FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARINA SILVA FOLGUIERI
ESTUDO MORFOLÓGICO, MOLECULAR E FUNCIONAL CARDÍACO DURANTE O ENVELHECIMENTO EM ANIMAIS SUBMETIDOS À
RESTRIÇÃO PROTEICA GESTACIONAL
CAMPINAS 2019
ESTUDO MORFOLÓGICO, MOLECULAR E FUNCIONAL CARDÍACO DURANTE O ENVELHECIMENTO EM ANIMAIS SUBMETIDOS A
RESTRIÇÃO PROTEICA GESTACIONAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADORA: PATRICIA ALINE BOER
COORIENTADOR: ANDRÉ SCHWAMBACH VIEIRA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARINA SILVA FOLGUIERI, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER.
CAMPINAS 2019
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
MARINA SILVA FOLGUIERIORIENTADOR: PATRICIA ALINE BOER
COORIENTADOR: ANDRÉ SCHWAMBACH VIEIRA
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER
2. PROFA. DRA. GLÁUCIA MONTEIRO DE CASTRO
3. PROF. DR. WELLERSON RODRIGO SCARANO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esse trabalho aos meus maiores exemplos, que não pouparam esforços para que eu concluísse esse projeto e que sempre dedicaram as suas vidas pela felicidade de seus filhos: minha mãe Sonia e meu pai João amados, que sempre vibram com as minhas vitórias.
não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Primeiramente a Deus, por ter me dado força e saúde para superar as dificuldades e permitiu que isso acontecesse.
“Quanto mais eu estudo a natureza, mais me maravilho com a obra do Criador”. Louis Pasteur.
Aos meus familiares pelo carinho, amor, paciência e ensinamentos. Agradeço de forma especial aos meus pais, João Ricieri Folguieri e Sonia
Maria R. S. Folguieri, por não medirem esforços para que eu pudesse realizar
meus sonhos e seguir adiante com os meus estudos. Serei eternamente grata pelos ensinamentos e paciência nos momentos difíceis. Foi graças a vocês, que hoje, tenho mais uma etapa cumprida na minha vida!
A minha orientadora Prof. Dra. Patrícia Aline Boer, não somente pela oportunidade, mas também, por toda dedicação e paciência na orientação, por suas correções e incentivo. Espero ter alcançado todas as expectativas e ter retribuído toda a confiança depositada em mim.
Ao Prof. Dr. Andre Schwambach Vieira por disponibilizar de seu tempo e pelo conhecimento fornecido para elaboração da técnica de Biblioteca de mRNA e análise dos dados do sequenciamento.
Ao Prof. Dr. José Antonio Rocha Gontijo, por abrir as portas de seu laboratório e por todos os ensinamentos.
Aos meus amigos do Laboratório de Metabolismo hidrossalino, Gabriela
lamana Leme, Vinícius Schiavinatto Mariano, Aparecida Marcela de Oliveira Damico, Heloisa Assalin, Ize Penhas de Lima, Daniel Bueno Block, Thais Ortiz, Augusto Custódio, Gabriel Grigoletti, Ana Teresa Franco, Marcelo Lopes, entre tantos outros que passaram no laboratório. Obrigada por me
receberem com tanto carinho, só tenho a agradecer por todos os ensinamentos e momentos de descontração. Em especial a Gabriela leme, Vinicius Mariana e Marcela Damico, pelos momentos de descontração e risadas. Foi muito bom
Agradeço também as minhas duas grandes amigas, Mariana Torreão e
Sofia Negri Braz, que apesar da distância sempre estiveram ao meu lado.
Obrigada pelas conversas, conselhos e motivação nos momentos difíceis. Sem vocês essa jornada teria sido bem mais difícil.
À Prof. Dra. Íscia Cendes pela disponibilização do laboratório para a realização da técnica de Biblioteca de mRNA e por todos em seu laboratório pela paciência e carinho ao me receber.
À CNPq pela concessão da bolsa, sem a qual não seria possível a realização desse projeto.
Fatores adversos influenciam o desenvolvimento do embrião, feto ou neonato e, estão correlacionados com aumentando do risco de doenças cardiovasculares, diabete tipo 2, hipertensão arterial, predisposição a obesidade e a adiposidade abdominal, resistência periférica à insulina, prejuízos no desenvolvimento dos rins, doenças psiquiátricas e maior susceptibilidade ao estresse oxidativo e a processos inflamatórios na vida adulta. No modelo de restrição proteica gestacional tem sido demonstrado diminuição na concentração da enzima 11-β-HSD2, permitindo que os glicocorticoides maternos tenham acesso ao feto, ocasionando redução da proliferação celular e início precoce do processo de diferenciação de células, podendo promover modificações na morfologia e função destes tecidos através de mudanças da regulação da expressão gênica pelo fenômeno epigenético. Supomos que, pelo fato do envelhecimento ser um fator de risco para doenças cardiovasculares, a associação com fenômenos epigenéticos decorrentes de programação fetal, poderia aumentar sobremaneira estes riscos. A crescente população de pacientes idosos portadores de doenças crônicas e degenerativas tem elevado os custos com cuidados à saúde, o estudo da biologia do envelhecimento é prioritário para a compreensão dos mecanismos envolvidos no envelhecimento e nos fatores preventivos e ligados ao tratamento. Sendo assim, presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão gênica no coração da prole de ratos Wistar HanUnib machos submetidos a restrição proteica gestacional com 62 semanas de idade. Ratas Wistar prenhes foram divididas em dois grupos, de acordo com o conteúdo proteico da dieta oferecida durante a prenhez: 1. NP (normal-protein - 17%) ou, 2. LP (low-protein - 6%). A pressão sistólica da prole foi aferida semanalmente a partir da 32ª até 62ª semana de vida, a área de miócitos, a fração de colágeno e a expressão gênica e a concentração de proteínas especificas foram realizadas. Nossos resultados corroboram dados da literatura mostrando que a restrição proteica gestacional causa baixo peso ao nascer e catch-up growth associados ao desenvolvimento de hipertensão arterial, aumento no conteúdo de colágeno e da área dos cardiomiócitos nos animais do grupo LP. Entretanto, embora os animais apresentaram aumento no conteúdo de colágeno e hipertrofia dos cardiomiócitos, não observamos aumento na massa do coração, nem dos ventrículos isolados. À análise por sequenciamento, verificamos alterações na expressão de 137 genes, avaliamos gene a gene quanto a importância biológica e, verificamos alterações em vias metabólicas que causam a fibrose e hipertrofia acarretando em alterações na função cardíaca podendo levar a insuficiência. Como análise geral dos resultados do presente trabalho, os animais submetidos a restrição proteica gestacional, apresentaram diversas alterações em vias metabólicas; na pressão arterial; na atividade inflamatória e estresse oxidativo; nos processos de apoptose, autofagia e senescência pelo envelhecimento que poderiam de forma associada, causar hipertrofia celular e fibrose de órgãos e tecidos, incluindo do coração. Somados, podem acarretar alterações precoces na função cardíaca, causando insuficiente cardíaca e a morte. Portanto, supomos que os animais do grupo LP poderiam apresentar processo precoce de envelhecimento que culminaria com morte celular antecipada,
Palavras-chave: Programação fetal, Doenças cardiovasculares, Hipertensão, Hipertrofia, Transcriptoma.
