UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP FACULDADE DE CIÊNCIAS APLICADAS – FCA
ISADORA CAROLINA BETIM PAVAN
CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE PROTEÍNAS DE INTERAÇÃO
DAS DIFERENTES ISOFORMAS DE S6Ks
LIMEIRA – SP 2017
ISADORA CAROLINA BETIM PAVAN
CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE PROTEÍNAS DE INTERAÇÃO
DAS DIFERENTES ISOFORMAS DE S6Ks
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de pós-graduação da Faculdade de Ciências Aplicadas da Universidade Estadual de Campinas (FCA-UNICAMP) como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo, com área de concentração em Metabolismo e Biologia Molecular.
Orientador: Dr. Fernando Moreira Simabuco
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA ISADORA
CAROLINA BETIM PAVAN E ORIENTADA
PELO DR. FERNANDO MOREIRA
SIMABUCO.
LIMEIRA – SP 2017
Autora: Isadora Carolina Betim Pavan.
Título: Caracterização funcional de proteínas de interação das diferentes isoformas de S6Ks.
Natureza: Pesquisa na área de Metabolismo e Biologia Molecular.
Instituição: Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas.
Aprovado em: Limeira, 30/08/2017.
Presidente: Dr. Fernando Moreira Simabuco Faculdade de Ciências Aplicadas (FCA/UNICAMP)
(Orientador)
Profa. Dra. Patrícia de Oliveira Prada
Faculdade de Ciências Aplicadas (FCA/UNICAMP)
Dra. Sandra Martha Gomes Dias
Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (LNBio/CNPEM)
A Ata de Defesa foi devidamente assinada pelos membros da Comissão Examinadora e consta no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por todas as oportunidades que me proporcionou, pela saúde e pelas pessoas especiais que colocou em meu caminho.
À minha família, Isidoro, Maria, Leopoldo, Rodolpho e Ionara, por todo suporte, estrutura, carinho e caráter que foi transmitido para mim.
Ao meu orientador Dr. Fernando Moreira Simabuco, por todo apoio, incentivo e respeito, por ser uma pessoa que posso contar em todos os momentos da minha vida. Agradeço todos seus ensinamentos, os quais foram e ainda serão muito úteis para minha vida profissional. Enfim, gostaria de agradecer infinitamente por ter sido um ótimo orientador e também pela amizade e confiança construída.
Agradeço em especial, os alunos de iniciação científica, Fernando Riback e Ana Paula Morelli, por toda a ajuda conferida, amizade, companheirismo e bons momentos, que fizeram com que o trabalho ficasse mais fácil e divertido.
A todos os meus amigos e colegas do Laboratório de Distúrbios do Metabolismo (LabDiMe), Josiane Érica, Suleyma Costa, Pamela Lanza, Camila Mendes, Isabela Lorizola, Tamires Santos, Julia Sartori, Andressa Reginato, Mariana Portovedo, Thais de Fante, Mariana Tavares e Alana Veras, os quais, de alguma forma, me auxiliaram e me estimularam a concluir esse trabalho.
Agradeço a Faculdade de Ciências Aplicadas (FCA-UNICAMP) e todo sеυ corpo docente, por todo o conhecimento transmitido, que foram fundamentais para a minha formação acadêmica. Em especial, agradeço aos docentes, Marcio Torsoni, Adriana Torsoni, Marciane Milanski e Rosangela Bezerra, por cederem espaço em seus laboratórios para execução desse projeto. Além disso, agradeço ao professor Augusto Ducati Luchessi e seus alunos por toda a colaboração e conhecimento transmitido.
Em especial, as minhas amigas da graduação, Leticia Tamborlin, Kamila Ramponi e Karina Martins, por toda amizade e companheirismo, por serem pessoas que posso contar a qualquer momento.
A todos os amigos e amigas que me acompanharam até aqui, que de alguma forma, me propiciaram bons momentos e conforto nas horas difíceis.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento das bolsas de iniciação científica e mestrado.
“A persistência é o caminho do êxito.” Charles Chaplin
RESUMO
Introdução: A via de sinalização da mTOR vem sendo relacionada a várias doenças e desordens metabólicas em humanos, incluindo obesidade, diabetes, vários tipos de câncer e neurodegeneração. As proteínas S6Ks têm mostrado importante papel na sinalização da mTOR, funcionando como efetoras dessa via. A família das S6Ks é composta por dois genes, RPS6KB1 e RPS6KB2, sendo que o primeiro codifica as isoformas p85- e p70-S6K1, enquanto que o segundo codifica as isoformas denominadas p56- e p54-S6K2. Este estudo investigou as parceiras de interação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 em células HEK293, com objetivo de diferenciar essas proteínas de acordo com seus envolvimentos em processos biológicos. Além disso, foi investigada mais detalhadamente a interação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 com as proteínas eIF2α e PARP1. Justificativa: Acreditava-se que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 apresentavam funções biológicas redundantes, uma vez que possuem um elevado grau de similaridade entre si. Dessa forma, poucos estudos têm como objetivo identificar diferentes funções e envolvimentos dessas isoformas em processos biológicos. Entretanto, descobrir as diferentes funções dessas proteínas pode ter grande importância para estudos que investigam novas estratégias para desenvolver terapias para certos tipos de doenças, como o câncer. De forma geral, esse trabalho contribui para um melhor entendimento da via mTOR/S6Ks. Resultados: Nos primeiros dados obtidos desse estudo, que geraram um artigo científico publicado na revista Proteomics em 2016 (Anexo I), foi observado, por espectrometria de massas, que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 possuem diferentes proteínas de interação e que atuam em diferentes processos biológicos, indicando que tais isoformas possuem funções biológicas distintas. Algumas parceiras de interação, eIF2α, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 e WDR77, foram escolhidas para que suas relações com as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 fossem estudadas de forma mais detalhada. Alguns experimentos de imunoprecipitação foram realizados mostrando evidências da interação entre p70-S6K1 e p54-S6K2 com a proteína eIF2α, e somente p54-S6K2 com a proteína PARP1. Em uma situação de estresse celular, eIF2α é fosforilada no seu resíduo serina 52 (S52), acarretando na inibição da síntese protéica global e no estimulo da autofagia e apoptose. Identificamos que eIF2α apresenta um sítio de fosforilação predito das S6Ks (RXRXXT/S) em serina 58 (S58), sendo este
conservado em uma variedade de espécies. Ensaios de imunoprecipitação revelaram que eIF2α é fosforilada em um sítio RXXT/S na presença de insulina. Além disso, foi visto que a ativação das S6K1 e S6K2 através de insulina e somente S6K2 através de FGF2 está diretamente relacionada com a redução na fosforilação de eIF2α em serina 52. Por outro lado, inibidores farmacológicos de mTOR e S6Ks, como a rapamicina e o PF4708671, respectivamente, estão associados com o aumento dos níveis de fosforilação de eIF2α (S52). Também foi realizada a superexpressão de p70-S6K1 e p54-S6K2 constitutivamente ativas e foi visto redução da fosforilação de eIF2α (S52). Por fim, foi realizado um ensaio de mutação sítio dirigida em eIF2α, mimetizando uma fosforilação no resíduo 58 de eIF2α. Como resultado, observamos que a fosforilação constante no resíduo 58 está acompanhado de uma redução da fosforilação do resíduo S52. Conclusões: Este estudo mostrou que diferentes isoformas de S6Ks possuem distintas proteínas de interação, indicando que tais isoformas possuem funções biológicas distintas na célula. Os resultados ainda sugerem que as S6Ks podem fosforilar eIF2α em serina 58, e devido a proximidade dos sítios, possa haver uma inibição da fosforilação em serina 52, regulando assim a atividade de eIF2α.
