(11) (21) PI A

(22) Data de Depósito: 05/04/2005 (43) Data de Publicação: 30/10/2007

República Federativa do Brasil _{(RPI 1921)}

Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial

(51) Int. CL:

C12N 15/86 (2007.10)

(57) Resumo: VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, VETOR DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, MÉTODOS PARA IMUNIZAR UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO CONTRA INFECÇÃO BACTERIANA E CONTRA INFECÇÃO VIRAL. A presente invenção refere-se amplamente à atenuação sinérgica do vírus da estomatite vesicular (VSV). Mais particularmente, a invenção refere-se à identificação de classes de mutação combinadas que atenuam sinergicamente a patogenicidade dos vetores de VSV em mamíferos e às suas composições imunogênicas.

(54) Título: VÍRUS DE ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, VETOR DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, MÉTODOS PARA IMUNIZAR UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO CONTRA INFECÇÃO BACTERIANA E CONTRA INFECÇÃO VIRAL

(30) Prioridade Unionista: 09/04/2004 US 60/561,214; 19/01/2005 US 60/644,902

(71) Depositante(s): Wyeth (US)

(72) Inventor(es): David Kirkwood Clarke, Roger Michael Hendry, Stephen A. Udem, Christopher Lee Parks

(74) Procurador: MOMSEN, LEONARDOS & CIA.

(86) Pedido Internacional: PCT US2005/011499 de 05/04/2005

(87) Publicação Internacional: WO 2005/098009 de 20/10/2005 0. .. 1.00E ■05 100E508 100E+07 1002405 100E+04 Alleeliellee._ ... 1 00e+06 • ir-.

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"VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, VETOR DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, MÉTODOS PARA IMUNIZAR UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO CONTRA 5 INFECÇÃO BACTERIANA E CONTRA INFECÇÃO VIRAL"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral aos campos da virologia, microbiologia, doença infecciosa e imunologia. Mais particularmente, a invenção refere-se à atenuação sinérgica do vírus da

10 estomatite vesicular e aos seus vetores, por combinação de classes de mutação

diferentes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Vírus da estomatite vesicular (VSV), um membro da família Rhabdoviridae, possui um genoma de RNA de fita única, senso-negativo, 15 não-segmentado. Seu genoma de onde kb possui cinco genes que codificam cinco proteínas estruturais do vírus; a proteína de nucleocapsídeo (N), que é requerida em quantidades estequiométricas para encapsidação do RNA replicado; a fosfoproteína (P), que é um cofator da RNA polimerase dependente de RNA (L); a proteína matriz (M) e a glicoproteína de fixação

20 (G) (por exemplo, veja Gallione et al., 1981; Rose e Gallione, 1981; Rose e

Schubert, 1987 e Schubert et al., 1985; Patente U.S. 6.033.886; Patente U.S.

6.168.943).

VSV é um vírus proveniente de artrópode que pode ser transmitido a uma variedade de hospedeiros mamíferos, mais comumente 25 gado bovino, cavalos, porcos e roedores. Infecção por VSV de humanos é incomum, e em geral é quer assintomática quer caracterizada por sintomas semelhantes à gripe suave que passam depois três a oito dias sem complicações. Devido ao fato de VSV não ser considerado um patógeno de humano, e a imunidade pré-existente ao VSV ser rara na população humana, o

desenvolvimento de vetores derivados de VSV tem sido um foco em áreas tais como composições imunogênicas e terapia genética. Por exemplo, estudos têm estabelecido que VSV pode servir como um vetor elevadamente efetivo para composições imunogênicas, expressando hemaglutinina do vírus da 5 influenza (Roberts et al., 1999), proteína H do vírus do sarampo (Schlereth et

al., 2000) e proteínas gag e env de HIV-1 (Rose et al., 2001). Outras

características de VSV que o tornam um vetor atrativo incluem: (a) a capacidade para se replicar robustamente em cultura celular; (b) a incapacidade para quer se integrar dentro do DNA da célula hospedeira quer 10 sofrer recombinação genética; (c) a existência de sorotipos múltiplos,

permitindo a possibilidade de estratégias de imunização inicial - reforçadora; (d) genes estranhos de interesse podem ser inseridos no genoma de VSV e expressados abundantemente por transcriptase reversa; e (e) o desenvolvimento de um sistema elevadamente especializado para o resgate de 15 vírus infeccioso de uma cópia de cDNA do genoma do vírus (Patente U.S.

6.033.886; Patente U.S. 6.168.943).

Embora haja pouca evidência o envolvimento neurológico de VSV durante infecção natural, animais (por exemplo, primatas, roedores, animais de rebanho) que são inoculados intracerebralmente (e no caso de 20 roedores instranasalmente) com vírus de tipo selvagem, vírus de tipo selvagem passado em cérebro de camundongo ou vírus de tipo selvagem adaptado à cultura celular, podem desenvolver sinais clínicos de doença, e normalmente morrem dois a oito dias após a infecção. Por causa destas observações, e a necessidade de produzir um vetor para composições 25 imunogênicas para uso em humanos que possui um perfil de segurança

excepcional, vetores de VSV sob desenvolvimento são testados em modelos estringentes de neurovirulência em animal pequeno e em primata. Estes testes são planejados para detectarem qualquer virulência residual em vetores de VSV atenuados antes da consideração para avanço em testes clínicos em

humanos.

A atenuação de vetores de VSV-prototípicos resultou do acúmulo de múltiplas substituições de nucleotídeo através do genoma de vírus durante passagem serial in vitro e a síntese e a montagem do DNA genômico. 5 Estas mutações tiveram efeitos pleiotrópicos que tornaram o vírus menos patogênico em camundongos do que o vírus de laboratório do qual ele fora derivado (por exemplo, veja Roberts et al., 1998). Vetores de VSV prototípicos adicionalmente atenuados também foram desenvolvidos por truncação da região de cauda citoplásmica da proteína G de vírus, acarretando 10 mutantes de VSV que foram defectivos em brotamento da membrana

plasmática de células infectadas (Schnell et al., 1998).

Vetores de VSV correntemente conhecidos, putativamente atenuados ou não, têm tido níveis inaceitáveis de virulência residual quando testados em modelos de virulência e primata não-humano e em animal. O 15 desenvolvimento de um vetor de VSV para usos tais como um vetor para composições imunogênicas, um vetor de terapia genética e semelhantes, requererá vetores de VSV possuindo níveis mínimos ou não detectáveis de patogenicidade em modelos de virulência em animal. Assim, presentemente há uma necessidade na técnica de vetores virais para identificar mutantes de 20 VSV atenuados, geneticamente modificados possuindo patogenicidade em

mamíferos significativamente reduzida (ou eliminada). SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção amplamente se refere à atenuação sinérgica de vírus da estomatite vesicular (VSV). Mais particularmente, a 25 invenção refere-se à identificação de classes de mutação combinadas que

atenuam sinergicamente a patogenicidade de vetores de VSV em mamíferos e às suas composições imunogênicas.

