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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE NUTRIÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO
EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS VERDE NO PROCESSO INFLAMATÓRIO DE CAMUNDONGOS
SUBMETIDOS A DIETA HIPOPROTEICA
Marina Barcelos de Miranda
Ouro Preto - Minas Gerais - Brasil 2018
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Marina Barcelos de Miranda
EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS VERDE NO PROCESSO INFLAMATÓRIO DE CAMUNDONGOS
SUBMETIDOS A DIETA HIPOPROTEICA
Área de concentração: Bioquímica e Fisiopatologia da Nutrição
Subárea: 2 - Ciências Biológicas / 2.06.01.00-0 - Citologia e Biologia Celular
Orientador(a): Profª. Drª. Sandra Aparecida Lima de Moura – Laboratório de Biomateriais e
Patologia Experimental (LBPE/NUPEB/UFOP)
Ouro Preto - Minas Gerais - Brasil 2018
Dissertação apresentada ao Programa de pós-graduação em Saúde e Nutrição, da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
M672e Miranda, Marina Barcelos de.
Efeitos da administração do extrato hidroalcóolico de propólis verde no processo inflamatório de camundongos submetidos a dieta hipoproteica [manuscrito] / Marina Barcelos de Miranda. - 2018.
85f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientadora: Profª. MScª. Sandra Aparecida Lima de Moura.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Nutrição. Departamento de Nutrição . Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição .
Área de Concentração: Saúde e Nutrição.
1. Inflamação - Teses. 2. Dieta hipoproteica - Teses. 3. Própolis - Teses. I. Moura, Sandra Aparecida Lima de. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Titulo.
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COLABORADORES / FINANCIADORES
Prof. Dr. Marcelo Eustáquio de Souza - Escola de Nutrição (ENUT) - Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP);
Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) - Escola de Nutrição (ENUT/UFOP);
Profª. Drª. Lucíola Barcelos - Laboratório de Angiogênese, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG);
Profª. Drª. Carmen Aparecida de Paula - Departamento de Análises Clínicas, Escola de Farmácia, UFOP;
Laboratório de Análises Clínicas (LAPAC), Escola de Farmácia, UFOP;
Pharma Nectar® - Empresa situada em Belo Horizonte, que gentilmente cedeu o extrato hidroalcoólico da própolis verde (Cytopropolis®) utilizado neste estudo;
Fundação de Amparo e Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG);
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
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AGRADECIMENTOS
À Deus, por tudo que sou, por me dar forças, uma família tão maravilhosa e bons amigos! À minha família: meus pais, Ana Maria e Antônio Timóteo; por me trazerem ao mundo e me ensinarem sobre amor, determinação, trabalho e caráter; ao meu padrasto Lourival; meus irmãos, Adenilson, Elysângela, Eliene e Anderson; minhas sobrinhas: Ana, Clarice, Marianna, Luiza, Amanda e Sofia e cunhados(as), por me darem forças e serem pilares na minha vida. Ao Víctor, meu esposo e amigo, pelo companheirismo e por ser meu “psicólogo” nesta jornada, sempre me ouvindo e me aconselhando, dizendo que tudo ia dar certo!
À Mariana Lanna e à Carmen, duas pessoas tão especiais, pelo apoio e pela doçura em ensinar. À equipe do Laboratório de Biomateriais e Patologia Experimental (LBPE): Katiane, Laser, Dani, Iara, Rafael, Ana Luiza e Thamires, obrigada pela convivência, aprendi muito com vocês; em especial, Dani e Bia, pela amizade especial de vocês, pelas conversas e sintonia.
Aos amigos de outros laboratórios: Talita, Raianne, Amanda, Jaime, Renata e Victor, sou grata por ter caminhado junto a vocês; e aos amigos de longa data: Pâmela, Williane, Aline, Sarah Matos, Hellem, Sarah Linhares e Priscila, pelo apoio, por compreenderem minha correria e falta de vida social.
À Universidade Federal de Ouro Preto; Escola de Nutrição; professores que participaram da minha formação; meninas da limpeza; porteiros; Marcela, secretária da pós graduação/ENUT; professor Marcelo; motoristas que me levavam na UFMG; Sr. Jair, Clodoaldo e Emiliane, técnicos do LABNEX, pelo apoio e boa vontade de todos.
À Lucíola, Mariane e todos do Laboratório de Angiogênese/UFMG, por me receberem tão bem. Aos meus anjinhos, como eu carinhosamente chamava “meus” camundongos, por darem suas vidas em prol da pesquisa e da humanidade.
À Pharma Nectar, por cederem o extrato hidroalcoólico da própolis verde utilizado neste estudo. Aos amigos do Grupo Espírita Evangelho de Cristo e do G.E. Novo Sol Brilhante, pelo apoio e incentivo; em especial, às crianças da evangelização, que sempre foram uma motivação. À Sandra, pela oportunidade e pela confiança depositada em mim desde nosso primeiro encontro e pelas nossas reuniões durante nosso desdobramento (só nós duas entendemos isso). Obrigada por tudo! Como você mesma disse, agora o passarinho vai voar.
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RESUMO
Inflamação e desnutrição, quando ocorrem de forma associada, são consideradas um fator agravante do risco de morbimortalidade no ambiente clínico. Em função disto, há uma busca incessante por novas terapias como possíveis estratégias terapêuticas para modular a inflamação crônica. Dentre estas estratégias, uma que se destaca é a própolis verde. A própolis verde é um produto natural, produzido pelas abelhas Apis melliferas, cuja espécie fornecedora da resina é a Baccharis dracunculifolia. Apesar das suas ações já evidenciadas pela literatura, não há esclarecimentos sobre o efeito antiinflamatório da própolis verde frente a um estado nutricional comprometido. Neste trabalho, propomos caracterizar os efeitos da administração do extrato hidroalcoólico da própolis verde no processo inflamatório crônico de animais submetidos a dieta hipoproteica. Foram utilizados 80 camundongos, divididos aleatoriamente em 8 grupos, considerando-se dois tempos de implantação e administração da própolis (7 e 15 dias): dieta normoproteica tratamento controle (NC); dieta normoproteica tratamento com própolis (NP); dieta hipoproteica tratamento controle (HC); dieta hipoproteica tratamento com própolis (HP). Foram ofertadas dietas artesanais com 3% (hipoproteica) e 12% de proteína (normoproteica), durante todo o período experimental. Na 4ª semana da dieta, realizou-se o procedimento cirúrgico para a implantação subcutânea das esponjas nos animais e indução da resposta inflamatória. Neste mesmo momento foi iniciada a administração diária, via oral, do extrato hidroalcoólico da própolis verde, na dose de 500mg/kg aos grupos tratados. A eutanásia ocorreu pós 7 e 15 dias da implantação das esponjas. Os resultados indicam que os animais que receberam a dieta hipoproteica em ambos os tempos avaliados, apresentaram uma redução significativa de peso corporal e ainda houve uma redução de proteínas totais séricas no tempo de 15 dias, no grupo HC. Os parâmetros hematológicos demonstraram que os animais que receberam a própolis, grupos NP e HP, sofreram alterações significativas nos valores de eritrócitos, hemoglobina e hematócritos, entretanto, os animais nutridos e tratados com própolis (NP) foram capazes de restabelecer estes valores no tempo de 15 dias. O tratamento com própolis também alterou níveis circulantes de plaquetas, monócitos e eosinófilos. A contagem de vasos nas esponjas implantadas revela, no tempo de 7 dias, uma maior contagem nos grupos com dieta hipoproteica (HC e HP); enquanto que, no tempo de 15 dias, houve uma menor contagem nos grupos tratados com própolis (NP e HP). A análise dos parâmetros inflamatórios, análise histopatológica, contagem total de células no microambiente das espojas e a dosagem dos níveis da citocinas TNF-α, indicaram que os grupos tratados com própolis apresentaram
5 significativa redução de infiltrado inflamatório em ambos os tempos e aumento de TNF-α no tempo de 7 dias. Conclui-se portanto, que o extrato hidroalcoólico da própolis verde exerceu atividade sobre peso, parâmetros hematológicos e leucocitário, perfil proteico, e ainda, ação antiangiogênica e antiinflamatória nos grupos com dieta normoproteica e hipoproteica, mas neste último, com menos eficácia.