ABSTRACT
Introduction: The mTOR signaling pathway has been related to several diseases and metabolic disorders in humans, including obesity, diabetes, several types of cancer and neurodegeneration. The S6Ks proteins have shown an important role in mTOR signaling, acting as effectors of this pathway. The S6Ks family is composed of two genes, RPS6KB1 and RPS6KB2. RPS6KB1 encodes two isoforms: p85- and p70-S6K1, while RPS6KB2 encodes two other isoforms, known as p56 and p54-S6K2. This study investigated the interaction partners of p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms in HEK293 cells, in order to differentiate these proteins according to their involvement in biological processes. Furthermore, it was investigated in more detail the interaction of p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms with eIF2α and PARP1 proteins. Justification: It was believed that S6K1 and S6K2 exhibited redundant biological functions, since they have a high degree of similarity. Thus, few studies aim to identify different roles and implications of these isoforms in biological processes. However, discovering different functions of these proteins may have great importance for the investigation of new strategies to develop therapies for certain types of diseases such as cancer. In general, this work contributes to a better understanding of the mTOR / S6Ks pathway. Results: The first data obtained from this study, which generated a scientific article published in the journal Proteomics in 2016 (Annex I), it was observed, by mass spectrometry, that the p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms have different interaction proteins and act in different biological processes, indicating that such isoforms have distinct biological functions. Some partner interaction, as eIF2α, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 and WDR77, were chosen for its relations with the p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms were studied in more detail. Some immunoprecipitation experiments were performed showing evidence of the interaction between p70-S6K1 and p54-S6K2 with the eIF2α protein, and only p54-S6K2 with the PARP1 protein. In a situation of cellular stress, eIF2α is phosphorylated at its serine residue 52 (S52), leading to the inhibition of global protein synthesis and the stimulation of autophagy and apoptosis. We have identified that eIF2α has a predicted phosphorylation site of S6Ks (RXRXXT/S) at serine 58 (S58), which is conserved in a variety of species. Immunoprecipitation assays revealed that eIF2α is phosphorylated at RXXT/S site in the presence of insulin. In addition, it was shown that the activation of S6K1 and S6K2 through
insulin and only S6K2 through FGF2 is directly related to the reduction in eIF2α phosphorylation in serine 52. Conversely, pharmacological inhibitors of mTOR and S6Ks, such as rapamycin and PF4708671, respectively, are associated with increased of eIF2α phosphorylation levels at S52. The overexpression of constitutively active p70-S6K1 and p54-S6K2 was also performed and reduction of the phosphorylation of eIF2α (S52) was seen. Finally, a site-directed mutation assay was performed on eIF2α, mimicking a phosphorylated residue 58 of eIF2α. As a result, we observed that constant phosphorylation at residue 58 is accompanied by a reduction of phosphorylation of residue S52. Conclusions: This study demonstrated that S6Ks isoforms present different interacting proteins, indicating that those isofroms present distinct biological functions in the cell. The results also suggest that S6Ks can phosphorylate eIF2α in serine 58, and due to the proximity of the sites may be an inhibition of the phosphorylation of serine 52, thereby regulating the activity eIF2α.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. A via de sinalização mTOR/S6K...23 Figura 2. S6K1 e S6K2 são proteínas homólogas, mas que apresentam diferenças na organização da estrutura primária...24 Figura 3. Modelo convencional de ativação das S6Ks...25 Figura 4. Mecanismo de regulação da síntese protéica através do complexo ternário (eIF2)...27 Figura 5. Vetores plasmidiais...32 Figura 6. Amplificação dos genes de interesse e screening da clonagem dos subprodutos da PCR no vetor pGEM...40 Figura 7. Screening da incorporação do peptídeo HA no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA 3.1 (+)...41 Figura 8. Screening da clonagem dos genes de interesse no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA...42 Figura 9. Superexpressão das proteínas recombinantes fusionadas ao HA em células HEK293...43 Figura 10. Análises in silico predizem que as S6Ks podem ser novas quinases de eIF2α...45 Figura 11. Ensaios de imunoprecipitação mostram interações das S6Ks e eIF2α em células HEK293...46 Figura 12. eIF2α é fosforilada no resíduo RXXT/S na presença de insulina...47 Figura 13. Tratamento com insulina e FGF2 reduz a fosforilação de eIF2α no resíduo 52 em células HEK293...48 Figura 14. Superexpressão das proteínas S6Ks constitutivamente ativas reduz a fosforilação de eIF2α em serina 52...50 Figura 15. Inibição de mTOR/S6Ks por rapamicina retoma a fosforilação de eIF2α no resíduo 52...51 Figura 16. Ativação de S6K2 causa alteração na fosforilação de eIF2α no resíduo 52...52 Figura 17. Mutação no resíduo 58 de eIF2α modula a fosforilação do resíduo 52...53 Figura 18. Análise da fosforilação de eIF2α, S6K1 e S6 após tratamento com salubrinal, arsenito e ISRIB...54 Figura 19. PARP1 pode interagir com S6K2 através de modificações
pós-traducionais “parilação”...55 Figura 20. Clonagem e expressão dos domínios de quinase, N- e C- terminal das S6Ks fusionados ao epítopo FLAG...56 Figura 21. Mecanismo proposto de regulação de eIF2α através das S6Ks...59
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPK 5' AMP-activated protein kinase
ATF3 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-3
ATF4 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4
ATG7 Autophagy related 7
ATP Adenosine triphosphate
AUG Start codon, adenine, uracila e guanine
BAD Bcl2-associated agonist of cell death
C C-terminal
CA Constitutivamente ativo
CBP80 Nuclear cap-binding protein subunit 1
CCTβ T-complex protein 1 subunit beta
cDNA DNA complementar
CHOP DNA damage-inducible transcript 3 protein
CK2 Casein Kinase 2
CREM cAMP-responsive element modulator
DK Dominio de quinase
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
eEF2K Eukaryotic elongation factor 2 kinase
eIF1 Eukaryotic translation initiation factor 1
eIF1A Eukaryotic translation initiation factor 1A
eIF1B Eukaryotic translation initiation factor 1B
eIF2 Eukaryotic Initiation Factor 2
eIF2α Eukaryotic translation initiation factor α
eIF2γ Eukaryotic translation initiation factor γ
eIF3 Eukaryotic translation initiation factor 3
EIF4B Eukaryotic translation initiation factor 4B
4E-BP1 Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1
EPRS Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase
ER Endoplasmatic reticulum
ERK1/2 Mitogen-activated protein kinase 3
ERα Estrogen receptor α
FL Full length
FMRP Synaptic functional regulator FMR1
FOXO1 Forkhead box protein O1
FXR1 Fragile X mental retardation syndrome-related protein 1
GCN2 eIF-2-alpha kinase GCN2
GDP Guanosina Difosfato
GEF Guanine nucleotide Exchange Factor
GRP75 75 kDa glucose-regulated protein
GSK2 Shaggy-related protein kinase GSK2
GTP Guanosina Trifosfato
H1 Histone H1
HEK293 human embryonic kidney 293
hnRNPF Heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein F
hnRNPs Heterogeneous nuclear Ribonucleoproteins
HRI Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 1
HSPA4 Heat shock 70 kDa protein 4
IB Immnoblotting
ILF3 Interleukin enhancer-binding factor 3
IP Imunoprecipitação
LC3 Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3
Mdm2 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2
Met-tRNA RNA transportador de metionina
mTOR mammalian Target Of Rapamycin
mTORC1 mammalian Target Of Rapamycin complex 1
mTORC2 mammalian Target Of Rapamycin complex 2
MYH10 Myosin-10
N N-terminal
NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide
NAT10 RNA cytidine acetyltransferase
NCL Nucleolin
NF-Kb Factor nuclear kappa B
NLS Nuclear Localization Signal
LISTA DE SIMBOLOS
Α Alpha Β Beta Γ Gamma % Percentual × g Aceleração gravitacional ® Marca registrada µL MicrolitroCO2 Gás carbônico (dióxido de carbono)