Adverse stimulus influences the development of the embryo, fetus or neonate and are correlated with increased risk of cardiovascular disease, type 2 diabetes, hypertension, predisposition to obesity and abdominal adiposity, peripheral resistance to insulin, in kidney development, psychiatric diseases and increased susceptibility to oxidative stress and inflammatory processes. The model of gestational protein restriction has been shown that this causes a decrease in concentration of the enzyme β-11-HSD2 allowing the maternal glucocorticoids have access to the fetus, causing reduction of cell proliferation associated with early process of differentiation of cells, which may promote morphological changes and function of these tissues through changes of regulation of gene expression by the epigenetic phenomenon. We assume that because of aging to be a risk factor for cardiovascular disease, the association with epigenetic phenomena resulting from fetal programming, could greatly increase these risks. The growing population of elderly patients suffering from chronic diseases and degenerative diseases have high health care costs, the study of the biology of aging is priority for the understanding of the mechanisms involved in aging and preventive factors and linked to the treatment of prevalent diseases. Therefore, this study aimed to assess the gene expression in the heart of the offspring of Wistar rats HanUnib males submitted to protein restriction in elderly animals of 62 gestational weeks of age. Pregnant Wistar rats were divided into two groups according to the protein content of the diet offered during pregnancy: 1. NP (standard-protein-17%), or 2. LP (low-protein-6%). The systolic pressure measured weekly offspring from the 32 ND until 62nd week of life; the glucose tolerance test with an intraperitoneal injection of a 25% glucose solution; the mass of the heart, the area of cardiomyocytes, the fraction of collagen and the gene expression and the concentration of specific proteins were made. Our results corroborate data from the literature showing that protein restriction dates cause low birth weight and catch-up growth associated with the development of arterial hypertension, increased collagen content and area of cardiomiócitos. However, although the animals had increase collagen content and hypertrophy of the cardiomyocytes, we did not observe increase in the mass of the heart, neither of the isolated ventricles. The sequencing analysis, we verified alterations in the expression of 137 genes, evaluated the gene for biological importance, and verified changes in pathways that cause the hypertrophy and fibrosis resulting in changes in heart function and may lead to heart failure. As a general analysis of the results of this study, the animals of offspring whose mothers were submitted to gestational protein restriction, presented several changes in metabolic pathways; in blood pressure; in inflammatory activity and oxidative stress; in the process of apoptosis, Autophagy and senescence by aging that could in no way associated with, cause cell hypertrophy and fibrosis of organs and tissues, including the heart. When added together, can lead to early changes in the cardiac function, causing insufficient, and death. Therefore, we assume that the animals from group LP could present early aging process that would culminate in early cell death, which can be verified in the present study, at least in part, from the analysis of the survival of the animals from group LP when compared to offspring NP.
FIGURA 1 EXPOSIÇÃO FETAL AOS GLICOCORTICOIDES. (A): CONDIÇÃO NORMAL, 11Β
-HSD2 ATUA COMO UMA BARREIRA PROTETORA AOS GLICOCORTICOIDES MATERNOS.(B): CONDIÇÃO DE ESTRESSE MATERNO, COM AUMENTO DE CORTISOL.
(C): REDUÇÃO NA CONCENTRAÇÃO E NA ATIVIDADE 11Β-HSD2 NA PROGRAMAÇÃO FETAL (50). ... 25
FIGURA 2.REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS ALTERAÇÕES NAS CÂMARAS CARDÍACAS DE UM INDIVÍDUO COM DOENÇA CARDÍACA HIPERTENSIVA. DOENÇA CARDÍACA HIPERTENSIVA LEVAM À HIPERTROFIA DE CARDIOMIÓCITOS E TRANSIÇÃO DE FIBROBLASTOS PARA MIOFIBROBLASTOS.ESSAS ALTERAÇÕES ESTÃO ASSOCIADAS NA DOENÇA PRECOCE COM AUMENTO DA MANIFESTAÇÃO DA MEC PELA FIBROSE PERIVASCULAR E FIBROSE DO ENDOMÍSIO E DO PERIMÍSIO (274). ... 27
FIGURA 3.REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO AUMENTANDO A ESPESSURA DA PAREDE VENTRICULAR CARDÍACAS DE UM INDIVÍDUO COM DOENÇA CARDÍACA HIPERTENSIVA
(274). ... 28
FIGURA 4. SEPARAÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS, PERÍODO E EXPERIMENTOS REALIZADOS.APÓS A CONFIRMAÇÃO DA PRENHES AS RATAS FORAM DIVIDIDAS EM DOIS GRUPOS, DE ACORDO COM A DIETA FORNECIDA. AS MÃES DOS ANIMAIS DO GRUPO LP RECEBERAM RAÇÃO COM QUANTIDADE REDUZIDA DE PROTEÍNA.AS MÃES DOS ANIMAIS DO GRUPO NP RECEBERAM RAÇÃO COM QUANTIDADE NORMAL DE PROTEÍNA.APÓS O NASCIMENTO, OS FILHOTES FORAM PESADOS, E AS MÃES DOS DOIS GRUPOS PASSARAM A RECEBER RAÇÃO COM QUANTIDADE NORMAL DE PROTEÍNA. APÓS OS DESMAME AS FÊMEAS FORAM SACRIFICADAS E OS MACHOS MANTIDOS PARA ANÁLISE... 37
FIGURA 5. A QUALIDADE DA BIBLIOTECA E CHECAGEM DO TAMANHO E DA PUREZA DAS AMOSTRAS. A: EXEMPLO DE TRUSEQ STRANDED MRNA PREPARAÇÃO DA
AMOSTRA DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DA BIBLIOTECA. B: TRUSEQ STRANDED MRNAPREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 260 BP PCRPRODUCT. ... 42
FIGURA 6. PESO DOS ANIMAIS AO NASCER. OS VALORES FORAM EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO.COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05 ... 46
DUAS VIAS PARA MEDIDAS REPETIDAS E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA P≤0,05. ... 47
FIGURA 8. PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA DOS ANIMAIS DOS GRUPOS NP E LP. AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM ANOVA DE DUAS VIAS PARA MEDIDAS REPETIDAS COM SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA P≤0,05. ... 47
FIGURA 9. MASSA DO CORAÇÃO E DOS VENTRÍCULOS NORMALIZADOS PELA MASSA CORPORAL E NÃO NORMALIZADOS. COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05 ... 48
FIGURA 10. GRÁFICO DA ÁREA DO MIÓCITO DO VENTRÍCULO ESQUERDO E FIGURAS REPRESENTATIVAS A: IMAGEM REPRESENTATIVA DO GRUPO NP E B: IMAGEM REPRESENTATIVO DO LP, A SETA REPRESENTA UM CARDIOMICIOCITO UTILIZADO PARA MENSURAÇÃO DA ÁREA. OS VALORES FORAM EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO. COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE
STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05 ... 49
FIGURA 11. GRÁFICO DO CONTEÚDO DE COLÁGENO DO VENTRÍCULO ESQUERDO E FIGURAS REPRESENTATIVAS, A: IMAGEM REPRESENTATIVA DO GRUPO NP E B: IMAGEM REPRESENTATIVO DO LP.OS VALORES FORAM EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO. COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE
STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 49
FIGURA 12. ESQUEMA REPRESENTANDO A VIA DO AMP CÍCLICO E VIAS ASSOCIADAS ELEITAS PARA INVESTIGAÇÃO.AS SETAS VERMELHAS INDICAM AS ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO GÊNICA.OS ASTERISCOS INDICAM AS PROTEÍNAS SELECIONADAS PARA ESTUDO POR WESTERN BLOT. ... 50
FIGURA 13. CODIFICANTES DE PROTEÍNAS RELACIONADAS À MORFOLOGIA E FUNÇÃO CARDÍACA. MRNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSO NO GRUPO LP COMPARADOS COM O GRUPO NP. ... 58
FIGURA 14. CODIFICANTES DE PROTEÍNAS RELACIONADAS A PROCESSOS TECIDUAIS IMPORTANTES NO MIOCÁRDIO. MRNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSO NO GRUPO
LP COMPARADOS COM O GRUPO NP. ... 59
FIGURA 15. CODIFICANTES DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO DIABETE MELLITUS E AO METABOLISMO. MRNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSO NO GRUPO LP COMPARADOS COM O GRUPO NP. ... 59
COMPARADOS COM O GRUPO NP. ... 60
FIGURA 17. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA SOD2 E NOS1 (%). COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 61
FIGURA 18. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CREB E PCREB (%). COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 62
FIGURA 19. EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ERK1/2 E PAKT (%). COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 62
FIGURA 20.EXPRESSÃO DA PROTEÍNA AT1 E AT2 (%). COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 63
FIGURA 21. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NAKATPASE (%). COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS COM TESTE T DE STUDENT E SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 63
FIGURA 22. ANALISE DA SOBREVIDA DOS ANIMAIS. NP EM VERDE, LP EM LARANJA
COMPARAÇÃO ENTRE OS GRUPOS LP E NP COM SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA PARA P<0,05. ... 64
FIGURA 23.O CAMP É UM DOS SEGUNDOS MENSAGEIROS MAIS COMUNS E UNIVERSAIS, E SUA FORMAÇÃO É PROMOVIDA PELA ATIVAÇÃO DA ADENILIL CICLASE (AC) APÓS A LIGAÇÃO DOS RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍNA G (GPCRS) POR LIGANTES INCLUINDO HORMÔNIOS, NEUROTRANSMISSORES E OUTRAS MOLÉCULAS DE SINALIZAÇÃO. O AMPC REGULA OS PRINCIPAIS PROCESSOS FISIOLÓGICOS,
INCLUINDO O METABOLISMO, A SECREÇÃO, A HOMEOSTASE DO CÁLCIO, A CONTRAÇÃO MUSCULAR, O DESTINO CELULAR E A TRANSCRIÇÃO GÊNICA.OAMPC ATUA DIRETAMENTE EM TRÊS ALVOS PRINCIPAIS: PROTEÍNA QUINASE A (PKA), A PROTEÍNA DE TROCA ATIVADA POR CAMP(EPAC) E CANAIS IÔNICOS CÍCLICOS POR NUCLEOTÍDEO (CNGCS). A PKA MODULA, VIA FOSFORILAÇÃO, VÁRIOS SUBSTRATOS CELULARES, INCLUINDO FATORES DE TRANSCRIÇÃO, CANAIS IÔNICOS, TRANSPORTADORES, TROCADORES, PROTEÍNAS INTRACELULARES DE MANIPULAÇÃO DE CA2 + E MAQUINARIA CONTRÁTIL. AS PROTEÍNAS EPAC
ADAPTADORAS IMPLICADAS NA MODULAÇÃO DO CITOESQUELETO DE ACTINA,
REGULADORES DE PROTEÍNAS G DA FAMÍLIA RHO E FOSFOLIPASES, SINALIZAÇÃO DE RETRANSMISSÃO A JUSANTE DE RAP. ... 100
TABELA 1. COMPOSIÇÃO DAS DIETAS PURINA LABINA® E AIN-93G. ... 36
TABELA 2.LISTA DOS ANTICORPOS UTILIZADOS, FABRICANTE E NÚMERO DE CATÁLOGO.