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ABSTRACT
Inflammation and malnutrition, as associated factors, are considered an aggravating factor in the risk of morbidity and mortality in the clinical setting. Because of this, there is an incessant search for new therapies as possible therapeutic strategies for chronic inflammation. Among them is the green propolis, produced by honeybees Apis, whose species supplying the resin is Baccharis dracunculifolia. Despite its actions already evidenced in the literature, there is no clarification about the antiinflammatory effect of green propolis against a compromised nutritional status. In this work, we propose to characterize the effects of the administration of the hydroalcoholic extract of the green propolis in the inflammatory process of animals submitted to a hypoprotein diet. We used 80 mice, randomly divided into 8 groups, considering two times of implantation and administration of propolis (7 and 15 days): normoproteic diet control treatment (NC); diet norprotein treatment with propolis (NP); Hypoproteic diet control treatment (HC); diet hypoproteic treatment with propolis (HP). Handmade diets were offered with 3% (hypoproteic) and 12% protein (normoproteic), throughout the experimental period. In the 4th week of the diet, the surgical procedure was performed for subcutaneous implantation of the sponges in the animals and induction of the inflammatory response. At the same time, daily administration of the hydroalcoholic extract of green propolis was initiated by oral administration at a dose of 500mg / kg to the treated groups. Euthanasia occurred after 7 and 15 days after sponge implantation. The results indicate that the animals that received the hypoprotein diet in both evaluated times presented a significant reduction in body weight; there was still a reduction of total serum proteins at the time of 15 days in the HC group. Hematological parameters demonstrated that the animals that received propolis, NP and HP groups, had significant alterations in erythrocyte, hemoglobin and hematocrit values. However, the animals fed and treated with propolis (NP) were able to restore these values in the time of 15 days; the treatment with propolis also altered circulating levels of platelets, monocytes and eosinophils. The vessel count in the implanted sponges revealed, in 7 days, a higher count in the groups with hypoproteic diet (HC and HP); while in the 15 days time there was a lower counting in the groups treated with propolis (NP and HP). The analysis of the inflammatory parameters, histopathological analysis, total cell count in the esophageal microenvironment and the levels of TNF-α cytokines indicated that the groups treated with propolis had a significant reduction of inflammatory infiltrate at both times and increased TNF- α at the time of 7 days. It was concluded, therefore, that the hydroalcoholic extract of green propolis exerted activity
7 under weight, hematological parameters, protein profile, and also, antiangiogenic and anti-inflammatory action in the groups with normoproteic and hypoproteic diet, but in the latter, less effective.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Extrato bruto de própolis verde ... 21
Figura 2: Delineamento dos grupos experimentais ... 27
Figura 3: Linha do tempo do período experimental com os principais procedimentos ... 27
Figura 4: Imagem da esponja antes e após implantação ... 30
Figura 5: Média de ganho de peso dos grupos experimentais ... 34
Figura 6: Análise da média de ganho de peso entre os tempos experimentais ... 36
Figura 7: Dosagem de proteínas séricas ... 37
Figura 8: Análise hematológica parcial dos grupos experimentais ... 38
Figura 9: Contagem diferencial relativa de leucócitos ... 41
Figura 10: Peso úmido dos implantes de esponja após a retirada ... 45
Figura 11: Secções histológicas das esponjas após implantação e tratamento ... 47
Figura 12: Contagem de células no interior das esponjas implantadas ... 48
Figura 13: Contagem de vasos das esponjas ... 50
Figura 14: Avaliação da produção de VEGF no interior das esponjas ... 51
Figura 15: Avaliação da produção de TNF no interior das esponjas ... 52
Figura 16: Resumo dos principais resultados ... 54
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição das dietas experimentais em gramas para cada 1000g da dieta ... 28
10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 12 2. REVISÃO DA LITERATURA ... 14 2.1. Inflamação ... 14 2.2. Deficiência proteica ... 15
2.3. Deficiência proteica e inflamação ... 17
2.4. Tratamento convencional das doenças inflamatórias crônicas ... 18
2.5. Própolis verde ... 20
3. OBJETIVOS ... 24
3.1 Objetivo geral ... 24
3.2. Objetivos específicos ... 24
4. METODOLOGIA ... 25
4.1. Caracterização do extrato hidroalcoólico da própolis verde ... 25
4.2. Modelo experimental ... 25
4.3. Delineamento experimental ... 26
4.4. Preparo e administração das dietas ... 28
4.5. Implante das esponjas ... 29
4.6. Tratamento ... 29
4.7. Eutanásia ... 29
4.8. Peso – Análise de ganho ou perda ponderal ... 30
4.9. Dosagem de proteínas séricas totais ... 30
4.10. Avaliação de parâmetros hematológicos ... 31
4.11. Análise histológica ... 31
4.12. Contagem de vasos ... 32
4.13. Dosagem das citocinas VEGF e TNF ... 32
4.14. Análise estatística ... 33
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34
5.1. Peso ... 34
5.1.1. Análise de ganho ou perda ponderal ... 34
5.1.2. Análise da evolução ponderal entre os tempos de 7 e 15 dias de implantação ... 35
5.2. Dosagem de proteínas séricas totais ... 37
5.3. Análise hematológica ... 38
5.2. Peso das esponjas ... 45
5.4 Análise histológica qualitativa e quantitativa ... 46
5.5. Contagem de vasos ... 49
5.6. Dosagem das citocinas VEGF e TNF nas esponjas ... 51
6. RESUMO DOS RESULTADOS ... 54
7. CONCLUSÃO ... 55
8. REFERÊNCIAS ... 56
9. ANEXOS ... 72
9.1. Certificado de análise do extrato hidroalcoólico da própolis verde ... 72
9.2. Protocolo aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) ... 85
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1. INTRODUÇÃO
A inflamação é um processo biológico complexo que inclui componentes vasculares, celulares e uma gama de mediadores químicos (ABBAS et al., 2003). Na literatura clássica, é caracterizada com sinais clínicos como dor, rubor, calor, edema e dor, com possibilidade de prejuízo funcional (ABBAS et al., 2003). No entanto, tais características tradicionais correspondem, por vezes, a uma resposta adaptativa de curto prazo e não se aplicam, exatamente da mesma forma, a todas doenças com componente inflamatório, como é o caso de doenças metabólicas, como a obesidade e a diabetes tipo II, embora tais doenças compartilhem muitos destes mesmos mecanismos (HOTAMISLIGIL, 2006). O conhecimento sobre os mecanismos que cercam a resposta inflamatória e as várias doenças inflamatórias tem sido largamente ampliado nos últimos anos (RICKLIN; LAMBRIS, 2017).
Comumente, a resposta inflamatória é benéfica ao organismo, no entanto, a presença de estímulos persistentes podem induzir a perpetuidade do processo inflamatório, resultando em um processo crônico. Substâncias químicas; insuficiência venosa crônica dos membros inferiores e alterações vasculares da diabetes; úlceras relacionadas à pressão, em pacientes acamados por tempo prolongado; presença de tecidos necróticos; presença de corpo estranho; menor atividade mitogênica; envelhecimento precoce dos fibroblastos (NWOMEH, 1998; DIEGELMANN, 2003); deficiências de vitaminas e desnutrição, são fatores que podem influenciar negativamente o processo inflamatório (CAMPOS, 2007).
Segundo Hughes & Kelly (2006), a desnutrição pode ser entendida como um grupo heterogêneo de distúrbios, caracterizados pela deficiência de macro e micronutrientes, sendo um grave problema de saúde pública (HUGHES & KELLY, 2006). No Brasil, os índices de desnutrição infantil foram reduzidos nas últimas décadas, mas a situação atual ainda exige permanente atenção (UNICEFBRASIL, 2017). A desnutrição calórico-proteica é caracterizada pela diminuição dos estoques de glicogênio e gorduras, promovendo redução de energia e fazendo com que a massa proteica do organismo se torne uma fonte alternativa de energia. Na desnutrição proteica ocorre redução da síntese de enzimas e proteínas, o que compromete o sistema imune (FECHNER et al., 2001); prolonga a fase inflamatória; diminui a síntese de colágeno nos fibroblastos; altera a angiogênese e prejudica a cicatrização, por reduzir a força tênsil das feridas, limitar a capacidade de ação de leucócitos e por aumentar a taxa de infecções (RUBERG, 1984; MAYES, 1998; YOUNG, 1998). Assim, a desnutrição proteica aumenta as possibilidades de complicações e comorbidades nas doenças inflamatórias (SCHAIBLE;
13 KAUFMANN, 2007; CURTIS et al, 2017). Dada a solidez das evidências da associação entre desnutrição proteica e inflamação, diversos estudos foram realizados para melhores esclarecimentos de como a privação dietética debilita a inflamação, objetivando a melhoria dos tratamentos existentes (CAULFIELD et al., 2004; TAN et al., 2015; JAGADESWARAN et al., 2018).
