Atividade antimicrobiana e propriedades físicas de filmes biodegradáveis incorporados com cafeína e ácido acético / Antimicrobial activity and physical properties of biodegradable films added with caffeine and acetic acid

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Atividade antimicrobiana e propriedades físicas de filmes biodegradáveis

incorporados com cafeína e ácido acético

Antimicrobial activity and physical properties of biodegradable films added

with caffeine and acetic acid

DOI:10.34117/bjdv6n8-443

Recebimento dos originais: 15/07/2020 Aceitação para publicação: 21/08/2020

Júlie Èvany dos Santos Carneiro

Universidade Federal de Goiás, Escola de Agronomia /Setor de Engenharia de Alimentos Av. Esperança s/n, Campus Samambaia, Goiânia/Goiás - Brasil - CEP 74690-900

Robson Maia Geraldine

Universidade Federal de Goiás

Escola de Agronomia /Setor de Engenharia de Alimentos

Av. Esperança s/n, Campus Samambaia, Goiânia/Goiás - Brasil - CEP 74690-900

Miriam Fontes Araujo Silveira

Maria Célia Lopes Torres

Aysha Jussara Ivonilde Carrim

Adriana Régia Marques Souza

Av. Esperança s/n, Campus Samambaia, Goiânia/Goiás - Brasil - CEP 74690-900

RESUMO

O aumento da exigência do consumidor por alimentos naturais e saudáveis faz com que as indústrias de alimentos se modifiquem, investindo em pesquisas e tecnologias avançadas para garantir ao consumidor produtos similares aos in natura. A produção de embalagens ativas pode contribuir na conservação de alimentos, aumentando sua vida útil e preservando suas características físicas, químicas e sensoriais. O presente trabalho objetivou produzir filmes de acetato de celulose incorporados com cafeína e ácido acético e avaliar sua atividade antimicrobiana, bem como suas características mecânicas, ópticas e de permeabilidade ao dióxido de carbono. Os filmes de acetato de celulose incorporados com cafeína e ácido acético e os filmes com cafeína mostraram efeito antimicrobiano sobre a Salmonella enteritidis. A cafeína influenciou as características mecânicas dos

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filmes, reduzindo sua elongação e aumentando sua rigidez. A adição de água tornou os filmes mais porosos, brancos, opacos e altamente permeáveis.

Palavras-chave: acetato de celulose, filme ativo, Salmonella enteritidis

ABSTRACT

The increase in consumer demand for natural and healthy foods causes the food industries to change, investing in advanced research and technologies to guarantee consumers products similar to those in natura. The production of active packaging can contribute to food preservation, increasing its shelf life and preserving its physical, chemical and sensory characteristics. The present work aimed to produce cellulose acetate films incorporated with caffeine and acetic acid and to evaluate its antimicrobial activity, as well as its mechanical, optical and carbon dioxide permeability characteristics. The cellulose acetate films incorporated with caffeine and acetic acid and the films with caffeine showed an antimicrobial effect on Salmonella enteritidis. Caffeine influenced the mechanical characteristics of the films, reducing their elongation and increasing their stiffness. The addition of water made the films more porous, white, opaque and highly permeable.

Keywords: cellulose acetate, active film, Salmonella enteritidis

1 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento sócio econômico do Brasil tornou a sociedade brasileira mais exigente em termos de qualidade de vida, afetando, principalmente, os setores do meio ambiente e alimentício. Assim, as indústrias têm procurado fabricar produtos saudáveis sem degradar o meio ambiente.

Embalagens biodegradáveis e ativas vêm sendo produzidas com biopolímeros, provenientes de fontes renováveis (IRKIN; ESMER, 2015) incorporadas com conservantes, corantes ou aromatizantes naturais (CARVALHO et al., 2017; SILVEIRA et al., 2007). As embalagens ativas têm como função oferecer uma barreira inerte entre o produto e as condições externas, que combinam avanços em tecnologia de alimentos e biotecnologia, de modo a cumprir as exigências dos consumidores por produtos frescos e seguros (SCANNELL et al., 2000).

