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TÍTULO: AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA E CITOTÓXICO DO VENENO DE COBRA BOTHROPS JARARACA FRENTE PATÓGENO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR
CATEGORIA: EM ANDAMENTO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: Biomedicina
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA - UNIFRAN
AUTOR(ES): JOÃO MATIAS DE SOUZA
ORIENTADOR(ES): LIZANDRA GUIDI MAGALHÃES CALDAS
COLABORADOR(ES): ANA CAROLINA BOLELA BOVO CANDIDO, CARLOS HENRIQUE GOMES MARTINS, ANDREIMAR MARTINS SOARES
RESUMO
A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença infecciosa negligenciada, transmitida por protozoários do gênero Leishmania. A LT é classificada de acordo com suas manifestações clínicas, Leishmaniose cutânea (LC), Leishmaniose cutânea difusa (LCD) e Leishmaniose mucocutânea (LMC). Contudo, as principais espécies envolvidas com a LT no Brasil são: Leishmania (L.) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) lainsoni. Os venenos de cobras são uma mistura complexa de substâncias, especialmente proteínas/peptídeos, e apresenta diversas atividades biológicas, incluindo atividade antibacteriana e leishmanicida. Nesse estudo, foi avaliado in vitro a atividade leishmanicida do veneno Bothrops jararaca frente Leishmania (Leishmania) amazonensis, bem como citotoxicidade frente macrófagos J774A.1. Formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis (MHOM/BR/PH8) e macrófagos da linhagem celular J774A.1 foram cultivados em meio RPMI 1640 suplementado e incubado com o veneno Bothrops jararaca, obtido do Serpentário de Proteínas Bioativas LTDA (Batatais, São Paulo). A porcentagem de inibição do crescimento de formas promastigotas (Concentração Inibitória 50% - CI50) foi determinada pela contagem na
câmera de Neubauer, enquanto que a porcentagem de células viáveis (Concentração Citotóxica 50% - CC50), foi determinado pelo ensaio colorimétrico MTT, após 24 h de
incubação, em concentrações de 3,12 a 100 μg/mL. A porcentagem de inibição de formas amastigotas (CI50), foram avaliadas em concentrações que não apresentaram
toxicidade aos macrófagos, em concentrações de 0,19 a 6,25 μg/mL. Para a atividade leishmanicida (formas promastigotas), o veneno de B. jararaca apresentou CI50 14,57
± 0,64, enquanto que na CC50, o veneno apresentou moderada toxicidade aos
macrófagos, com CC50 164,1 ± 0,52. Para o Índice de Seletividade (IS), razão entre
CC50/CI50, o veneno apresentou IS 11,26. Para a atividade leishmanicida
(amastigotas), o veneno apresentou CI50 1,81 ± 0,73. Nesse estudo in vitro, o veneno
B. jararaca apresentou atividade leishmanicida e moderada toxicidade aos macrófagos.
INTRODUÇÃO
A leishmaniose é um grave problema de saúde, pois, desde os tempos primórdios, a leishmaniose afeta aproximadamente 98 países, em especial, no continente europeu, africano, asiático e americano, no qual estima-se que há 350
milhões de pessoas com risco de contrair a doença e 12 milhões de pessoas em todo o mundo apresentam alguma forma clínica dessa doença (Torres-Guerrero et. al., 2017).
A leishmaniose possui duas principais formas da doença: Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Tegumentar (LT). A LV é uma enfermidade fatal e ocorrem em países no qual grande parte da população vivem em situação de pobreza, tais como Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil (Brasil, 2012), enquanto que a LT ocorrem principalmente no Oriente Médio e América Latina, tais como Brasil, Peru e Venezuela (Alvar et. al., 2012).
A transmissão da LT para os hospedeiros vertebrados ocorre devido a picada de flebotomíneos fêmeas infectadas (Pimenta et. al., 2012), no qual o principal inseto vetor da Leishmania (L.) amazonensis é o Lutzomyia flaviscutellata, encontrado em matas úmida, em especial no Acre, Amapá, Pará, Rondônia, Bahia, Ceará, Maranhã, Distrito Federal e Mato Grosso do Sul (Brasil, 2013). O ciclo de vida do parasito apresenta ciclo extracelular e intracelular. O ciclo extracelular apresenta formas promastigotas circulantes em sangue periférico, no qual essas formas são liberadas no hospedeiro durante o processo de hematofagia, enquanto que o ciclo intracelular apresenta formas amastigotas no interior dos macrófagos (Sunter, Gull; 2017).
Os antimoniais são os principais medicamentos de escolha para o tratamento da Leishmaniose, entretanto apresenta problemas de uso, tais como alta toxicidade e redução de seus efeitos leishmanicida (Mohammadzadeh et. al., 2013), enquanto que o antifúngico anfotericina B é considerado medicamento de segunda escolha, entretanto apresenta inúmeros problemas de saúde, tais como alta toxicidade, insuficiência renal, problemas cardíacos, anemia e morte do paciente (Sundar et. al., 2013).
