A análise topográfica da superfície das formas epimastigotas de T. cruzi tratadas com os peptídeos análogos demonstraram alterações drásticas na morfologia das células (Figura 20). É possível observar diferentes alterações para cada peptídeo. O StigA25 parece não agir através da formação de poros, como seria esperado, devido a característica intrínseca dos PAMs de promoverem poros na membrana celular de patógenos (GUILHELMELLI et al., 2013). Contudo, esses poros são claramente observados nas células tratadas com o StigA31, com poros bem estruturados ao longo da superfície dos parasitas. O StigA25 parece promover modificações estruturais drásticas na morfologia dos parasitas, onde é possível observar a formação de estruturas anormais e protuberâncias. Um estudo com o peptídeo antimicrobiano Melitina também observou em formas epimastigotas de T. cruzi que a maioria dos parasitas apresentava conformações celulares anormais com alterações na
morfologia dos flagelares, seguido de rachaduras e protuberâncias na membrana plasmática dos parasitas (ADADE et al., 2013). Outros estudos também destacaram a atividade de peptídeos antimicrobianos em Trypanosoma cruzi (JACOBS et al., 2003; MCGWIRE et al., 2003).
Figura 20 - Análise topográfica por MEV na forma epimastigota do Trypanosoma cruzi Cepa Y após 24 h de
incubação. As setas indicam as alterações morfológicas causadas pelos peptídeos StigA25 e StigA31.
Fonte: autoria própria
A formação de poros bem característicos promovidos pelo StigA31 é seguido por extravasamento celular, pois as aberturas de membrana provocadas por um peptídeo através de qualquer mecanismo de formação de poros (independentemente dos poros serem estáveis ou transitórios) afetará o ambiente interno da célula-alvo e, se não forem reparados eficientemente, resultará na morte da célula (JACOBS et al., 2003). A fim de monitorar esse extravasamento celular, foram analisadas as amostras que continham aparente liberação de conteúdo intracelular por EDS, que é uma análise quantitativa que permite analisar a composição atômica da amostra através de um mapa atômico. Como o carbono é o átomo mais abundante em estruturas orgânicas, esse foi utilizado como parâmetro. O silício é representado na imagem devido ao suporte da amostra ser feito desse átomo (Figura 21). De
fato, é possível observar que o conteúdo ao lado dos parasitas nas imagens A1 e B1 é de origem orgânica. Ainda é possível verificar em A1 conteúdo orgânico ao redor do parasita, sendo esse indicativo de lise celular.
Figura 21 - Mapa da composição atômica das amostras de MEV por EDS (Espectroscopia por Energia
Dispersiva) na forma epimastigota do Trypanosoma cruzi Cepa Y após 24 h de incubação. A cor vermelha representa os átomos de carbono e o verde os átomos de silício.
Fonte: autoria própria
A1 (StigA25) e B1 (StigA31); em A2 e B2 é mostrado o mapa da composição atômica da amostra; em A3 e B3 apenas os átomos de carbono são mostrados; em A4 e B4 apenas os átomos de silício são mostrados.
5.11 Atividade antiproliferativa
Os peptídeos análogos demonstraram um efeito dose-dependente nas linhagens testadas (Figura 22). Um perfil semelhante da atividade hemolítica dos peptídeos análogos é observado em células normais 3T3, em que a toxicidade é dependente de concentração. O análogo StigA31 demonstrou um perfil de toxicidade menor do que o análogo StigA25, o que pode estar relacionado com a maior hidrofobicidade desse peptídeo, já que a hidrofobicidade está associada a capacidade de permeação de membranas (TOKE, 2005). No entanto, os peptídeos demonstram ter baixa toxicidade nas concentrações que exercem atividade terapêutica. Outro fator que se pode observar, é que o StigA31 na concentração de 4µM induziu a proliferação de fibroblastos, sendo esse efeito indicativo de uma possível atividade cicatrizante.