dNTP Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
HCl Ácido clorídrico I Isoleucina Kb Quilobase KCl Cloreto de potássio kDa Quilodálton KH2PO4 Fosfato monopotássico L Leucina M Metionina Mg Miligrama MgCl2 Cloreto de magnésio mM Milimolar
Na2HPO4 Fosfato dissódico
NaCl Cloreto de sódio
nM Nanomolar º C Graus Celsius Pb Pares de base PBS Tampão fosfato-salino Ph Potencial hidrogeniônico R Arginina S Serina
SDS Dodecil sulfato de sódio
Tris Tris(hidroximetil)aminometano Triton Polietilenoglicol-terc-octilfenil éter
T Treonina
Tween 20 Monolaurato de polietilenoglicol-sorbitana
U Unidade de atividade enzimática
v/v Volume por volume
V Valina
w/v Peso por volume
X Aminoácido qualquer
SUMÁRIO
RESUMO ... 6
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... 12
LISTA DE TABELAS ... 14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 15
1 INTRODUÇÃO... 21
1.1 A via da mTOR e as proteínas S6K1 e S6K2 ... 21
1.2 A proteína eIF2α e o controle da síntese protéica ... 26
1.3 A proteína PARP1 e suas modificações pós-traducionais ... 28
1.4 Justificativa ... 29 2 OBJETIVOS ... 30 2.1 Objetivo geral ... 30 2.2. Objetivos específicos ... 30 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 32 3.1 Células ... 32 3.2 Plasmídeos ... 32 3.3 Anticorpos ... 33
3.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ... 33
Tabela I. Seqüências de primers utilizados na PCR. ... 34
3.5 Anelamento de primers ... 35
3.6 Clonagem no vetor de entrada pGEM-T ... 35
3.7 Transfecção em células humanas ... 35
3.8 Imunoprecipitação endógena utilizando proteína G acoplada a sepharose. ... 35
3.9 Imunoprecipitação das proteínas alvo fusionadas aos peptídeos HA e FLAG. ... 36
3.10 Tratamentos em células ... 36
3.11 Mutação sítio dirigida ... 37
3.12 Immunoblotting ... 37
4 RESULTADOS ... 38
4.1 Resultados obtidos no estudo de caracterização das diferentes isoformas de S6Ks . 38 4.2 Clonagem e expressão dos genes das proteínas eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B ... 39
4.3 Caracterização da interação entre S6Ks e eIF2α ... 43
4.4 Caracterização da interação entre S6Ks e PARP1 ... 55
4.5 Clonagem dos diferentes domínios de S6K1 e S6K2 ... 56
5 DISCUSSÃO ... 57
5.1 Caracterização das diferentes isoformas de S6Ks ... 57
5.2 Relação de eIF2α e S6Ks ... 58
5.3 Relação de PARP1 e S6Ks ... 61
REFERÊNCIAS ... 64
1 INTRODUÇÃO
1.1 A via da mTOR e as proteínas S6K1 e S6K2
O alvo da rapamicina em mamíferos, a proteína mTOR, é estimulado por aminoácidos, ATP, insulina e fatores de crescimento, sendo todos esses estímulos indicadores de abundância de nutrientes (figura 1; Tavares et al., 2015). Dessa forma, mTOR regula a homeostase e o crescimento celular. A via de sinalização de mTOR controla muitos processos celulares que geram ou utilizam grandes quantidades de energia e nutrientes. É cada vez mais evidente que a via da mTOR tem impacto em importantes funções celulares, tendo, portanto, uma grande relevância na regulação de comportamentos celulares básicos, como crescimento e proliferação. Desregulações na via da mTOR estão relacionadas com algumas doenças em humanos, como por exemplo, câncer, obesidade, diabetes tipo 2 e neurodegeneração, sendo assim muito estudada como um alvo terapêutico (Laplante e Sabatini, 2012).
A mTOR interage com várias proteínas para formar dois complexos multiprotéicos, chamados de mTORC1 e mTORC2 (Zoncu et al., 2011). mTORC1 é um complexo sensível a rapamicina, que promove a síntese protéica (Magnuson et al., 2012), inibição da autofagia (Eisenberg- Lerner et al., 2009) e regula a homeostase lipídica (Chakrabarti e Kandror, 2015). Sabe-se que mTORC2 é ativada por fatores de crescimento através de mecanismos ainda pouco esclarecidos. Além disso, mTORC2 é insensível ao tratamento agudo com rapamicina e regula a sobrevivência celular, metabolismo e organização do citoesqueleto. O conhecimento das funções de mTORC2 ainda é muito limitado quando comparado com mTORC1 (Laplante M e Sabatini DM, 2012).
As S6Ks são membros da família de quinases do tipo AGC, juntamente com PKA, PKB (Akt) PKC e PKG. Dois genes de S6K são conhecidos, RPS6KB1 e RPS6KB2, codificando 2 proteínas distintas chamadas de p70-S6K1 e p54-S6K2 (Pavan et al., 2016b). Cada uma dessas proteínas apresenta isoformas geradas pelo uso alternativo de códons AUG de início de tradução, sendo proteínas maiores chamadas de p85-S6K1 e p56-S6K2 (figura 2). O aumento do tamanho de ambas as proteínas acarreta na adição de um sinal de localização nuclear (NLS), o que, entretanto, tem pouco suporte experimental, visto que tais isoformas não são encontradas predominantemente no núcleo das células devido a esse NLS
(Magnuson et al., 2012). Um estudo recente mostrou que a localização da isoforma p85-S6K1 é predominantemente citoplasmática (contradizendo a presença de um NLS em sua seqüência), enquanto que a localização de p70-S6K1 é tanto citoplasmática quanto nuclear, sendo esta última favorecida por sua fosforilação (Rosner e Hengstschläger, 2011). Já para S6K2, ambas isoformas, que apresentam um NLS adicional no C-terminal, aparentam ter uma predominante localização nuclear (Koh et al., 1999) e são caracterizadas ainda por uma região rica em prolina no C-terminal (figura 2).
Modificações pós-traducionais podem ocorrer nas S6Ks, sendo estas: fosforilação, ubiquitinação e acetilação (figura 2). Interessantemente, algumas dessas modificações ocorrem de forma específica para cada isoforma, como por exemplo, a proteína Casein kinase 2 (CK2) fosforila somente a S6K1 no seu domínio N-terminal, ocasionando a sua translocação do núcleo para o citoplasma (Panasyuk et al., 2006). Além disso, a S6K1, e não a S6K2, é capaz de interagir com a Protein phosphatase 2A (PP2A), causando sua desfosforilação e inativação (Peterson et al., 1999). Wang et al (2008) mostrou que ambas S6Ks são ubiquitinadas e que, especificamente, a E3 ubiquitin-protein ligase RBX1, conhecida como ROC1, interage com S6K1, causando sua degradação. Da mesma forma, ambas também são acetiladas pelo complexo p300/PCAF, podendo ocasionar na inibição da fosforilação das S6Ks por mTOR (figura 2, Fenton et al., 2010).
O modelo mais aceito de ativação das S6Ks consiste na fosforilação de quatro principais resíduos no seu C-terminal, S411, S418, S421 e S424, induzindo uma conformação relaxada de suas estruturas (figura 3, Ferrari et al., 1992). Algumas quinases são capazes de fosforilar o C-terminal das S6Ks, sendo estas: ERK, p38, CDC2 e JNK1 (Lehman et al., 2003; Magnuson et al., 2002; Papst et al., 1998; Zhang et al., 2013). Tal evento permite a exposição de regiões internas das S6Ks, as quais podem ser fosforiladas pela mTOR nos resíduos T389 e T388 para S6K1 e S6K2, respectivamente, levando à ativação parcial dessas quinases (Weng et al., 1998). A ativação máxima só é adquirida quando PDK1 fosforila S6K1 e S6K2 na região t-loop em T229 e T288, respectivamente (Magnuson et al., 2012; Pullen et al., 1998). É importante notar que a fosforilação de S6K1 e S6K2 pela mTOR atua como um sítio de ancoragem para a fosforilação de PDK1.
As proteínas S6Ks são conhecidas por fosforilar seus substratos em sítios consenso, que consistem na seqüência de aminoácidos RXRXXT/S ou RXXT/S,
na qual R: arginina, X: um aminoácido qualquer, T: treonina e S: serina. Ambos os sítios podem ser fosforilados por Akt, entretanto as S6Ks têm preferência por fosforilar tal região quando é sucedida pelos aminoácidos metionina (M), valina (V), leucina (L) e isoleucina (I) (Magnuson et al., 2012; Leighton et al., 1995)
Figura 1. A via de sinalização mTOR/S6K. Aminoácidos podem estimular o complexo
mTORC1 através das proteínas VPS34 e Rag GTPases. O metabolismo de glicose aumenta os níveis de ATP, que inibem AMPK, estimulando mTORC1. Insulina e fatores de crescimento ativam a via de sinalização PI3K/Akt, a qual inibe o complexo TSC1/TSC2, estimulando, dessa forma, mTORC1. Ativação de PDK1 e mTORC1 culmina na fosforilação de S6K1 e S6K2, levando a síntese protéica celular. As proteínas em vermelho são oncogênicas e as em azul são supressoras tumorais (Tavares et al., 2015, adaptado).
O principal e mais conhecido alvo de S6K1 é a proteína ribossomal rpS6, da subunidade ribossomal 40S. Fatores de início da tradução, PDCD4 e eIF4B, e de elongação da tradução, eEF2K, são outros alvos conhecidos de S6K1 que explicam em parte o papel dessa proteína no estímulo da síntese protéica.