O acetato de celulose é um biopolímero muito utilizado, pois se degrada no meio ambiente em curto período de tempo. É um polímero amorfo, não tóxico e inodoro, estável em óleos vegetais e minerais, permeável ao vapor de água e, dependendo do grau de substituição, é solúvel em acetona. Tem a capacidade de formar filmes transparentes e apresenta um baixo custo (CERQUEIRA et al., 2010).

Diversas pesquisas têm utilizado o acetato de celulose como base polimérica incorporado com diferentes aditivos, como antimicrobianos, antioxidantes, aromatizantes, entre outros, para desenvolvimento de embalagens ativas (GONÇALVES et al., 2019; POLA et al., 2016; GOUVÊA et al., 2015; MORAES et al, 2011). Quando em contato com os alimentos, o polímero é capaz de liberar antimicrobianos de forma eficaz para a preservação dos alimentos (COOKSEY, 2005).

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A cafeína tem sido apontada como um antimicrobiano de grande potencial. È o componente do café mais conhecido devido às suas ações fisiológicas e farmacológicas. Segundo Ibrahim et al. (2006), entre as várias propriedades da cafeína que apresentam comprovação científica tem-se: efeito estimulante do sistema nervoso central e do músculo cardíaco, diminuição do sono e atividade inibidora sobre bactérias e fungos.

Almeida (2007), em suas pesquisas com diferentes concentrações de cafeína (2 a 8 mg/mL), confirmou sua ação inibidora a diversas enterobactérias. Carneiro et al. (2013) verificaram que a solução de cafeína e ácido acético, ambos a 2%, mostrou grande potencial frente a cepa Salmonella enteritidis.

Existe uma grande preocupação com as propriedades físicas dos polímeros, que, segundo Appendini e Hotchkiss (2002), são influenciadas para cada combinação componente ativo-polímero. Essas propriedades são importantes para a caracterização, o desenvolvimento e a avaliação da qualidade da embalagem ativa.

O presente trabalho objetivou produzir filmes de acetato de celulose incorporados com cafeína e ácido acético e avaliar sua atividade antimicrobiana e suas propriedades mecânicas, ópticas e de permeabilidade ao dióxido de carbono.

2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Setor de Engenharia de Alimentos, da Escola de Agronomia (EA) da Universidade Federal de Goiás (UFG), em Goiânia-GO.

Para a preparação dos filmes foram utilizados acetato de celulose, doado pela empresa Rhodia, acetona (99,5 % de pureza), tween 80 (99,5 % de pureza) e ácido acético (99,5 % de pureza), adquiridos da empresa CAQ (Casa Química), e cafeína (98,5 % de pureza) da Cromoline.

2.1 PRODUÇÃO DOS FILMES DE ACETATO DE CELULOSE

Os filmes foram produzidos pelo método casting (SILVEIRA et al., 2007), tendo como base polimérica o acetato de celulose e como solvente a acetona. Foram adicionados, também, 2 mL de água destilada e 0,2 g de tween 80. A mistura foi colocada em frascos com tampa, homogeneizada e usada como controle (CON). Outros três tratamentos foram obtidos pelo acréscimo de 13,4 % de cafeína e 2 % de ácido acético (CAA), 2 % de ácido acético (ACI) e 2 % de cafeína (CAF).

2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS FILMES

Para avaliação da atividade antimicrobiana in vitro dos filmes foi usado o método de difusão em Agar (NCCLS, 2003). A cepa ativa da bactéria Salmonella enteritidis (IAL 1132) foi cultivada

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em ágar nutriente, a 35 ºC por 48 horas. Cinco colônias da bactéria foram transferidas para tubo de ensaio, contendo 5 mL de caldo triptona de soja. Em seguida, o inóculo foi transferido para placas de petri (15 cm de diâmetro) contendo ágar Mueller Hinton ou ágar Salmonella-Shigella (SS) Posteriormente, discos de filmes esterilizados (10 mm de diâmetro) foram colocados assepticamente sobre o ágar. As placas foram incubadas a 35 ºC durante 6 e 24 horas. Após estes períodos, mediu-se o halo de inibição com um paquímetro, considerando-se o diâmetro total, incluindo o disco.

