sintéticos (FFRR)3, (LLRR)3 e (LLKK)3 mostraram menor toxicidade contra os glóbulos vermelhos do sangue quando comparados a outro
peptídeo testado (AARR)3, onde sugerem que isso aconteceu como resultado da menor anfipaticidade superficial nesses peptídeos.
Embora as hélices catiônicas anfipáticas sejam amplamente comuns entre os
peptídeos antimicrobianos, há muitos relatos de PAMs estruturados em β-folha, especialmente peptídeos projetados. Como um exemplo, o peptídeo sintético
(KIGAKI)3-NH2, que foi produzido para ter características anfipáticas e se dobrar como uma β-folha, onde a conformação desejada apresentou melhor atividade antimicrobiana e menor atividade hemolítica do que os peptídeos α-helicoidais testados pelos autores (BLAZYK et al., 2001). A síntese de α- hélices ainda é preferida devido ao menor custo. A conformação de β- folha precisa de pontes dissulfeto para serem estáveis, aumentando o custo de síntese (GROß et al., 2016).
Figura 4 - Estrutura tridimensional teórica pelo software UCSF Chimera para os peptídeos IsCT (A) e
Stigmurina (C). Em (B) e (D) superfície eletrostática dos peptídeos IsCT e Stigmurina, respectivamente. O azul claro e o azul escuro representam regiões hidrofílicas e hidrofóbicas, respectivamente.
Fonte: autoria própria
2.5.3 Hidrofobicidade (H)
Como mencionado acima, esses peptídeos têm aminoácidos hidrofóbicos e básicos, portanto, apresentam uma característica anfipática, o que confere a capacidade de solubilização em ambos os solventes hidrofóbicos e hidrofílicos. Ainda, apresentam em particular alta hidrofobicidade, que é importante para a sua interação com a membrana
citoplasmática, através de interações hidrofóbicas, assim, a sua atividade antimicrobiana (TOKE, 2005).
No entanto, estudos demonstraram que altos níveis de hidrofobicidade podem levar à agregação e precipitação de peptídeos, portanto, uma hidrofobicidade muito alta, ao contrário do esperado, pode diminuir a atividade antimicrobiana dos peptídeos (ZOU et al., 2018). Uma correlação muito mais direta entre a hidrofobicidade e a atividade hemolítica é encontrada (CHANG et al., 2017; PARENTE et al., 2018). Alterações na hidrofobicidade causaram diferenças na capacidade do peptídeo de se inserir em membranas eletricamente neutras (DATHE et al., 1996; WIEPRECHT et al., 1997). A hidrofobicidade, como já foi dito, é importante para a interação com membranas citoplasmáticas gerais. Assim, é provável que uma alta hidrofobicidade possibilite a interação do peptídeo com membranas sem seletividade, o que pode levar à toxicidade. No entanto, existem controvérsias em relação à correlação entre hidrofobicidade e hemólise. Em um estudo com dois peptídeos análogos da Stigmurina, um peptídeo antimicrobiano do escorpião Tityus stigmurus, os autores observaram que o peptídeo nativo apresentava maior hidrofobicidade que os análogos, mas não se mostrava hemolítico, mas os peptídeos análogos apresentavam taxa de hemólise superior (MELO et al., 2015; PARENTE et al., 2018). Assim, a hidrofobicidade é uma importante característica peptídica relacionada à sua atividade e toxicidade, embora não esteja totalmente clara a sua influência.
2.5.4 Momento Hidrofóbico (µH)
Os peptídeos com atividade de membrana cumprem duas características, eles devem ser solúveis em água para permitir o transporte e devem ser hidrofóbicos para interagir com a membrana (DATHE; WIEPRECHT, 1999). Diferentemente da hidrofobicidade, o momento hidrofóbico é a hidrofobicidade de um peptídeo medida por diferentes ângulos de rotação por resíduo, ou seja, a quantificação da anfipaticidade do peptídeo. Onde uma fase da hélice peptídica é hidrofílica e a outra é hidrofóbica (SEGREST et al., 1990).