Figura 2. S6K1 e S6K2 são proteínas homólogas, mas que apresentam diferenças na organização da estrutura primária. Apesar de serem proteínas homólogas, existem
diferenças significativas entre S6K1 e S6K2, visto que compartilham 84% de identidade em seus domínios de quinase, e somente 43% e 59% no N-terminal e C-terminal, respectivamente. Além disso, as S6Ks possuem diferentes modificações pós-traducionais conhecidas, como a fosforilação no domínio N-terminal da S6K1 por CK2 e a fosforilação no C-terminal da S6K2 através da PKC. Ambas quinases são ubiquitinadas e acetiladas. NLS: Sinal de localização nuclear; NTD: Domínio N-terminal; CTD: Domínio C-terminal; P: Resíduo de fosforilação; Pro: Domínio rico em prolina (Pavan et al., 2016b, adaptado).
Alvos e funções adicionais da proteína S6K1 têm sido descritos, como por exemplo: inibição de GSK2, BAD e Mdm2 (envolvidos em sobrevivência e apoptose), estímulo de CREM e ERα (fatores de transcrição), estímulo de SKAR e CBP80 (processamento de RNAm) e interação com CCTβ (complexo de chaperona; Magnuson et al., 2012). Um estudo recente identificou, usando uma abordagem de fosfo-proteômica, novos alvos de S6K1, tais como: GRP75, PGK1 e RACK1 (Jastrzebski et al., 2011).
Entretanto, muitos aspectos da regulação e funções biológicas de S6K2 continuam sendo uma incógnita. De fato, o elevado grau de similaridade entre S6K1 e S6K2 conduziu a maior parte dos estudos na isoforma canônica, p70-S6K1. Entretanto, cada vez mais está ficando evidente que essas proteínas podem ter funções e envolvimentos em processos celulares distintos através de seus diferentes substratos celulares (Pardo e Seckl, 2013).
N KD C N LS p85 p70 -23 1 502 S6K1 P D Z S6K2 KD C N LS p56 p54 -13 1 482 P R O N LS Modificações Pós-traducionais Fosforilação Ubiquitinação Acetilação Ub Ac P PDK1 mTOR PDK1 mTOR P300/PCAF P300/PCAF ROC1 CK2 PKC P P P P P P P P P P P P P P P P Ub Ub Ac P Ac Ac Ub Ub P RO N
Figura 3. Modelo convencional de ativação das S6Ks. A) A interação entre os domínios
N- e C-terminal é autoinibitória. B) A fosforilação em múltiplos resíduos no C terminal das S6Ks permite que ela adquira uma forma relaxada em sua estrutura. C) A mTOR fosforila S6K1 e S6K2 nos resíduos T389 e T388, respectivamente, resultando na sua parcial ativação. D) Por último, PDK1 fosforila S6K1 e S6K2 nos resíduos T229 e T228, respectivamente, causando a ativação máxima das S6Ks (Pavan et al., 2016b, adaptado).
Um estudo demonstrou que S6K2 apresenta alguns parceiros de interação nuclear da família de hnRNPs, tais como hnRNPF, o que de fato correlaciona com sua predominante localização nuclear (Goh et al., 2010). Além disso, outro trabalho demonstra que S6K2, mas não S6K1, apresenta, em algumas células, uma localização próxima ao centríolo, sugerindo uma possível função na divisão celular (Rossi et al., 2007).
O estudo aqui apresentado tem como foco a comparação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2, dados estes que foram publicados na revista Proteomics (Anexo I) e que refletem a caracterização do interactoma dessas diferentes isoformas de S6Ks, o que permitiu inferir as atuações dessas quinases em diferentes processos biológicos (Pavan et al., 2016a).
Sendo assim, como uma continuação do estudo de caracterização, proteínas como eIF2α (Eukaryotic translation initiation factor 2α), PARP1 (poly (ADP-ribose polymerase)), PPM1B (Protein Phosphatase 1B), FXR1 (Fragile X mental retardation syndrome-related protein 1), FMRP (Synaptic functional regulator FMR1), PRMT5 (Protein arginine N-methyltransferase 5) e WDR77 (WD
repeat-containing protein 77) foram escolhidas para serem estudadas suas relações com as proteínas S6Ks, possibilitando um melhor entendimento dos mecanismos de ação e regulação dessas diferentes quinases. O estudo aqui apresentado enfatizou a interação das S6Ks com as proteínas eIF2α e PARP1, uma vez que foram obtidos resultados mais promissores.
1.2 A proteína eIF2α e o controle da síntese protéica
A proteína eIF2α é uma inibidora sistêmica da tradução quando está em seu estado fosforilado no resíduo serina 52. eIF2α interage com mais 2 subunidades, chamadas de eIF2β e eIF2γ, formando o complexo eIF2. Para que ocorra o início da tradução é necessário que eIF2 esteja ligada a um GTP e a um Met-tRNA, formando um complexo ternário. O complexo eIF2 liga-se à subunidade 40S do ribossomo, e, juntamente com os fatores de início de tradução eIF1, eIF1A e eIF3, formam o complexo de pré-iniciação 43S, o qual se liga no RNAm próximo à estrutura Cap 5’ e se desloca na direção 3’ até encontrar o primeiro códon de iniciação (AUG). Uma vez que o códon de início da tradução é identificado, o GTP ligado a eIF2γ é hidrolisado a GDP e fosfato inorgânico (Pi) e o complexo eIF2-GDP dissocia-se do RNAm. A substituição do GDP pelo GTP é feita pela proteína eIF2B, uma GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) sendo um fator necessário para que ocorra outro ciclo de início de tradução (figura 4, Pestova et al., 2001).
Existem quatro quinases conhecidas que são capazes de fosforilar eIF2α em resposta a alterações na concentração de aminoácidos (GCN2), presença de RNA dupla fita (PKR), estresse de retículo endoplasmático (PERK) e ausência de grupo heme (HRI), de forma geral, estados de estresse celular em mamíferos. Uma vez que eIF2α é fosforilada no resíduo 52, há uma forte ligação de eIF2B na proteína eIF2, fazendo com que haja um impedimento na conversão de GDP em GTP, e, conseqüentemente, ocorre o bloqueio da síntese protéica (figura 4). Entretanto, há o aumento da tradução de alguns RNAm específicos que auxiliam na adaptação celular ao estresse, como por exemplo para as proteínas ATF4, ATF3 e CHOP (Kedersha e Anderson, 2007).
Figura 4. Mecanismo de regulação da síntese protéica através do complexo ternário (eIF2). O complexo ternário, composto pelas subunidades α, β e γ, um RNA transportador
de metionina (Met-tRNA) e também na sua forma ligada ao GTP, o qual é adicionado ao complexo pela proteína eIF2B, participa do início de tradução de proteínas. Esse complexo se desloca no RNA mensageiro (RNAm) no sentido 5’-3’ até encontrar o start códon (AUG), ocorrendo a hidrólise do GTP em GDP e Pi e dissociando-se do RNAm. O mecanismo de início da tradução através do complexo ternário é inibido uma vez que uma condição de estresse celular ativa quinases conhecidas de eIF2α (PKR, PERK, HRI e GCN2), levando à fosforilação da subunidade α de eIF2 no resíduo serina 52, impedindo a função de eIF2B. Sendo assim, em uma situação de estresse celular há a inibição da síntese protéica global através da fosforilação de eIF2α (S52).
Os grânulos de estresse são formados por uma variedade de estímulos de estresse celular, como por exemplo, hipóxia, estresse de retículo, alteração na temperatura, entre outros (Kedersha e Anderson, 2007). Estudos mostram que a formação dos grânulos de estresse, que é precedido pela fosforilação de eIF2α (S52), inibe a síntese protéica por um mecanismo de retenção de TORC1 e mTORC1, em leveduras e em células humanas, respectivamente (Thedieck et al., 2013). Uma vez que mTOR está seqüestrada nos grânulos de estresse, há uma redução na fosforilação de S6Ks e mTOR deixa de inibir 4E-BP1, uma proteína inibidora da síntese protéica (Heberle et al., 2014).