... 45
TABELA 3.CODIFICANTES DE PROTEÍNAS COM SUAS FUNÇÕES SEGUNDO A LITERATURA.
... 50
TABELA 4. LISTA DOS GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSO NO GRUPO LP QAUANDO COMPARADOS COM O GRUPO NP. QUANDO O VALOR DE LOG2FOLDCHANGE
NEGATIVO OS GENES APRESENTAM EM MENOR QUANTIDADE EM LP E QUANDO POSITIVO OS GENES ESTAM MIAS EXPESSOS EM LP. FORAM CONSIDERADOS OS GENES QUE TIVERAM P<0.05. ... 99
α1-AR α1-Adrenergico
AKT Serine/threonine kinase AngI Angiotensina I
AngII Angiotensina II ANOVA Analise de variância
AT1 Receptores de angiotensina tipo 1 AT2 Receptores de angiotensina tipo 2
11β-HSD2 11β-hidroxiesterióde desidrogenase tipo 2 BSA Albumina de soro bovino
Β-AR Beta adrenérgicos cAMP Via AMP cíclico
CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área de Ciências em Animais de Laboratório – UNICAMP
CEUA/UNICAMP Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas
CREB CAMP responsive element binding protein DCV Doenças cardiovasculares
DM Diabetes mellitus
ECA Enzima conversora de angiotensina
ERK 1 Proteínas quinases reguladas por sinais externos 1 ERK 2 Proteínas quinases reguladas por sinais externos 2 GLUT 4 Transportador de glicose 4
GPCRs Receptores acoplados à proteína G Gs Proteína G estimuladora
HPA Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal IRS1 Receptor de insulina tipo 1 IRS2 Receptor de insulina tipo 2 JUNK Quinase c-jun NH2 – termianal
LaCTAD Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho, Campinas da UNICAMP
LP Low protein
MAPK Proteínas quinases ativadoras de miogênicas MEC Matriz extracelular
Na/K-ATPase sódio -potassio ATPase
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido Nítrico sintase NOS1 Óxido Nítrico sintase 1
NP normal protein
OMS Organização Mundial da Saúde p300 CREB-binding protein
PI3K Fosfatidil inositol 3 quinase PAC Pressão arterial caudal PKA Proteínas quinases A RAP1 Ras-related protein 1
ROS Espécies reativas de oxigênio
SRAA Sistema renina-angiotensina-aldosterona SOD2 Superoxido dismutase 2
1.1. PROGRAMAÇÃO FETAL ... 22
1.1.1. GÊNESE DA PROGRAMAÇÃO FETAL ... 24
1.2. PROGRAMAÇÃO FETAL E DOENÇAS CARDIOVASCULARES ... 27
1.2.1. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E ENVELHECIMENTO... 31
2. OBJETIVOS ... 34
2.1. OBJETIVO PRINCIPAL... 34
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 34
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 35
3.1. PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 35
3.2. ANIMAIS, ACASALAMENTO E GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 35
3.3. AFERIÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL (PAC) ... 37
3.4. EUTANÁSIA E COLETA DOS MATERIAIS ... 38
3.5. PROCESSAMENTO PARA ANÁLISE HISTOLÓGICA E MORFOMÉTRICA ... 39
3.5.1. MENSURAÇÃO DO CONTEÚDO DE COLÁGENO, DA ÁREA DOS MIÓCITOS E DA ESPESSURA DO VENTRICULO ESQUERDO .... 39
3.6. ANÁLISES DE EXPRESSÃO GÊNICA ... 40
3.6.1. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL ... 40
3.6.2. ANÁLISE DA QUANTIDADE, QUALIDADE E INTEGRIDADE DO RNA TOTAL ... 40
3.6.3. SEQUENCIAMENTO DO mRNA ... 41
3.6.4. ANÁLISE DOS DADOS ... 42
3.7. WESTERN BLOTTING ... 43
3.8. ANALISE ESTATISTICA ... 45
4. RESULTADOS ... 46
4.3. ANÁLISE DOS PARÂMETROS RELACIONADOS À HIPERTROFIA E FIBROSE CARDÍACA NOS ANIMAIS COM 62 SEMANAS ... 47 4.4. SEQUENCIAMENTO DOS mRNAS ... 49 4.5. WESTERN BLOTING ... 60 4.6. CURVA DE SOBREVIDA ... 64 5. DISCUSSÃO ... 65 6. CONCLUSÃO ... 74 7. REFERÊNCIAS ... 75 ANEXOS ... 98 Anexo 1... 98 Anexo 2 ... 99 Anexo 3 ... 100
1.INTRODUÇÃO
1.1.PROGRAMAÇÃO FETAL
Durante o desenvolvimento, tanto o embrião quanto o feto são extremamente sensíveis a fatores adversos aos quais a gestante pode ser exposta (1). Assim a ocorrência desses fatores durante a gestação, como por exemplo: desnutrição, exposição a toxinas, alto consumo de bebidas alcoólicas e/ou nicotina e infecções, podem levar a alterações placentárias e/ou redução na disponibilidade de oxigênio ou de nutrientes para o concepto (2). Tais disfunções placentárias podem modular a diferenciação, proliferação, o número de células e de unidades funcionais, modificando as vias normais de desenvolvimento de tecidos e órgãos (2,3). Sendo assim, o ambiente intrauterino pode ser considerado um fator-chave na etiologia de diversas doenças na vida adulta, sendo esse processo denominado de programação fetal.
O termo programação fetal foi utilizado pela primeira vez por Alan Lucas em 1991, que o definiu como “estímulo ou insulto que ocorre em um período do
desenvolvimento, que resulta em mudanças permanentes ou a longo prazo na estrutura ou função do organismo”, ou seja, fatores adversos tanto ao embrião
quanto ao feto ou neonato, influenciam seu desenvolvimento e estão correlacionados a sua saúde na vida adulta (4). Entretanto, estudos demonstrando evidências da programação ocorreram anteriormente a essa data, grande parte destes na década de 80 e, associaram mortalidade por doença cardiovascular com eventos ocorridos na primeira fase da infância. Mas, as primeiras evidências de programação datam da década de 60. Em 1964 Rose notou incidência duas vezes maior de infarto em pacientes cujos irmãos nasceram mortos (natimortos) ou que morreram na infância (5).Forsdahl (1977) foi o primeiro a evidenciar correlação entre doenças cardiovasculares (DCV) e condições de pobreza dos primeiros anos de vida até a adolescência (6).