Assim, em certas modalidades, a invenção refere-se a um VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes

de mutações em seu genoma, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Em uma modalidade específica, a patogenicidade de VSV é adicionalmente definida como neurovirulência. Em outra modalidade, as classes de mutações são uma mutação sensível à 5 temperatura (ts), uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Em uma modalidade específica, as duas mutações de VSV são 10 uma mutação de gene G truncado (daqui em diante, "G( co") e uma mutação de rearranjo de gene N (isto é, o gene N é movido para longe de sua primeira posição promotor-proximal 3' de tipo selvagem, para uma posição mais distal na ordem do gene de VSV). Em outra modalidade, a proteína G de VSV codificada pelo gene G truncado possui uma deleção nos últimos vinte 15 aminoácidos carbóxi-teiminais (daqui em diante, "G( ct_9)"). Em ainda outra

modalidade, a proteína G de VSV codificada pelo gene G truncado possui uma deleção dos últimos vinte e oito aminoácidos carbóxi-terminais (daqui em diante, "G (ct_0"). Em ainda outra modalidade, o gene N de VSV é rearranjado para 3'-PNMGL-5' ou 3'-PMNGL-5', em relação ao genoma de 20 tipo selvagem 3'-NPMGL-5' de VSV de tipo selvagem, no qual N é o gene

codificador da proteína de nucleocapsídeo, P é o gene codificador da fosfoproteína, M é o gene codificador de glicoproteína de fixação e L é o gene codificador da proteína RNA polimerase dependente de RNA. Em certas modalidades, o VSV compreende um genoma mutado de 3'-PNMG (ct_ i)L-5', 25 3'-PNMG(ct_9)L-5', 3'-PMNG( ct_i)L-5' ou 3'-PMNG(et_9)L-5', nos quais N é o gene codificador da proteína de nucleocapsídeo, P é o gene codificador da fosfoproteína, M é o gene codificador da proteína matriz, G( ct_ i ) é o gene codificador da glicoproteína de fixação possuindo uma região de cauda

glicoproteína de fixação possuindo uma região de cauda citoplásmica de nove aminoácidos e L é o gene codificador da proteína RNA polimerase dependente de RNA. Em uma modalidade específica, o genoma mutado é 3'- PMNG(et_ oL-5'. Em outra modalidade específica, o genoma mutado é 3'- 5 PNMG(ct_ i)L-5'. Em outra modalidade, o VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação G-stem, uma mutação de gene G, uma mutação de deleção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M.

10 Em certas modalidades, o VSV modificado injetado

intracranialmente em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD 50 100 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em certas outras modalidades, o VSV intracranialmente 15 injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade

possui uma LD 50 1.000 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade 20 \ possui uma LD 50 10.000 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD50 100.000 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem 25 intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4

semanas de idade.

Em outras modalidades da invenção, as duas mutações de VSV são uma mutação de gene G truncado e uma mutação não-citopática de gene M. Em certas modalidades, a proteína G codificada pelo gene G

truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G( ct_o) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct-9)). Em outras modalidades, a mutação não-citopática de gene M (daqui em diante, "M (ncp)") é uma mutação de metionina para alanina 5 na posição 33 (M33A) e uma mutação de metionina para alanina na posição 51 (M51A) da proteína M. Em uma modalidade específica, o VSV compreende um genoma mutado de 3'-NPM( ncp)G(ct_i)L-5' ou

3'-NPM(ncp)G(ct-9)L-5'. Em outra modalidade, o vírus compreende adicionalmente uma terceira

classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma 10 mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de rearranjo de gene, uma

mutação de deleção de gene, uma mutação de inserção de gene, uma mutação de inserção de gene G, uma mutação G-stem, ou uma mutação pontual.

Como descrito abaixo na Seção A.3, uma mutação ts de qualquer um dos genes G, M, N, P ou L de VSV é uma "classe de mutação" 15 separada da invenção. Assim, em certas modalidades da invenção, as duas

mutações de VSV são uma mutação ts de gene N (daqui em diante, "N (ts)") e uma mutação ts de gene L (daqui em diante, "L( ts)"). Em uma modalidade específica, o VSV compreende um genoma mutado de 3'-N (ts)PMGL(ts)-5'. Em certas outras modalidades, o VSV compreende adicionalmente uma 20 terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G ou uma mutação de deleção de gene.

25 Em certas modalidades, as duas mutações de VSV são uma

mutação G-stem (daqui em diante, "G(stem)") e uma mutação de rearranjo de gene. Em outras modalidades, o VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação

não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a um vetor de VSV 5 geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA estranho como uma unidade transcricional separada inserida dentro ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Como definido 10 daqui em diante, uma seqüência de "RNA estranho" é qualquer seqüência de polinucleotídeo que não é endógena ao genoma do VSV de tipo selvagem. Em uma modalidade específica, patogenicidade de vetor é adicionalmente definida como neurovirulência. Em certas outras modalidades, o RNA estranho é definido como uma estrutura de leitura aberta (ORF). Em certas 15 outras modalidades, as classes de mutações são selecionadas do grupo

consistindo de uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

20 Em uma modalidade específica, as duas mutações de vetor de

VSV são uma mutação de gene G truncado e uma mutação de rearranjo de gene N. Em outra modalidade, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui uma deleção dos últimos vinte aminoácidos carbóxi-terminais ou uma deleção dos últimos vinte e oito aminoácidos carbóxi-terminais. Em certas 25 outras modalidades, o gene N do vetor de VSV está rearranjado para 3'- PNMGL-5' ou 3'-PMNGL-5', relativo ao genoma 3'-NPMGL-5' de VSV de tipo selvagem. Em uma modalidade específica, o vetor de VSV compreende um genoma mutado de 3 ' -PNMG( ct_ i )L-5', 3' -PNMG( ct_9)L-5', 3' -PMNG (c,_ DL-5' ou 3' -PMNG(c,9)L-DL-5'. Em uma modalidade específica, o genoma de vetor

mutado é 3'-PMNG (ct_ i)L-5'. Em outra modalidade, o genoma de vetor mutado é 3'-PNMG (ct_ i)L-5'.

Em ainda outras modalidades, o vetor de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a 5 mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação G-stem, uma mutação de gene G, uma mutação de deleção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M. Em certas modalidades, o VSV modificado injetado intracranialmente em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD 5 0 100 vezes 10 maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em certas outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD50 1.000 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos 15 fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades,

o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD 50 10.000 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV 20 intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4

semanas de idade possui uma LD 50 100.000 vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade.

Em certas outras modalidades, o RNA estranho inserido dentro 25 ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene de CMV, um gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela-Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus

do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de alfavírus, um gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de 5 vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene

de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de

Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Corynebacteria diphtheria,

um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de

10 Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um

gene de Escherichia coli, um gene de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade 15 específica, o gene de HIV é gag, no qual o gene gag é inserido no genoma de VSV na posição um ou na posição cinco. Em modalidades específicas, o genoma do vetor de VSV mutado é 3 '-gag i -PNMG(ct_ i)L-5 ' , 3

'-gagi-PNMG(ct-9)-5 ', 3 '-gag i -PMNG(ct_ oL-5 ' , 3 '-gag i -PMNG(e6t_9)L-5 ' , 3 ' -PNMG( ct_ i )L-gags -

5 ', 3 '-PNMG(et_9)L-gag5-5', 3 '-PMNG(ct_oL-gag5-5 ' ou 3 ' -PMNG(ct_9)L-gag5 -

20 5'.