O trabalho de Pavan et al (2016a) mostra que a isoforma p54-S6K2 pode apresentar localização endógena em grânulos de estresse. Nesse trabalho foi sugerida a existência de uma relação entre as S6Ks e eIF2α no controle da síntese protéica em um estado de estresse celular. Sendo assim, o presente estudo
β α γ 3’ 5’ GTP Met-tRNA β α γ Met-tRNA GDP + Pi A U G eIF2B β α γ GTP GTP Complexo ternário (eIF2) CONDIÇÃO NORMAL Quinases de eIF2α (PKR, PERK, HRI e GCN2) ESTRESSE CELULAR S52 P RNAm
investigou a interação das S6Ks e eIF2α, de forma a identificar uma possível regulação da atividade dessas proteínas.
1.3 A proteína PARP1 e suas modificações pós-traducionais
A PARP1 é uma proteína multifuncional nuclear que atua, principalmente, como um sensor de dano ao DNA. Uma vez que PARP1 encontra uma região do DNA danificada, é recrutada uma série de proteínas de reparo de DNA para o sítio identificado (Malyuchenko et al., 2015). PARP1 é um dos principais membros da família das PARPs e atua realizando uma modificação pós-traducional denominada “parilação”, a qual consiste na transferência de um ou vários grupos de ADP-ribose provenientes do NAD+ para a proteína-alvo em resíduos de aspartato, glutamato e lisina, de forma covalente, alterando suas características físicas e enzimáticas devido à elevada carga negativa dessas estruturas (Jiang et al., 2015).
Sendo assim, PARP1 apresenta uma grande relevância em modificações pós-traducionais de várias proteínas e participação em vários processos celulares, como por exemplo, progressão do ciclo celular, reparo de DNA, manutenção da integridade genômica e apoptose (Malyuchenko et al., 2015).
Recentemente, vários motivos específicos de proteínas foram encontrados de forma a interagir de maneira não covalente com os polímeros de ADP ribose (PAR), alterando também as funções e interações dessas proteínas (Miwa et al., 2016). Interessantemente, um estudo teve como objetivo identificar as proteínas que se ligam não covalentemente com os monômeros ou polímeros de ADP-ribose, e, dessa forma, foi evidenciado, através de análises in silico, que S6K1 e S6K2 apresentam o sítio de ligação não covalente a poli-ADP ribose (Gagné et al., 2008), representado pela seqüência HXBXHHBBHHB, onde “H” são os aminoácidos hidrofóbicos, “B” resíduos básicos e “X” qualquer aminoácido (Pleschke et al., 2000).
PARP1 apresenta um domínio, denominado auto-modificação, que é alvo para várias modificações, como parilação, fosforilação, sumoilação, acetilação e ubiquitinação, as quais regulam a atividade de PARP1. Um estudo evidenciou que ERK1/2 fosforila PARP1, acarretando na sua ativação, e, conseqüentemente, na morte celular neuronal em respostas a neurotoxinas (Kauppinen et al., 2006).
do interactoma da isoforma p54-S6K2. Dessa forma, o presente estudo investigou a interação das S6Ks e PARP1 de forma a descobrir um possível mecanismo de regulação da atividade dessas proteínas.
1.4 Justificativa
Uma vez que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 são proteínas homológas, a maior parte dos estudos se concentra em investigar somente as funções de p70-S6K1, a qual é a isoforma canônica das S6Ks. Dessa forma, pouca informação na literatura existe sobre a isoforma p54-S6K2. Entretanto, como já mencionado, as isoformas de S6K2 apresentam estruturas específicas que não ocorrem em S6K1, como por exemplo, o sinal de localização nuclear na sua região C-terminal, domínios WW e SH3, que influenciam nas suas proteínas de interação celular. Sendo assim, descobrir as diferentes funções dessas proteínas pode ter grande importância para estudos que investigam novas estratégias para desenvolver terapias para certos tipos de doenças, como o câncer. De forma geral, esse trabalho contribui para um melhor entendimento da via mTOR/S6Ks.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Realizar uma análise comparativa das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2, de forma a diferenciar o interactoma dessas proteínas e identificar novas parceiras de interação, permitindo uma melhor compreensão de seus diferentes mecanismos moleculares de ação e regulação.
2.2. Objetivos específicos
1) Caracterizar o interactoma das diferentes isoformas de S6Ks, p70-S6K1 e p54-S6K2, identificando possíveis novos alvos ou proteínas reguladoras e funções biológicas distintas (anexo I);
2) Construção de um vetor plasmidial capaz de expressar proteínas recombinantes em células eucarióticas, pcDNA-HA;
3) Clonagem e expressão de algumas possíveis proteínas de interação das S6Ks, eIF2α, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 e WDR77, fusionadas ao epítopo HA;
4) Validação da interação dessas proteínas por immunoblotting, imunoprecipitação reversa e imunofluorescência;
5) Análise in silico das possíveis proteínas de interação das S6Ks;
i. Identificar a presença de sítios preditos de fosforilação das S6Ks (RXRXXT/S) nas possíveis proteínas de interação identificadas por espectrometria de massas;
ii. Alinhamento da seqüência de aminoácidos para identificar se tais sítios encontram-se conservados em diferentes espécies;
ou inibidores como PF4708671 e rapamicina podem afetar a interação e ativação de algumas dessas proteínas com as S6Ks;
7) Analisar se as possíveis novas proteínas de interação podem regular a atividade das S6Ks;
8) Clonagem dos domínios protéicos das diferentes isoformas de S6Ks para validar a região de ligação das interações.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
A metodologia referente à caracterização dos interactomas de diferentes isoformas de S6Ks se encontra no anexo I. A metodologia aqui apresentada é específica para a segunda estapa deste estudo, que envolveu a caracterização da relação de S6Ks com PARP1 e eIF2α.
3.1 Células
Células HEK293 foram cultivadas em DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) contendo 10 % de FBS (Fetal Bovine Serum) a 37 ºC, sob atmosfera de 5 % de CO2.
3.2 Plasmídeos
Os seguintes plasmídeos foram utilizados:
Figura 5. Vetores plasmidiais. A) O vetor pcDNA-HA, utilizado para a clonagem e
superexpressão dos genes PRMT5, WDR77, PARP1, eIF2α, FXR1, FMRP, rpS6 e PPM1B. B) O vetor pFLAG, utilizado para a clonagem e superexpressão de p70-S6K1 e p54-S6K2. Ambos os vetores foram originados do vetor pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen®) para a adição dos respectivos epítopos. C-D) Os vetores de superexpressão da S6K1 e S6K2 constitutivamente ativos (Addgene®).
A) B)
3.3 Anticorpos
Para a realização das técnicas de immunoblotting e imunoprecipitação foram empregados os seguintes anticorpos primários específicos: Phospho-p70 S6 Kinase (Thr389; 1:2.000; Cell Signaling®), p70 S6 Kinase (1:2.000; Cell Signaling®), Phospho S6 Ribosomal Protein (1:2.000; Cell Signaling®), S6 Ribosomal Protein (1:2.000; Cell Signaling®), Phospho mTOR (Ser2448; 1:2.000; Cell Signaling®), mTOR Antibody (1:2.000; Cell Signaling®), Phospho eIF2α Antibody (1:2.000; Cell Signaling®), eIF2α Antibody (1:2.000; Cell Signaling®), PARP (46D11) Rabbit mAb (1:2.000, Cell Signalling®), p70 S6 Kinase 2 (S6K2) Antibody (1:2.000; Cell Signaling®), Anti-PAR (Ab-1) Mouse mAb (1:2.000; Cell Signaling®), Monoclonal anti-FLAG (1:5.000; Sigma-Aldrich®), Monoclonal anti-FLAG (1:5.000; Sigma-Aldrich®), (Anti-ATG7 A2856 (1:2.000; Sigma-Aldrich®); Phospho Akt Substrate (RXXT/S; 1:2.000; Cell Signaling®).
3.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A reação de PCR foi realizada seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen®), utilizando na reação 10 mM de dNTP, tampão 10X, mix de primers 10 mM cada, 50 mM de MgCl2, 1 µL de cDNA, 1,5 U de Platinum Taq DNA
Polimerase® e água ultrapura. A reação foi feita nas seguintes condições:
desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos, seguida de 35 ciclos com 3 etapas: desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 55 ºC por 30 segundos e extensão a 72 ºC (1 minuto por kB do gene). A tabela abaixo mostra as seqüências dos primers utilizados:
Tabela I. Seqüências de primers utilizados na PCR.