2.3 PROPRIEDADES DOS FILMES

A espessura foi determinada através da média dos valores obtidos de 10 pontos aleatórios de cada filme, utilizando-se micrômetro de bancada com resolução de 0,0001 mm (Qualitylabor, modelo MEP/Q, Perus/São Paulo, Brasil).

Para avaliar as propriedades mecânicas, corpos de prova de 14 cm de comprimento e 1 cm de largura, obtidos de acordo com a norma ASTM-D638-02 (2002), foram submetidos a tração no equipamento INSTRON série 5500 (825 University Ave, Norwood, MA 02062-2643, EUA). As propriedades de tensão na ruptura (MPa), módulo de Young (Mpa) e elongação (%) foram determinadas segundo a Norma ASTM-D882-09 (2009), utilizando velocidade de 12,5 mm/min.

A taxa de transmissão ao dióxido de carbono foi determinada em analisador de permeabilidade a gases (Labthink Instruments, PERMEC VAC - V1, Jinan, China) à temperatura de 23,2 ± 1 °C e umidade relativa de 50 ± 2 %, conforme método padrão ASTM-D1434-82 (2009). A área do filme exposta à análise foi de 38,46 cm².

A cor e a opacidade foram determinadas em aparelho Color QUEST II (Hunterlab, série 6553, Reston, EUA), com Universal Software Versions 3.6, operando no padrão CIE L* a* b*. Para o cálculo das coordenadas de cor foi estabelecido o iluminante D65, o ângulo de 10º para o observador e a escala do sistema de cor CIELab (RAVI; PRAKASH; BHAT, 2005). As coordenadas medidas foram: L* (luminosidade), a* (tonalidades de verde a vermelho) e b* (tonalidades de azul a amarelo). As determinações foram feitas em triplicata com corpos de prova de 2 x 2 cm, após a calibração do colorímetro com fundo padrão branco, cinza e preto.

2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste microbiológico foi realizado com 10 repetições. Nos testes de tração foram realizadas cinco repetições em 10 replicatas e nos testes de permeabilidade, cor e opacidade cinco repetições em triplicata. Os dados foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e as diferenças entre os tratamentos avaliadas pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade (FERREIRA, 2011).

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3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A Figura 1 mostra o efeito dos filmes sobre o crescimento de Salmonella enteritidis em ágar Salmonella-Shigella (SS).

Figura 1. Efeito dos filmes controle (CON); cafeína e ácido acético (CAA); ácido acético (ACI) e cafeína (CAF), sobre

o crescimento de Salmonella enteritidis em ágar Salmonella-Shigella (SS), após 6 horas de incubação a 35 ºC.

Após 6 horas de incubação, observou-se formação de halo nos tratamentos CAA e CAF, porém não houve diferença significativa (p>0,05) entre os mesmos, nas placas com ágar Salmonella-Shigella (SS) (Tabela 1). A formação de um halo de inibição está relacionada à ausência de crescimento do microrganismo e difusão do antimicrobiano em meio sólido (GOUVÊA et al., 2015).

Tabela 1. Diâmetro do halo de inibição da Salmonella enteritidis em ágar Salmonella-Shigella (SS), após 6 horas de

incubação a 35 ºC.

Tratamentos** Diâmetro do halo (cm)*

CON 0 a

CAA 1,74 ± 0,30 b

ACI 0 a

CAF 1,64 ± 0,29 b

* Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey (p > 0,05).

**CON - controle (sem adição de cafeína e ácido); CAA - 13,24 % de cafeína e 2 % de ácido acético; ACI - 2 % de ácido acético; CAF - 13,24 % de cafeína.

Quando se utilizou o ágar Mueller Hinton não foi observada formação nítida de halo com os filmes testados (Figura 2), pois este meio é rico em nutrientes, sendo usado para diversos microrganismos. Já o ágar Salmonella-Shigella é um meio especifico para o crescimento do microrganismo em estudo.