Entretanto, foi somente com o surgimento da Hipótese de Barker (1989) que o termo programação pode ser fundamentado por Alan Lucas. Em seus estudos Barker observou a relação inversa entre o peso ao nascer e a
prevalência de DCV, interpretando os ambientes embrionário e fetal como novo componente na etiologia dessas doenças. Essa correlação é independente do estilo de vida, isto é, de hábitos como por exemplo tabagismo e sedentarismo. Nesses estudos Barker analisou coorte de 10.141 homens que nasceram entre 1911 e 1930, em seis distritos de Hertfordshire (Inglaterra), e verificou que os casos de óbito como resultado de doença cardíaca isquêmica eram maiores entre os homens que exibiram os menores valores de peso corporal ao nascimento e nos primeiros anos de vida, quando comparados com homens que apresentaram peso normal ao nascimento (7,8). Desta forma surgiu a Hipótese de Barker, que evidencia a importância do ambiente intrauterino como fator-chave nas condições de saúde da prole ao longo da vida.
No período da segunda guerra mundial, nos anos de 1944 a 1945, a Holanda passou por um período de extrema fome, devido a proibição dos alemães ao transporte de alimentos para essa área. Esse período permitiu o estudo sobre os efeitos da desnutrição materna na saúde do organismo na vida adulta (9). Neste estudo Roseboom e colaboradores analisaram uma coorte de indivíduos nascidos entre os anos de 1943 – 1947 cujas mães foram privadas de alimentação adequada durante cinco meses. Essa privação acometeu grávidas em períodos diferentes da gestação. Quando adultos os indivíduos que foram expostos a desnutrição materna, na fase inicial da gestação, apresentaram índices maiores de obesidade, doença coronariana, e alteração no metabolismo de lipídios (9). Já os indivíduos que sofreram exposição à desnutrição materna durante o final da gestação apresentaram maiores índices quanto ao desenvolvimento de diabetes do tipo 2 (9).
É importante salientar que o quadro de desnutrição pode ocorrer não somente pelo consumo insuficiente, mas também pelo consumo excessivo de carboidratos e outros alimentos pobres em nutrientes (10). Estudos indicam que condições sociais precárias estão relacionadas a estímulos adversos durante a infância e a adolescência, aumentando o risco de DCV (11). Além de doenças cardiovasculares, outras doenças podem ser induzidas no adulto pela manipulação do ambiente fetal (12,13) como diabetes tipo 2 (9,14–16), hipertensão arterial (17–19), obesidade e a adiposidade abdominal (20,21) e resistência à insulina (16,22).
As alterações moleculares e funcionais dos diversos tecidos, resultantes do desequilíbrio nutricional materno, ocorrem por meio da modulação da expressão gênica e são inicialmente benéficas, permitindo a sobrevivência da prole (23,24). Contudo, seus efeitos em longo prazo, ao haver aumento na disponibilidade de nutrientes após o nascimento, levam a prejuízos a saúde do indivíduo e acarretam em risco aumentado de doenças cardiovasculares e metabólicas (25–28). Assim, a incompatibilidade entre os ambientes intra e extrauterino pode gerar crescimento pós-natal acelerado, conhecido como
catch-up growth, que aumenta ainda mais a incidência de doenças cardiovasculares e
metabólicas no adulto (29–34).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) (2014) são consideradas com baixo peso ao nascer recém-nascidos com menos de 2500g (2,5 Kg). Cerca de 15% a 20% de todas as crianças nascidas no mundo, apresentam baixo peso, sendo considerado um problema de saúde pública a nível mundial. Até o ano de 2025 a OMS tem como meta a redução de cerca de 30% no número de crianças com baixo peso ao nascimento (35).
1.1.1. GÊNESE DA PROGRAMAÇÃO FETAL
Diante da ameaça à sobrevivência, o feto sofre adaptações que priorizam o desenvolvimento de tecidos e órgãos acelerando a maturação, entretanto, restringe seu crescimento (36).
Dentre os fatores envolvidos na gênese da programação fetal está a nutrição materna que irá determinar a quantidade de nutrientes que chegará ao feto bem como a capacidade placentária de transferência desses nutrientes (2). Já está bem estabelecido que a nutrição materna, nos diferentes estágios da gravidez, pode induzir mudanças no desenvolvimento do feto, acarretando alterações permanentes na estrutura e função de diversos órgãos da prole (37,38).
No modelo de restrição proteica gestacional o feto recebe quantidade reduzida de aminoácidos essenciais e também, como visto em modelos animais, a restrição proteica leva ao aumento no tamanho e na superfície de troca da
placenta (39,40), redução no fluxo sanguíneo (41). Além disso, modelos experimentais de restrição proteica gestacional podem apresentar alterações nas concentrações de hormônios maternos e fetais, assim como, hormônios de crescimento (GH), fatores de crescimento semelhantes a insulina (IGFs), insulina, glicocorticoides, catecolaminas, leptina, hormônios tireoidianos e hormônios placentários (42,43). Dentre estes, o glicocorticoide é o principal envolvido na programação fetal (44,45).
Em casos de partos prematuros são utilizados glicocorticoides sintéticos pela sua capacidade de promover rápida maturação celular, entretanto, essa maturação ocorre em detrimento à proliferação celular (42). O glicocorticoide atravessa livremente a placenta por ser lipofílico, entretanto, a concentração dessa molécula é muito menor no feto do que em sua progenitora (46–48). Essa diferença entre as concentrações, materna e fetal, é mantida pela ação da enzima 11β-hidroxiesterióde desidrodenase tipo 2 (11β-HSD2) que catalisa o cortisol e corticosterona em suas formas inativas, cortisona e 11-deidrocorticosterona em humanos e roedores, respectivamente (49) (Figura1).
Tanto em modelos animais, quanto em humanos, a ineficiência da enzima
11β-HSD2 está associada com o baixo peso ao nascer da prole (50). Em
modelos de programação fetal a redução na concentração e atividade dessa
Circulação materna Placenta Circulação fetal Circulação materna Placenta Circulação fetal Circulação
materna Placenta Circulação fetal
Barreira 11β-HSD2 Cortisol ativo Cortisona inativa Dexametasona Deficiência de 11β-HSD2
Figura 1 Exposição fetal aos glicocorticoides. (A): condição normal, 11β-HSD2 atua como uma barreira
protetora aos glicocorticoides maternos. (B): condição de estresse materno, com aumento de cortisol. (C): redução na concentração e na atividade 11β-HSD2 na programação fetal (50).
enzima permite que os glicocorticoides maternos tenham acesso ao feto, ocasionando retardo em seu crescimento, com a maturação precoce de seus tecidos, bem como outras alterações que podem gerar doenças na vida adulta (2,51,52). Uma consequência importante desta exposição aumentada à glicocorticoides é a redução de seus receptores hipocampais que são responsáveis pelo feedback negativo do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) gerando hiperatividade do mesmo (44,53–55).
A superexposição dos órgãos fetais a esse hormônio leva a alterações morfológicas e funcionais por meio da regulação da expressão gênica (51). Desta forma os glicocorticoides maternos atuam como agente regulador epigenético assim como, metilação do DNA e alterações na estrutura da cromatina (56–61). Diversos trabalhos demonstraram que as mudanças epigenéticas, que podem ocorrer pela exposição fetal a diversas toxinas e a desnutrição materna (durante a gestação e/ ou lactação), são consideradas mecanismos potenciais para alterações do fenótipo da prole gerando consequências em longo prazo (21,28,62,63). Além disso, estudo demonstrou que essas alterações são transmitidas para as gerações subsequentes, através das linhagens germinativas (64).
Vários estudos, com modelos animais, investigaram o efeito da nutrição materna durante a gestação e/ou lactação na expressão gênica da prole. Utilizando alguns genes específicos para análise, demonstra que modificações na expressão de alguns fatores-chave irão acarretar em modificações em diversas vias metabólicas, de desenvolvimento e alterações na estrutura e funcionamento de diversos tecidos (28) e, que as marcas epigenéticas apresentam um período crucial de estabelecimento e manutenção, apresentando um período crítico e vulnerável durante os estágios iniciais de desenvolvimento em mamíferos (65).
Embora os estudos sobre os efeitos da nutrição materna no fenótipo da prole ainda estejam na sua fase inicial, eles vêm aumentando rapidamente. A compreensão dos mecanismos epigenéticos no controle da expressão gênica e a análise das alterações da expressão gênica envolvidas no desenvolvimento de doenças cardiovasculares e metabólicas decorrentes da programação fetal,
poderão proporcionar avanços em novos marcadores de indivíduos de risco e avanços no tratamento e intervenção (28).