Códon em verde: Start codon / Códon em vermelho: Stop codon
Nome Seqüência Sítio
p70-S6K1 forward 5’ AGGATCCATGGCAGGAGTGTTTGACATAGACC 3’ BamHI p70-S6K1 reverse 5’ ACTCGAGTCATAGATTCATACGCAGGTGCTCTG 3’ XhoI p54-S6K2 forward 5’ AGGATCCATGGCGGCCGTGTTTGATTTGG 3’ BamHI p54-S6K2 reverse 5’ ACTCGAGTTCCTAGCGCCCTGGACGCC 3’ XhoI eIF2α forward 5’ AACGCGTAAGGATCCAGAATGCCGGGTCTAAGTTGTAG 3’ MluI/BamHI eIF2α reverse 5’ AGCGGCCGCGTTAATCTTCAGCTTTGGCTTCCA 3’ NotI FXR1 forward 5’ AACGCGTAAGGATCCAACATGGCGGAGCTGACG 3’ MluI/BamHI FXR1 reverse 5’ AGCGGCCGCTTATGAAACACCATTCAGGACTGC 3’ NotI FMRP forward 5’ AACGCGTAGAATTCAATGGAGGAGCTGGTGGTGGAAG 3’ MluI/EcoRI FMRP reverse 5’ AGCGGCCGCTTAGGGTACTCCATTCACGAGTGG 3’ NotI PARP forward 5’ AACGCGTAAAGATCTATGGCGGAGTCTTCGGATAA 3’ MluI – BglII PARP reverse 5’ AGCGGCCGCCCCAATTACCACAGGGAGGTC 3’ NotI PPM1B forward 5’ AACGCGTAAAGATCTATGGGTGCATTTTTGGATAAACCC 3’ MluI – BglII PPM1B reverse 5’ AGCGGCCGCTCATATTTTTTCACCACTCATCTTTGTCC 3’ NotI PRMT5 forward 5’ AACGCGTAAGGATCCAGAAAGATGGCGGCGATGG 3’ MluI/BamHI PRMT5 reverse 5’ AGCGGCCGCCTAGAGGCCAATGGTATATG 3’ NotI WDR77 forward 5’ AACGCGTAAGGATCCGAGATGCGGAAGGAAAC 3’ MluI/BamHI WDR77 reverse 5’ AGCGGCCGCCTACTCAGTAACACTTGCAG 3’ NotI S6 forward 5’ AACGCGTAAGGATCCATGAAGCTGAACATCTCCTTCCC 3’ MluI/BamHI S6 reverse 5’ AGCGGCCGCCTTATTTCTGACTGGATTCAGACTTAGAAG 3’ NotI HA forward
5’
AAAGCTAGCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTAAGCTTAAA 3’
NheI HA reverse
5’ TTTAAGCTTAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATGCTAGCTTT
3’ HindIII
N-term p70-S6K1 reverse 5’ ACTCGAGAACATTCTGGTCTGATTTTTTCTG 3’ XhoI KD p70-S6K1 forward 5’ AGGATCCATGTTTGAGCTACTTCGGGTACTTGG 3’ BamHI KD p70-S6K1 reverse 5’ ACTCGAGTCATTTCACACTTTCAAGTACAGATGG 3’ XhoI C-term p70-S6K1 forward 5’ AGGATCCATGGAAAAGTTTTCCTTTGAACCAAAAATCC 3’ BamHI N-term p54-S6K2 reverse 5’ ACTCGAGTCAGCAGTGGGGCCCGATGC 3’ XhoI KD p54-S6K2 forward 5’ AGGATCCATGTTTGAGCTGCTGCGTGTGC 3’ BamHI KD p54-S6K2 reverse 5’ ACTCGAGTCACTTGATGCTGTCCAGGACAGAC 3’ XhoI C-term p54-S6K2 forward 5’ AGGATCCATGGAGGGCTTCTCCTTCCAGCC 3’ BamHI
3.5 Anelamento de primers
Os primers forward e reverse da seqüência codificadora do peptídeo HA, em uma concentração de 20 nM, foram misturados e aquecidos a uma temperatura de 95 ºC por 10 minutos e incubados à temperatura ambiente por 30 minutos. Após isso, foram digeridos com as enzimas NheI e HindIII da mesma forma que o vetor pcDNA 3.1 (+), sendo em seguida ligados com a enzima T4 DNA ligase.
3.6 Clonagem no vetor de entrada pGEM-T
A clonagem no vetor pGEM-T foi realizada seguindo o protocolo da Promega, o qual consistiu na adição de 5 µL de 2x rapid ligation buffer, 1 µL do vetor pGEM-T, 3 µL do produto de PCR e 1 µL da enzima T4 DNA ligase (1 U). A reação ocorreu overnight a 4 ºC.
3.7 Transfecção em células humanas
Lipofectamine PLUS (Invitrogen®): Misturamos 50 µL de DMEM sem soro com 0,4 µg de DNA e 4 µL do reagente PLUS e incubamos por 15 minutos. A essa mistura adicionamos 100 µL de DMEM sem soro combinado com 1 µL de Lipofectamina e incubamos por 15 minutos. Placas de 24 poços, contendo células a uma confluência de cerca de 70 %, foram então lavadas com DMEM sem soro e cobertas com 800 µL de meio sem soro, e adicionamos os 200 µL da solução contendo DNA, reagente PLUS e Lipofectamina. Após 3 horas, o meio foi trocado por DMEM com 10 % de SFB e as células incubadas por 24 a 72 horas.
3.8 Imunoprecipitação endógena utilizando proteína G acoplada a sepharose.
Os extratos protéicos foram coletados e, logo em seguida, quantificados e diluídos com tampão de lise (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1 %) e uma massa protéica na faixa de 250 a 2000 µg foi usada no ensaio. Após isso, as amostras foram incubadas com anticorpo e deixadas em agitação overnight a 4 ºC. Resina de Sepharose acoplada à proteína A/G (25 µL) (Thermo Scientific®) foi lavada 5 vezes com tampão de IP (Tris pH 7,5 25 mM e NaCl 150 mM) e adicionada nas amostra. Cada lavagem foi feita com uma centrifugação de 8200 × g por 1 minuto e incubação no gelo por 1 minuto. As amostras foram centrifugadas novamente à 8200 × g por 1 minuto e lavadas por 5 vezes com tampão de IP. A
eluição consistiu na adição de 50 µL de Laemmli Buffer 1x (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 1,5% SDS (w/v); 0,0025% bromophenol blue (w/v); 8% de glicerol (v/v) e 1,5% de beta-mercapto-etanol (v/v).
3.9 Imunoprecipitação das proteínas alvo fusionadas aos peptídeos HA e FLAG.
Células HEK293 foram lavadas com PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4, pH 7,4) e lisadas com tampão de lise celular (Tris pH
7,5 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1 %). Os lisados foram incubados por 15 minutos em gelo e centrifugados a 12.000 × g por 10 minutos. Os sobrenadantes foram coletados e diluídos em tampão de lise. Antes da imunoprecipitação, as microesferas acopladas com anticorpo anti-HA e anti-FLAG (Sigma-Aldrich®) foram lavadas 5 vezes com PBS e então adicionadas aos extratos celulares e incubadas a 4 ºC por cerca de 16 horas sob lenta agitação. As microesferas foram então lavadas 5 vezes com PBS, ressuspendidas em PBS contendo peptídeo HA ou FLAG (Sigma-Aldrich®) a uma concentração final de 500 e 300 ng/μL, respectivamente, e incubadas a 4 ºC por 2 horas sob moderada agitação. Os sobrenadantes contendo as proteínas imunoprecipitadas foram finalmente coletados por centrifugação e analisados por SDS-PAGE e immunoblotting.
3.10 Tratamentos em células
As células HEK293 foram tratadas com FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2; Sigma-Aldrich®) na concentração de 50 ng/mL por 4 horas, sendo que foram deixadas em starvation por 16 horas antes do tratamento. O tratamento de insulina (Sigma-Aldrich®) também foi antecedido por 16 horas de starvation e feito na concentração de 4,2 nM por 4 horas ou 10 μg/mL por 15 minutos. Células HEK293 foram tratadas com salubrinal (Sigma-Aldrich®) na concentração de 50 e 100 μM, ISRIB (Sigma- Aldrich®) a 100 e 200 nM, ambos por 24 horas e arsenito por 1 mM por 30 minutos. Os experimentos que foram utilizados insulina ou FGF2 em conjunto com rapamicina ou PF4708671 (Sigma-Aldrich®) consistiram em deixar as células em starvation por 16 horas, seguido do tratamento de insulina 4,2 nM por 4 horas, sendo adicionado rapamicina ou PF4708671, um inibidor de S6K1 (Pearce et al., 2010), na concentração de 20 nM ou 10 µM, respectivamente, por 1 hora, concomitante ao tratamento de insulina.