Em outra modalidade, o RNA estranho expressa um antígeno específico de tumor ou antígeno associado a tumor, para indução de uma resposta imune protetora contra um tumor (por exemplo, um tumor maligno). Tais antígenos específicos de tumor e associado a tumor incluem, mas não são 25 limitados a, antígeno de pan-carcinoma KS 1/4; antígeno de carcinoma ovariano (CAl25); fosfato ácido prostático; antígeno específico de próstata; antígeno p9'7 associado a melanoma; antígeno p75 de melanoma; antígeno de melanoma de peso molecular alto e antígeno de membrana específico de próstata.

Em certas outras modalidades, as duas mutações de vetor de VSV são uma mutação G(co e uma mutação M (n,p) . Em certas modalidades, a proteína G codificada por gene G truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G( ct_o) ou um domínio de cauda 5 citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct-9)). Em ainda outras

modalidades, a mutação M(ricp) é uma mutação de metionina para alanina na

posição 33 (M33A) e uma mutação de metionina para alanina na posição 51 (M51 A) da proteína M. Em uma modalidade específica, o genoma mutado é 3'-NPM(ncp)G(ct_i)L-5' ou 3'-NPM( r,cp)G(ct_9)L-5'. Em outra modalidade, o vetor 10 compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma,

no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G, e uma mutação de deleção de gene. Em certas modalidades, o vetor de VSV compreende um gene de HIV selecionado do 15 grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em uma

modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'- g ag i -NPM(n,p)G(c, i)L-5 ' , 3 ' -gag i -NPM(ncp)G(c,9)L-5 ', 3 ' -NPM(ncp)G(c,_ DL-gag5 - 5 ' ou 3 '-NPM(ncp)G(ct_9)L-gag5 -5' .

Em ainda outras modalidades, as duas mutações de vetor de 20 VSV são uma mutação de gene N (ts) e uma mutação de gene L( ts). Em uma

modalidade específica, o vetor compreende um genoma mutado de 3'-

N(ts)PMGL(ts) -5 3 . Em outras modalidades, o vetor compreende adicionalmente

uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, 25 uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em certas modalidades, o vetor de VSV compreende um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env,

HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'-gag i -N(ts)PMGL(t s-5' ou 3'- N(ts)PMGL(ts)-gag5-5'.

Como descrito abaixo na Seção A.1, a inserção de uma seqüência de ácido nucleico estranho (por exemplo, gag de HIV) no genoma 5 de VSV 3' a qualquer um dos genes N, P, M, G ou L efetivamente resulta em

uma "mutação de rearranjo de gene". Assim, em certas modalidades, as duas

mutações de vetor de VSV são mutação G(stem) e uma mutação de rearranj o de

gene. Em uma modalidade, o genoma de vetor mutado é 3'-gagr NPMG(stem)L-5'. Em outras modalidades, o vetor de VSV compreende 10 adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a

mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

15 Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição

imunogênica compreendendo uma dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA estranho como uma unidade transcricional separada inserida em ou substituindo uma 20 região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Em outra modalidade, as classes de mutações são selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação 25 de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de

inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Em certas modalidades, as duas mutações são uma mutação de gene G truncado e uma mutação de rearranjo de gene N. Em modalidades específicas, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui um domínio

de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G(ct-i)) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G( ct_9)). Ainda em outras modalidades, o gene N é rearranjado em 3'-PNMGL-5' ou 3'- PMNGL-5', em relação ao genoma 3'-NPMGL-5' de genoma de VSV de tipo 5 selvagem. Em certas modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende um genoma mutado de 3'-NMG (ct_ i )L-5', 3'- PNMG(ct_9)L-5', 3 '-PMNG (ct_ 01,5' ou 3 '-PMNG (ct_9)L-5 ' . Em uma modalidade específica, o genoma de vetor mutado da composição imunogênica é 3'-PMNG(ct_ i)L-5'. Em outra modalidade, o genoma de vetor 10 mutado é 3'-PNMG (ct_ i )L-5'. Em outras modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação pontual, uma mutação G-stem, uma mutação de inserção de gene G, uma mutação de deleção de gene ou uma

15 mutação não-citopática de gene M.

Em certas outras modalidades, o RNA estranho inserido no vetor de VSV geneticamente modificado da composição imunogênica é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene 20 de CMV, um gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de

Varicela-Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de 25 alfavírus, um gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de

um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de

Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um

gene de Escherichia coli, um gene de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade 5 específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o gene gag é inserido no genoma de VSV na posição um ou na posição cinco. Em modalidades específicas, o genoma do vetor de VSV mutado é 3'-gagi-PNMG(ct_01,-5', 3'-gagi-PNMG(ct- 10 9)-5', 3 ' -gag i -PMNG(ct_ 01,-5 ' , 3 ' -g agi-PMNG(c6t-9)1 ,5 ' , 3 ' -PNMG(ct_ i)L-gag5 - 5 ', 3 ' -PNMG( ct_9)L-gag5-5 ' , 3 '-PMNG(ct_ i)L-gag5 -5' ou 3 '-PMNG(ct_9)L-gag5- 5'.

Em certas outras modalidades, o vetor de VSV da composição

imunogênica compreende uma mutação G( co e uma mutação M(ncp). Em outra

15 modalidade, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G( ct_o) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct-9))• Em outra modalidade, a mutação 1\4(„ cp) é uma mutação de metionina para alanina na posição 33 (M33A) e uma mutação de metionina para alanina na posição 51 20 (M51A) da proteína M. Em uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende o genoma de VSV mutado de 3'-NPM (ncp) G(ct_ i)L-5' ou 3'-NPM(ncp)G(ct-9)1 ,-5' - Em ainda outras modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação 25 pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em ainda outras modalidades, o RNA estranho inserido no vetor de VSV geneticamente modificado da composição imunogênica é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um

gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene de CMV, um gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela-Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de 5 rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de alfavírus, um gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um 10 gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus

pneumoniae, um gene de Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Co7ynebacteria diphtheria, um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um gene de Escherichia coli, um gene

15 de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e

vpu. Em outra modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o genoma

mutado é 3'-gag NPM -(ncp)G(ct_i )L-5 , 3'-gag -NPM(ncp)G(ct-9) -5 2 3'-

20 NPM(„cp)G(ct_ o-L-gag5 -5 ' ou 3 ' -NPM (n,p)G-(ct_9)L-gag5 -5 ' .

Em certas outras modalidades, a composição imunogênica compreende uma mutação de gene N (ts) e uma mutação de gene L (ts) . Em uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende um genoma VSV mutado de 3'-N (ts)PMGL9,$)-5'. Em outras modalidades, a composição 25 imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em

seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em

ainda outras modalidades, o RNA estranho inserido no vetor de VSV geneticamente modificado da composição imunogênica é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene de CMV, um 5 gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela-Zoster, um gene de

vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de alfavírus, um 10 gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de

Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Corynebacteria diphtheria,

15 um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de

Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um

gene de Escherichia coli, um gene de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo 20 consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'-gagr N(ts)PMG(ts)L-5 ' ou 3 '-1\1(ts)PMGL(ts)-gag5 -5' .