Atualmente os venenos de diferentes espécies de animais peçonhentos, tais como cobras, escorpiões e anfíbios vem-se destacando na literatura, em especial proteínas e peptídeos, demonstrando potencial uso terapêutico frente inúmeros patógenos (McCleary & Kini, 2013). Esses venenos podem ser aproveitados em beneficio ao homem, para posterior desenvolvimento de novos medicamentos (Samy et. al., 2013).
Os venenos de cobras do gênero Bothrops são constituídos por uma mistura complexa de substâncias, proteínas, peptídeos, no qual corresponde aproximadamente 90% do peso seco do veneno, incluindo fosfolipases A2,
serinoproteases, hialuronidases, L-aminoácido oxidase, fatores de crescimento, ativadores de proteína C, compostos orgânicos, inorgânicos e entre outros (Samy et. al., 2007). Esses venenos apresentam potencial para a produção de novos medicamentos, no qual destaca algumas aplicações, tais como: analgésicos, antimicrobiano, hipotensivo, antiviral e antiparasitário (Lee et. al., 2011; Lameu et. al., 2010; Deolindo et. al., 2010; Paiva et. al., 2011).
OBJETIVO
O presente trabalho teve por objetivo avalição in vitro da atividade leishmanicida do veneno Bothrops jararaca frente formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, bem como avaliado a citotoxicidade em macrófagos da linhagem celular J774A.1.
METODOLOGIA
O veneno de cobra Bothrops jararaca foi coletado no Serpentário Proteínas Bioativas LTDA, na cidade de Batatais (SP/Brasil) e armazenado sobre refrigeração (2 a 8 °C). O veneno B. jararaca foi cedido gentilmente pelo Prof. Dr. Andreimar Martins Soares, pesquisador-chefe do Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde (CEBio), Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia e Departamento de Medicina da Universidade Federal de Rondônia (UNIR), Porto Velho-RO, em colaboração com o Prof. Dr. Carlos Henrique Gomes Martins, professor livre-docente da Universidade Federal de Uberlândia (UFU).
A cepa de Leishmania (Leishmania) amazonensis (MHOM/BR/PH8) é mantido in vitro no Laboratório de Pesquisa em Parasitologia (LAPPA) da Universidade de Franca, em meio RPMI 1640 (suplementado com 10% de soro bovino fetal, 10.000 U/mL de penicilina, 10.000 µg/mL de estreptomicina e pH 7,4) à 25 °C em estufa B.O.D (Demanda Química de Oxigênio), no qual o meio de cultura é trocado a cada dois dias.
A linhagem celular de macrófagos J774A.1 são células derivadas de camundongo Balb/c, foi adquirido do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ) e mantidos in vitro em meio RPMI 1640 suplementado, no LAPPA da Universidade de Franca, no qual o meio de cultura foi trocado a cada dois dias.
A Concentração Inibitória 50% (CI50) é definida como concentração capaz de
Concentração Citotóxica 50% (CC50) é definida como concentração que apresenta
igual e/ou maior que 50% da viabilidade celular, ou seja, células viáveis. Por fim, foi utilizado o software GraphPad Prism versão 8.0.1 para análise estatística.
DESENVOLVIMENTO
Para a realização da Concentração Inibitória 50% (CI50) frente formas
promastigotas, foram semeados 5x106 de formas promastigotas em placa de 96
poços, contendo meio de RPMI 1640 (suplementado com 10% de soro bovino fetal, 10.000 U/mL de penicilina, 10.000 µg/mL de estreptomicina e pH 7,4). O veneno Bothrops jararaca foi previamente dissolvido em Dimetilsulfóxido (DMSO), em concentrações de 3,12 a 100 µg/mL (micrograma por mililitro). O controle negativo (não tratado) foi utilizado o meio RPMI 1640 contendo 0,1% DMSO, enquanto que o controle positivo (tratado) foi utilizado anfotericina B, em concentrações de 0,002 a 1,56 µM (micromolar). Posteriormente a placa de 96 poços foi incubada em estufa B.O.D (Demanda Química de Oxigênio) à 25 °C durante 24 h. A porcentagem de inibição do crescimento de formas promastigotas foi determinada pela contagem em Câmara de Neubauer, levando-se em consideração a motilidade flagelar. Os resultados foram expressados como a média da porcentagem da inibição da motilidade em comparação com o controle negativo (0,1% DMSO), determinados por meio de curvas de regressão não-linear utilizando o software GraphPad Prism versão 8.0.1.