Os peptídeos antimicrobianos geralmente apresentam alto momento hidrofóbico e moderada hidrofobicidade. Uma correlação mais direta entre o momento hidrofóbico e a atividade antimicrobiana é encontrada. Assim, ao aumentar o momento hidrofóbico, a atividade antimicrobiana aumenta (ALMAAYTAH et al., c2012; LA SALUD BEA; ASCUITTO; DE JOHNSON, 2015; LEE, K. et al., 2004). Um estudo realizado por La Salud Bea et al., (2015) em que eles projetaram 5 peptídeos análogos do peptídeo antimicrobiano BmKn1 do escorpião Buthus martensii Karsh, demonstrou que os peptídeos análogos com
momentos hidrofóbicos mais altos mostraram maior atividade antimicrobiana. Resultados similares foram observados por Parente et al., (2018), onde os dois peptídeos análogos estudados, com momentos hidrofóbicos de 0,66 e 0,72, apresentaram maior atividade antimicrobiana e aumento do espectro de ação, quando comparado ao peptídeo nativo que apresentou momento hidrofóbico de 0,57. Permitindo inferir que o momento hidrofóbico é uma característica que modula a atividade do peptídeo antimicrobiano através de interações hidrofóbicas entre o peptídeo e a membrana bacteriana.
2.5.2 Carga superficial (Z)
Apesar da natureza diversificada dos PAMs, existe uma característica amplamente encontrada entre eles: a cationicidade (EPAND; EPAND, 2011). Em que a carga líquida é a soma das cargas de todos os grupos ionizáveis de um peptídeo (BAHAR; REN, 2013). A membrana bacteriana Gram-positiva ou Gram-negativa é carregada negativamente. Portanto, a principal importância dos PAMs catiônicos é interagir com essas membranas (DATHE; WIEPRECHT, 1999). Interações eletrostáticas entre os peptídeos catiônicos e os fosfolipídios aniônicos presentes na membrana bacteriana desempenham um papel importante no reconhecimento e seletividade à superfície bacteriana (MALANOVIC; LOHNER, 2016).
Em relação aos PAMs, a carga líquida varia de +2 a +9 (JENSSEN et al., 2006). No entanto, a carga líquida da maioria dos PAMs está entre +4 e +6, o que pode representar uma carga ótima para sua atividade (TOSSI et al., 2000). Há exceções para esta faixa, como o PAM Imcroporin encontrado em Isometrus maculates e as Pandinins encontradas em
Pandinus imperator, ambos com carga +1 (ZENG et al., 2013; ZHAO et al., 2009).
Sabe-se que a membrana bacteriana é cerca de 50% mais negativa que as membranas celulares de mamíferos (CORPE, 1970). A diferença de carga de procariotos e a membrana celular de eucariotos aumenta a seletividade dos PAMs catiônicos (JENSSEN et al., 2006). Para ilustrar a distribuição de carga na superfície dos peptídeos antimicrobianos, o peptídeo nativo TsAP-1 com carga +2 do escorpião Tityus serrulatus e seu análogo TsAP-STsAP-1 com carga +6 é mostrado na Figura 5, tendo o peptídeo análogo TsAP-S1 atividade bem superior quando relacionado com o peptídeo nativo, demonstrando a influência da carga na atividade antimicrobiana (GUO et al., 2013).
Figura 5 - Peptídeos antimicrobianos visualizados usando PyMol. Em (A) e (C) a visão tridimensional do
peptídeo TsAP-1 e TsAP-S1, respectivamente. (B) e (D) são diferentes ângulos da superfície eletrostática criados por meio do Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS). A superfície carregada negativamente é mostrada em vermelho, a superfície carregada positivamente em azul e a neutra em branco.
Fonte: autoria própria
A carga está diretamente relacionada à atividade antimicrobiana e regula o equilíbrio entre atividade antimicrobiana e atividade hemolítica. Foi demonstrado a relevância de resíduos carregados positivamente e, embora os PAMs catiônicos sejam amplamente estudados, existem PAMs aniônicos. Um estudo mostrou que a atividade antimicrobiana foi afetada em peptídeos análogos do escorpião Opithancatus Madagascariensis projetados para terem carga negativa, porém, não demonstrou citotoxicidade aparente nas concentrações testadas (DE LA SALUD BEA et al., 2017). Além disso, não foram encontrados relatos de PAMs aniônicos nativos isolados de espécies de escorpiões.