Em certas outras modalidades, a composição imunogênica compreende uma mutação G(stem) e uma mutação de rearranjo de gene. Em 25 uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende um

genoma mutado de 3'-gagi-NPMG(stem)L-5'. Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação não-citopática

de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Em ainda outra modalidade, uma composição imunogênica da 5 invenção é administrada por qualquer rota convencional selecionada do grupo

consistindo de intravenosa, intradermal, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, oral, retal, intranasal, bucal, vaginal e ex vivo.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método de imunizar um indivíduo mamífero contra infecção por HIV compreendendo 10 administrar ao indivíduo um dose imunogênica de um vetor de VSV

geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA de HIV como uma unidade transcricional separada inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas 15 mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV e o RNA de HIV codifica um antígeno selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em certas modalidades, o vetor de VSV é 3'-gag1-PNMG(ct_ 1)L-5', 3'-gag i -PNMG(ct..9)L-5', 3'-gag 1 PMNG(ct_ 1)L-5', 3'-g ag i

-PMNG (ct_9)L-5', 3 1-PNMG(ct_1)L-gag5-5', 3I-PNMG( ct_9)L-gagá-5', 3 1-PMNG(ct-

20 0L- gag 5-5', 3'-PMNG(ct_9)L-gagá -5', 3'-gag,-NPM( ncp)G(ct_ 1 )L-5', 3

I-gagi-NPM(nep) G(ct_9)L-5', 3'-NPM(ncp)G(ct_ 1)L-gag5-5', 3'-NPM(ncp)G(ct_9)L-gag5-5', 3'- gag 1 -N(ts)PMGL(ts)-5' ou 3'- N(„)PMGL(ts)-gag5-5'.

Em certas outras modalidades, a invenção refere-se a um método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção bacteriana 25 compreendendo administrar uma dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo (a) pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma, as mutações selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene

M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV e (b) pelo menos uma seqüência de RNA estranho inserida em ou substituindo 5 uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual o RNA codifica uma proteína bacteriana selecionada do grupo consistindo de proteína de Vibrio cholerae, uma proteína de Streptococcus pneumoniae, uma proteína de Streptococcus pyogenes, uma proteína de Streptococcus agalactiae, uma proteína de Helionacter pylori, uma proteína de Neisseria meningitidis, uma 10 proteína de Neisseria gonorrheae, uma proteína de Corynebaceria

diphtheriae, uma proteína de Clostridium tetani, uma proteína de Bordetella pertussis, uma proteína de Haemophilus, uma proteína de Chlamydia e uma

proteína de Escherichia coli.

Em uma modalidade específica, as duas mutações são uma 15 mutação G(co e uma mutação de rearranjo de gene N. Em certas modalidades,

a proteína G codificada pelo gene G truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G(ct_o) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct_9)). Em certas outras modalidades, o gene N é rearranjado para 3'-PNMGL-5' ou 31-PMNGL-5', 20 em relação ao genoma 3'-NPMGL-5' de VSV de tipo selvagem. Em outras

modalidades, o genoma de VSV mutado é 3'-PNMG( ct_DL-5', 3'-PNMG(ct_9)L-5, 3'-PMNG(ct_1)L-5' ou 3'-PMNG( ct_9)L-5'. Em uma modalidade específica, o genoma mutado é 3 '-PMNG (ct_ 01,-5 ' ou 3 '-PNMG( ct_ i)L-5 ' .

Em outras modalidades, o VSV compreende adicionalmente 25 uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de deleção de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de inserção de gene G, uma mutação de inserção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção viral compreendendo administrar uma dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo (a) pelo menos duas classes diferentes de 5 mutações em seu genoma, as mutações selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene, no qual as duas 10 mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV e (b) pelo menos

uma seqüência de RNA estranho inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual o RNA codifica uma proteína bacteriana selecionada do grupo consistindo de uma proteína de HIV, uma proteína de HTLV, uma proteína de SIV, uma proteína de RSV, uma 15 proteína de PIV, uma proteína de HSV, uma proteína de CMV, uma proteína de vírus Epstein-Barr, uma proteína de vírus Varicela-Zoster, uma proteína de vírus da caxumba, uma proteína de vírus do sarampo, uma proteína do vírus de influenza, uma proteína de poliovírus, uma proteína de rinovírus, uma proteína de vírus da hepatite A, uma proteína de vírus da hepatite B, uma 20 proteína de vírus de hepatite C, uma proteína de vírus Norwalk, uma proteína

de togavírus, uma proteína de alfavírus, uma proteína de vírus da rubéola, uma proteína de vírus da raiva, uma proteína de vírus Marburg, uma proteína de vírus Ebola, uma proteína de papilomavírus, uma proteína de poliomavírus, uma proteína de metapneumovírus e uma proteína coronavírus. 25 Em uma modalidade específica, o RNA é um gene de HIV selecionado do

grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev ou vpu.

Em certas modalidades, as duas mutações são uma mutação G(ct) e uma mutação de rearranjo de gene N. Em uma modalidade específica, o genoma de VSV mutante é 3'.-PNMG( ct_01,-5', 3'-PNMG (ct_9)L-5', 3'-

PMNG(ct_ i)L-5' ou 3'-PMNG(ct_9)L-5'. Em outra modalidade, o gene de MV é

gag, no qual o gene gag é inserido no genoma de VSV na posição um ou na

posição cinco, no qual o genoma mutado é 3'-gagi-PNMG(ct_i)L-5', 3'-gag1-PNMG(ct_9)L-5 ', 3' -g agi-PMNG(ct_i)L-5 3 -gagi-PMNG( c t_ i)L-5 ' , 3 ' -PNMG(ct-

5 1)L-gag5-5', 3'-PNMG(c,_9)L-gagá-5', 3'-PMNG(ct_ i)L-gagá -5',

3'-PMNG(ct_9)L-gag5-5'. Em outra modalidade, o VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de deleção de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de inserção de gene 10 ts, uma mutação de inserção de gene ou uma mutação não-citopática de gene

M.

Em outras modalidades do método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção viral, as duas mutações de VSV são uma mutação G(ct) e uma mutação M( ricp) . Em uma modalidade específica, o genoma de VSV 15 mutado é 3'..-NPM( ncp)G(ct-1)L-5 ou 3'-NPM( ncp)G(ct_9)L-5'. Em outra

modalidade, o genoma mutado é NPM( c,-,p)G(ct_ i )L-5' ou 3'-gagi-NPM(cnp) G(ct_9)L-5', 3 9 .-NPM(enp)G(ct_ 1 )1, -* gag5-5 9 ou 3 5-NPM(cnp)G(ct_9)L - gag5 -5 ' . Em outra modalidade, genoma de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação 20 ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação

li-stem, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Em outras modalidades do método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção viral, as duas mutações de VSV são uma mutação 25 de gene N(ts) e uma mutação de gene L( ts). Em uma modalidade específica, o genoma de VSV mutado é 3'-N (ts)PMGL(ts) -5', 3'-gag i -Nts)PMGL(„)-5' ou 3'- N(ts)PMGL(ts)-gag5 -5'. Em outra modalidade, o genoma de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma

mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Em outras modalidades do método de imunizar um hospedeiro 5 mamífero contra infecção virai, as duas mutações e VSV são uma mutação G(stem) e ma mutação de rearranjo de gene. Em uma modalidade, o genoma de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação não-citopática de gene M, uma 10 mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma

mutação de gene G e uma mutação de deleção de gene.