As terapias tradicionais para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas trazem consigo diversos riscos, restrições e efeitos colaterais, como complicações gastrointestinais, hemorragias, insuficiência cardíaca e renal, hipertensão e osteoporose (ABRAHAM, 2007; BATLOUNI, 2010; BALBINO, 2011). A busca pela medicina alternativa e alimentos funcionais são uma nova tendência, que vêm motivando pesquisas de compostos naturais e substâncias bioativas, visando tratamentos mais eficazes e com menores efeitos colaterais (RAUD-MATTEDI, 2008). Desta forma, a própolis tem sido apontada como uma alternativa para o tratamento da inflamação crônica, uma vez que há evidências das suas propriedades anti-inflamatórias na literatura (MONTPIED et al., 2003; MOURA et al., 2011b; LIMA et al., 2014).
Dentro deste contexto optamos por trabalhar com o modelo inflamatório de implantação subcutânea de discos de esponja de poliéster poliuretano e com um extrato hidroalcoólico de própolis verde. O extrato utilizado neste estudo é uma combinação balanceada das frações aquosa e alcoólica da própolis verde, a CYTOPROPOLIS®, composto produzido pela indústria farmacêutica PHARMANECTAR®, com certificado de qualidade internacional, o que nos propiciou o estudo das ações biológicas de um extrato com altas concentração de compostos fitoquímicos. Diante dessas considerações, este trabalho visa expor as ações do extrato hidroalcoólico da própolis verde na resposta inflamatória induzida pelo implante subcutâneo de esponjas, utilizando o modelo experimental de deficiência proteica em camundongos.
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2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Inflamação
O sistema imunológico consiste em barreiras físicas, químicas, biológicas e células especializadas, sendo composto pela ação de macrófagos, neutrófilos, células natural killer (NK), linfócitos, anticorpos, citocinas e quimiocinas; contando ainda com rapidez, adversidade, memória, especialização e autolimitação (LORD et al., 1988; MEDZHITOV et al., MEDZHITOV et al., 2008). Na ocorrência de um dano tecidual, a primeira defesa do organismo é a resposta inflamatória, que inclui fenômenos vasculares (hemostase e coagulação) e celulares (LAUREANO; RODRIGUES, 2011).
A fase vascular se inicia logo após uma lesão tecidual, onde há exposição da matriz extracelular e ativação das plaquetas, que promovem adesão, agregação e a secreção de mediadores vasoativos. Tais eventos por sua vez irão perpetuar a ativação e a secreção plaquetária, além de auxiliar na ativação da cascata de coagulação, proporcionando a formação de um coágulo estável de fibrina, caracterizando a hemostase. As plaquetas também contribuem para a fase celular, pois constituem uma matriz que permite a migração de inúmeras células, além de secretarem vários fatores de crescimento, que estimulam a migração leucocitária para o local lesionado (KIRSNER; EAGLSTEIN, 1993). A fase celular é caracterizada pelo influxo de células por diapedese, direcionadas pela presença de mediadores químicos, liberados ainda na fase de hemostasia (NWOMEH, 1998).
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico e possuem papel fundamental nas fases iniciais da inflamação. São sensíveis a agentes quimiotáticos, como produtos do sistema do complemento e, também, a substâncias geradas pelos mastócitos e basófilos. Os neutrófilos estão entre as primeiras células a chegarem no local da inflamação e possuem grande capacidade fagocitária (BRINKMANN et al., 2004).
Os monócitos dão origem aos macrófagos e estes desempenham a função de fagocitose e atuam na apresentação de antígenos via MHC, estimulando a resposta mediada por linfócitos T. A ação dos macrófagos ainda inclui a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como IL1, IL6, IL12, TNF-α e quimiocinas, além da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (ABBAS, LICHTMAN, 2003). Dentre suas ações, os macrófagos ainda induzem a angiogênese, a formação de tecido de granulação e a liberação de vários fatores de crescimento (LEWIS et al., 1999), sendo fundamentais para o seguimento da fase proliferativa da inflamação (LAUREANO; RODRIGUES, 2011).
15 A angiogênese é definida como a formação de novos capilares por germinação ou intussuscepção de vasos pré-existentes (FOLKMAN, 2006). A angiogênese pode transcorrer de forma excessiva e persistente em determinadas doenças, como é o caso da artrite reumatoide e do crescimento tumoral, com a finalidade, neste caso, de aumentar o suprimento de nutrientes e oxigênio para as células no local da lesão. A inflamação contribui para a geração de uma angiogênese deignada “angiogênese inflamatória” (KIM et al., 2013). A neovascularização requer estímulos, como lesões, hipóxia, liberação de citocinas e fatores de crescimento, produtos de células necróticas; requer ainda ativação de endotélio, mobilização celular, mitogênese e formação de membrana basal (KIM et al., 2013; FOLKMAN, 1985; NISSEN et
al., 1998; RIBATTI et al., 2001).
Comumente, a resposta inflamatória é benéfica ao organismo, repercutindo na eliminação ou no neutralização do agente causador da inflamação. No entanto, algumas reações podem tomar um curso exacerbado, que pode ser local ou mesmo sistêmico. São exemplos de reações crônicas: rinite alérgica, asma, nefrite, eritema nodoso, vasculite, pneumonite, artrite reumatoide e tuberculose (ABBAS, LICHTMAN, 2003; CRUVINEL et al., 2010). A inflamação crônica é caracterizada por um infiltrado constituído predominantemente por células mononucleares (monócitos, macrófagos e linfócitos), sinais de angiogênese e fibrose (ABBAS, LICHTMAN 2003; MEDZHITOV, 2008). Existem estímulos que, quando persistentes, podem contribuir para que um processo inflamatório se torne crônico (NWOMEH, 1998; DIEGELMANN, 2003) e dentre estes estímulos, pode-se destacar a desnutrição proteica (CAMPOS, 2007).
2.2. Deficiência proteica
Segundo relatórios publicados pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO), para o Fundo Internacional de Desenvolvimento Agrícola (FIDA) e segundo relatórios do Programa Mundial de Alimentos (PAM), existem cerca de 805 milhões de pessoas com subnutrição crônica no mundo, em outras palavras, isso significa que, uma em cada nove pessoas no mundo sofrem com a fome. Sabe-se ainda que mais de 2 bilhões sofrem com deficiências de micronutrientes e cerca de 159 milhões de crianças menores de 5 anos apresentam graus preocupantes de subnutrição (ONUBR, 2003; FAO, 2014). Alguns dados de 2006 nos mostram que 7,2 milhões de brasileiros ainda enfrentavam situações graves de privação de alimentos, incluindo fome (UNICEF, 2014). Dados de 2017 mostram que 40% das crianças indígenas possuem desnutrição crônica (UNICEFBRASIL, 2017). A desnutrição é um
16 grave problema de saúde pública, o que a torna ainda mais relevante em nosso estudo (HUGHES & KELLY, 2006).
As proteínas são definidas como macromoléculas biológicas formadas por uma sequência de aminoácidos e são consideradas nutrientes essenciais ao organismo, pois desempenham funções estruturais, de transporte, regulação e defesa (TIRAPEGUI et al., 2005
apud SILVA et al., 2016). A desnutrição proteica, alvo do nosso estudo, tem sido muito
utilizada em estudos experimentais, devido aos seus graves efeitos no organismo, pois sabe-se que, a baixa ingestão de aminoácidos acarreta em prejuízos à síntese proteica estrutural, de enzimas, neuropeptídios e neurotransmissores, e ainda causa prejuízos no desenvolvimento físico e metabólico (NASCIMENTO et al., 1990; MORGANE et al., 1993; NUNES et al., 2002; SILVA et al., 2014). A desnutrição proteica também pode ocorrer associada à desnutrição calórica, sendo assim denominada desnutrição energético-proteica. Este tipo de desnutrição acarreta na diminuição dos estoques de glicogênio e gorduras, promovendo redução de energia e fazendo com que a massa proteica do organismo se torne uma fonte alternativa (MONTE, 2000).
