Resultados obtidos no estudo de caracterização das diferentes isoformas de S6Ks

Inicialmente, um experimento piloto de imunoprecipitação foi realizado com as isoformas p70-S6K1, p85-S6K1 e p54-S6K2, seguido de espectrometria de massas. Entretanto uma quantidade muito pequena de proteínas, quando comparado com as outras isoformas analisadas, foi identificada para p85-S6K1 (dados não demonstrados). Sendo assim, optamos por realizar um estudo de caracterização das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2, dados que foram publicados na revista Proteomics (anexo I) e que forneceram pela primeira vez uma análise comparativa dos interactomas de S6K1 e S6K2 (Pavan et al., 2016a). Na literatura, pouca informação se tem da isoforma de S6K2 e, de forma contrastante, muito se sabe sobre as funções do eixo mTOR/S6K1.

Primeiramente, foi realizado um ensaio de imunoprecipitação anti-FLAG, o qual revelou que a S6K2 possui mais proteínas de interação do que S6K1. Esse dado é interessante, uma vez que obtivemos mais informações da isoforma menos estudada das S6Ks, a p54-S6K2. Além disso, algumas proteínas que foram identificadas por espectrometria de massas foram validadas por immunoblotting e imunofluorescência. Diversas proteínas foram validadas para S6K2, sendo estas: eIF2α, PARP1, NPM1, NCL, XRCC6, FXR1, FMRP, SRSF1 e PRMT5, revelando possíveis novas proteínas de interação para S6K2 e não para S6K1. Para S6K1, foi validada a interação com PRMT5, da mesma forma que foi identificado para S6K2.

Uma classificação funcional das proteínas de interação de S6K1 e S6K2 mostrou que a isoforma S6K1 tem mais relação com os processos biológicos de resposta ao estresse celular, citoesqueleto, metabolismo, remodelamento de cromatina e fosfatases, enquanto S6K2 está mais associada a processos de transcrição, biogênese de ribossomos, síntese protéica, replicação e reparo de DNA e splicing e processamento de RNA.

As proteínas identificadas por espectrometria de massas passaram por uma análise estatística denominada Contaminant Repository for Affinity Purification (CRAPome), a qual forneceu um score de probabilidade de interação chamado Saint Probability (SP). As fosfatases PPM1A e PPM1B e a chaperona HSP90 receberam um elevado score SP para a isoforma de S6K1, enquanto PARP1 e

XRCC6, as quais são proteínas envolvidas no reparo do DNA, e NCL e NPM1, que participam da biogênese de ribossomos, se destacaram pelo elevado score SP para a S6K2.

As possíveis proteínas de interação das S6Ks foram classificadas de acordo com sua localização celular. A partir desta análise, foi possível concluir que S6K1 apresenta mais parceiras de interação no citosol, enquanto S6K2 apresenta mais interação com proteínas nucleares. Além disso, também foi observado que S6K1 apresenta localização mais dispersa no citosol, enquanto S6K2 apresenta localização robusta no núcleo e nucléolo. Além disso, as proteínas NCL, eIF2α, XRCC6, ILF3, FXR1, entre outras, apresentam o sítio predito de fosforilação de S6Ks, RXRXXT/S.

As proteínas que foram validadas por immunoblotting ou

imunofluorescência, tais como: eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77 e PPM1B, apresentando ou não o score SP elevado, foram escolhidas para que fossem estudadas suas relações com as diferentes isoformas de S6Ks. As proteínas NCL (Nucleolin) e NPM1 (Nuclephosmin1), as quais foram validadas por immunoblotting e apresentaram SP elevado, estão sendo estudadas por outro integrante de nosso laboratório (bolsa de iniciação científica; processo FAPESP nº: 15/16601-9). As proteínas eIF2α, FXR1 e NCL foram também escolhidas por apresentarem o sítio predito de fosforilação de S6Ks, RXRXXT/S.

4.2 Clonagem e expressão dos genes das proteínas eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B

Tendo em vista os resultados apresentados em Pavan et al (2016a), foram escolhidos alguns parceiros de interação das S6Ks para prosseguirmos com estudos mais detalhados visando a caracterização funcional dessas interações. Para tanto, os genes das proteínas eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1, PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B foram amplificados através de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando a enzima AccuPrime Taq DNA Polymerase (figura 6A), a fim de que fossem purificados do gel de agarose e ligados no vetor de entrada pGEM-T (figura 6B).

Figura 6. Amplificação dos genes de interesse e screening da clonagem dos subprodutos da PCR no vetor pGEM. A) Os genes de eIF2α, FMRP, FXR1, PARP1,

PRMT5, WDR77, S6 e PPM1B foram amplificados partindo de um cDNA de células HEK293. B) Através de digestões por enzimas de restrição específicas, foi verificada a efetiva incorporação dos insertos de interesse no vetor de entrada pGEM, com exceção de PARP1.

Após a digestão com enzimas de restrição específicas para cada clonagem, foi possível verificar a incorporação dos insertos de interesse no vetor pGEM-T, uma vez que houve a liberação de bandas em seus respectivos tamanhos esperados (PPM1B: 1440 pb, eIF2α: 942 pb, FXR1: 1866 pb FMRP: 1899 pb, PRMT5: 1914 pb, WDR77: 1029 pb, S6: 750 pb) e, também, o tamanho do próprio vetor plasmidial (pGEM: 3000 pb; figura 6B).