3.11 Mutação sítio dirigida
A substituição do aminoácido serina (S58) por um ácido glutâmico (E58) da proteína eIF2α foi realizada através do Kit Q5® Site-Directed Mutagenesis (New England BioLabs®). O protocolo consiste em uma reação de PCR com os componentes: Q5 Hot Start High-Fidelity, 2X Master Mix, 10 µM Primer Forward, 10 µM Primer Reverse, plasmídeo da eIF2α-HA (WT) como molde de DNA, na concentração de 1 ng/µl e água ultrapura livre de nucleases. Essas amostras foram submetidas ao termociclador nas seguintes condições: Etapa inicial de desnaturação a 98 ºC por 30 segundos, 25 ciclos a 98 ºC por 10 segundos, 60 ºC por 20 segundos, 72 ºC por 20 segundos/kB, e por fim, a etapa de extensão por 72 ºC por 2 minutos. O produto da PCR foi incubado por 5 minutos à temperatura ambiente com 2X KLD Reaction Buffer 5 µl 1X, 10X KLD Enzyme Mix 1 µl 1X e água ultrapura. Após isso, a amostra foi transformada em bactérias competentes (E. coli), seguido da extração de DNA das colônias geradas por esse procedimento.
3.12 Immunoblotting
Após separação das proteínas por SDS-PAGE, as mesmas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (GE), a qual foi então incubada com solução de bloqueio (0,1 % Tween 20; 5 % leite em pó desnatado em TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 137 mM NaCl) por cerca de 2 horas a temperatura ambiente e em seguida com o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio (0,1 % Tween 20; 3 % albumina em TBS) por 16 horas à temperatura ambiente. A membrana foi então lavada 3 vezes com solução de lavagem (0,1 % Tween 20 em TBS) a 37 ºC por 10 minutos cada e incubada com o anticorpo secundário contra IgG de camundongo, coelho ou cabra conjugado com peroxidase (Amersham®) diluído 1:5.000 em solução de bloqueio por 1 hora a temperatura ambiente. A membrana foi então lavada novamente 3 vezes com solução de lavagem (0,1% Tween 20 em TBS) a temperatura ambiente e tratada com o ECL Plus Western Blotting Detection
System (GE Healthcare®) por 5 minutos. Por fim, a membrana foi exposta ao ECL
4 RESULTADOS
4.1 Resultados obtidos no estudo de caracterização das diferentes isoformas de S6Ks
Inicialmente, um experimento piloto de imunoprecipitação foi realizado com as isoformas p70-S6K1, p85-S6K1 e p54-S6K2, seguido de espectrometria de massas. Entretanto uma quantidade muito pequena de proteínas, quando comparado com as outras isoformas analisadas, foi identificada para p85-S6K1 (dados não demonstrados). Sendo assim, optamos por realizar um estudo de caracterização das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2, dados que foram publicados na revista Proteomics (anexo I) e que forneceram pela primeira vez uma análise comparativa dos interactomas de S6K1 e S6K2 (Pavan et al., 2016a). Na literatura, pouca informação se tem da isoforma de S6K2 e, de forma contrastante, muito se sabe sobre as funções do eixo mTOR/S6K1.
Primeiramente, foi realizado um ensaio de imunoprecipitação anti-FLAG, o qual revelou que a S6K2 possui mais proteínas de interação do que S6K1. Esse dado é interessante, uma vez que obtivemos mais informações da isoforma menos estudada das S6Ks, a p54-S6K2. Além disso, algumas proteínas que foram identificadas por espectrometria de massas foram validadas por immunoblotting e imunofluorescência. Diversas proteínas foram validadas para S6K2, sendo estas: eIF2α, PARP1, NPM1, NCL, XRCC6, FXR1, FMRP, SRSF1 e PRMT5, revelando possíveis novas proteínas de interação para S6K2 e não para S6K1. Para S6K1, foi validada a interação com PRMT5, da mesma forma que foi identificado para S6K2.
Uma classificação funcional das proteínas de interação de S6K1 e S6K2 mostrou que a isoforma S6K1 tem mais relação com os processos biológicos de resposta ao estresse celular, citoesqueleto, metabolismo, remodelamento de cromatina e fosfatases, enquanto S6K2 está mais associada a processos de transcrição, biogênese de ribossomos, síntese protéica, replicação e reparo de DNA e splicing e processamento de RNA.
As proteínas identificadas por espectrometria de massas passaram por uma análise estatística denominada Contaminant Repository for Affinity Purification (CRAPome), a qual forneceu um score de probabilidade de interação chamado Saint Probability (SP). As fosfatases PPM1A e PPM1B e a chaperona HSP90 receberam um elevado score SP para a isoforma de S6K1, enquanto PARP1 e
XRCC6, as quais são proteínas envolvidas no reparo do DNA, e NCL e NPM1, que participam da biogênese de ribossomos, se destacaram pelo elevado score SP para a S6K2.
As possíveis proteínas de interação das S6Ks foram classificadas de acordo com sua localização celular. A partir desta análise, foi possível concluir que S6K1 apresenta mais parceiras de interação no citosol, enquanto S6K2 apresenta mais interação com proteínas nucleares. Além disso, também foi observado que S6K1 apresenta localização mais dispersa no citosol, enquanto S6K2 apresenta localização robusta no núcleo e nucléolo. Além disso, as proteínas NCL, eIF2α, XRCC6, ILF3, FXR1, entre outras, apresentam o sítio predito de fosforilação de S6Ks, RXRXXT/S.
As proteínas que foram validadas por immunoblotting ou
imunofluorescência, tais como: eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77 e PPM1B, apresentando ou não o score SP elevado, foram escolhidas para que fossem estudadas suas relações com as diferentes isoformas de S6Ks. As proteínas NCL (Nucleolin) e NPM1 (Nuclephosmin1), as quais foram validadas por immunoblotting e apresentaram SP elevado, estão sendo estudadas por outro integrante de nosso laboratório (bolsa de iniciação científica; processo FAPESP nº: 15/16601-9). As proteínas eIF2α, FXR1 e NCL foram também escolhidas por apresentarem o sítio predito de fosforilação de S6Ks, RXRXXT/S.
4.2 Clonagem e expressão dos genes das proteínas eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B
Tendo em vista os resultados apresentados em Pavan et al (2016a), foram escolhidos alguns parceiros de interação das S6Ks para prosseguirmos com estudos mais detalhados visando a caracterização funcional dessas interações. Para tanto, os genes das proteínas eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B foram amplificados através de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando a enzima AccuPrime Taq DNA Polymerase (figura 6A), a fim de que fossem purificados do gel de agarose e ligados no vetor de entrada pGEM-T (figura 6B).
Figura 6. Amplificação dos genes de interesse e screening da clonagem dos subprodutos da PCR no vetor pGEM. A) Os genes de eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1,
PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B foram amplificados partindo de um cDNA de células HEK293. B) Através de digestões por enzimas de restrição específicas, foi verificada a efetiva incorporação dos insertos de interesse no vetor de entrada pGEM, com exceção de PARP1.
Após a digestão com enzimas de restrição específicas para cada clonagem, foi possível verificar a incorporação dos insertos de interesse no vetor pGEM-T, uma vez que houve a liberação de bandas em seus respectivos tamanhos esperados (PPM1B: 1440 pb, eIF2α: 942 pb, FXR1: 1866 pb FMRP: 1899 pb, PRMT5: 1914 pb, WDR77: 1029 pb, S6: 750 pb) e, também, o tamanho do próprio vetor plasmidial (pGEM: 3000 pb; figura 6B).
Após as clonagem no vetor pGEM-T, os plasmídeos foram seqüenciados pelo método de Sanger, e aqueles que tiveram o total alinhamento com a seqüência de referência do banco de dados tiveram prosseguimento no processo de subclonagem no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA.