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Figura 2. Efeito dos filmes controle (CON); cafeína e ácido acético (CAA); ácido acético (ACI) e cafeína (CAF), sobre

o crescimento de Salmonella enteritidis em ágar Mueller Hinton (MH), após 6 horas de incubação a 35 ºC.

Em ágar Salmonella-Shigella (SS), após 24 horas de incubação, as colônias de Salmonella enteritidis adquiriram coloração preta, permitindo observar que não houve crescimento de bactérias sob o filme com cafeína (CAF), em contraste com o filme controle (CON) (Figura 3).

Figura 3. Efeito da ação antimicrobiana do filme com cafeína (CAF), em relação ao controle (CON), quanto ao

crescimento de Salmonella enteritidis em ágar Salmonella-Shigella, após 24 horas a 35 o_C.

O ágar Muller Hinton é um meio rico em nutrientes, consequentemente, o crescimento dos microrganismos ocorre mais rápido que em outros meios. Assim, com o seu uso, não foi possível a percepção nítida da formação de halo de inibição pelos filmes CAA e CAF. Porém, no ágar Salmonella-Shigella (SS), um meio seletivo diferencial, foi possível visualizar a formação dos halos de inibição pelos filmes CAA e CAF sobre a Salmonella enteritidis.

O ágar Salmonella-Shigella (SS) possui em sua composição tiossulfato de sódio, sais biliares e verde brilhante, responsáveis pela inibição do crescimento dos microrganismos gram-positivos e

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coliformes. Isto faz com que a velocidade de crescimento de bactérias não especificas deste meio seja retardada, porém favorece o crescimento do microrganismo em estudo. Após 24 horas de incubação das placas foi possível notar o escurecimento das bactérias. Isto ocorre devido à precipitação do H2S (ácido sulfídrico), reduzido pelas enzimas tiossulfato redutase (BRASIL, 2011).

A formação dos halos de inibição dos filmes CAA e CAF sobre a bactéria Salmonella enteritidis no ágar Salmonella-Shigella (SS) evidencia a ação antimicrobiana da cafeína. Observou-se que o ácido acético não afetou a atividade antimicrobiana da cafeína, visto que os diâmetros dos halos de inibição não apresentaram diferença significativa entre estes tratamentos. Estudos realizados mostram o efeito antimicrobiano da cafeína na inibição do crescimento da Escherichia coli, sugerindo-se que esta se ligou ao DNA da bactéria, provocando sua morte(SANDLIE; KLEPPE, 1982).

Almeida (2007), em estudos com a cafeína (2 mg/mL) frente à Salmonella entérica, obteve halo de inibição com 8,25 mm ± 0,36 de diâmetro no teste de disco-difusão, utilizando ágar Mueller Hinton como meio para o teste. Carneiro et al (2013), trabalhando com solução 2% de cafeína e 2% de ácido acético para inibição da bactéria Salmonella enteritidis, verificaram a formação de halo de inibição (2 mm da borda do disco de papel) em ágar Muller Hinton.

Segundo Toledo (2000), a formação do halo de inibição está relacionada com a difusão do antimicrobiano e com a velocidade de crescimento do microrganismo. Os fatores que podem influenciar a difusão do antimicrobiano no meio são: a composição do ágar e as interações que ocorrem entre o antimicrobiano e o filme (ALMEIDA et al., 2013).

3.2 PROPRIEDADES DOS FILMES

A espessura dos filmes não variou (p>0,05) em função dos tratamentos, apresentou média de 114,8 ± 8,3 µm, indicando um bom ajuste na produção manual do filme.

Os resultados das propriedades mecânicas dos ensaios de tração dos filmes estão apresentados na Tabela 2. Quanto à tensão de ruptura, não foi observada diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos, os filmes suportaram a mesma tensão antes de se romperem. Laroque (2018) observou redução na tensão de ruptura em filmes de acetato de celulose incorporados com carvacrol, em relação ao controle.