1.2.PROGRAMAÇÃO FETAL E DOENÇAS CARDIOVASCULARES
Diversos estudos citados anteriormente demonstraram que fatores adversos que acometem a gestante, assim como a desnutrição materna, levaram a diminuição no peso ao nascimento, e que esse está relacionado com maior incidência de DCV, entretanto, os mecanismos relacionados a essa doença não estão elucidados completamente. Supõe-se que possa ocorrer secundariamente a alterações em vias metabólicas, tecidos e órgãos, que levam a aumento da pressão arterial e, em resposta a essa sobrecarga pressórica o miocárdio sofre remodelação primária (aumentando a espessura da parede ventricular, aumento no depósito de colágeno e hipertrofia dos cardiomiócitos) (66,67) (Figura 2 e 3).
Endomísio
Miócito
Fibroblas Artéria Perimísio
Miócito hipertrófico Miofibroblastos Fibrose perivascula r Fibrose perimisial Fibrose endomisial Coração normal DCH
Figura 2. Representação esquemática das alterações nas câmaras cardíacas de um
indivíduo com doença cardíaca hipertensiva. Doença cardíaca hipertensiva levam à hipertrofia de cardiomiócitos e transição de fibroblastos para miofibroblastos. Essas alterações estão associadas na doença precoce com aumento da manifestação da MEC pela fibrose perivascular e fibrose do endomísio e do perimísio (274).
O crescimento do coração em mamíferos, pós-nascimento, ocorre por hipertrofia dos cardiomiócitos sem haver divisão celular (68). Podendo ser reiniciada em adultos em resposta à sobrecarga hemodinâmica em condições fisiológicas (condições transitórias, assim como: crescimento na adolescência) ou patológicas (condição permanente) (69). Contudo, os fatores que levam a hipertrofia ventricular esquerda ainda não estão completamente elucidados. O estimulo primário para a hipertrofia pode ser o estiramento mecânico da parede do coração decorrente da hipertensão, fatores neuro-humorais ou, até mesmo, da interação entre eles. A célula recebe essas informações e as traduzem em seu interior por meio de alterações bioquímicas. Essas informações ativam receptores celulares que irão desencadear uma cascata de sinalização pela ativação inicialmente de segundos mensageiros que são citosólicos e levam a ativação de terceiros mensageiros, que agem no núcleo da célula e regulam a transcrição. E por fim, essa alteração gênica acarreta em mudanças que levam a hipertrofia (70).
A sobrecarga pressórica decorrente de condições patológica, assim como, hipertensão arterial, é capaz ativar diversas moléculas de sinalização (71). A angiotensina II, a endotelina-1, o fator de crescimento endotelial vascular
Figura 3. Representação esquemática do aumentando a espessura da parede ventricular
cardíacas de um indivíduo com doença cardíaca hipertensiva (274). DCH VEIA CAVA ATRIO DIREITO VENTRICULO DIREITO AORTA ARTERIA PULMONAR VEIA PULMONAR ATRIO ESQUERDO VENTRICULO ESQUERDO
(VEGF) e o fator de crescimento transformador β (TGFβ) têm sido implicados na hipertrofia celular cardíaca pela capacidade comum em ativar membros da família da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) por meio de vias de sinalização dependentes de Raf / Ras. As MAPKs são responsáveis pela indução da transcrição de genes associados à hipertrofia. Entre a superfamília MAPK estão a reguladas por sinais externos (ERK), a quinase c-jun NH2- terminal (JUNK) e a p38 bem conhecidas mediadoras de sinalização hipertrófica. (71).
A hipertrofia pode ser desencadeada também pela ativação de receptores adrenérgicos por fatores neuro-humorais (72). Os cardiomiócitos expressam receptores β-adrenérgicos (β-AR) e α1-adrenérgicos (α1-AR) (73) e ambos estão envolvidos nos na ativação de MAPK induzida por fatores neuro-humorais que levam a hipertrofia (73). Os β-AR desencadeiam a cascata de sinalização que tem como segundo mensageiro a proteína G estimuladora (Gs) ativando proteínas quinases A (PKA), e a p38. Essa ativação leva a hipertrofia, com o aumento da massa cardíaca, dos cardiomiócitos e da fibrose (74,75). Os receptores α1-AR desencadeiam a cascata de sinalização que tem como segundos mensageiros proteínas G (Gq) levando a ativação de Proteína quinase C (PKC) (76).
A insulina também pode levar a hipertrofia. Em condições normais, a insulina desencadeia uma casca de sinalização com efeito vasodilatador e antiapoptótico pela via IRS/PI3K/AKT/mTOR, que se inicia pela indução da fosforilação do substratos do receptor de insulina (IRS-1) em tirosina (77). Entretanto, agentes que levam a resistência à insulina (TNFα, ácidos graxos, hiperinsulinemia) inibem a função de IRS-1, levando uma inativação da via Fosfatidil inositol 3-quinase (PI3K) e manutenção da via ERK/MAPK que levam a hipertrofia (78,79). A via ERK/MAPK está relacionada ao controle do crescimento e mitogênese e a via IRS/PI3K está envolvida no metabolismo da insulina (80–85).
Estudos demonstraram que a restrição proteica gestacional leva a maior estresse oxidativo (86–88). O estresse oxidativo é a causa do envelhecimento precoce, por causar danos celulares e ao DNA, assim como, encurtamento dos telômeros. O estresse oxidativo ocorre pelo desequilíbrio entre a produção de
espécies reativas de oxigénio (ROS) e a sua remoção através de sistemas que defendem as células contra o excesso desses radicais livres (89,90) e estão relacionados com doenças relacionadas a idade, como por exemplo, doenças cardiovasculares (91,92). O aumento das ROS ativa proteínas quinases ativadoras mitogênicas (MAPK), via de sinalização hipertrófica (93) e também em alterações na biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) produzidos pelas enzimas óxido nítrico sintases (NOS) (94,95). Sendo assim, esse desequilíbrio leva ao remodelamento do miocárdio.
Estudos de 1999 já demonstraram que a restrição proteica gestacional leva a alterações na atividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) do feto (96). Esse sistema está envolvido no controle da pressão arterial e hidroeletrolítico desempenhando papel importante no desenvolvimento de hipertensão e de doenças renais e cardiovasculares (97). Ele é caracterizado por cascatas de eventos que englobam a angiotensina I (AngI), enzima conversora de angiotensina (ECA) e a angiotensina II (AngII). Estudos em ratos submetidos à restrição proteica gestacional observaram maior atividade da ECA e, a administração de inibidores de ECA ocasionou redução na pressão da prole (98). A Angiotensina II possui dois receptores, o receptor de angiotensina tipo 1 (AT1) e o receptor de angiotensina tipo 2 (AT2), que apresentam ações antagônicas (99). O receptor AT1 quanto ativado pela ligação com a angiotensina II provoca vasoconstrição, aumento do estresse oxidativo, inflamação e ativação do sistema nervoso simpático. Já a ligação da angiotensina II nos receptores AT2 resulta em vasodilatação, diminuição na produção e secreção de renina, apoptose de cardiómicitos e inibição dos radicais livres (97,99,100).
Dentre outros fatores decorrentes da manipulação do ambiente intrauterino que poderão acarretar repercussões cardiovasculares, estão as alterações no desenvolvimento do tecido muscular com aumento nas miofibras do tipo IIb, diminuição no transportador de GLUT 4 (transportador de glicose 4), diminuição da atividade da CPT-1 (carnitine palmitoyltransferase-1) e regulação negativa das principais enzimas envolvidas na função mitocondrial. Tais alterações juntas levariam ao acumulo de triglicérides intramuscular e redução do metabolismo energético, explicando parcialmente a resistência à insulina
observada e a predisposição a obesidade e ao diabetes tipo 2 (101–103). Outro fator importante é a modulação do desenvolvimento renal, com redução no número de néfros (28%), acarretando hipertensão e consequente hipertrofia ventricular esquerda (104–107).
Entretanto, Menendez-Castro e colaboradores (2011) observaram que no 70º dia de vida ratos submetidos à restrição proteica ainda não apresentavam pressão arterial elevada e já apresentavam modificações na expressão de genes e na estrutura do coração. Sendo assim, é concebível que as alterações do miocárdio possam não somente ocorrer secundariamente a hipertensão (108).