Outras características e outros aspectos da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de suas modalidades preferidas e das reivindicações.

15 BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra a cinética de crescimento (pfu/mL versus tempo) de VSV de tipo selvagem (3'-NPMGL-5'), mutantes de VSV rearranjados N (3'-PNMGL-5' [N2], 3'-PMNGL-5' [N3] e 3'-PMGNL-5' [N4]), mutantes de VSV de truncação de cauda citoplásmica (ct) de proteína 20 G (3'-NPMG( ct_9)L-5' [CT9] e 3'-NPMG( ct_oL-gagá -5' [CT1-GAG5]) e

mutantes de truncação de ct de proteína G / rearranjados N de VSV combinados (3 ' -PNMG( ct_ DL-5 ' [N2CT1], 3 '-PNMG (ct_9)L-5 ' [N2CT9], 3 - PMNG(ct_ 1 )1,-5 ' [N3CT1] e 3'-PMNG(ct_9)L-5' [N3CT9]). A abreviação "in" mostrada na legenda da figura inserida representa a cepa indiana de VSV. 25 Figura 2 é uma comparação de cinética de crescimento de

mutantes de VSV rearranjados N (3'-PNMGL-5', 3'-PMNGL-5'e 3'- PMGNL-5') em relação ao VSV de tipo selvagem (3'-NPMGL-5') e ao mutante de VSV de ct-1 de proteína G (3'-NPMG (ct_9)L-gagá -5').

mutantes de ct-1 de proteína G / rearranjado N de VSV combinados (3'- PNMG(ct_ i )L-5', e 3-PMNG(ct_ oL-5') em relação ao VSV de tipo selvagem (3'- NPMGL-5') e a um mutante de VSV de ct-1 de proteína G (3'-NPMG (c, i)L-gag5 -5').

5 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção descrita aqui adiante atende à necessidade na técnica por vetores de vírus de estomatite vesicular (VSV) possuindo patogenicidade significativamente atenuada em mamíferos, particularmente neuropatogenicidade atenuada como revelado em modelos de neurovirulência 10 animal. Como descrito acima VSV possui muitas características que o tornam um vetor interessante para composições imunogênicas e/ou terapia genética. Por exemplo, infecção por VSV de humanos é incomum e é quer assintomática quer caracterizada por sintomas semelhantes à gripe suave que passam depois três a oito dias sem complicações, e como tal, VSV não ser 15 considerado um patógeno de humano. Outras características de VSV que o tornam um vetor atrativo incluem: (a) a capacidade para se replicar robustamente em cultura celular; (b) a incapacidade para quer se integrar dentro do DNA da célula hospedeira quer sofrer recombinação genética; (c) a existência de sorotipos múltiplos, permitindo a possibilidade de estratégias de 20 imunização inicial - reforçadora; (d) genes estranhos de interesse podem ser inseridos no genoma de VSV e expressados abundantemente por transcriptase reversa; e (e) o desenvolvimento de um sistema elevadamente especializado para o resgate de vírus infeccioso de uma cópia de cDNA do genoma do vírus (Patente U.S. 6.033.886; Patente U.S. 6.168.943) e (f) pré-existência de 25 imunidade ao VSV na população humana é não freqüente.

Vetores de VSV atenuados de uma classe inicial descritos na técnica referiram-se aos mutantes sensíveis à temperatura (ts), no qual os mutantes ts falharam em produzir vírions em uma temperatura restritiva. Por exemplo, vários mutante ts de VSV são conhecidos na técnica (veja, por

exemplo Holloway et al., 1970; Pringle et al., 1971; Evans et al. 1979; Pringle et al., 1981; Monta et al.; 1987; Gopalakrishna e Lenard, 1985). Em adição, outras classes de mutantes de VSV atenuados também têm sido descritas na técnica e incluem mutações de cauda citoplásmica (ct) truncada 5 de proteína G de VSV (Schnell et al., 1998), mutações de rearranjo de gene (ou de rearranjo de ordem de gene) (Wertz et al., 1998; Ball et al., 1999; Flanagan et al., 2001; Patente U.S. 6.596.529), mutações G-stem (Jeetendra et

al., 2003; Jeetendra et al., 2002; Robinson e Whitt, 2000), mutações de

proteína M não-citopática (Finke e Conzelmann, 1997; Finke e Conzelmann 10 1999). Contudo, como enunciado acima, vetores de VSV atenuados correntemente disponíveis retêm virulência residual quando testados em modelos animais, e como tais, não são provavelmente candidatos vetores para avanço em testes clínicos em humano.

Como descrito aqui em detalhe, a presente invenção refere-se 15 às observações surpreendentes e inesperadas de que combinações de duas ou mais classes de mutações atenuantes (mutações de rearranjo de gene, mutações de truncação e de inserção de proteína G, mutações de RNA

ambi-sentido, mutações de deleção de gene, e semelhantes) possuem um efeito sinérgico (em contraste com um efeito aditivo) sobre o nível resultante de 20 atenuação de patogenicidade alcançada. Por exemplo, é aqui demonstrado,

que mutantes de truncação de proteína G de VSV, quando combinados com mutantes de gene N rearranjado, exerceram uma atenuação sinérgica de crescimento de VSV (Exemplo 2) e de neurovirulência (Exemplo 3). Em adição, certas modalidades da presente invenção referem-se às combinações 25 de outras classes de mutação, que também possuem um efeito sinérgico sobre

a atenuação de VSV. Tais classes incluem, mas não são limitadas a• mutações ts, mutações pontuais, mutações de rearranjo de gene (incluindo rearranjos de gene N, P, M, G e L), mutações G-stem, inserções de gene G, mutações não-citopáticas de gene M, mutações de gene G truncado (por exemplo, um

mutante ct), mutações de RNA ambi-sentido e mutações de deleção de gene. Assim, em certas modalidades, a invenção refere-se a um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA 5 estranho como uma unidade transcricional separada inserida em ou

substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Em certas outras modalidades, a invenção refere-se às composições imunogênicas compreendendo um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo 10 pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos

u( ma seqüência de RNA estranho como uma unidade transcricional separada

inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV.

