Um tempo total de simulação de 100 ns foi suficiente para equilibrar as membranas da bicamada lipídica, onde a estabilização estrutural ocorreu por volta de 50 ns.
Em um estudo anterior gerado para o modelo de membrana Gram-negativa com relação molar 1:3 de POPG/POPE na ausência de peptídeos, os valores publicados de área por lipídio (Å2) e espessura da membrana (Å) foram de 58,34 ± 1,33 e 41,65 ± 0,78, respectivamente (MUKHERJEE et al., 2017). Os valores obtidos nas simulações de DM foram de 57,7 ± 0,7 e 42,17 ± 0,3 para os mesmos parâmetros. Estes resultados similares indicam a estabilização estrutural da membrana no tempo simulado. O mesmo tempo foi aplicado para o sistema com os peptídeos isolados. A raiz quadrada média do desvio
(RMSD) dos Cα alcançaram um valor constante em torno de ~0,55 nm, indicando também uma estabilização.
Figura 10 - Vista esquemática do sistema submetido as simulações por DM de membranas Gram-negativas
mimetizadas.
Fonte: autoria própria
Representação no plano xz do sistema com o peptídeo (amarelo) acima da bicamada lipídica representando as condições iniciais para todos os peptídeos simulados e Stigmurina (preto), StigA25 (vermelho) e StigA31 (verde) apresentando suas respectivas condições finais. As moléculas lipídicas foram representadas como linhas, com átomos de carbono em cinza, nitrogênios em azul, oxigênio em laranja e fósforo em roxo.
A Figura 10 mostra a configuração inicial do sistema simulado e a geometria final obtida para os peptídeos Stigmurina, StigA25 e StigA31 com a bicamada lipídica ao final da simulação de 100 ns. A figura 11 apresenta a dinâmica de aproximação dos peptídeos (Stigmurina, StigA25 e StigA31) para a bicamada lipídica através da distância entre cada aminoácido do peptídeo para o mais próximo do átomo de fósforo (cabeça hidrofílica de lipídios) na membrana. É possível observar na Figura 11 que os peptídeos apresentaram diferentes comportamentos de aproximação à bicamada lipídica em toda a simulação. A Stigmurina (Figura 11A) não se aproxima da membrana uniformemente enquanto os análogos Stig25 (Figura 11B) e StigA31 (Figura 11C) mostram maior área de contato devido à menor distância peptídeo-membrana para a maioria dos seus aminoácidos durante toda a simulação. Por isso, eles têm valores de IPE mais negativos de -258,29 (± 43,74) kcal mol-1 e -313,31 (± 36,63) kcal mol-1 respectivamente, comparados com o valor de IPE da Stigmurina de -89,25 (± 33,05) kcal mol-1. O valor de IPE da Stigmurina é uma consequência direta da menor superfície de cobertura desse peptídeo com os lipídios da bicamada e, portanto, diminuindo sua eficiência de interação.
Figura 11 - Distância peptídeo-membrana ao longo do tempo por aminoácido durante 100 ns de simulações
DM para (A) Stigmurina, (B) StigA25 e (C) StigA31. A distância entre os átomos (exceto hidrogênio) de cada aminoácido dos peptídeos e átomo de fósforo (cabeça hidrofílica dos lipídios) foi considerada.
Fonte: autoria própria
A análise de IPE entre a bicamada lipídica e cada resíduo individual pode explicar a maior atividade antimicrobiana dos análogos em relação ao peptídeo nativo Stigmurina e fornecer a razão pela qual as modificações nestas posições alteraram significativamente a atividade antimicrobiana observada experimentalmente.
Figura 12 - Energia Potencial de Interação (kcal mol-1) entre resíduos dos peptídeos e a bicamada lipídica nos
últimos 50 ns de simulações DM. Stigmurina (preto), StigA25 (vermelho) e StigA31 (verde).
Fonte: autoria própria
Figura 13 - Flutuações da raiz quadrática média (RMSF) por resíduo dos peptídeos acima de 100 ns a partir
de simulações DM. Stigmurina (preto), StigA25 (vermelho) e StigA31 (verde).
Fonte: autoria própria
A Figura 12 mostra os valores de IPE entre os resíduos dos peptídeos e a bicamada lipídica ao longo dos últimos 50 ns das simulações. Os resíduos mutados 10, 11 e 14 (para StigA25) e 3, 7, 10, 11 e 14 (para StigA31) apresentaram menores valores de IPE (em torno de 30 a 40 kcal mol-1) quando comparados com as mesmas posições na Stigmurina. Isso demonstra que a inserção de uma cadeia lateral carregada positivamente tornou a interação existente mais estável devido à natureza aniônica da bicamada lipídica. A Figura 13 confirma
a grande flutuação de resíduos terminais que se movem muito bem durante a simulação
devido à sua conformação em α-hélice, portanto, são capazes de encontrar locais de interação mais estáveis.
Nesse estudo, StigA31 (+7) apresentou maior IPE negativo na análise in silico de bicamadas lipídicas quando comparado com a Stigmurina (+2) e o StigA25 (+5), indicando uma interação intermolecular mais forte. A compilação desses resultados sugeriu que o StigA31 apresentasse maior atividade antimicrobiana in vitro devido ao maior valor de IPE (valor mais negativo) quando comparado ao StigA25 e a Stigmurina, tendo esses dados teóricos sido confirmados experimentalmente (Tabela 5).
Pôde-se presumir também que o mecanismo de ação desses PAMs está diretamente associado a interações eletrostáticas (Coulomb) mais dominantes que as interações de Van der Waals (Lennard-Jones). As posições mutadas desempenharam um papel crucial na eficiência antimicrobiana dos peptídeos devido à inserção de cargas positivas nas cadeias laterais que tornaram a interação mais forte com a membrana aniônica. Os dados reafirmam a capacidade preditiva das simulações de DM e trazem a perspectiva futura de estudar novos análogos através de métodos teóricos (BERGLUND et al., 2015).
Berglund et al., (2015) ao estudar o peptídeo antimicrobiano Polimixina B1, conseguiu determinar os potenciais mecanismos de ruptura da membrana externa e interna da bactéria Gram-negativa Escherichia coli, sugerindo que os peptídeos ao se inserirem prontamente no núcleo interno da membrana, promoveria o aumento concomitante da hidratação da membrana, sendo essa responsável pela desestabilização da bicamada lipídica e pela função antimicrobiana, argumentando que os detalhes mecanicistas fundamentais demonstrados no seu trabalho, poderiam ser explorados para o futuro desenvolvimento racional de medicamentos.