Foi bem definido na literatura que a desnutrição proteica está relacionada, não só com a inanição, mas também com uma série de doenças, como causa, e também como consequência das doenças, resultando em graves complicações. Citando alguns exemplos, sabe-se que pacientes submetidos a cirurgia bariátrica passam por perda severa de peso, que associada a uma dieta líquida na fase pós operatória, acarreta em perda de massa muscular, colocando-os sob risco de desnutrição proteica (RICHARDSON et al., 2009; SHAMARI et al, 2018;). Curtis
et al. (2017) realizaram análises univariadas e multivariadas em dados de um estudo de coorte
em 18 hospitais canadenses e verificaram que 40% dos pacientes acometidos por doenças gastrointestinais estavam com desnutrição moderada ou severa, além do mais, a desnutrição ainda apresentou uma relação dependente com o tempo de internação, bem superior ao dos pacientes bem nutridos (CURTIS et al., 2017). O déficit proteico pode resultar em atrofia das vilosidades intestinais; esteatose hepática com alterações das funções normais do órgão; perda de massa muscular; alteração da função renal, com redução da filtração glomerular; alteração do débito cardíaco e ainda dos níveis hormonais (MONTE, 2000).
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2.3. Deficiência proteica e inflamação
Nossa história evolutiva e a interferência do ambiente moderno vêm deslocando o espectro das doenças humanas ao longo dos séculos. As doenças ditas modernas, incluindo obesidade, diabetes tipo II, aterosclerose, doenças autoimunes, alergias e certos distúrbios psiquiátricos, tem duas características em comum: envolvem interrupção da homeostase e são comumente associadas à inflamação crônica (STEARNS, KOELLA, 2008; KOTAS, MEDZHITOV, 2015). Enquanto a obesidade se associa ao aumento da inflamação e da ativação imune, a desnutrição e a restrição de nutrientes estão associadas à imunodeficiência e ao aumento da suscetibilidade a doenças infecciosas, uma vez que os processos da resposta imunológica demandam de muita energia (CHRISTADOSS et al., 1984).
A deficiência proteica, caracterizada pela baixa ingestão de proteína, reduz as concentrações de aminoácidos no plasma, debilitando o sistema imunológico (YOUNG, 1998; WU et al., 1999) e, quando associada a inflamação, tornam-se um grande fator de risco, sendo consideradas o maior risco de morbimortalidade em pacientes submetidos a hemodiálise (PRADO et al., 2014). Em pacientes oncológicos não é muito diferente; Tan et al. (2015) realizaram uma associação entre o estado nutricional, marcadores inflamatórios e a sobrevida global em pacientes com câncer avançado, por coorte prospectivo e verificaram que, os pacientes oncológicos e desnutridos apresentavam concentrações mais altas de proteína C-reativa sérica (PCR) e de linfócitos, além de menores pontuações na escala de Glasgow (Glasgow Coma Scale - GCS), o que os levou a concluir que existe uma associação entre marcadores inflamatórios e desnutrição.
Em estudo de Bulgrin et al. (1993), foi demonstrado que uma dieta livre do aminoácido arginina foi capaz de prejudicar a síntese de óxido nítrico e a cicatrização de ratos adultos. Estudos in vitro demonstraram que a arginina extracelular é essencial para a síntese de óxido nítrico e ativação de macrófagos (NORRIS et al., 1995). Por outro lado, pacientes internados sob dieta enteral e suplementação com arginina tiveram uma diminuição significativa de incidência de infecções (CALDER; YAGOOB, 2004; KORINN; SAKER, 2006).
Segundo estudo de Calder e Yagoob (2004) sobre as ações da glutamina in vitro e in
vivo, este aminoácido aumenta a proliferação de linfócitos T e a produção das citocinas IL-2 e
IFN-δ. Neste mesmo estudo, ficou demonstrado in vivo que o enriquecimento da dieta com glutamina aumenta os níveis de linfócitos T e das citocinas TNF-α, IL1, IL2, IL6 e IFN-δ, em lesões inflamatórias e infecções (CALDER, YAGOOB, 2004). Nirgiotis (1991) desenvolveu um estudo experimental onde ratos foram submetidos a uma dieta sem arginina, o que resultou
18 em animais com deficiência na deposição de colágeno e menor força tênsil na cicatriz (NIRGIOTIS, 1991). Oliveira e colaboradores (2014) testaram a hipótese de que a terapia precoce com glutamina intravenosa previne a lesão pulmonar em ratos desnutridos e com sepse. Estes animais receberam dieta hipoproteica por 4 semanas, e após, foram induzidos à sepse. Em conclusão, a terapia intravenosa reduziu a inflamação, a fibrose e a apoptose, minimizando a lesão pulmonar (OLIVEIRA et al., 2014). O aporte proteico para pacientes hospitalizados mostrou-se eficiente em diminuir o desenvolvendo de úlceras nestes pacientes, além de promover eficiência na cicatrização (FIFE, 2001; STRATTON, 2005; LEE et al., 2006). Um estudo recente verificou que cerca de 33% dos pacientes com doença renal crônica (DRC) apresentavam algum grau de desnutrição e inflamação, o que contribuiu de forma significativa para o rápido avanço da doença (JAGADESWARAN et al., 2018). Os pacientes em diálise e com inflamação apresentam acentuada perda de peso e um balanço proteico negativo, mesmo com o apetite intacto (KAIZU et al., 1998). Alguns autores sugerem que a desnutrição pode ser uma consequência do processo inflamatório na doença renal crônica, pelo fato da citocina pró inflamatória TNF-α estar envolvida na ativação de processos catabólicos, com consequente suspensão da síntese proteica, induzindo consequentemente uma anorexia nestes pacientes (FLORES et al., 1989; MCCARTHY, 2000; ZADEH et al., 2002). Outro argumento a esta teoria, de que a inflamação antecede a desnutrição, seria de que, níveis aumentados de marcadores inflamatórios em pacientes em hemodiálise têm sido relacionados à diminuição do apetite (ZADEH et al., 2002).
2.4. Tratamento convencional das doenças inflamatórias crônicas
A resolução do processo inflamatório é um processo ativo, controlado por mediadores endógenos, cujo objetivo é neutralizar o agente nocivo e restaur o tecido inflamado, constituindo-se em um mecanismo com fins resolutivos. Quando os mediadores inflamatórios não são suficientes para a resolução do problema, a inflamação pode se perpetuar, resultando em variados graus de dano tecidual (COTRAN, 1999; GILROY, 2004). Existem inúmeros tratamentos para doenças como asma, doença reumatóide, artrite, psoríase, lúpus, doença de Crohn, esclerose múltipla, dentre outras doenças com fundo inflamatório, no entanto, tais terapias ainda trazem consigo efeitos colaterais indesejáveis (AMERICAN COLLEGE OF RHEUMATOLOGY, 2001).
Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) são utilizados no tratamento da inflamação e estão entre os medicamentos mais consumidos no mundo. Possuem a função de
19 inibir as cicloxigenases (COX) e são classificados em seletivos e não seletivos (BATLOUNI, 2010; BALBINO, 2011). Os AINEs não seletivos são mais antigos, no entanto, são muito abrangentes e possuem diversos efeitos colaterais. Ao inibirem a produção de prostaglandinas, podem causar gastroduodenite, úlcera gástrica, sangramento digestivo e alguns ainda reduzem a produção plaquetária. Como consequência do bloqueio da COX1, tem-se uma inibição da sua ação de proteção da mucosa, resultando no aumento da secreção ácida, causando erosão, ulceração, perfuração e hemorragia (ABRAHAM, 2007; BATLOUNI, 2010).
Os AINES seletivos de COX2 foram dando lugar aos tradicionais, devido a sua toxicidade gastrointestinal, mas posteriormente seu consumo foi relacionado ao aumento de risco cardiovascular, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca e renal, além de hipertensão. Em pacientes mais propensos a desenvolver algum destes efeitos colaterais o uso de inibidores da COX2 deve ser limitado, administrado em baixas doses e pelo menor tempo possível (ABRAHAM, 2007; BATLOUNI, 2010).
Os antiinflamatórios esteroidais são também uma opção para o alívio da inflamação crônica, no entanto, também possuem efeitos indesejáveis, como um maior risco de causar osteoporose, e ainda prejudica a cicatrização de feridas (BEER et al., 2000). A terapia com o fator de necrose tumoral α (TNF-α) é inovadora, no entanto, não é recomendada para pacientes cardíacos ou com história familiar de doença desmielinizante; além disso, contribuem para o aumento de infecções (ANTONI, BRAUN, 2002).