15 A. CLASSES DE MUTAÇÃO DE VÍRUS DA ESTOMATITE

VESICULAR

Como enunciado acima, um vetor de VSV geneticamente modificado da invenção compreende pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma. Como defmidos aqui em diante, os termos "classe 20 de mutação" ou "classes de mutação" são usados intercambiavelmente, e referem-se às mutações conhecidas na técnica, quando usadas individualmente, para atenuar VSV. Por exemplo, uma "classe de mutação" da invenção inclui, mas não se limita a, uma mutação de gene N sensível à temperatura de VSV (daqui em diante, "N( ts)"), uma mutação de gene L 25 sensível à temperatura (daqui em diante, "L( ts)"), uma mutação pontual, uma mutação G-stem (daqui em diante, "G(stem)"), uma mutação não-citopática de gene M (daqui em diante, "M (icp)"), uma mutação de rearranjo ou de reorganização de gene, uma mutação de gene G truncado (daqui em diante, "G(c0 "), uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de inserção de

gene G, uma mutação de deleção de gene e semelhante. Como definido aqui em diante, uma "mutação" inclui mutações conhecidas na técnica como inserções, deleções, substituições, modificações de reorganização ou de rearranjo de gene.

Coin-o definido aqui adiante, o termo "atenuação sinérgica" 5 refere-se a um nível de atenuação de VSV que é mais do que aditiva. Por exemplo, uma atenuação sinérgica de VSV de acordo com a presente invenção compreende combinar pelo menos duas classes de mutação no mesmo genoma de VSV, resultando deste modo uma redução de patogenicidade de VSV muito maior do que um nível de atenuação aditiva 10 observado em cada classe de mutação de VSV sozinha. Assim, em certas modalidades, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50

pelo menos maior do que o nível de atenuação aditiva observado para cada classe de mutação sozinha (isto é, a soma das duas classes de mutação), no qual os níveis de atenuação (isto é, a LD 50) são determinados em um modelo

15 de virulência em animal pequeno.

Por meio de um exemplo não limitante, se a equação (1) descreve uma "atenuação aditiva" de VSV:

(1) AaLD 50 + AbLD50 = xLpso•

na qual AaLD 50 é a LD50 de um VSV possuindo uma primeira classe de mutação em seu genoma, AbLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo 20 uma primeira classe de mutação em seu genoma e xLD 50 é a soma de AaLD 50 e AbLD 50 ; então uma "atenuação sinérgica" de VSV da invenção, possuindo uma LD50 pelo menos maior do que o nível de atenuação aditiva para cada classe de mutação sozinha, é descrita pela equação (2):

(2) Aa,bLD 50 > (AaLD 50 + AbLD50);

na qual Aa,bLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo uma 25 combinação de duas classes de mutação em seu genoma, AaLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo uma primeira classe de mutação em seu genoma e AbLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo uma primeira classe de mutação em

seu genoma. Assim, em certas modalidades, a sinergia de atenuação de VSV (isto é, duas classes de mutação em mesmo genoma de VSV) é descrita em relação à LD 50 de dois construtos de VSV (cada construto de VSV possuindo uma única classe de mutação em seu genoma), no qual a atenuação sinérgica 5 do VSV possuindo duas classes de mutação em seu genoma é definida como

uma LD50 pelo menos maior do que a LD 50 aditiva dos dois construtos de VSV possuindo uma única classe de mutação em seu genoma (por exemplo, veja valores de LD 50 de VSV na Tabela 7).

Em certas outras modalidades, a sinergia de atenuação de VSV 10 é descrita em relação à LD 50 de um VSV de tipo selvagem. Assim, em uma modalidade, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual a LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em uma modalidade, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos 15 10 vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em outra modalidade, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos 100 vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em outra modalidade, 20 uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos

1.000 vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em ainda outras modalidades, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50

que é pelo menos 10.000 vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo 25 selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em certas outras modalidades, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos 100.000 vezes maior do que a LD50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. A determinação de uma dose letal 50%

(LD50) para um vetor de VSV específico é prontamente determinada por uma pessoa experiente na técnica usando métodos de teste conhecidos e modelos animais (por exemplo, veja o Exemplo 1).

Assim, em certas modalidades, a invenção refere-se a um VSV 5 geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes

de mutações descritas abaixo.

1. MUTAÇÕES DE REARRANJO DE GENE

Em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado da invenção compreende uma mutação de rearranjo de gene em seu genoma. 10 Como aqui defmidos, os termos "rearranjo de gene", "gene rearranjado", "rearranjado", "rearranjo", "reorganização de gene" e "translocação de gene" são usados intercambiavelmente, e referem-se a uma mudança (mutação) na ordem do genoma de VSV de tipo selvagem. Como aqui definido, um genoma de VSV de tipo selvagem possui a seguinte ordem: 3'-NPMGL-5'.

15 É sabido na técnica, que a posição de um gene de VSV em relação ao promotor 3' determina o nível de expressão e a atenuação de vírus (Patente U.S. 6.596.529 e Wertz et al., 1998, cada uma aqui especificamente incorporada como referência). As seqüências de nucleotídeos codificadoras de proteínas G, M, N, P e L de VSV são conhecidas na técnica (Rose e Gallione, 20 1981; Gallione et al., 1981). Por exemplo, Patente U.S. 6.596.529 descreve mutações de rearranjo de gene nas quais o gene para a proteína N está translocado (rearranjado) de sua primeira posição proximal ao promotor de tipo selvagem para posições sucessivamente mais distais no genoma (por exemplo, 3 ' -PNMGL-5 ', 3 ' -PMNGL-5', 3 ' -PMGNL-5 ', referidas como N2, 25 N3 e N4, respectivamente). Assim, em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado compreende uma mutação de rearranjo de gene em seu genoma. Em uma classe de mutação, em uma modalidade específica, um VSV geneticamente modificado compreende uma mutação de rearranjo de gene compreendendo uma translocação do gene N (por exemplo, 3'-PNMGL-

5' ou 3 '-PMNGL-5 ').

Deve ser observado aqui que a inserção de uma seqüência de ácido nucleico estranho (por exemplo, gag de HIV) no genoma de VSV 3' a qualquer um dos genes N, P, M, H ou L, efetivamente resulta em uma 5 "mutação de rearranjo de gene! como definida acima. Por exemplo, quando o

gene gag de HIV é inserido no genoma de VSV na posição um (por exemplo,

3'-gag 1 -NPMGL-5'), os genes N, P, M, G e L são cada um movidos de suas posições de tipo selvagem para posições mais distais no genoma. Assim, em certas modalidades da invenção, uma mutação de rearranjo de gene inclui a 10 inserção de uma seqüência de ácido nucleico estranho no genoma de VSV 3' a qualquer um dos genes N, P, M, G ou L (por exemplo, 3'-gag i -NPMGL-5', 3'-N-gag2-PMGL-5', 3'-NP-gag 3-MGL-5', etc.)

2. MUTAÇÕES DE TRUNCAÇÃO E DE INSERÇÃO DE PROTEÍNA G

15 Em certas outras modalidades, um VSV geneticamente

modificado da invenção compreende um gene G mutado, no qual a proteína G codificada está truncada em seu domínio citoplásmico (terminação carboxila), também referida como "região de cauda citoplásmica" da proteína G. É sabido na técnica que mutações de gene G que truncam a terminação 20 carboxila do domínio citoplásmico influenciam o brotamento de VSV e

atenuam a produção de vírus (Schnell et al., 1998; Roberts et al., 1999). O

domínio citoplásmico de proteína G de VSV de tipo selvagem compreende vinte nove aminoácidos (RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK-COOH; SEQ ID NO: 1).