2.5.6 Ângulo Polar (θp) e Ângulo Hidrofóbico (θh)
Estes ângulos são definidos pelas faces polares e hidrofóbicas das estruturas anfipáticas dos peptídeos e modulam a maneira na qual estes peptídeos se ligam à membrana. Onde esse parâmetro é de extrema importância para o entendimento das interações entre peptídeos e membranas, pois enfatizam as diferenças entre ligação e permeabilização. Peptídeos com ângulos polares (ou hidrofílicos) pequenos e altas médias de hidrofobicidade tendem a formar poros transmembranares, isto é, permeabilizando a membrana, enquanto que peptídeos que tem as faces apolares e polares equivalentes orientam-se paralelamente ao ligar-se a membrana (DATHE; WIEPRECHT, 1999). Independentemente da
hidrofobicidade e do momento hidrofóbico, é esperado que o ângulo hidrofóbico/hidrofílico influencie na inserção do peptídeo dentro da membrana e a estrutura dos poros transmembranares.
Um estudo mostrou uma penetração mais profunda na bicamada hidrofóbica em peptídeos contendo vários resíduos hidrofóbicos de leucina, onde peptídeos com menos resíduos de leucina, isto é, menos hidrofóbicos, só foram capazes de interagir com membranas negativamente carregadas. Obviamente, um amplo núcleo hidrofóbico é um pré-requisito para uma perturbação efetiva da membrana hidrofóbica (KIYOTA; LEE; SUGIHARA, 1996).
Foram investigados três peptídeos com variações do ângulo polar de 100°, 120° e 140°, e relataram uma diminuição na atividade hemolítica com o aumento do ângulo (TYTLER et al., 1993). Esse efeito também foi observado em análogos do peptídeo escorpiônico VmCT1, onde o aumento do ângulo polar pela substituição de resíduos de alanina por ácido glutâmico na face hidrofílica, foi importante para reduzir a atividade hemolítica em aproximadamente 15 vezes, para o [E]4-VmCT1-NH2 em relação a outros análogos gerados (PEDRON et al., 2017).
Também foi observado que o equilíbrio entre a face hidrofóbica e hidrofílica em análogos do peptídeo Pin2 do escorpião africano Pandinus imperator causou uma redução na atividade hemolítica deste peptídeo (RODRÍGUEZ et al., 2014). Deixando evidente que as alterações no equilíbrio entre o domínio polar e hidrofóbico de peptídeos afetam principalmente a eficiência de permeabilização a membranas. E que a diminuição do efeito hemolítico pode, pelo menos parcialmente, surgir da redução da anfipaticidade.
2.6 Alvos moleculares de peptídeos antimicrobianos
O principal mecanismo de ação dos PAMs está associado à sua capacidade de causar danos à membrana celular, contudo, a maioria dos estudos negligencia o fato das células microbianas apresentarem parede celular, componentes esses que podem ser alvos celulares e moleculares importantes para a ação dos PAMs, além de ser uma barreira física de defesa dos microrganismos contra moléculas antibióticas, em que, diversos efeitos podem ser induzidos em diferentes partes do patógeno por peptídeos antimicrobianos (Figura 6). Onde a interação entre os microrganismos e os PAMs acontece por forças eletrostáticas entre seus resíduos positivos e as cargas negativas expostas na superfície dos patógenos (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014).