Estratégias terapêuticas medicamentosas e nutricionais devem ser exploradas de forma a se complementarem, na tentativa de oferecer um tratamento visando a cura e o bem estar do paciente. A busca por tratamentos alternativos é uma nova tendência e vem motivando pesquisas de compostos naturais e substâncias bioativas, visando tratamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais (RAUD-MATTEDI, 2008). Na Índia, 79% dos pacientes com asma utilizam tratamentos alternativos para o tratamento desta síndrome inflamatória crônica das vias aéreas, as alternativas adotadas incluem remédios caseiros, chás, homeopatias e yoga (SINGH et al., 2002). No Brasil, o Ministério da Saúde já determinou, pela portaria nº 145/2017 que o SUS irá incorporar ao seu rol de procedimentos 19 novos tratamentos, sendo alguns destes: yoga, plantas medicinais, fitoterapia e meditação (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000).
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2.5. Própolis verde
A própolis se tornou mundialmente popular com o surgimento do conceito de alimentos funcionais. Este conceito se originou no Japão, na década de 80, através de um programa do governo cujo objetivo era incentivar a população para melhores hábitos alimentares e de vida (ANJO, 2004). A definição de alimentos funcionais e nutracêuticos não é universal, no entanto, entende-se por alimentos funcionais os alimentos e bebidas que, quando consumidos regularmente, trazem benefícios fisiológicos e específicos à saúde (CÂNDIDO; CAMPOS, 2005). Já os ditos nutracêuticos são os compostos alimentícios de forma isolada, geneticamente planejados, ou então, alimentos processados que trazem benefícios de prevenção e/ou tratamento de doenças (KWAK & JUKES, 2001).
Não existe uma categoria de “suplementos alimentares” no Brasil e ainda não existe uma legislação única para estes produtos. Os suplementos podem ser enquadrados como alimentos ou medicamentos, dependendo das suas características de composição e finalidade de uso (ANVISA). No Brasil, a legislação aprovada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, não define o termo “alimentos funcionais”, mas sim, “alegação de propriedade à saúde”, ou seja, afirma a existência da relação entre alimento e proteção à saúde. Dentro da classificação de alimentos com propriedades funcionais, a própolis é classificada como um opoterápico, termo definido pela ANVISA como “preparações obtidas a partir de
glândulas, órgãos, tecidos ou secreções animais” (ANVISA, 1999; LACERDA et al., 2011).
A palavra “própolis” deriva do grego, onde “pro” significa “em defesa” e “polis” significa “cidade ou comunidade”, tendo neste caso, a colmeia como comunidade. A própolis vem sendo utilizada de várias formas e por diversas civilizações como um remédio natural. Sabe-se que em 1700 a.C. ela já era utilizada pelos egípcios para embalsamar cadáveres e, ao que se tem notícia, também foi utilizada por assírios, gregos, romanos e incas (BARREIRO, 1990, apud PEREIRA et al., 2002). Foi descrita por Aristóteles como “um remédio para os
males da pele” (AZEVEDO, 1986) e em 1908, foi publicado na França o primeiro trabalho
científico com suas propriedades e composição química (HELFENBERG, CHEM, 1908 apud PEREIRA et al., 2015). Na Segunda Guerra Mundial e na Guerra dos Boêres, na África do Sul, foi largamente utilizada como um cicatrizante natural (AZEVEDO, 1986); em 1968 sua primeira patente foi lançada na produção de loções de banho, cuja matéria prima era a própolis Romena (IULIU, 1965).
A própolis verde brasileira (FIGURA 1) é produzida pelas abelhas africanizadas Apis
21 também conhecida pelo nome popular “Alecrim do Campo”, uma espécie tipicamente brasileira e que é a responsável por lhe conferir sua cor verde (GHISABERTI, 1979; PARK et al., 2002; SALATINO, 2005).
Figura 1: Extrato bruto da própolis verde da empresa Pharma Nectar®
As abelhas coletam resinas em ramos, flores, pólen, brotos e exsudatos de árvores, em seguida, esta resina coletada sofre modificações e adição de secreções salivares das próprias abelhas, originando a própolis (GHISABERTI, 1979; GREENWAY et al., 1990), que é utilizada na colmeia com a finalidade de vedar orifícios e frestas, diminuindo aberturas e impedindo a entrada de invasores. Este produto natural também é utilizado pelas abelhas para mumificar cadáveres e para revestir os favos, esterilizando o ambiente da colmeia internamente, assegurando o local de postura dos ovos e reparando favos danificados. Possui cheiro característico, textura pegajosa, é maleável e suas cores variam de acordo com a sua composição, podendo ter a tonalidade verde, marrom, vermelha ou amarela (AZEVEDO et al., 1986; MARCUCCI, 1996).
Sua composição química é complexa e varia conforme sua origem geográfica, diferenças genéticas das abelhas, variações sazonais e forma de coleta. Tais fatores influenciam, não só a cor da própolis, mas também a qualidade da sua resina, que costuma ser mais rica quando é proveniente de regiões tropicais do planeta, em virtude da riqueza vegetal destes locais, influenciando consequentemente nas suas atividades biológicas (AZEVEDO et al., 1986; PARK, 2002). Segundo Bankova (2005), comparar amostras de própolis de diferentes regiões do mundo pode ser o mesmo que comparar extratos de duas plantas pertencentes a famílias diferentes, e como consequência disto, observamos que, atualmente, a maior parte das publicações sobre própolis apresentam algum tipo de caracterização química da amostra utilizada, como uma forma de identificação do extrato (BANKOVA, 2005).
22 A própolis é constituída basicamente de 50 a 60% de resinas e bálsamos aromáticos, 30 a 40% de ceras, 5 a 10% de óleos essenciais e até 5% de outras substâncias, tais como alumínio, cálcio, ferro, cobre, manganês, magnésio, silício, bromo, zinco e vitaminas B1, B2, B6, C e E (GHISALBERTI, 1979). A própolis verde de Minas Gerais tem como principais compostos: flavonóides, ácido benzoico, benzoatos, ésteres aromáticos e alifáticos, alcanos e terpenóides (MOURA et al., 2011a). Park et al. (2000) classificaram as amostras de própolis de todo o Brasil em 12 grupos, de acordo com suas características fisicoquímicas e suas propriedades biológicas. Posteriormente, um novo tipo de própolis foi encontrada, de coloração vermelha, sendo classificada como pertencente ao grupo 13 (PARK et al., 2000; DAUGSCH et al., 2008). Dentre todos os tipos de própolis, a verde é a que mais se destaca nas pesquisas, pela riqueza se seus constituintes e ações biológicas (SALATINO et al., 2005). O extrato utilizado no presente estudo é pertencente ao grupo 12, cuja origem botânica é a Baccharis dracunculifolia, tendo como principais compostos: Ácido Cumárico, Rutina, Pinobanksina, Quercetina, Kaempferol, Apigenina, Pinocembrim, Pinobanksin-3 -acetato, Crisina, Galangina, Tectocrysina, Artepilina C®, Bacarina (PHARMA NECTAR).
Apesar de várias pesquisas utilizando compostos isolados da própolis, é de conhecimento que seu amplo potencial biológico se deve justamente ao sinergismo entre seus muitos componentes. Dentre suas atividades biológicas, destacam-se: atividade antimicrobiana (GONSALES et al., 2006), antifúngica (FARNESI, 2007; FERNANDES et al., 2007), anti-inflamatória (MONTPIED et al., 2003), cicatrizante (GHISALBERTI, 1979; SANTOS et al, 2007), anestésica (BURDOCK, 1998), anticariogênica (BHARGAVA et al., 2018), antiprotozoária (FERREIRA et al., 2014), antiviral (PETER et al., 2017), antioxidante (ANDRADE et al., 2017) e hepatoprotetora (BANSKOTA et al., 2000). A própolis também é amplamente comercializada pela indústria alimentícia, como conservante de alimentos ou para agregar valor nutricional (PASSOS et al., 2016); pela indústria farmacêutica e de cosméticos, na forma de comprimidos, pastilhas, loções, sprays, cremes corporais, pomadas e sabonetes (BANKOVA et al., 2000; SILVA et al., 2016).