Estudos demonstram que o crescimento intrauterino restrito acarreta em atraso na transformação dos cardiomiócidos mononucleados em binucleados, na presença de cardiomiócitos hipertróficos em relação ao tamanho do coração (109–111) e também redução em seu número (112,113). Além de alterações nos cardiomiócitos, estudos observaram redução no peso do coração e também maior número de fibroblastos cardíacos (114) e fibrose intersticial no ventrículo esquerdo de ratos adultos (115), predispondo à disfunção cardiovascular e a arritmias (116,117).
1.2.1. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E ENVELHECIMENTO
Eventos patológicos progressivos levam ao desequilíbrio na manutenção do sistema cardiovascular, acarretando em diversas DCV que podem levar a insuficiência cardíaca (118).
As desordens decorrentes das DCV se sobrepõem as alterações associadas à idade, confirmando que incidência das DCV aumenta com o passar dos anos. Sendo assim, o envelhecimento pode ser considerado, junto com outros fatores (tabagismo, sedentarismo, alteração na dieta e no metabolismo lipídico, etc.), fator de risco na incidência de DCV (119,120).
Os mecanismos que levam as alterações associadas à idade ainda são discutidos. É ainda discutido se as mudanças associadas à idade na estrutura e/ou função das artérias iniciam a inflamação crônica reparadora, ou se a inflamação crônica, decorrente do aumento de desordens moleculares com o
avançar da idade, inicia alterações na estrutura e função das artérias. Possivelmente ambos processos ocorram. Sendo assim, o envelhecimento cardíaco pode ser caracterizado inicialmente por distúrbios moleculares associados à idade, podendo levar à inflamação arterial crônica que leva a alterações fenotípicas das células arteriais, promovendo remodelamento da parede arterial e alteração da função arterial, acentuando o ciclo inflamatório (121). Esse quadro faz com que o sistema cardiovascular opere no limite das desordens clinicas das doenças cardiovasculares (119).
Com o passar dos anos as grandes artérias tornam-se menos elásticas e mais rígidas por meio da fragmentação e calcificação das fibras elásticas, aumento na deposição de colágeno a na ligação cruzada entre suas fibras, deposição amiloide na camada media e migração e proliferação de células da musculatura lisa vascular. Esse processo é mediado pelo ambiente pró-inflamatório juntamente com aumento do estresse oxidativo. O aumento na rigidez das artérias envelhecidas leva ao aumento da pressão arterial sistólica e da pressão de pulso e redução da pressão diastólica (121). A cascata de sinalização pró-inflamatória mediada por AngII tem papel dominante no processo adverso do envelhecimento da parede arterial (122).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), nos anos de 2000-2016, mais pessoas morreram por DCV do que por qualquer outra causa em todo mundo (123), chegando a 31% (17.7 milhões) do total de mortes mundo, sendo que, um terço delas tinham menos de 70 anos (124). A OMS prevê para o ano de 2030 que número de mortes por DCV aumentará para 22.2 milhões (125). No mundo, o número de pessoas com mais de 60 anos também irá aumentar entre os anos de 2015 e 2050, de 12% para 22%, sendo que, no ano de 2020 o número de pessoas com 60 anos ou mais ultrapassará o número de crianças com menos de 5 anos (126). Pelo fato do envelhecimento ser fator de risco para DCV, no caso de programação fetal, este risco aumenta sobremaneira. A crescente população de pacientes idosos com DCV tem levado ao aumento dos custos com cuidados em saúde tornando os avanços do conhecimento em medicina personalizada e biologia do envelhecimento de extrema importância (127).
Diante das informações apresentadas acima é plausível supor que a restrição proteica materna, e/ou seus efeitos durante o envelhecimento, possam induzir alterações na expressão gênica e antecipação de alterações cardiovasculares, características do envelhecimento. Isso poderia ainda, contribuir para a redução da sobrevida destes animais.
2.OBJETIVOS
2.1.OBJETIVO PRINCIPAL .
Avaliar o impacto do envelhecimento na prole de ratos machos submetidos à restrição protéica intraútero investigando a pressão arterial, a morfologia do ventrículo cardíaco esquerdo, a expressão gênica e proteica e a longevidade.
2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar na prole de ratos Wistar HanUnib machos submetidos a restrição proteica gestacional com 62 semanas de vida:
• Pressão arterial;
• Morfometria ventricular esquerda;
• Expressão gênica e quantificação de proteínas traduzidas de genes com expressão alterada bem como de suas vias de sinalização.
3.MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.PROTOCOLO EXPERIMENTAL
O protocolo experimental para o uso de animais em pesquisa do presente estudo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUA/UNICAMP) (Protocolo número 4272-1, 2016; Anexo 1) em conjunto com outro protocolo experimental (Protocolo número 3425-1, 2014).
3.2.ANIMAIS, ACASALAMENTO E GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar HanUnib, pesando de 250 a 300g, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na área de Ciência em Animais de Laboratório - UNICAMP (CEMIB). Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura de 23 + 2 ºC, umidade relativa do ar 50 + 10%, e ciclo claro escuro definido por luzes acesas das 7h00 às 19h00.
Estes animais com 11 semanas de vida foram submetidos ao acasalamento em sistema poligâmico temporário (harém – um rato macho e três fêmeas foram colocados juntos em uma mesma gaiola) durante o ciclo escuro. Após constatação da presença de espermatozoides no lavado vaginal, as ratas prenhas foram separadas em caixas individuais, alocadas em um dos grupos de acordo com o conteúdo proteico da dieta ofertada. Parte delas com ração padrão normoproteica para ratos, contendo 17% de caseína (Grupo NP - normal protein) e a outra parte com ração com quantidade reduzida de proteína, contendo 6% de caseína (grupo LP - low protein) durante todo o período gestacional. Ambas as dietas são isocalóricas e normossódica (Tabela 1). Durante todo período gestacional, semanalmente, o peso corporal das ratas prenhes foi aferido.
No dia do nascimento os filhotes foram pesados e, nos casos em que a progenitora concebeu mais de oito filhotes, foi realizado o ajuste de ninhada, (mantendo somente oito filhotes por mãe) a fim de garantir que todos os animais
da prole tivessem a mesma disponibilidade de alimento durante o período de amamentação. Demos preferência por manter o maior número de filhotes machos e não foram utilizadas ninhadas com uma quantidade reduzida de filhotes (menos que 6 filhotes) ou foram adicionados animais excedentes de outra ninhada para completar 8 filhotes. Os filhotes excedentes foram eutanasiados por decapitação. As fêmeas não foram utilizadas na pesquisa, uma vez que já é conhecido que os hormônios sexuais femininos interferem na modulação da programação fetal, como mostrado no estudo de Grigore e colaboradores onde ocorre menor incidência de hipertensão arterial, disfunções cardiovasculares em fêmeas (128).
Durante a amamentação todas as ratas foram alimentadas com ração padrão de biotério. Após o desmame as fêmeas foram descartadas e os machos da prole foram mantidos em biotério até a 62ª semana de vida, quando foram anestesiados e a eutanásia ocorreu de diferentes modos para diferentes técnicas (Figura 4).
Tabela 1. Composição das dietas Purina Labina® e AIN-93G.
Ingredientes Purina Labina® Low Protein (6%) Normal Protein (17%) Amido de milho 39,75% 48% 39,67% Amido dextrinizado (90-94%) 13,2% 15,9% 13,05% Sacarose 10,0% 12,1% 10,0% Carboidratos 62,95% 76% 62,72% Caseína (84%) 20,0% 7,15% 20,23% L-cistina 0,3% 0,1% 0,3% Bitartarato de colina 0,25% 0,25% 0,25% Proteínas 20,55% 7,5% 20,78% Óleo de soja 7,0% 7,0% 7,0% Gorduras Totais 7,0% 7,0% 7,0% Celulose microcristalina 5,0% 5,0% 5,0% Fibras Totais 5,0% 5,0% 5,0% Mix mineral 3,5% 3,5% 3,5% Mix vitaminas 1,0% 1,0% 1,0% BHT 0,0014% 0,0014% 0,0014% 100% 100% 100%
Em um estudo foi demonstrado que ratos machos submetidos à restrição proteica gestacional (9%) apresentaram média de sobrevida de 69 semanas, enquanto que naqueles cujas mães receberam ração normoproteica (18% de caseína) a média foi de 74 semanas (129).Baseados neste estudo determinamos a idade de 62 semanas para ser avaliada.
Alguns animais foram mantidos, com ração padrão e água à vontade, em gaiolas contendo 3 animais, até a morte natural para análise de sobrevida.