A parede celular é uma estrutura bacteriana essencial e responsável pela forma da célula, impedindo a lise celular devido à alta pressão osmótica citoplasmática. Além disso, permite a ancoragem de componentes da membrana e proteínas extracelulares. O principal componente da parede celular de bactérias Gram-positivas é o peptidoglicano associado ao ácido teicóico (TA) e lipoteicoico (LTA), sendo essas moléculas responsáveis pela carga negativa global das bactérias Gram-positivas (SCOTT; GOLD; HANCOCK, 1999). Já nas bactérias Gram-negativas, tem-se uma membrana externa sobreposta a camada de peptidoglicano, composta principalmente por lipopolissacarídeos (LPS), componentes esses carregados negativamente. O conjunto de LPSs fornece uma barreira de penetração para moléculas maiores que 1000 Da, como mecanismo de defesa contra antibióticos e PAMs, impossibilitando que peptídeos antimicrobianos muitos grandes atravessem os poros microbianos (KOTRA et al., 1999) (Figura 6).
É provável que devido à natureza catiônica e anfifílica, onde a carga líquida positiva permite que os PAMs possam se acumular na superfície de bactérias que contêm polímeros aniônicos, como ácido lipoteicoico e os lipopolissacarídeos, possam promover a desestabilização da parede celular pela interação com esses componentes (BROGDEN, K. A., 2005). Esses mecanismos de interação dos PAMs com moléculas da parede celular de patógenos já foram descritos na literatura para diversos peptídeos. O Kn2-7, um análogo do peptídeo nativo BmKn2 isolado do escorpião Mesobuthus martensii Karsch, promoveu a interrupção das paredes celulares de Staphylococcus aureus e Escherichia coli através da ligação ao LTA e LPS, respectivamente (CAO; DAI; et al., 2012). Em outro estudo com análogos do peptídeo Bac2A, também foi observado mudanças drásticas na superfície celular de S. aureus, com protuberâncias e rachaduras na parede celular, não demonstrando interferência desse peptídeo na membrana interna das células, tendo sua ação antimicrobiana apenas na parede celular, matando S. aureus sem promover a lise da célula (WU, X. et al., 2014).
Figura 6 - Esquema dos principais alvos moleculares de PAMs já descritos. PAM (peptídeo antimicrobiano);
TA (ácido teicóico); LTA (ácido lipoteicoico).
Fonte: autoria própria
A membrana celular bacteriana é composta essencialmente por lipídios carregados negativamente, como o fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina e a fosfatidiletanolamina zwitter
ionic (PE), o que promove a especificidade de PAMs catiônicos (LOHNER, 2009). Onde a
interação e a ação dos PAMs com as células-alvo dependem em grande parte da superfície celular, mas também da composição de aminoácidos desses peptídeos. Esta ideia é apoiada pela alta conservação de resíduos de aminoácidos carregados positivamente entre as sequências de peptídeos antimicrobianos de vários organismos (GUILHELMELLI et al., 2013). Além disso, a estrutura secundária adotada pelo peptídeo é essencial para a ligação os fosfolipídios aniônicos (MATSUZAKI, 2009).
Com isso, diversos efeitos na membrana dos patógenos podem ser induzidos por PAMs, sendo a formação de poros, a separação de fases e a ruptura da bicamada lipídica os mais bem caracterizados (LOHNER; PRENNER, 1999). Tendo alguns modelos sido propostos para explicar o rompimento de membranas por PAMs (Figura 7).
Figura 7 - Esquema dos principais mecanismos de ação propostos para PAMs na membrana celular de
microrganismos.
Fonte: autoria própria
No modelo barril, o PAM liga-se à superfície da membrana em monômeros, onde é oligomerizado, permitindo a formação do poro. O recrutamento de monômeros adicionais pode aumentar o tamanho dos poros, com consequente extravasamento celular e morte da célula. Neste mecanismo, estruturas secundárias de peptídeos, tais como α-hélice e/ou β-folha anfipática, são essenciais para a formação dos poros (BREUKINK; DE KRUIJFF, 1999). As regiões hidrofóbicas interagem com os lipídios da membrana, enquanto as regiões hidrofílicas do peptídeo formam o lúmen do canal (BROGDEN, K. A., 2005; NGUYEN et al., 2011). O modelo “carpete” se caracteriza pelo recobrimento dos PAMs na superfície da membrana semelhante a de um detergente, afetando sua arquitetura (ROTEM; MOR, 2009). Essa interação é primeiramente impulsionada pela atração elétrica e, quando a quantidade de PAMs na superfície da membrana atinge uma concentração limiar, a membrana se desintegra, levando à lise celular e a formação micelar (OREN; SHAI, 1998). Em contrapartida, no modelo “poro toroidal”, os peptídeos se inserem na membrana formando um feixe, induzindo as monocamadas lipídicas a se curvarem continuamente através do poro. Como consequência, os lipídios da membrana tornam-se intercalados com os peptídeos estruturando o poro (YANG et al., 2001; YEAMAN; YOUNT, 2003).