25 Em certas modalidades, um gene G de VSV truncado da

invenção codifica uma proteína G na qual os últimos vinte e oito resíduos de aminoácido carbóxi-terminais do domínio citoplásmico estão deletados (retendo apenas arginina do domínio citoplásmico de tipo selvagem de vinte e nove aminoácidos de SEQ ID NO: 1). Em certas outras modalidades, um gene

G de VSV truncado da invenção codifica uma proteína G na qual os últimos vinte resíduos de aminoácido carbóxi-terminais do domínio citoplásmico estão deletados (em relação ao domínio citoplásmico de tipo selvagem de vinte e nove aminoácidos de SEQ ID NO: 1).

5 Em certas outras modalidades, um gene G de VSV truncado da

invenção codifica uma proteína G compreendendo um único aminoácido em seu domínio citoplásmico (região de cauda citoplásmica), na qual a único aminoácido é qualquer aminoácido naturalmente ocorrente. Em ainda outras modalidades, um gene G de VSV truncado da invenção codifica uma proteína 10 G compreendendo nove aminoácidos em seu domínio citoplásmico (região de cauda citoplásmica), na qual os nove aminoácidos são quaisquer aminoácidos naturalmente ocorrentes. Em certas outras modalidades, o gene de VSV mutado da invenção codifica uma proteína G contendo uma inserção representando um epítopo estranho. Tais mutantes são conhecidos na técnica

15 (por exemplo, veja Schlehuber e Rose, 2003).

Como aqui definido, um mutante de gene G codificador de uma proteína G na qual os últimos vinte e oito resíduos de aminoácido carbóxi-terminais do domínio citoplásmico estão deletados, em relação à seqüência de tipo selvagem de SEQ ID NO: 1; é chamado de "G(et_i)", no qual 20 o domínio citoplásmico de G( ct_i) possui uma seqüência de aminoácidos de

(R-COOH). Como aqui definido, um mutante de gene G codificador de uma proteína G na qual os últimos vinte resíduos de aminoácido carbóxi-terminais do domínio citoplásmico estão deletados, em relação à seqüência de tipo selvagem de SEQ ID NO: 1, é chamado de "G(ct-9)", no qual o domínio

25 citoplásmico de G(ct-9) possui uma seqüência de aminoácidos

(RVGIHLCIK-COOH; SEQ ID NO: 2). Assim, em certas modalidades da invenção, um VSV geneticamente modificado da invenção compreende um gene G mutado, no qual a proteína G codificada é uma G(ct_i) ou G(ct-9).

MUTAÇÕES PONTUAIS

Uma mutação "de sensível à temperatura" (ts) de VSV, como aqui definida, é uma mutação no genoma de VSV que restringe o crescimento de VSV em uma temperatura não permissiva. Por exemplo, um mutante ts de 5 VSV da invenção cresce normalmente em um título alto na temperatura

permissiva (por exemplo, 31 °C), mas seu crescimento ou sua reprodução é restringida em temperaturas não permissivas (por exemplo, 37 °C ou 39 °C). A geração de mutantes ts por mutagênese química e sítio-direcionada é bem conhecida na técnica (por exemplo veja Pringle, 1970; Li et al., 1988); e 10 numerosos mutantes ts têm sido caracterizados e descritos (por exemplo, veja

Flamand e Pringle, 1971; Flamand e Bishop, 1973; Printz e Wagner, 1971; Gopalakrishna e Lenard, 1985; Pringle et al., 1981; Morita et al., 1987; Li et

al., 1988; Rabinowitz et al., 1977; Lundh et al., 1988; Dal Canto et al., 1976;

Rabinowitz et al., 1976). Em certas modalidades, um VSV geneticamente

15 modificado da invenção compreende uma mutação ts em seu genoma, no qual a mutação ts é uma ou mais mutações de uma seqüência de ácido nucleico codificadora da proteína G, M, N, P ou L.

Como aqui definida, uma mutação ts de qualquer um dos genes G, M, N, P ou L de VSV é uma "classe de mutação" separada da 20 invenção. Por exemplo, em certas modalidades da invenção, um VSV

geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma (no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a fagogenicidade de VSV) compreende uma ou mais mutações de gene N ts (daqui em diante, "Nts)") como uma primeira classe de 25 mutação e uma ou mais mutações de gele L ts (daqui em diante, "L (ts)) como uma segunda classe de mutações. Como um exemplo não limitante, um VSV geneticamente modificado compreendendo um genoma tal como 3'- N(ts)PMGL(ts)-5' compreende duas classes de mutações (isto é, (1) uma mutação de gene N („) e (2) uma mutação de gene L(ts)) e um VSV

geneticamente modificado compreendendo um genoma tal como 3'gagi -N(ts)PMGL(ts)-5' compreende três classes de mutações (isto é, (1) uma mutação de gene N(ts), (2) uma mutação de gene L (t,) e (3) por exemplo inserção gap, uma mutação de rearranjo de gene).

5 Em certas outras modalidades, um VSV geneticamente

modificado da invenção compreende uma mutação pontual em seu genoma, no qual a mutação pontual é uma ou mais mutações de uma seqüência de ácido nucleico codificador de proteína G, M, N, P ou L, no qual a mutação confere um fenótipo de atenuação tal como adaptação ao frio, fusão diminuída 10 ou eficiência citopatogênica (por exemplo, veja Fredericksen e Whitt, 1998;

Ahmed e Lyles, 1997). Por exemplo, Fredericksen e Whitt (1998) descrevem três mutações pontuais atenuantes do gene G (por exemplo, D137-L, E139-L ou DE-SS) que possuem um limite de pH deslocado para atividade de fusão. Ahmed e Lyles (1997) descreveram mutação pontual atenuante do gene M 15 (NI 63D) que era elevadamente defeituoso em inibição da expressão do gene de hospedeiro e foi processado mais rapidamente do que a proteína M de tipo selvagem. Assim, em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado da invenção compreende uma ou mais mutações pontuais em seu genoma.

4. MUTAÇÕES NÃO-CITOPÁTICAS DE GENE M

20 Em certas outras modalidades, um VSV geneticamente

modificado da invenção compreende uma mutação não-citopática no gene M. O gene M de VSV (sorotipo Indiana) codifica uma proteína (matriz) M de 229 aminoácidos, na qual os primeiros trinta aminoácidos da terminação-NH 2

compreendem um motivo PPPY (PY) rico em prolina (Harty

et al., 1999). O

25 motivo PY de proteína M de VSV está localizado nas posições de aminoácido 24-27 em ambos os sorotipos VSV New Jersey (Número de Acesso no GenBank M14553) e VSV Indiana (Número de acesso no GenBank X04452). Foi determinado por Jayakar et al., (2000), que mutações no motivo PY (por exemplo, APPY, AAPY, PPAY, APPA, AAPA e PPPA) reduz o rendimento

de vírus pelo bloqueio de um estágio tardio em brotamento de vírus. Assim, em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado da invenção compreende uma mutação não-citopática no gene M, no qual a mutação está no motivo PPPY da proteína M codificada.