3.3.AFERIÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL (PAC)
A pressão arterial sistólica dos animais foi aferida na 32ª, 40ª, 48ª, 52ª e 62ª semana pelo método de pletismografia caudal. O aparelho foi devidamente calibrado antes dos procedimentos. Antes de iniciar as aferições cada rato foi
PESO DO ANIMAL, PESO DO CORAÇÃO, PESO DO VENTRICULO ESQUERDO E DIREITO, ANÁLISE MORFOMÉTRICA E MOLECULAR.
Figura 4. Separação dos grupos experimentais, período e experimentos realizados. Após a
confirmação da prenhes as ratas foram divididas em dois grupos, de acordo com a dieta fornecida. As mães dos animais do grupo LP receberam ração com quantidade reduzida de proteína. As mães dos animais do grupo NP receberam ração com quantidade normal de proteína. Após o nascimento, os filhotes foram pesados, e as mães dos dois grupos passaram a receber ração com quantidade normal de proteína. Após os desmame as fêmeas foram sacrificadas e os machos mantidos para análise.
colocado em uma caixa de madeira aquecidos à temperatura de 40°C por 10 minutos, com a finalidade de estimular a vasodilatação da artéria caudal. E, posteriormente animais foram imobilizados em contentor acrílico e a cauda do animal foi posicionada em manguito inflável acoplado ao aparelho de medição através de um transdutor/ amplificador de pulso. O manguito foi insuflado, até que houvesse a interrupção total do fluxo sanguíneo arterial. Em seguida, a pressão foi lentamente liberada, e a pressão arterial sistólica aferida graficamente pelo software Windaq, do equipamento Automatic Cuff Inflation
Pump, ITC Life Science Inc®. Sendo aferida por 3 vezes consecutivas para cada
animal e foi adotado o valor médio destas aferições.
3.4.EUTANÁSIA E COLETA DOS MATERIAIS
A eutanásia dos animais foi realizada na 62º semana do nascimento e ocorreu de duas formas distintas (10 animais, sendo 5 do grupo NP e 5 do grupo LP, para cada um dos métodos de eutanásia, num total de 20 animais).
Parte dos animais (10 animais, sendo 5 do grupo NP e 5 do grupo LP) foram anestesiada com isofluorano por via inalatória. Após a anestesia, foi realizada a abertura da região abdominal até a região do tórax com a exposição do coração pelo afastamento das costelas e identificando-se a área cardíaca correspondente ao ventrículo esquerdo, onde foi inserido uma agulha acoplada a um sistema de perfusão Masterflex® (Cole-Parmer®, EUA), até o arco aórtico. Em seguida, um pequeno corte foi realizado no átrio direito, a fim de possibilitar o extravasamento dos líquidos. Inicialmente foi feita a perfusão de solução salina heparinizada por todos os órgãos do animal e em seguida, de solução de paraformaldeído tamponado em tampão fosfato a 4%, pH 7,4 para a fixação dos órgãos. Posteriormente, foi realizada a coleta do coração do animal e a dissecção do ventrículo esquerdo, que foi armazenado para a análise histológica.
O restante dos animais (10 animais, sendo 5 do grupo NP e 5 do grupo LP) foram anestesiados com isofluorano por via inalatória, e após a anestesia, foram decapitados com o auxílio de guilhotina. O tórax dos animais foi aberto e o coração foi coletado e dissecado para a separação dos ventrículos direito e
esquerdo. As massas do coração total, do ventrículo esquerdo e do ventrículo direito foram mensuradas. As massas dos ventrículos foram normalizadas pelo peso corporal dos animais, e usadas como índice de hipertrofia ventricular. O ventrículo esquerdo foi rapidamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado em -80°C para as análises de biologia molecular.
3.5.PROCESSAMENTO PARA ANÁLISE HISTOLÓGICA E MORFOMÉTRICA
3.5.1. MENSURAÇÃO DO CONTEÚDO DE COLÁGENO, DA ÁREA DOS
MIÓCITOS E DA ESPESSURA DO VENTRICULO ESQUERDO
Os ventrículos esquerdos dos dois grupos (5 ventrículos dos animais do grupo NP e 5 do grupo LP), após perfusão, permaneceram em solução de paraformaldeído 4% por 2 horas. Em seguida foram lavados sob água corrente por 1 hora e armazenados em álcool 70°. Os ventrículos esquerdos foram desidratados em solução com concentração crescente de álcool (80%,90%, 95%, 100%), diafanizados em xilol e embebidos em paraplast (Sigma-Aldrich®) para a formação dos blocos. Esses blocos foram seccionados em cortes histológicos com 5µm de espessura e posicionados em lâminas anteriormente tratadas em solução de triethoxyl-silane (Sigma-Aldrich®).
As lâminas contendo os cortes histológicos foram mantidas em estufa à 37°C por meia hora e, posteriormente, desparafinizadas em dois banhos de xilol e um de álcool-xilol e, hidratadas em banhos de álcool em concentração decrescente (100%,100%II,95% e 70%) e em água destilada.
Para a aferição do conteúdo de colágeno intersticial do ventrículo esquerdo foram utilizados 5 animais do grupo NP-62s e 5 animais do grupo LP-62s. Essas lâminas, após serem desparafinizadas e hidratadas, foram submetidas a citoquímica por picrosirus-red e contra coradas com fast green. Foram capturadas imagens, de aproximada de 20 campos diferentes por lâmina de cada animal (5 do grupo NP e 5 do grupo LP, num total de 200 campo). As áreas com pouco tecido foram evitadas e o colágeno perivascular foi excluído da análise. Após a captura dessas imagens foram quantificadas as áreas das fibras de colágenos que ficaram com coloração vermelha e as áreas verdes que
correspondem aos miócitos. A consentração de colágeno presente nos grupos foi estimada pelo programa Olympus CellSens Dimension 1.15.
Para a aferição das áreas de secção transversa do miócito foram utilizados 10 animais: 5 animais do grupo NP-62s e 5 animais do grupo LP-62s. Essas lâminas, após serem desparafinizadas e hidratadas, foram coradas com hematoxilina e eosina. Foram capturadas imagens utilizando o programa
CellSens DimensionI. Os miócitos utilizados para a análise apresentavam a
forma mais arredondada possível, com núcleo visível e central.
Para aferição da espessura da parede e da área da luz do ventrículo esquerdo as lâminas coradas foram escaneadas e as imagens foram analisadas no programa ImageJ.
3.6.ANÁLISES DE EXPRESSÃO GÊNICA
3.6.1. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL
Foram selecionados os ventrículos esquerdos dos animais LP e NP (10 animais, sendo 5 do grupo NP e 5 do grupo LP) com 62 semanas, que apresentaram os maiores valores de pressão arterial a fim de verificar os efeitos da hipertensão na expressão gênica. Os ventrículos que estavam congelados a -80ºC foram macerados e, posteriormente, foi extraído o RNA total das amostras pelo método de extração com Trizol, baseado no protocolo desenvolvido e revisado por Chomczynski & Sacchi (130).
3.6.2. ANÁLISE DA QUANTIDADE, QUALIDADE E INTEGRIDADE DO
RNA TOTAL
A quantidade de RNA total foi determinada pela absorbância de 260nm usando espectrofotômetro nanoDrop e a pureza do RNA foi avaliada pelas razões A260nm/A280nm e A260nm/A230nm (aceitável quando ambas as razões foram > 1,8).
3.6.3. SEQUENCIAMENTO DO mRNA
O sequenciamento de mRNA consiste em uma técnica altamente sensível para medir a expressão de todo transcriptoma, possibilitando quantificar os níveis de mudanças de expressão de cada transcrito durante o desenvolvimento e/ou sob condições diferentes.
3.6.3.1.CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA E SEQUENCIAMENTO
Antes de enviar as amostras para sequenciamento, foi construída uma biblioteca para cada amostra. Foi utilizado 50µl de RNA total seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante do TruSeq Stranded mRNA kit (illumina)
(
https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/truseq-stranded-mrna.html). A montagem da biblioteca consiste,
inicialmente, na purificação do mRNA pela captura de sua cauda PoliA e eliminação do restante do RNAs. O mRNA é fragmentado para a síntese do cDNA. Após a síntese do cDNA, são adicionados adaptadores index, com sequencias conhecidas para a identificação de cada uma das amostras. Posteriormente o fragmento de cDNA é amplificado por PCR.