Ainda, alguns PAMs podem atravessar espontaneamente membranas externas e internas bacterianas, visando moléculas intracelulares como ácidos nucléicos e proteínas. O
peptídeo antimicrobiano buforina II penetra a membrana da célula microbiana e liga-se ao DNA e RNA, inibindo o processo de duplicação, transcrição e, portanto, o processo de tradução sem promover a lise da célula, fortalecendo a ideia que um único PAM pode ter múltiplos mecanismos de ação que contribuem simultaneamente para a morte do microrganismo. Um estudo com isótopos radioativos mostraram claramente que os análogos de IsCT do escorpião Opithancatus Madagascariensis, I9K-IsCT, E7K e I9K-IsCT inibem os ácidos nucleicos e a síntese de proteínas em E. coli (TRIPATHI et al., 2015).
Contudo, alguns peptídeos muito pequenos não levam a formação de poros, mas apenas a perturbações na membrana como o seu estreitamento e alterações eletrostáticas. Estes peptídeos podem também se difundir para o citoplasma e agir em alvos intracelulares, podendo alterar eventos naturais como a síntese da parede e a divisão celular. Essa interação ocorre devido à composição química da molécula, bem como aos fatores estruturais, como tamanho e estrutura secundária (FJELL et al., 2012) (Figura 6).
2.7 Engenharia de peptídeos antimicrobianos
Substituições de aminoácidos na cadeia curta de peptídeos têm sido relatadas na literatura, promovendo modificações na conformação estrutural e aprimorando as características destes peptídeos nativos, potencializando sua atividade biológica e reduzindo a toxicidade, sendo esta uma abordagem promissora para o desenvolvimento de novas moléculas com alto potencial biotecnológico (FJELL et al., 2012; MELO et al., 2015; NGUYEN et al., 2011).
As modificações por resíduos básicos como, por exemplo, a lisina e arginina conferem aumento de carga positiva a peptídeos nativos, já que estes aminoácidos apresentam carga positiva em pH neutro, onde as cadeias laterais carregadas positivamente se orientam externamente ao eixo da hélice em peptídeos estruturados em α -hélice, compondo a face hidrofílica das hélices anfipáticas (HANCOCK, 1997).
Numerosos estudos foram realizados para avaliar a influência de carga líquida positiva na atividade antimicrobiana, sendo geralmente observado um padrão de aumento da atividade contra muitos microrganismos em peptídeos com carga crescente (GUILHELMELLI et al., 2013). Dentro de uma certa taxa, o aumento da cationicidade do peptídeo está geralmente associado a um incremento no potencial antibacteriano (LA SALUD BEA et al., 2015). Já as substituições por resíduos não polares (hidrofóbicos) é muito realizada devido à natureza policatiônica e hidrofóbica dos peptídeos serem importantes para a interação inicial com as bactérias (HANCOCK; FALLA; BROWN, 1995;
WU et al., 1999). O aminoácido leucina tende a aumentar a hidrofobicidade em uma estrutura anfipática, conferindo um papel importante na atividade antimicrobiana através da interação com membranas bacterianas (KIM et al., 2018). Com base na natureza desses peptídeos antimicrobianos, podemos esperar que, ao aumentar a hidrofobicidade, o peptídeo tenha não apenas maior estrutura em α-hélice, mas também potencialmente maior atividade antimicrobiana, contudo, um aumento na hemólise de células sanguíneas geralmente é observado (YEAMAN; YOUNT, 2003).