Utilizando o implante de esponja como modelo experimental para estudar a inflamação, ficou demonstrado que o extrato aquoso de própolis verde atua como modulador no processo inflamatório (MOURA et al., 2011b). Ainda lhe é atribuída a ação de moduladora do sistema imune, por influenciar na redução de citocinas próinflamatórias e no aumento de citocinas anti-inflamatórias (MACHADO et al., 2012). Recentemente, foi evidenciada sua ação sob o microRNA relacionado com a expressão de proteínas presentes em lesões e inflamações
23 (ZACCARIA et al., 2017). Animais tratados com o extrato aquoso de própolis verde tiveram um aumento na expressão dos genes associados à ativação diferencial de macrófagos (LIMA et
al., 2014). O tratamento com própolis via retal atenuou a resposta inflamatória na mucosa do
cólon em animais com colite (GONÇALVES et al, 2013). Ainda sobre sua ação anti-inflamatória, Farias et al. (2014) investigaram o efeito do extrato hidroalcoólico da própolis verde, em um modelo de asma em camundongos e demonstraram que a própolis inibiu a inflamação nas vias aéreas; assim, sugeriram a utilização da própolis como alternativa complementar no tratamento da asma (FARIAS et al., 2014). Diante de tantas evidências científicas sobre as atividades da própolis verde, ainda existem muitas perguntas sobre seus efeitos. Desta forma, propomos neste trabalho estabelecer a sua eficácia na resposta inflamatória crônica, induzida pelo implante subcutâneo de implantes de esponja, no modelo experimental de deficiência proteica.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Caracterizar os efeitos da administração do extrato hidroalcoólico da própolis verde na resposta inflamatória crônica de camundongos submetidos a dieta hipoproteica.
3.2. Objetivos específicos
Estabelecer o estado hipoproteico por meio da manutenção dos animais em dieta hipoproteica;
Avaliar os parâmetros nutricionais: peso, níveis séricos de proteína e índices hematológicos;
Avaliar os efeitos da administração diária do extrato hidroalcoólico da própolis verde sob os parâmetros: peso, níveis séricos de proteína e índices hematológicos;
Avaliar a eficácia da administração do extrato hidroalcóolico da própolis verde na cinética inflamatória, no modelo experimental de implante de esponja, por meio de análise histológica qualitativa e quantitativa; pela quantificação de vasos sanguíneos nas esponjas implantadas, peso das esponjas e pela dosagem das citocinas VEGF e TNF-α.
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4. METODOLOGIA
4.1. Caracterização do extrato hidroalcoólico da própolis verde
O extrato hidroalcoólico de própolis verde utilizado neste estudo é comercializado com a denominação CYTOPROPOLIS® (Certificado de Análise em ANEXO I). Por se tratar de um extrato hidroalcoólico, este extrato conta com uma combinação balanceada e concentrada das duas frações da própolis verde, a alcoólica e a aquosa, de forma simultânea. A colheita, manuseio e produção deste extrato conta com métodos de produção padronizados que garantem a homogeneidade da própolis ao longo de todo ano (PHARMA NECTAR), garantindo um produto de qualidade para nossas pesquisas.
4.2. Modelo experimental
Foram utilizados 80 camundongos, da linhagem swiss, fêmeas, com idade de 6 semanas, fornecidos pelo Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais utilizados foram mantidos em gaiolas, com no máximo 5 animais por caixa, forradas com maravalha, higienizadas semanalmente, sob condições controladas de temperatura (24°C) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 h), com dieta e água ad libitum. O presente projeto foi submetido e avaliado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), com aprovação sob número de protocolo 2016/56 (ANEXO 2).
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4.3. Delineamento experimental
Os procedimentos experimentais foram iniciados na 6ª semana de vida, na qual os camundongos foram divididos aleatoriamente em 8 grupos:
Após divisão aleatória dos camundongos nas gaiolas, os animais passaram por uma marcação individual com solução de ácido pícrico, tiveram seus pesos coletados em uma planilha e receberam dietas diferenciadas, com 3% (hipoproteica) e 12% de proteína (normoproteica) (REEVES et al., 1992) até o fim do período experimental. Na 10ª semana de vida os camundongos foram submetidos a um procedimento cirúrgico para o implante dos discos de esponjas, ao mesmo tempo, se iniciou a administração diária do extrato hidroalcoólico de própolis verde por gavagem. Após 7 (para os grupos com 7 dias de implantação) e 15 dias (para os grupos com 15 dias de implantação) os animais foram eutanasiados. Todos os animais foram pesados no início e no final do período experimental. A divisão dos animais em grupos;
Grupo NC 7dias
- Dieta normoproteica - Tratamento controle
- Tempo de implantação de 7 dias
Grupo NP 7dias
- Dieta normoproteica - Tratamento com própolis
- Tempo de implantação de 7 dias
Grupo HC 7dias - Dieta hipoproteica - Tratamento controle
- Tempo de implantação 7 dias
Grupo HP 7dias
- Dieta hipoproteica - Tratmento com própolis
- Tempo de implantaçãode 7 dias
Grupo NC 15dias
- Dieta normoproteica - Tratamento controle
- Tempo de implantação de 15 dias
Grupo NP 15dias
- Dieta normoproteica - Tratamento com própolis
- Tempo de implantação de 15 dias
Grupo HC 15dias - Dieta hipoproteica - Tratamento controle
- Tempo de implantação de 15 dias
Grupo HP 15dias - Dieta hipoproteica - Tratamento com própolis
27 os principais procedimentos e seus tempos de execução foram resumidos em forma de delineamento (Figura 2) e linha do tempo (Figura 3).
Figura 2: Delineamento dos grupos experimentais.
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4.4. Preparo e administração das dietas
A dieta hipoproteica, contendo 3% de proteína (caseína) em sua constituição foi padronizada pela equipe de pesquisa, enquanto a dieta normoproteica, contendo 12% de proteína, teve como referência a dieta AIN93M, recomendada para roedores (REEVES et al., 1993). A composição das dietas constituiu-se de ingredientes específicos para roedores e durante seu preparo os ingredientes foram pesados e misturados com as mãos. A massa seca foi peneirada e homogeneizada 3 vezes, e após, foram sendo adicionadas pequenas quantidade de água, enquanto a massa ia se sendo misturada, até obter-se uma massa maleável e firme. Foram formados pellets, que foram dispostos em um grande tabuleiro de aço higienizado e identificado, para secagem em estufa à temperatura de 50ºC por 24h. As rações secas foram reservadas em sacos fechados e identificados. A quantidade de amido da dieta hipoproteica foi ajustado para se obter 1kg de ração. Dieta e água foram oferecidos aos animais ad libitum. As dietas artesanais foram ofertadas aos animais da 6ª semana de vida até a 11ª semana, para os grupos com 7 dias de implantação, e da 6ª até a 12ª semana de vida, para os grupos com 15 dias de implantação.
Tabela 1: Composição das dietas experimentais em gramas, para cada 1000g da dieta
* O teor da caseína usada foi de 80 a 90%
** Mistura de Minerais: NaCl, HI, MgSO47H2O, CaCO3, MnSO4.H2O, FeSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O, KH2PO4 - Reagen.
***Mistura de Vitaminas: Acetato de retinol, colecalciferol5, ácido pamino benzóico, inositol, riboflavina, tiamina HCL, ácido fólico, biotina, cianocobalamina3, α tocoferol, sacarose q.s.p. - Merk.
Ingredientes Grupo Controle Grupo Desnutrido
Amido de milho 645 735 Caseína (*) 120 30 Óleo de soja 40 40 Sacarose 100 100 Fibra 50 50 Mistura de Minerais (**) 35 35 Mistura de Vitaminas (***) 10 10
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4.5. Implante das esponjas
Foram utilizados discos de esponjas de poliéster-poliuretano, com 4 mm de diâmetro, 5 mm de espessura e 4,64 mg de peso (Vitaform, Manchester UK). Os procedimentos envolvendo as esponjas foram baseados em publicações de trabalhos que utilizaram o mesmo tipo de esponja, com a finalidade de desenvolver estudos relacionados ao processo inflamatório. As esponjas foram preparadas (Figura 4A) e colocados em álcool 70ºGL, 24 horas antes das implantações. No dia do implante, as esponjas foram fervidas a 95ºC em água destilada durante 20 minutos. O material cirúrgico para o procedimento de implantação foi previamente autoclavado, conforme treinamento em práticas de higiene e assepsia cirúrgica.