A qualidade da biblioteca foi verificada em Agilent Technologies 2100
Bioanalyzer usando um chip específico de DNA e foi checado o tamanho e a
Após a validação da biblioteca as amostras foram preparadas para a geração de um cluster e enviadas para serem sequenciadas. O sequenciamento foi realizado na plataforma Hiseq no LaCTAD- Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho, Campinas da UNICAMP.
3.6.4. ANÁLISE DOS DADOS
Os dados do sequenciamento de mRNA foram gerados em arquivo texto no formato FASTQ, que contém vários trechos (reads) que apresentam homologia com sequencias de genes transcritas em RNAs já conhecidas. A qualidade dos dados foi verificada pelo programa FastQC e a análises dos dados foi realizada utilizando o programa para normalização e analises estatística
DESeq2, sendo gerada uma lista com todos os genes diferencialmente
expressos no grupo tratado comparado com o grupo controle.
Os genes que tiveram expressão significativamente alterada, assumindo p<0.05, foram analisados quanto a sua função e possíveis vias de atuação. A partir dessa análise foram selecionados genes e vias com funções que estivessem relacionadas com envelhecimento e doenças cardíacas, para validação de expressão por western blot.
A
B
Figura 5. A qualidade da biblioteca e checagem do tamanho e da pureza das amostras. A:
Exemplo de TruSeq Stranded mRNA Preparação da Amostra Distribuição do Tamanho da Biblioteca. B: TruSeq Stranded mRNA Preparação de Amostras 260 bp PCR Product.
3.7.WESTERN BLOTTING
Os animais foram sacrificados, na 62ª semana de vida, por decapitação e os ventrículos esquerdos foram rapidamente removidos, congelados em nitrogênio líquido e armazenados em Biofreezer (-80ºC).
No momento da extração os ventrículos foram inicialmente macerados e colocados em tubos com solução tampão de extração (10mM de EDTA, 100mM de Tris base, 10mM de pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio, 100mM de ortovanato de sódio, 2mM de PMSF, 0,1mg/mL de aprotinina e agua destilada) para homogeneização em Polytron (modelo PT 10/35, Brinkmann Instruments®) operando em velocidade máxima por 15 segundos. Terminada a homogeneização, foi aplicado a cada amostra 10% do volume total de Triton® 10% e mantida em gelo por 40 minutos. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 4°C durante 40 minutos, a 12000 RPM.
A quantificação proteica foi realizada com método de biureto e foram lidas em leitor de ELISA. Após a leitura, foi adicionado de 100µL de Laemmili e 0,015mg de DTT para cada 400µL do sobrenadante da amostra armazenadas em -80°C, o excedente também foi armazenado.
O extrato total foi aplicado no gel de poliacrilamida, sendo antes, aquecido a 100°C em banho seco, por cinco minutos. Após o aquecimento, aplicou-se no gel seis microlitros do marcador de peso molecular, permitindo a orientação quanto ao peso molecular das bandas a serem observadas nas amostras. A eletroforese foi realizada em cuba de minigel da BioRad® (Mini-Protein), com solução tampão para corrida, previamente diluído, sendo submetida a 60 volts, aumentando gradualmente de 20 em 20 volts a cada 10 minutos até chegar aos 120 volts, onde permaneceu até as bandas do marcador estarem bem separadas. As proteínas separadas no gel foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, utilizando-se o equipamento de eletro-transferência de minigel
da BioRad®. A solução tampão de transferência foi mantida em voltagem
Após a transferência, a membrana foi retirada e corada com Ponceau para normalização. Após a lavagem acrescentou-se uma solução bloqueadora (5% de leite em pó desnatado em solução de lavagem) e procedeu-se agitação no por duas horas, para bloquear epítopos inespecíficos. Passado o tempo do bloqueio, as membranas ficaram imersas por 10 minutos em solução de lavagem, sob agitação e o procedimento foi repetido por três vezes.
Após as lavagens, preparou-se solução para anticorpo com 3% de albumina de soro bovino (BSA) em solução de lavagem para cada membrana e a essa preparação foi adicionado o anticorpo primário de interesse (Tabela 2) e foram mantidas em geladeira (4°C) overnight, sob agitação, para completa ligação do anticorpo primário às proteínas. No dia seguinte, novamente lavou-se cada membrana por três vezes, por 10 minutos cada, com solução basal para limpar os resquícios do anticorpo primário. Posteriormente, preparou-se uma solução de anticorpo secundário (3% de leite em pó desnatado em solução de lavageml, anticorpo secundário ligado à peroxidase) e as membranas foram deixado no agitador por duas horas. Por último, cada membrana foi lavada por três vezes, de 10 minutos cada, com solução de lavagem para limpar os resquícios do anticorpo secundário. Para a revelação das membranas, foi utilizado um kit de quimiluminescência Supersignal West Pico Chemiluminescent
Substrate (Thermo Scientific®). A quantificação das bandas foi feita por
Tabela 2. Lista dos anticorpos utilizados, fabricante e número de catálogo. Numa diluição de 1:100.
3.8.ANALISE ESTATISTICA
Os dados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk e ao teste de Levene para avaliar o padrão de distribuição e a variância das variáveis. As variáveis foram adequadamente apresentadas em média ± desvio. Os resultados obtidos ao longo do tempo foram analisados usando análise de variância (ANOVA) de medidas consecutivas. Para comparação de dois grupos foi utilizado o teste t de Student.
ANTICORPO FABRICANTE CATALOGO
AT1 Santa Cruz Sc-31181
AT2 Santa Cruz sc-9040
PAKT Santa Cruz sc-101629
CREB Cell Signaling 9104
Pcreb Cell Signaling 9191
ERK1/2 Cell Signaling 4370S
NaKatpase Santa Cruz sc-21713
NOS1 Santa Cruz sc-648
4.RESULTADOS
4.1.PESO CORPORAL
O peso das mães que receberam dieta hipoprotéica durante o período gestacional não apresentou diferença significativa em comparação àquelas que se alimentaram com dieta normoprotéica, durante as semanas gestacionais. Os animais do grupo LP apresentaram peso ao nascer significativamente menor quando comparados aos do grupo NP (6 ± 0,06 N=195 versus 6,9 ± 0,11 N=189; P< 0,0001) (Figura 6).
Essa diferença perdurou durante a lactação e permaneceu, até quatro semanas de vida, na qual o peso da prole LP (109±21g, n=107) ainda foi significativamente menor quando comparado ao peso da prole NP (168 ±37g, n=101) (P< 0,0001). Entretanto, na oitava semana os pesos entre os grupos se igualam, demostrando o acontecimento conhecido com Catch-up growth. (586±50g, n=28 versus 628±40g, n=35; P< 0,0001). Já na 62ª semana, momento do sacrifício, observamos novamente redução significativa no peso dos animais do grupo LP (586±50g, n=28 versus 628±40g, n=35; P< 0,0001) (Figura 7).
Figura 6. Peso dos animais ao nascer. Os valores foram
expressos como média ± desvio padrão. Comparações estatísticas foram feitas com Teste t de Student e significância estatística para p<0,05
NP LP 0 2 4 6 8
***
M a s s a a o n a s c e r (g )4.2.AFERIÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL (PAC)
Ao analisarmos a pressão arterial encontramos aumento significativo em LP comparativamente àquela observada em NP, da 32ª até a 62ª semana de vida (Figura 8).
4.3.ANÁLISE DOS PARÂMETROS RELACIONADOS À HIPERTROFIA E FIBROSE CARDÍACA NOS ANIMAIS COM 62 SEMANAS
Ao analisarmos a massa do coração e dos ventrículos normalizadas pela massa corporal, observamos aumento significativo em LP comparativamente ao NP. Entretanto, como demostrado anteriormente, os animais LP apresentaram redução significativa de peso e, quando não normalizados, os valores não são
Figura 7. Peso semanal dos grupos, da 4ª semana de vida até o sacrifício, NP: laranja; LP: verde. Comparações estatísticas foram feitas com Anova de duas vias para
medidas repetidas e significância estatística p≤0,05.
Figura 8. Pressão arterial sistólica dos animais dos grupos NP e LP. As
comparações estatísticas foram feitas com Anova de duas vias para medidas repetidas com significância estatística p≤0,05.
significativamente diferentes. A espessura da parede do ventrículo esquerdo em LP, embora maior, não foi significativamente diferente quando comparamos aquela observada em NP (Figura 9).
Figura 9. Massa do coração e dos ventrículos normalizados pela massa corporal e não normalizados.