6000 pb 3000 pb 1000 pb 6000 pb 3000 pb 1000 pb A) B) 6000 pb 3000 pb 1000 pb 6000 pb 3000 pb 1000 pb BglII NotI PPM1B BamHI NotI eIF2α BamHI NotI FXR1 EcoRI NotI FMRP BamHI NotI PRMT5 BamHI NotI WDR77 BamHI NotI S6 BamHI NotI NPM1 6000 pb 3000 pb 1000 pb BglII NotI PPM1B BamHI NotI eIF2α BamHI NotI FXR1 EcoRI NotI FMRP BamHI NotI PRMT5 BamHI NotI WDR77 BamHI NotI S6 BamHI NotI NPM1 6000 pb 3000 pb 1000 pb
Para a clonagem dos insertos em um vetor de expressão em células eucarióticas, o plasmídeo pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) foi modificado incorporando-se a incorporando-seqüência codificante do peptídeo HA, repreincorporando-sentado pelos aminoácidos: YPYDVPDYA. Para tanto, foi realizado o anelamento dos primers forward e reverse (descrito em Materiais e Métodos, 3.5.) e, posteriormente, ligados ao vetor pcDNA 3.1 (+). A fim de comprovar a incorporação do peptídeo HA no vetor, foi realizada uma PCR utilizando-se de primers CMV e BGH. Uma vez incorporada a seqüência HA no plasmídeo pcDNA 3.1 (+), um total de 42 pb foi acrescentado, o que foi observado através de um screening por eletroforese em gel de agarose (figura 7).
Figura 7. Screening da incorporação do peptídeo HA no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA 3.1 (+). Através de uma PCR utilizando-se primers CMV e
BGH foi possível observar a incorporação da seqüência codificadora do peptídeo HA no plasmídeo através de uma diferença de tamanho de 42 pb, sendo utilizado água como controle negativo da amplificação.
Através de uma análise de restrição específica para cada clonagem, foi possível verificar que os genes PARP1, PPM1B, eIF2α, FXR1, PRMT5, WDR77 e S6 foram efetivamente subclonados no vetor pcDNA-HA, de aproximadamente 5,4 kB, visto que houve a liberação de bandas nos tamanhos esperados dos genes clonados no vetor de expressão (figura 8). A clonagem de PARP1 foi realizada de forma direta no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA, sem a clonagem no vetor de entrada pGEM-T (figura 8).
262 pb 220 pb HA pcDNA-HA HA = YPYDVPDYA CMV MCS BGH pcDNA 3.1 CMV HA MCS BGH
Figura 8. Screening da clonagem dos genes de interesse no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA. Através de uma análise com enzimas de restrição, foi
observada a efetiva incorporação dos genes de interesse (PARP1, PPM1B, eIF2α, FXR1, PRMT5, WDR77 e S6) no vetor pcDNA-HA.
Na figura 9, células HEK293 foram transfectadas com os plasmídeos PPM1B, NPM1, eIF2α, FXR1, PRMT5 e WDR77 fusionados ao HA, a fim de que fosse comprovado a funcionalidade do plasmídeo construído em laboratório (pcDNA-HA) em superexpressar as proteínas recombinantes. O plasmídeo GFP-FLAG foi utilizado como controle da transfecção. É importante ressaltar que a proteína NPM1 não faz parte do projeto em questão, entretanto fizeram parte do artigo publicado na revista Proteomics (anexo I), e, atualmente, está sendo estudado por outro integrante de nosso laboratório (bolsa de iniciação científica; processo FAPESP nº: 15/16601-9). Portanto, algumas partes do processo de clonagem foram realizadas em conjunto.
PARP1-HA S6-HA eIF2α-HA FXR1-HA ND ND ND ND NheI/NotI BamHI/NotI BamHINotI BamHI/NotI 5,4 kB 3 kB 750 pb 5,4 kB 5,4 kB 942 pb 1,8 kB 5,4 kB PPM1B-HA ND BglII/NotI 5,4 kB 1,4 kB PRMT5-HA WDR77-HA ND BamHI/NotI BamHI/NotI ND 5,4 kB 5,4 kB 1,9 kB 1 kB
Figura 9. Superexpressão das proteínas recombinantes fusionadas ao peptídeo HA em células HEK293. Após a transfecção dos plasmídeos pcDNA-HA fusionados aos
genes de interesse, foi realizado o extrato protéico das células e immunoblotting anti-HA, o que confirmou a superexpressão de PPM1B, NPM1, eIF2α, FXR1, PRMT5 e WDR77 fusionadas ao epítopo HA em células HEK293.
Apesar dos processos de clonagem e superexpressão em células terem sido concluídos com sucesso, os resultados mostrados a seguir tiveram enfoque nas proteínas eIF2α e PARP1, uma vez que apresentaram mais evidências de interação com as isoformas de S6K1 e/ou S6K2. Importante ressaltar que PARP1 apresentou elevado score SP na análise inicial e eIF2α apresenta o sítio predito de fosforilação de S6Ks, RXRXXT/S (anexo I).
4.3 Caracterização da interação entre S6Ks e eIF2α
Como mostrado em Pavan et al (2016a), algumas proteínas que co-imunoprecipitaram com as S6Ks apresentam o sítio de fosforilação predito de tais quinases, representado pela seqüência de aminoácidos RXRXXT/S (R: arginina, X: aminoácido qualquer, T: treonina e S: serina), dentre elas eIF2α e FXR1. O sítio reduzido de fosforilação das S6Ks, RXXT/S, também está presente nas proteínas PARP1, PRMT5 e WDR77. Apesar de estes serem os mesmos sítios preditos de fosforilação da Akt, existe uma preferência das S6Ks por fosforilar este mesmo motivo sucedido pelos aminoácidos M, L, V e I (M: metionina, L: leucina, V: valina e
FLAG HA INS - - - + + + + + + + + + -- + + + + + + + -Anti-HA 78 kDa 72 kDa 50 kDa 38 kDa 42 kDa Extrato protéico IB: Anti-HA
I: isoleucina; Leighton et al., 1995).
Dessa forma, foi realizada uma análise in silico através do software Benchling, que consistiu no alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína eIF2α de diferentes espécies (figura 10A). Foi observado que eIF2α apresenta o sítio de fosforilação consenso das S6Ks, e que o mesmo está extremamente conservado em diversas espécies, podendo indicar que esse motivo apresenta uma relevância biológica. Além disso, o sítio RXRXXT/S encontrado na eIF2α é sucedido pelo aminoácido isoleucina ou valina, fato este que fortalece os indícios de que as S6Ks podem ser quinases que fosforilam o resíduo de aminoácido 58 da proteína eIF2α. Importante ressaltar que as quinases conhecidas da eIF2α, sendo estas PKR, PERK, HRI e GCN2, fosforilam no resíduo 52 (Donnelly et al., 2013), o qual não representa um sítio de fosforilação consenso das S6Ks e também mostra-se conservado em diferentes espécies.
Outra análise in silico foi realizada com o objetivo de identificar o potencial do resíduo serina 58 de eIF2α ser fosforilado pelas S6Ks (figura 10B). Para tanto foi utilizado o software Group-based Prediction System (Xue et al., 2008), o qual, a partir da sequência de eIF2α, fez uma predição de que o resíduo 58 pode ser fosforilado pelas S6Ks, dando um score próximo ao dado para a fosforilação do resíduo serina 52 pelas quinases já conhecidas de eIF2α, sendo até superior ao score de PKR e GCN2. É importante ressaltar que a literatura refere-se ao resíduo 52 de eIF2α também como resíduo 51, em decorrência da perda do aminoácido metionina na região N-terminal da proteína.
Como demonstrado em Pavan et al (2016a), a eIF2α endógena mostrou ser co-imunoprecipitada com a S6K2-FLAG em uma imunoprecipitação anti-FLAG. De forma reversa, na figura 11A, foi realizado um experimento de imunoprecipitação anti-HA (descrito em Materiais e Métodos, 3.9.), no qual consistiu na co-transfecção dos plasmídeos das S6Ks fusionados ao FLAG em conjunto com plasmídeos para superexpressão de eIF2α e S6 fusionados ao HA em células HEK293. A co-imunoprecipitação das S6Ks na imunoprecipitação de S6-HA foi utilizada como controle positivo, uma vez que já é muito bem estabelecido na literatura que a S6 é o principal substrato das S6Ks (Magnuson et al., 2012). O ensaio de imunoprecipitação anti-HA foi realizado com os extratos protéicos após 48 horas da transfecção. Como resultado, obtivemos que tanto S6K1 e S6K2, quanto as fusionadas ao FLAG, co-imunoprecipitaram com a eIF2α e S6, sugerindo, portanto, a existência de interação entre as proteínas S6Ks e eIF2α.