Antes da implantação, os animais foram anestesiados com uma mistura de ketamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg), via intraperitoneal. A região dorsal foi tricotomizada e a assepsia nessa região foi feita com gase umedecida com álcool 70ºGL. Foi realizada uma incisão de cerca de 1 cm de comprimento na pele da região dorso-lombar, em sentido vertical. O tecido subcutâneo foi divulsionado, o implante inserido a cerca de 2 cm acima da região de incisão. Após, o corte foi suturado (MOURA et al., 2011b; LIMA et al., 2014).
4.6. Tratamento
O extrato hidroalcoólico de própolis verde foi adquirido na forma liofilizada. Para o tratamento, o extrato foi pesado e ressuspendido em água, obtendo-se porções com concentrações de 500mg/kg/dia. As porções foram homogeneizadas em vórtex e a administração foi realizada via oral, por gavagem, na qual foi administrada diariamente o volume de 200µl por animal. Para o grupo controle foi administrado o mesmo volume de água autoclavada.
4.7. Eutanásia
No dia da eutanásia, os animais foram anestesiados para coleta de sangue por punção cardíaca e a amostra de sangue foi direcionada para análise hematológica. Logo após os animais receberam uma dose letal de ketamina e xilazina, via intraperitoneal, e as esponjas foram coletadas e encaminhadas para análise histológica. Realizou-se deslocamento cervical após a finalização dos procedimentos, as carcaças foram dispostas em embalagem identificada, que após lacrada foi armazenada em freezer situado no Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX), para posterior descarte, realizado pelo técnico responsável.
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Figura 4A-B: Imagem de esponja antes (A) e após (B) implantação subcutânea.
4.8. Peso - Análise de ganho ou perda ponderal
Com a finalidade de avaliar o estado nutricional e verificar a funcionalidade das dietas hipoproteica e normoproteica, os animais tiveram seus pesos coletados em planilhas. A coleta dos pesos foi realizada durante o início do período experimental e no dia da eutanásia. Através do peso final menos o inicial foi possível obter o ganho ou a perda ponderal durante o período experimental. Os resultados foram planilhados em excel, analisados no programa Graph Pad Prism 5.0 e foram expressos em média de peso (g) por grupo.
4.9. Dosagem de proteínas séricas totais
Para a dosagem de proteínas séricas, foi utilizado o método de Lowry, desenvolvido por Lowry et al. (1951), que foi originalmente proposto por Wu (1922). Este método se baseia na redução de um reagente durante uma reação com as proteínas do soro, que na presença de um catalisador produzem um composto com absorção máxima em 750nm. O método é bastante recomendado, por ser mais sensível, em comparação à outras metodologias, por sua exatidão e por permitir menor consumo de amostras (ZAIA et al., 1998).
Para estabelecer o perfil proteico dos animais foi utilizada uma amostra de sangue, coletada por punção cardíaca, sem anticoagulante. As amostras foram centrifugadas para separação do soro, que foram armazenados a -80ºC, com identificação. No dia da dosagem, as amostras foram mantidas durante todo o momento no gelo. Anterior ao procedimento, realizou-se um teste de diluição, onde efetuou-realizou-se a dosagem de proteínas utilizando somente 1 animal por grupo, com diluições de 10, 20, 30, 40 e 50 vezes, sendo esta última a mais indicada e utilizada para o experimento.
Em microplaca, foram pipetados em todos os poços 200 µl de solução contendo água destilada, sulfato de cobre, citrato de sódio, carbonato de sódio e hidróxido de sódio. Em seguida, foram pipetados 20 µl do branco, 20 µl dos padrões e 20 µl das amostras de soro
31 homogeneizadas. Após, os poços foram homogeneizados com auxílio de pipeta e a placa foi incubada em ambiente sem luz, durante 15 minutos e sob temperatura ambiente. Após, adicionou-se 20 µl de solução de folin ciocalteu em todos os poços, homogeneizando com auxílio de pipeta. As amostras foram incubadas em ambiente sem luz, por 30 minutos e em temperatura ambiente. Logo após realizou-se a leitura da placa em espectrofotômetro de microplacas, a 600nm. Após a obtenção das absorbâncias foi gerada a curva de absorbância e realizado o cálculo da quantidade de proteínas, que foi expresso em mg/µl. Os dados foram planilhados em excel e a análise estatística realizada no Graph Pad Prism 5.0.
4.10. Avaliação de parâmetros hematológicos
No dia da eutanásia foi realizada coleta de sangue por punção cardíaca. As amostras foram dispostas em microtubos previamente identificados, contendo 20 ul de EDTA a 10%. A concentração de sangue e EDTA foi determinada por padronização prévia. Após a coleta, o tubo foi homogeneizado lentamente por inversão, e foram retiradas pequenas alíquotas para o filme sanguíneo. Os tubos foram encaminhados para análise hematológica no Laboratório de Análises Clínicas (LAPAC), da Escola de Farmácia, em analisador seminautomático (BIOPLUS 200®) utilizando kits comerciais Labtest®.
As lâminas contendo o filme sanguínei foram coradas com o corante Panótico May-Grunwald/Giensa. Após a secagem realizou-se a contagem de 100 células por lâmina (1 lâmina por animal), considerando: neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, monócitos e basófilos. A análise foi realizada com o auxílio do microscópio óptico, em objetiva de 100 vezes, utilizando óleo de imersão.
4.11. Análise histológica
Após a eutanásia as esponjas foram retiradas, colocadas em cassetes com identificação e foram emergidas em solução formalina 10% para fixação. Em seguida, passaram por processamento manual, no qual ficaram emergidas em soluções crescentes de álcool (70%, 80%, 90%, 100%), sendo 30 minutos em cada álcool, 30 minutos em xilol para diafanização e 30 minutos em parafina à 60ºC. Conseguinte, os tecidos e esponjas foram incluídos em paraplast. A microtomia dos blocos foi realizada em micrótomo semiautomático na espessura de 5 micrômetros. Após confecção das lâminas, estas foram coradas com os corantes histológicos hematoxilina e eosina (HE), em tempos previamente padronizados. Lamínulas foram montadas sobre os cortes, utilizando o meio de montagem Entelan®. As imagens digitais
32 das esponjas foram obtidas com o auxílio de microscópio óptico e câmera de captura AmScope 3.0® UCMOS 3000 através do software Toup View 64x. O estudo histológico das esponjas permitiu analisar o processo inflamatório junto ao tratamento com o extrato hidroalcoólico de própolis verde.
Para a análise quantitativa do infiltrado inflamatório, foram contabilizadas as células totais no interior das esponjas. Foi realizado inicialmente o estudo da variação da instabilidade dos valores médios, pelo qual obteve-se que o número mínimo representativo de campos para quantificação de células foi o de 20 imagens/grupo. Com o auxílio do programa Image J, versão 1.4.3.67, foram contabilizadas as células no interior das esponjas. As contagens foram planilhadas e analisadas no programa Graph Pad Prism 5.0. Os resultados foram expressos em média do número de células/campo.
4.12. Contagem de vasos
Para a contagem dos vasos, foi necessária inicialmente a definição do número mínimo de campos utilizados para as análises, o que foi realizado através do estudo da variação da instabilidade dos valores médios. Nas lâminas representativas do grupo controle foram obtidos 50 campos, dos quais foi realizada a contagem de vasos. Por meio de sorteio, as contagens foram agrupadas em números de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 campos. De acordo com o teste obteve-se que 40 campos/grupo era representativo para a análise de vasos por grupo. A contagem foi planilhada e analisada no programa Graph Pad Prism 5.0. Os resultados foram expressos em média do número de vasos/campo.
4.13. Dosagem de citocinas VEGF e TNF
As esponjas foram retiradas na eutanásia, pesadas, identificadas e armazenadas no -80ºC até o momento da dosagem, quando foram, uma a uma, trituradas em solução de Drabkin. O homogeneizado resultante foi centrifugada por 40minutos, a 10000g e 4ºC. Sobrenadante e pellet foram mantidos a -20ºC. O anticorpo de captura específico para a cada citocina, previamente diluído em PBS, foi adicionado em placa de microtitulação para sensibilização, e após, a placa foi vedada e incubado ao abrigo de luz, a 4ºC, overnigth. No dia seguinte, a placa passou por 4 processos de lavagem com solução tampão e foi adicionado um tampão de bloqueio por 1 hora. Foram adicionados na placa os padrões para a curva, o branco e as amostras diluídas em reagente diluente, após a placa foi incubado ao abrigo de luz, a 4ºC, overnigth. No dia seguinte a placa foi lavada 4 vezes, foi adicionado o anticorpo de detecção para incubação
33 por 2 horas, seguido novamente de 4 lavagens da placa. Em seguida, realizou-se a adição de streptavidina nas amostras que foram encubadas por 20 minutos e lavadas com tampão de lavagem. Adicionou-se tampão citrato fosfato, dihidrocloreto de fenilenodiamina (OPD - O-Phenylenediamine Dihydrochloride) e peróxido de hidrogênio por 20 a 60 minutos, até que fossem observadas as diferenças de cor na curva. A leitura das amostras foi realizada em espectrofotômetro a 490nm. Os resultados foram expressos em pictogramas (pg)/mg de tecido.