Tabela 2. Propriedades mecânicas dos filmes*.

Tratamentos** _{Ruptura (MPa)}Tensão de Elongação (%)

Módulo de Young (MPa)

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CON 9,07 ± 2,09 ª 6,55 ± 3,02 b _{587,35 ± 91,47 ª}

CAA 11,95 ± 0,97 ª 5,47 ± 0,58 b _{1093,02 ± 159,24}b

ACI 9,14 ± 1,98 ª 6,75 ± 1,40 b _{600,57 ± 84,78 ª}

CAF 10,05 ± 2,47 ª 2,55 ± 0,72 ª 949,96 ± 250,62 b

*Nas colunas, médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey (p >0,05). **CON- controle; CAA- 13,24 % de cafeína e 2 % de ácido acético; ACI- 2 % de ácido acético; CAF- 13,24 % de cafeína.

Na propriedade de elongação, o filme contendo apenas cafeína (CAF) apresentou diferença significativa (p≤0,05) em relação aos demais tratamentos. A elongação é definida como sendo a deformação total, relacionada com a variação no comprimento, sofrida pelo material na análise (ASTM D882-09, 2009). A redução na elongação observada no tratamento CAF em relação aos demais tratamentos pode ser explicada pela cristalização da cafeína na superfície desses filmes, tornando-os menos elásticos. Também Ahmad et al. (2012) observaram redução na elongação de filmes de gelatina com adição de óleo essencial, em comparação ao controle. Entretanto, Gouvêa et al. (2015) verificaram que a incorporação de bacteriófagos em filmes de acetato de celulose não afetou significativamente a elongação dos filmes.

Os filmes CAA e CAF não mostraram diferença significativa entre si (p>0,05) quanto ao módulo de Young, porém se diferiram (p≤0,05) em relação aos filmes CON e ACI. O módulo de Young corresponde à porção linear de uma determinada curva tensão-deformação cuja deformação sofrida pelo filme é ainda reversível (ASTM D1434-82, 2009). Os filmes incorporados com cafeína (CAA e CAF) apresentaram aumento significativo nos valores do módulo de Young. Portanto, tornaram-se mais rígidos e menos elásticos em relação aos filmes dos tratamentos CON e ACI. Porém, Gouvêa et al. (2015) observaram redução do módulo de Young em filmes de acetato de celulose incorporados com bacteriófagos, em relação ao filme controle.

Com a incorporação de água os filmes tornaram-se frágeis e menos elásticos. Gemili; Yemenicioglu; Altinkaya (2009),trabalhando com filmes de acetato de celulose incorporados com água e lisozima, obtiveram valores equivalentes na elongação e superiores na tensão de ruptura e no módulo de young, em relação aos filmes deste experimento.

Observou-se que os filmes apresentaram alta permeabilidade ao dióxido de carbono (superior a 100,000 cm3/m².24h.0,1MPa), não sendo possível detectar a taxa de permeabilidade ao gás no equipamento utilizado. Os filmes de acetato de celulose são naturalmente hidrofílicos (TAKEUCHI, 2012). Assim, a utilização de água na produção dos filmes tornou-os mais porosos e, consequentemente, elevou a permeabilidade ao dióxido de carbono ao ponto de não ser possível sua determinação pelo equipamento utilizado.

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Não houve diferença significativa (p>0,05) na opacidade (Op) e na cor (ΔE) dos filmes produzidos, obtendo-se valores médios de 81,67 ± 6,035 e 1,39 ± 0,485, respectivamente. A água usada na produção dos filmes proporcionou a obtenção de filmes brancos e opacos.

4 CONCLUSÃO

Os filmes de acetato de celulose incorporados com cafeína e ácido acético e os filmes com cafeína mostraram efeito antimicrobiano sobre a Salmonella enteritidis. A cafeína influenciou as características mecânicas dos filmes, reduzindo sua extensão e aumentando sua rigidez. A adição de água tornou os filmes mais porosos, brancos, opacos e altamente permeáveis.

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