Para a linhagem celular de câncer cervical humano (HeLa), é percebido uma redução do número de células ao aumentar a concentração, sendo esse efeito mais pronunciado para o StigA25. Na concentração de 15 µM o StigA31 tem efeito significativo nessa linhagem, reduzindo 54% do número de células e não demonstrando citotoxicidade em células normais para a mesma concentração. Vários estudos mostraram que os PAMs também têm atividade anticancerígena (GASPAR; VEIGA; CASTANHO, 2013), o que também foi demonstrado
nesse estudo. Além disso, outros peptídeos antimicrobianos de escorpiões já demonstraram efeitos em células normais e cancerígenas (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; DANIELE- SILVA et al., 2016), incluindo outros análogos da Stigmurina, que demonstrou atividade significativa contra várias linhagens celulares de cânceres (PARENTE et al., 2018).
Figura 22 - Atividade antiproliferativa dos peptídeos análogos em linhagem celular normal e cancerosa.
Fonte: autoria própria
Os valores representam média ± DP (N = 3). *** p ≤ 0,0001, ** p ≤ 0,001 e * p ≤ 0,01 em comparação com o controle. +++ p ≤ 0,0001, ++ p ≤ 0,001 e + p ≤ 0,01 comparado entre os análogos StigA25 e StigA31 na mesma concentração. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Tukey.
Células cancerígenas, diferente das células normais, possuem a membrana celular rica em fosfatidilserinas e mucinas O-glicosilada, os quais proporcionam uma superfície carregada negativamente (HARRIS et al., 2013; PERAVALI et al., 2013) e que pode contribuir para a interação eletrostática dos PAMs a esse tipo celular. A presença de microvilosidades e pseudopodia na membrana de células cancerígenas possibilita o aumento da área superficial da célula tumoral, o que pode contribuir para uma maior concentração dos peptídeos na sua superfície, acarretando em alterações estruturais da membrana celular (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014). Rodrigues et al. (2008) relatou que um creme contendo o peptídeo antimicrobiano Gomesin, quando usado como um medicamento tópico para espalhar sobre a superfície externa dos tumores, tratou com sucesso os cânceres intradérmicos e intraepiteliais.
Assim, é possível que esses resultados diferentes nas linhagens de células estudadas possam ser mais bem compreendidos quando observarmos a composição celular de cada linhagem, que reflete na expressão diferencial de alvos celulares geralmente reconhecidos pelos peptídeos de escorpiões (JEHLE et al., 2011). Esta característica sugere que a
susceptibilidade destas células é dependente das características físico-químicas dos peptídeos, uma vez que o análogo StigA25 se comporta de forma muito diferente do StigA31. Além disso, os resultados encontrados podem ser atribuídos a variações na sensibilidade das linhagens, incluindo diferentes processos de metabolismo e toxicidade.
6 CONCLUSÃO
Os peptídeos análogos nesse estudo exibiram predominante conformação em α- hélice em ambientes hidrofóbicos semelhante a membranas bacterianas, apresentando alta estabilidade em uma ampla faixa de temperatura e pH.
As substituições promovidas na sequência do peptídeo nativo por resíduos de lisina resultaram em aumento do momento hidrofóbico e carga superficial líquida positiva para os análogos, potencializando as propriedades antimicrobianas e aumentando o espectro de ação quando comparados a Stigmurina. Na CIM, os peptídeos análogos demonstraram baixa atividade hemolítica e baixa toxicidade em células 3T3 nas concentrações antimicrobianas. A atividade antiparasitária também foi demonstrada para os análogos, com alta taxa de inibição para as cepas de T. cruzi, com mecanismo de ação associado a formação de poros na membrana plasmática do parasita pelo StigA31 e lise celular pelo StigA25.
Também foi revelada maior atividade antimicrobiana dos análogos em relação a todos os antibióticos de referência utilizados para a mesma concentração e tempo de ação nesse estudo, onde os dados de MEV mostraram que os análogos têm seu mecanismo de ação provavelmente na parede celular de S. aureus. Efeito significativo na redução do número de células em linhagem de câncer HeLa também foi observado para ambos os análogos.
Os resultados da dinâmica molecular revelaram que o peptídeo StigA31 apresentou a maior propensão de interação com as membranas microbianas entre os peptídeos avaliados, corroborando com os dados obtidos in vitro, onde este peptídeo apresentou maior atividade antimicrobiana contra as linhagens testadas., demonstrando a capacidade preditiva da dinâmica molecular.
Portanto, este estudo demonstra a potencial aplicação da engenharia de peptídeos para a produção de moléculas mais eficientes, baseadas em moléculas já descritas na literatura, sendo os peptídeos aqui relatados, potentes agentes anti-infecciosos.
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