5 Tem sido recentemente relatado que o M mRNA codifica

adicionalmente duas proteínas adicionais, referidas a M2 e M3 (Jayakar e Whitt, 2002). As proteínas M2 e M3 são sintetizadas de metioninas a jusantes na mesma matriz de leitura que codifica a proteína M de 229 aminoácidos (referida como M1), e são faltantes dos primeiros vinte e dois aminoácidos 10 (proteína M2) ou cinqüenta aminoácidos (proteína M3) da proteína Ml. Tem sido observado que as células infectadas com um VSV recombinante que expressa a proteína M, mas não M2 e M3, exibe um início retardado do efeito citopático (em certos tipos de célula), ainda produzindo um rendimento de vírus normal. Assim, em certas modalidades, um VSV geneticamente 15 modificado da invenção compreende uma mutação não-citopática no gene M, no qual a mutação de gene M resulta em um vírus que não expressa a proteína M2 ou M3 (por exemplo, veja Jayakar e Whitt, 2000).

Também aqui contempladas são as mutações de aminoácido (por exemplo, deleções, substituições, inserções, etc.) no motivo PSAP (PS) 20 de proteína M descritas por Irie et al. (2004).

5. MUTAÇÕES G-STEM

Em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado da invenção compreende uma mutação no gene G, no qual a proteína G codificada possui uma mutação na região de stem de membrana-proximal do 25 ectodomínio da proteína G, referida como uma proteína G-stem. A região

li-stem compreende resíduos de aminoácido 421 a 462 da proteína G. Estudos recentes têm demonstrado a atenuação de VSV via mutações de inserção e/ou deleção (por exemplo, truncação) no G-stem da proteína G (Robinson e Whitt, 2000; Jeetendra et al., 2002; Jeetendra et al., 2003). Assim, em certas

modalidades, um VSV geneticamente modificado compreende uma inserção, deleção, substituição de G-stem ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade específica, um vetor de VSV geneticamente modificado da invenção compreende uma mutação G-stem (e suas composições

5 imunogênicas), compreende um genoma 3'-gag i -NPMG(stem)L-5'.

6. MUTAÇÕES DE RNA AMBI-SENTIDO

Em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado da invenção compreende uma mutação de RNA ambi-sentido, no qual o promotor 5'-antigenoma (AGP) está substituído por uma cópia do promotor 10 3'-genoma (GP). O 5' AGP de VSV, bem como outros vírus de RNA de fita negativa, não-segmentado, atua como um promotor forte de replicação enquanto que 3' GP atua como um promotor de transcrição e um promotor fraco de replicação. No curso normal da infecção por VSV, há uma predominância de 3 a 4 vezes de cópias de genoma sobre cópias de 15 antigenoma; esta razão é ainda maior para vírus de coelho, outro membro da

família Rhabdovírus (Finke e Conzelmann, 1999). Trabalho prévio com vírus de coelho demonstrou que a substituição de 5' GAP por uma cópia de GP (conhecido como mutação de RNA ambi-sentido) acarretou níveis iguais e cópias de RNA de genoma e de antigenoma dentro de células infectadas. Em 20 adição, um gene estranho foi expressado da cópia do GP localizado na extremidade 5' do genoma. Quando serialmente passado em células de cultura, o vírus de coelho contendo a mutação de RNA ambi-sentido consistentemente replicou títulos 10 a 15 vezes menores do que um vírus de coelho de tipo selvagem recombinante (Finke e Conzelmann, 1997). Uma tal 25 mutação é usada em vetores de VSV tanto para atenuar a replicação de vírus quanto para expressar genes estranhos. Assim, em certas modalidades, um VSV geneticamente modificado compreende uma mutação de RNA ambi-sentido.

7. DELEÇÕES DE GENE

modificado da invenção compreende um vírus no qual um gene de VSV (tal como G ou M) é deletado do genoma. Por exemplo, Roberts et al. (1999) descreveram um vetor de VSV no qual o gene inteiro codificador da proteína G foi deletado (AG) e substituído por proteína hemaglutinina (HA) de influenza, no

5 qual o vetor de VSV (AG-HA) demonstrou patogênese atenuada.

B. VETORES DE VÍRUS DE ESTOMATITE VESICULAR RECOMBINANTE

Em certas modalidades, a invenção proporciona um vetor de VSV (recombinante) geneticamente modificado compreendendo pelo menos 10 duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA estranho inserida como uma unidade transcricional separada em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação.

Métodos de produzir vírus de RNA recombinante são referidos 15 na técnica como métodos de "resgate" ou "de genética reversa". Métodos de resgate exemplares para VSV são descritos na Patente U.S. 6.033.886, Patente U.S. 6.596.529 e WO 2004/113517, cada uma aqui incorporada como referência. A transcrição e a replicação de genomas virais de RNA, não segmentado, de fita única, de senso negativo, são realizadas através de 20 atividade enzimática de um complexo de proteína multimérica atuando sobre o núcleo de ribonucleoproteína (nucleocapsídeo). RNA genômico nu não pode servir como um modelo. Em vez disso, estas seqüências genômicas são reconhecidas apenas quando estão inteiramente encapsidadas pela proteína N na estrutura de nucleocapsídeo. É apenas neste contexto que as seqüências de 25 promotor terminal antigenômico e genômico são reconhecidas para iniciar as

rotas de transcrição ou de replicação.

Um equivalente de DNA clonado do genoma de VSV é posicionado entre um promotor de RNA polimerase dependente de DNA (por exemplo, o promotor de T7 RNA polimerase) e uma seqüência de ribozima

auto-clivável (por exemplo, delta-ribozima de hepatite), que é inserida em um vetor de transcrição adequado (por exemplo, um plasmídeo bacteriano propagável). Este vetor de transcrição proporciona o modelo de DNA prontamente manipulável do qual a RNA polimerase (por exemplo, T7 RNA 5 polimerase) pode fielmente transcrever uma cópia de RNA de fita única do

antigenoma (ou genoma) de VSV com as terminações 5' e 3' precisas ou quase precisas. A orientação da cópia de DNA genômico de VSV e o promotor flanqueador e as seqüências de ribozima determinam se os equivalentes de RNA de genoma ou de antigenoma são transcritos. Também 10 requeridas para resgate de nova progênie de VSV são as proteínas de suporte

de ação-trans específicas de VSV necessárias para encapsidar os transcritos de RNA de genoma ou de antigenoma de VSV de fita única, nu, em modelos de nucleocapsídeo funcionais: a proteína de nucleocapsídeo viral (N), a fosfoproteína polimerase associada (P) e a proteína polimerase (L). Estas 15 proteínas compreendem a RNA polimerase dependente de RNA viral ativa

que tem que empregar este modelo de nucleocapsídeo para realizar transcrição e replicação.

Assim, VSV atenuado e geneticamente modificado da invenção, compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em 20 seu genoma (por exemplo, veja Seção A), é produzido de acordo com métodos de resgate conhecidos na técnica. Por exemplo, um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma é gerado usando (1) um vetor de transcrição compreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende 25 uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de um genoma ou antigenoma de um VSV e (2) pelo menos um vetor de expressão que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora de proteínas N, P e L de ação-trans necessárias para encapsidação, transcrição e replicação. em urna célula hospedeira sob condições suficientes para permitir a co-expressão