Foi observado em células de S. aureus tratadas com os peptídeos Stigmurina, StigA25 e StigA31 várias protuberâncias e rachaduras na superfície das células, possivelmente causadas pela interação e inserção dos peptídeos na parede celular dos microrganismos. Essas mudanças são mais pronunciadas nos peptídeos análogos quando comparados ao peptídeo nativo Stigmurina, sendo mais evidente no StigA31, podendo estar associado à maior força de interação com a parede bacteriana devido à maior carga superficial líquida deste peptídeo. Além disso, esses resultados indicam que a camada externa das células de S. aureus foi rompida (Figura 16), sem promover a lise ou a formação de poros. E que possivelmente a síntese da camada de peptidoglicano foi interrompida, podendo ser observado através das rachaduras na parede celular. Um estudo com análogos do peptídeo antimicrobiano Bac2A, também demonstrou mudanças drásticas na superfície celular de S. aureus, com protuberâncias e rachaduras na parede celular, não sendo observada ruptura da membrana citoplasmática das células (WU, X. et al., 2014).
Ainda, os dados de MEV sugerem que o mecanismo de morte dos peptídeos deste estudo é distinto da maioria dos peptídeos catiônicos, que geralmente influenciam a permeabilidade da membrana ou até mesmo formam poros na superfície bacteriana, alterando seriamente a morfologia celular (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014).
É provável que devido à natureza catiônica e anfifílica, onde a carga líquida positiva permite que os PAMs possam se acumular na superfície de bactérias que contêm polímeros aniônicos, como ácido teicóico (TA) e lipoteicoico (LTA) e os lipopolissacarídeos (LPS), possam promover a desestabilização da membrana pela interação com esses componentes (BROGDEN, K. A., 2005). Esse mecanismo de ação já foi relatado para o Kn2-7, um análogo do peptídeo nativo BmKn2 isolado do escorpião Mesobuthus martensii Karsch, que promoveu a interrupção das paredes celulares de S. aureus e E. coli através da ligação ao LTA e LPS, respectivamente (CAO; DAI; et al., 2012), sugerindo que os peptídeos análogos aqui relatados possam ter um mecanismo de ação antimicrobiano semelhante. Portanto, esse estudo fornece evidências de que a Stigmurina e seus análogos podem induzir a supressão de S. aureus ao romper a parede celular bacteriana sem promover a lise da célula.
Figura 16 - MEV de S. aureus tratado com diferentes concentrações de Stigmurina, StigA25 e StigA31 após
18 h. As setas indicam as alterações morfológicas promovidas na superfície das células de S. aureus pelos peptídeos, com protuberâncias e fissuras na parede celular
Fonte: autoria própria
5.8 Atividade hemolítica
A Stigmurina apresentou baixa hemólise (5,8%) na maior concentração testada (150 µM). Foi observado um aumento na hemólise para os peptídeos análogos, em que a taxa de hemólise é dependente de concentração e diretamente proporcional. Os peptídeos análogos StigA25 e StigA31 apresentaram hemólise aceitável em concentrações abaixo de 18,8 µM (32,4% e 22,8%), com hemólise completa em 150 µM (93,5% e 75,6%) para o StigA25 e StigA31, respectivamente (Figura 17).
Figura 17 - Percentual de atividade hemolítica dos peptídeos Stigmurina, StigA25 e StigA31
Fonte: autoria própria
Embora muitos peptídeos sejam ativos na membrana de procariontes, eles parecem ter uma menor capacidade de perturbar membranas eucariontes devido à ausência de lipídios carregados negativamente na superfície da célula eucariótica e ainda pela falta de um forte potencial de membrana negativo na maioria das membranas. Contudo, os PAMs podem interagir com a superfície dos eritrócitos ao se ligarem aos resíduos de ácido siálico presentes em glicoproteínas ou glicoensfingolipídios que fazem parte do glicocálix (HANCOCK; SAHL, 2006). Em que é comum observar um aumento na hemólise da maioria dos PAMs análogos, e isso pode estar associado a diferentes fatores estruturais dos peptídeos, o que também tem efeito na potência antimicrobiana contra cepas resistentes a múltiplos fármacos (XIE et al., 2017).
La Salude Bea et al., (2015) estudando análogos do peptídeo nativo BmKn1 encontrado no veneno do escorpião Buthus martensii Karsch, argumenta que quando as mudanças são feitas introduzindo cargas mais positivas com adição de lisina, tanto a atividade antimicrobiana quanto a hemólise aumentam. A atividade hemolítica de análogos do TsAP-1 e de TsAP-2 foi consideravelmente afetada pelo aumento da carga, através da substituição de quatro resíduos de aminoácidos neutros por resíduos de lisina em cada peptídeo, promovendo efeitos dramáticos nas suas potências antimicrobianas e atividades hemolíticas. Onde os MICs do análogo catiônico (TsAP-S1) foi de 2,5 µM para S. aureus /
hemolítica (30% em 5 µM) (GUO et al., 2013). Portanto, parece evidente que existe uma possível toxicidade limitando a aplicação terapêutica de peptídeos antimicrobianos.
Já em contraste aos efeitos hemolíticos encontrados através do aumento de carga, Kim et al., (2018) observou em análogos do peptídeo escorpiônico Hp1404, gerados através da substituição de resíduos neutros por lisina, aumentando a carga de +1 para +6, que os análogos demonstravam menos efeitos hemolíticos e tóxicos para as células de mamíferos do que o peptídeo nativo Hp1404, especialmente para o Hp1404-T1e (carga +6), que exibiu atividade antibacteriana e antibiofilme particularmente potentes contra cepas de
Pseudomonas aeruginosa multirresistentes (MRPA) e também foi funcional em condições
fisiológicas, demonstrando seu potencial como agente terapêutico eficaz e a possibilidade de desenhar peptídeos seguros. Além do mais, esses resultados sugerem que além da carga, a estrutura primária e a conformação secundária dos peptídeos têm efeitos na atividade hemolítica, onde o aumento da carga e hidrofobicidade não são fatores limitantes para o aumento da toxicidade de peptídeos. E que é importante levar em consideração todos os parâmetros associados a atividade antimicrobiana de forma geral e não isolada, quando se pretende projetar um novo agente antimicrobiano. Com isso, os peptídeos análogos desse estudo apresentaram baixa hemólise nas concentrações com atividade antimicrobiana, demonstrando sua potencial aplicação terapêutica.