Já os resíduos polares como a serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina são frequentemente substituídos por resíduos básicos e hidrofóbicos quando se pretende aumentar a carga e hidrofobicidade, respectivamente. Outros resíduos que tendem a ser substituídos, são os aminoácidos que apresentam grupos R com carga negativa final em pH 7,0, como o ácido aspártico e o ácido glutâmico e também tendem a ser substituídos por resíduos hidrofóbicos ou carregados positivamente, devido à importância desses atributos para a atividade antimicrobiana.
Portanto, a Stigmurina é um peptídeo antimicrobiano curto (17 resíduos de aminoácidos) sem pontes dissulfeto (PSPDs) obtido a partir da análise do transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião T. stigmurus, e que demonstrou baixa atividade hemolítica, ação antiproliferativa in vitro sobre as linhagens celular SiHa (IC50 212,54 μg/mL) e Vero E6 (IC50 275,67 μg/mL), atividade antibacteriana in vitro em cepas de
Staphylococcus aureus (CIM 17,37 μM), e S. aureus resistente a meticilina (CIM 34,75 μM),
ação antifúngica contra Candida albicans (CIM 139 μM), C. krusei (CIM 139 μM) e C.
glabrata (CIM 69,5 μM), e atividade antibacteriana in vivo em modelo de sepse
experimental, evidenciando o potencial biotecnológico e terapêutico desta molécula (DANIELE-SILVA et al., 2016; MELO et al., 2015). Diante disto, utilizando a Stigmurina como protótipo, nosso grupo de pesquisa obteve 31 peptídeos análogos (patente BR102015029044-6) onde os resíduos polares e não carregados de serina e glicina do peptídeo nativo foram substituídos por resíduos de lisina, a fim de aumentar a carga positiva da Stigmurina através de análogos com potencial atividade antimicrobiana, antiproliferativa e antiparasitária superior ao peptídeo nativo.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar a conformação estrutural e avaliar as atividades antiproliferativa, antibacteriana, antifúngica e antiparasitária de novos peptídeos análogos da Stigmurina presente na peçonha do escorpião Tityus stigmurus.
3.2 Objetivos Específicos
Predizer a estrutura tridimensional dos peptídeos análogos;
Estudar a interação in sílico por dinâmica molecular dos peptídeos com a membrana bacteriana;
Determinar a conformação estrutural secundária dos peptídeos análogos por dicroísmo circular;
Testar a atividade antimicrobiana dos peptídeos análogos in vitro;
Mensurar a atividade hemolítica dos peptídeos análogos in vitro;
Avaliar o potencial antiparasitário dos peptídeos análogos in vitro;
Avaliar a atividade antiproliferativa in vitro dos peptídeos análogos;
Demonstrar o efeito antimicrobiano e antiparasitário por microscopia eletrônica de varredura;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção do peptídeo sintético
Os peptídeos liofilizados da Stigmurina (FFSLIPSLVGGLISAFK) e análogos StigA25 (FFSLIPSLVKKLIKAFK) e StigA31 (FFKLIPKLVKKLIKAFK) foram obtidos comercialmente com amidação na região C-terminal da empresa AminoTech Pesquisa e Desenvolvimento (São Paulo, Brasil), com purezas maiores que 98% (Anexo 1, 2, 3, 4, 5 e 6). Os peptídeos foram armazenados em freezer a -20 °C até o momento do uso.
4.2 Análise in silico
As características físico-químicas (hidrofobicidade, momento hidrofóbico e carga superficial) da Stigmurina e peptídeos análogos foram preditas com o servidor HeliQuest (http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/) e a conformação da estrutura secundária teórica obtida utilizando o servidor PORTER (http://distill.ucd.ie/porter/) (GAUTIER et al., 2008; POLLASTRI; MCLYSAGHT, 2004).
4.3. Modelagem molecular
A predição da estrutura tridimensional dos peptídeos foi realizada pelo método ab
initio, utilizando o software AIDA (http://ffas.burnham.org/AIDA/) (XU et al., 2014). Os
modelos teóricos foram validados utilizando o servidor Molprobity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) e analisado os parâmetros do gráfico de Ramachandran, tamanho e ângulos das ligações químicas da molécula, para otimizar a estrutura teórica obtida. A visualização da estrutura tridimensional foi gerada pelo software UCSF Quimera (Versão 1.8.1) (CHEN et al., 2010; DAVIS et al., 2007; PETTERSEN et al., 2004).