Após as clonagem no vetor pGEM-T, os plasmídeos foram seqüenciados pelo método de Sanger, e aqueles que tiveram o total alinhamento com a seqüência de referência do banco de dados tiveram prosseguimento no processo de subclonagem no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA.

6000 pb 3000 pb 1000 pb 6000 pb 3000 pb 1000 pb A) B) 6000 pb 3000 pb 1000 pb 6000 pb 3000 pb 1000 pb BglII NotI PPM1B BamHI NotI eIF2α BamHI NotI FXR1 EcoRI NotI FMRP BamHI NotI PRMT5 BamHI NotI WDR77 BamHI NotI S6 BamHI NotI NPM1 6000 pb 3000 pb 1000 pb BglII NotI PPM1B BamHI NotI eIF2α BamHI NotI FXR1 EcoRI NotI FMRP BamHI NotI PRMT5 BamHI NotI WDR77 BamHI NotI S6 BamHI NotI NPM1 6000 pb 3000 pb 1000 pb

Para a clonagem dos insertos em um vetor de expressão em células eucarióticas, o plasmídeo pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) foi modificado incorporando- se a seqüência codificante do peptídeo HA, representado pelos aminoácidos: YPYDVPDYA. Para tanto, foi realizado o anelamento dos primers forward e reverse (descrito em Materiais e Métodos, 3.5.) e, posteriormente, ligados ao vetor pcDNA 3.1 (+). A fim de comprovar a incorporação do peptídeo HA no vetor, foi realizada uma PCR utilizando-se de primers CMV e BGH. Uma vez incorporada a seqüência HA no plasmídeo pcDNA 3.1 (+), um total de 42 pb foi acrescentado, o que foi observado através de um screening por eletroforese em gel de agarose (figura 7).

Figura 7. Screening da incorporação do peptídeo HA no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA 3.1 (+). Através de uma PCR utilizando-se primers CMV e

BGH foi possível observar a incorporação da seqüência codificadora do peptídeo HA no plasmídeo através de uma diferença de tamanho de 42 pb, sendo utilizado água como controle negativo da amplificação.

Através de uma análise de restrição específica para cada clonagem, foi possível verificar que os genes PARP1, PPM1B, eIF2α, FXR1, PRMT5, WDR77 e S6 foram efetivamente subclonados no vetor pcDNA-HA, de aproximadamente 5,4 kB, visto que houve a liberação de bandas nos tamanhos esperados dos genes clonados no vetor de expressão (figura 8). A clonagem de PARP1 foi realizada de forma direta no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA, sem a clonagem no vetor de entrada pGEM-T (figura 8).

262 pb 220 pb HA pcDNA-HA HA = YPYDVPDYA CMV MCS BGH pcDNA 3.1 CMV HA MCS BGH

Figura 8. Screening da clonagem dos genes de interesse no vetor de expressão em células eucarióticas, pcDNA-HA. Através de uma análise com enzimas de restrição, foi

observada a efetiva incorporação dos genes de interesse (PARP1, PPM1B, eIF2α, FXR1, PRMT5, WDR77 e S6) no vetor pcDNA-HA.

Na figura 9, células HEK293 foram transfectadas com os plasmídeos PPM1B, NPM1, eIF2α, FXR1, PRMT5 e WDR77 fusionados ao HA, a fim de que fosse comprovado a funcionalidade do plasmídeo construído em laboratório (pcDNA-HA) em superexpressar as proteínas recombinantes. O plasmídeo GFP- FLAG foi utilizado como controle da transfecção. É importante ressaltar que a proteína NPM1 não faz parte do projeto em questão, entretanto fizeram parte do artigo publicado na revista Proteomics (anexo I), e, atualmente, está sendo estudado por outro integrante de nosso laboratório (bolsa de iniciação científica; processo FAPESP nº: 15/16601-9). Portanto, algumas partes do processo de clonagem foram realizadas em conjunto.

PARP1-HA S6-HA eIF2α-HA FXR1-HA ND ND ND ND NheI/NotI BamHI/NotI BamHINotI BamHI/NotI 5,4 kB 3 kB 750 pb 5,4 kB 5,4 kB 942 pb 1,8 kB 5,4 kB PPM1B-HA ND BglII/NotI 5,4 kB 1,4 kB PRMT5-HA WDR77-HA ND BamHI/NotI BamHI/NotI ND 5,4 kB 5,4 kB 1,9 kB 1 kB

Figura 9. Superexpressão das proteínas recombinantes fusionadas ao peptídeo HA em células HEK293. Após a transfecção dos plasmídeos pcDNA-HA fusionados aos

genes de interesse, foi realizado o extrato protéico das células e immunoblotting anti-HA, o que confirmou a superexpressão de PPM1B, NPM1, eIF2α, FXR1, PRMT5 e WDR77 fusionadas ao epítopo HA em células HEK293.

Apesar dos processos de clonagem e superexpressão em células terem sido concluídos com sucesso, os resultados mostrados a seguir tiveram enfoque nas proteínas eIF2α e PARP1, uma vez que apresentaram mais evidências de interação com as isoformas de S6K1 e/ou S6K2. Importante ressaltar que PARP1 apresentou elevado score SP na análise inicial e eIF2α apresenta o sítio predito de fosforilação de S6Ks, RXRXXT/S (anexo I).