4.14. Análise estatística
A determinação do número de animais por grupo foi dado pelo software Bioestat 5.3. Todos resultados obtidos foram planilhados e as análises estatísticas foram realizadas no programa Graph Pad Prism 5.0. A distribuição dos dados é não normal, segundo o teste de normalidade. Foi utilizado o teste t e o teste Mann Whitney para dados independentes e não normais. O intervalo de confiança considerado foi de 95% e os dados foram expressos em média ± desvio padrão e número de animais no grupo. Os dados obtidos foram considerados significativos quando o valor de P foi <0,05. Os grupos foram comparados da seguinte forma:
✓ NC versus NP; ✓ HC versus HP; ✓ NC versus HC; ✓ NP versus HP.
34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Peso
5.1.1. Análise de ganho ou perda ponderal
Ao avaliar o peso dos animais (Figura 5), observamos que, com 7 dias de implantação das esponjas (Figura 5A) os grupos que receberam a dieta hipoproteica, HC (-0.3250 ± 1.887, N=4) e HP (-11.80 ± 1.035, N=4), apresentaram redução do peso corporal, em comparação aos grupos com dieta normoproteica, NC (7.260 ± 0.9574, N=5) e NP (6.500 ± 0.9028, N=5), que apresentaram ganho significativo de peso (Figura 5A).
Ao avaliar o tempo de 15 dias de implantação das esponjas (Figura 5B) o grupo HC (-1.686 ± 3.401 N=5) apresentou significativa redução de peso corporal, quando comparado ao grupo NC (12.00 ± 1.387, N=5), que obteve ganho de peso. O grupo HP (3.952 ± 0.9751, N=5) obteve ganho de peso, porém, menor, quando comparado ao grupo NP (9.760 ± 0.9527, N=5). Os valores do grupo NC, em ambos os tempos, serviram como valores normais de referência.
Figura 5: Média de ganho e perda de peso dos grupos experimentais com 7 (Figura 5A) e 15 dias (Figura 5B) de
implantação e tratamento. No eixo y estão representados os pesos em gramas (g) e no eixo x estão representados os grupos: grupo com dieta normoproteica e tratamento controle (NC); dieta normoproteica e tratado com própolis (NP); dieta hipoproteica e tratamento controle (HC); dieta hipoproteica e tratado com própolis (HP). As diferenças significativas (p<0,05) estão representadas em linhas conectoras.
De forma semelhante aos nossos resultados, no qual os animais submetidos a dieta hipoproteica apresentaram perda significativa de peso (Figura 5), Araújo et al. (2006) investigaram a ação da deficiência proteica no plexo mesentérico e no cólon descendente de ratas jovens. A dieta utilizada neste estudo continha 4% de proteína em sua constituição, foi ofertada por 12 semanas e não só acarretou na interrupção do ganho de peso corporal, como também em perda significativa de peso, com relação ao peso inicial dos animais (ARAÚJO et al., 2006). 5A 5B N C N P H C H P - 2 0 - 1 0 0 1 0 2 0 E v o lu ç ã o d o p e s o 1 5 d ia s ( g ) N C N P H C H P - 2 0 - 1 0 0 1 0 2 0 E v o lu ç ã o d o p e s o 7 d ia s ( g )
35 Os resultados do trabalho de Qureshi e Qureshi (2001) também se assemelham aos nossos achados. Neste estudo, ratos foram submetidos a desnutrição proteica por 3 a 6 semanas e os resultados indicaram mudanças significativas nos pesos destes animais, desde a primeira semana com a dieta experimental. Sabe-se que uma dieta com déficit proteico pode resultar em redução no diâmetro das fibras musculares, o que contribui para a perda de peso (NASCIMENTO et al., 1990). O peso corporal é uma medida simples da massa total dos componentes do corpo e sua alteração em animais submetidos a dieta hipoproteica já é um resultado bem documentado (HAYDOCK et al.,1988; NASCIMENTO et al., 1990; QURESHI, QURESHI, 2001; SILVA et al., 2014). Desta forma, podemos afirmar a eficácia do procedimento em gerar um insulto nutricional.
Contudo, a evolução do peso do grupo HP se destacou: no tempo de 7 dias este grupo apresentou uma perda de peso significativa, enquanto no tempo de 15 dias o mesmo grupo deixou de perder peso e apresentou uma grande recuperação do peso ponderal (Figura 5). Considerou-se essencial uma melhor análise do efeito do extrato hidroalcoólico de própolis verde sobre o parâmetro peso e para tal, foi realizada uma análise comparativa do ganho de peso entre os grupos, do 7º para o 15º dia, a fim de verificar a evolução destes pesos de um tempo em relação à outro (Figura 6).
5.1.2. Análise da evolução ponderal entre os tempos de 7 e 15 dias de implantação
A análise do ganho de peso entre os tempos de 7 e 15 dias (Figura 6), evidenciou que, os grupos com dieta normoproteica, NC e NP, apresentaram um ganho significativo de peso do 7º (NC: 7.260 ± 0.9574, N=5; NP: 6.500 ± 0.9028, N=5) para o 15º dia de implantação (NC: 12.00 ± 1.387, N=5; NP: 9.760 ± 0.9527, N=5). Quanto aos grupos com dieta hipoproteica, o grupo HC não apresentou alteração significativa de peso entre os tempos avaliados, no entanto, o grupo HP apresentou, do 7º (HP: -11.80 ± 1.035, N=4) para o 15º dia (HP: 3.952 ± 0.9751, N=5), uma relevante recuperação do peso ponderal, uma média de 15,752g.
36 Figura 6: Análise da média de ganho ou perda de peso entre os tempos experimentais de 7 (Figura 5A) e 15 dias
(Figura 5B) de implantação e tratamento. Os pesos foram expressos em gramas no eixo y, enquanto o eixo x representa os tempos de implantação (7 e 15 dias). Cada grupo é indicado por uma linha com uma cor correspondente: grupo com dieta normoproteica e tratamento controle (NC) na cor azul; dieta normoproteica e tratado com própolis (NP) na cor verde; dieta hipoproteica e tratamento controle (HC) na cor vermelha; dieta hipoproteica e tratado com própolis (HP) na cor amarela. As diferenças significativas (p<0,05) entre os tempos foram indicadas em asteriscos (*).
A análise entre os tempos nos permitiu avaliar que, os grupos NC e NP apresentaram ganho de peso, do 7º para o 15º dia; o grupo HC manteve o peso ponderal e o grupo HP obeteve um ganho considerável de peso, do 7º para o 15º dia de implantação e tratamento. O grupo HP se destaca quanto a capacidade de recuperação do peso, o que evidencia o efeito do extrato hidroalcoólico da própolis verde neste parâmetro.
Estes resultados se assemelham aos de Gheisari et al. (2017), que estudaram os efeitos do extrato etanólico da própolis verde como uma alternativa aos antibióticos promotores de crescimento utilizados em frangos, utilizando as doses de 50, 100, 200 e 300 mg/kg do extrato etanólico de própolis, durante 42 dias. Os resultados deste trabalho evidenciaram que, a administração diária do extrato etanólico de própolis verde aumentou o peso corporal dos frangos e estimulou a ingestão diária dos animais, em comparação ao grupo controle (GHEISARI et al., 2017). De forma similar, nossos resultados também demonstram que o extrato hidroalcoólico da própolis verde exerceu efeito positivo no restabelecimento do peso corporal dos animais no modelo estudado.
* * * 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 N C N P H C H P D i a s a p ó s I m p l a n t a ç ã o E v o lu ç ã o d o p e s o e n t r e 7 e 1 5 d ia s ( g )