4.4 Dinâmica molecular (DM)
O modelo de bicamada lipídica foi construído para o estudo teórico com o objetivo de simular a membrana de bactérias Gram-negativas. Para construir este modelo, foi utilizada uma mistura com uma razão molar 1:3 de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG) aniônico para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) (MUKHERJEE et al., 2017).
O módulo Membrane Builder do servidor CHARMM-GUI (WU, E. L. et al., 2014) foi usado para a construção das bicamadas lipídicas. As estruturas iniciais dos peptídeos gerados através do MolProbity foram simuladas separadamente em um sistema contendo apenas moléculas de água por 100 ns. As estruturas finais destas simulações foram colocadas na região superior das membranas, sendo a posição inicial a mesma para todos os peptídeos. A bicamada lipídica utilizada para todas as simulações de membrana foi posicionada no plano xy da caixa e composta por 120 lipídios entre as moléculas de POPE e POPG. Uma camada espessa de água de ~ 40 Å (eixo z) foi sempre mantida em ambos os lados da bicamada lipídica. Todas as simulações DM foram realizadas usando o pacote Gromacs 5.1.4 (VAN DER SPOEL et al., 2005) implementado com o campo de força CHARMM36 (HUANG, J.; MACKERELL, 2013).
As moléculas de água TIP3P (JORGENSEN et al., 1983) foram usadas para solvatar os sistemas simulados. A neutralização dos sistemas foi obtida através da adição de contra-íons. O algoritmo Leap-Frog (VAN GUNSTEREN; BERENDSEN, 1988) foi aplicado para integrar a equação de movimento com o intervalo de tempo de 2,0 fs. As interações de longo alcance foram modeladas usando a soma de malha de partículas de Ewald (PME) (DARDEN; YORK; PEDERSEN, 1993), com um corte de 1,2 nm. As interações de van der Waals também foram calculadas usando o mesmo limite. Ligações envolvendo átomos de hidrogênio foram contidas usando LINCS (HESS et al., 1997). O termostato de Nosé-Hoover (HOOVER, 1985) foi usado para fixar a temperatura do sistema (310 K) em todas as simulações, enquanto a pressão do sistema foi controlada usando um barostato de Parrinello-Rahman nas simulações do NPT (número de partículas (N), pressão do sistema (P) e temperatura (T) são constantes) (NOSÉ; KLEIN, 1983).
A geometria dos sistemas foi minimizada pelo algoritmo de descida mais íngreme para 5000 passos com tolerância de 500 kJ mol-1 nm-1. Duas dinâmicas de equilíbrio curtas de 25 ps foram realizadas com o conjunto NVT (número de partículas (N), volume do sistema (V) e temperatura (T) são constantes), seguidas por quatro dinâmicas de equilíbrio curtas de 25 ps, 100 ps, 100 ps e 225 ps com o conjunto NPT. Finalmente, as simulações de DM de 100 ns usando NVT foi realizada para cada sistema, a fim de determinar a adsorção dos peptídeos (Stigmurina, StigA25 ou StigA31) com as bicamadas lipídicas. Um sistema contendo apenas a bicamada lipídica sem a presença dos peptídeos também foi avaliado.
Para analisar a adsorção entre os peptídeos e a bicamada lipídica, utilizou-se a Energia Potencial de Interação (IPE), que pode ser definida como a energia total de interação entre dois grupos, e foi calculada de acordo com a equação:
IPEi,j = ∑ ∑ Vij Nj
j≠i Ni
i
Onde IPEi,j é a energia de interação entre um grupo de átomos i e um grupo de átomos j, onde Ni e Nj são o número total de átomos nos grupos i e j, respectivamente. Este parâmetro
é frequentemente utilizado para avaliar as energias de interação em sistemas proteína-ligante e proteína-proteína (RIBEIRO et al., 2016), mas também pode ser aplicado para quantificar a interação entre aminoácidos específicos e as moléculas circundantes (SILVA et al., 2017).
4.5 Estrutura secundária por Dicroísmo Circular
A caracterização da estrutura secundária dos peptídeos Stigmurina, StigA25 e StigA31 foi obtida por dicroísmo circular no Laboratório de Bacteriologia do Instituto Butantan, utilizando um espectropolarímetro JASCO-810 acoplado a um sistema interno de controle de temperatura a 25 ºC e pH 7,0. Os espectros foram analisados em água ultra-pura, PBS 10 mM, dodecilsulfato de sódio (SDS) 20 mM e 4 mM e 2,2,2- trifluoroetanol (TFE) numa variação de concentração de 20% a 70% (v/v), tendo os peptídeos uma concentração final de 0,3 mg/mL. As análises foram realizadas na faixa de 190 - 260 nm, sendo detectados 10 vezes a uma velocidade de 50 nm.mim-1. Os resultados foram obtidos em milidegrees (1/1000°) e convertidos em elipticidade molar utilizando a seguinte expressão (LIN et al., 2011):
[θ] = [θ] × 100 × M C × I × Nr
Onde [θ] corresponde a elipiticidade em millidegrees, I é o caminho óptico (cm), C corresponde a concentração (mg/mL), M é a massa molecular e Nr corresponde ao número de resíduos de aminoácidos. A deconvolução dos espectros do dicroísmo circular foi obtida pelo banco de dados Dichroweb (WHITMORE; WALLACE, 2008), utilizando o algoritmo CDSSTR (SREERAMA; WOODY, 2000). A linha de base dos espectros obtidos foi corrigida subtraindo-se do espectro obtido com os diluentes em condições idênticas.
4.6 Estabilidade estrutural por Dicroísmo Circular
A estabilidade dos peptídeos foi avaliada em uma concentração de 0,15 mg/mL em SDS a 20mM numa faixa de pH de 3,0 a 9,0 em temperatura de 2 °C a 98 °C. Os resultados
foram obtidos em milidegrees (1/1000°) e convertidos em elipticidade molar como descrito no item 4.5.
4.7 Microrganismos
A atividade antimicrobiana da Stigmurina, StigA25 e StigA31 foi avaliada sobre as bactérias gram-positivas: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus
epidermidis (ATCC 12228) e Enterococcus faecalis (ATCC 4028), gram-negativas: Escherichia coli (ATCC 25922); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Enterobacter cloacae (ATCC 13047). A ação antifúngica foi avaliada sobre as leveduras de Candida glabatra (ATCC 90030), Candida albicans (ATCC 90028) e Candida krusei (ATCC 6258).
Todas as cepas foram obtidas no Laboratório de Microbiologia Clínica, do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Estando as bactérias conservadas em ágar nutriente (HIMEDIA®, India) a 4 ºC e em miçangas a -80ºC.
4.8 Atividade antimicrobiana in vitro
A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pelo método de microdiluição em caldo seguindo as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (COCKERILL, 2011). Em uma placa de 96 poços, 50 μL da suspensão de microrganismos com densidade de 106 UFC/mL (bactérias) e 105 UFC/mL (leveduras) em caldo Mueller Hinton (MH) foram adicionados a Stigmurina, StigA25, StigA31 (1,2 μM - 150 μM) ou solução salina 0,9% e incubado a 35 ± 2 °C, sob agitação a 200 rpm, por 24 horas. Após a incubação, a densidade óptica foi avaliada a 595 nm em um leitor de microplacas (Epoch Biotek, Winooski, EUA). Os poços com meio MH na ausência de microrganismos foram utilizados como controle de esterilidade do meio (controle negativo de crescimento), e os poços com meio e microrganismos como controle positivo de crescimento. Para o controle do perfil de sensibilidade dos microrganismos foi utilizado à Vancomicina (cepas gram-positivas), Gentamicina (cepas gram-negativas) e Anfotericina B (leveduras). A concentração inibitória mínima foi determinada como a mínima concentração dos peptídeos em que a absorbância a 595 nm foi a mesma do controle negativo (ANDREWS, 2001).