Para a realização da Concentração Citotóxica 50% (CC50), foi utilizado o ensaio
colorimétrico MTT, conforme descrito por Muelas-Serrano et. al. (200), no qual o ensaio é baseado na medida da atividade da enzima desidrogenase mitocondrial, pois, quando ativo, é capaz de metabolizar o reagente MTT em um composto colorido, denominado formazan (Araújo et. al., 2008). Inicialmente foram semeados 2x105
macrófagos da linhagem celular J774A.1, em placa de 96 poços contendo meio RPMI 1640 suplementado (conforme descrito anteriormente) e placa foi incubada à 37 °C na presença de 5% de CO2 durante 24 h (para ocorrer a fixação dos macrófagos no
fundo da placa). Após período de incubação, o meio RPMI foi desprezado e acrescentado novo meio de cultura, juntamente com o veneno B. jararaca, que foi previamente dissolvido em DMSO, em concentrações de 3,12 a 100 µg/mL. O controle negativo (não tratado) foi utilizado o meio RPMI 1640 contendo 0,1% DMSO, enquanto que o controle positivo (tratado) foi utilizado DMSO à 25%. Posteriormente a placa foi
incubada novamente à 37 °C na presença de 5% de CO2 durante 24 h. Após o período
de incubação, foi adicionado 20 µL de MTT (na concentração de 10 mg/mL) e placa incubada à 37 °C na presença de 5% de CO2 durante 4 h, para incorporação do MTT.
Posteriormente, foi desprezado o meio de cultura, adicionado 100 µL de solução 100% álcool isopropílico, no qual a placa foi solubilizada para interromper a reação do MTT (Reuter et. al., 2008). Em seguida, foi realizado análise em espectrofotômetro (leitor placa de Elisa), a uma absorbância de 570 nm. Os resultados da CC50 foram
determinados pela curva de regressão não-linear utilizando o GraphPad Prism versão 8.0.1. O cálculo para o Índice de Seletividade (IS) foi utilizado a razão entre CC50 e
CI50, conforme descrito por Ribeiro et. al., (2014), através do seguinte cálculo:
IS=CC50/CI50.
Para a avaliação frente formas amastigotas, inicialmente foi incubado 5x106 de
formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis com 10 mL de meio RPMI 1640 suplementado, pH 5,5 e incubado à 33 °C em estufa B.O.D durante 24 h. Posteriormente os macrófagos foram contados em Câmara de Neubauer, ajustados em concentração de 2x105 células/poço e semeado em placa de 24 poços, contento
lamínulas redondas com meio RPMI 1640 suplementado. Posteriormente foi incubado a placa de 24 poços em estufa à 37 °C na presença de CO2 durante 24 h. Após período
de incubação, formas promastigotas acidificadas (método para facilitar a internalização entre parasito-macrófago, conforme descrito por Leirião et. al., 2004) foram adicionadas nos poços contendo os macrófagos numa concentração de 1x106
células/poços, na razão de 10:1 (ou seja, 10 formas promastigotas para 1 macrófago). Em seguida, a placa de foi incubada novamente em estufa à 37 °C na presença de CO2 durante 4 h. Após período de incubação, formas promastigotas acidificadas que
não foram internalizadas nos macrófagos foram retiradas, sendo desprezado o meio e adicionado novo meio de cultura. O veneno B. jararaca foi adicionado em concentrações que não foram tóxicas para os macrófagos durante o ensaio de citotoxicidade (que apresente viabilidade celular igual e/ou maior que 75%), avaliado em concentrações de 0,19 a 6,25 µg/mL, durante 48 h à 37 °C na presença de CO2.
O controle negativo (não tratado) foi utilizado o meio RPMI 1640 contendo 0,1% DMSO, enquanto que o controle positivo (tratado) foi utilizado DMSO à 25%. Posteriormente, as lamínulas foram fixadas com Metanol durante 3 minutos e coradas com Giemsa durante 30 minutos (lâminas permanentes). As lâminas foram analisadas utilizando microscopia de luz transmitida em aumento de 100x, no qual os parâmetros
avaliados foi o número de células infectadas em 200 células analisadas aleatoriamente e o número de amastigotas no interior de cada célula infectada (Desoti et. al., 2015). Os resultados foram expressados como a média da porcentagem de células infectadas e porcentagem de redução de amastigotas em comparação ao controle negativo (meio RPMI 1640 contendo 0,1% de DMSO). Os resultados da CI50
foram determinados pela curva de regressão não-linear utilizando o GraphPad Prism versão 8.0.1. Os experimentos foram realizados em três experimentos independentes em triplicata.
RESULTADOS PRELIMINARES
Para a atividade leishmanicida frente formas promastigotas (extracelular), o veneno B. jararaca apresentou valor de CI50 14,57 ± 0,64 µg/mL após 24 h de
incubação, sendo observado resultados significativos desse veneno em comparação com o controle negativo (DMSO 0,1%), onde notou-se porcentagem de inibição crescimento do parasito próximo e/ou maior que 50% nas maiores concentrações avaliadas (100, 50 e 25 µg/mL). O antifúngico, anfotericina B (controle positivo) apresentou valor de CI50 de 0,011 ± 0,54 µM (avaliado em concentrações menores
0,002 a 1,56 µM, pois, é uma substância pura (isolada) e calculado concentrações de acordo com o seu peso molecular), conforme demonstrado na Tabela 1. Em relação aos ensaios leishmanicida de extratos de fontes naturais, alguns autores (Osório et. al., 2007) estabeleceram critérios de valor de CI50 para determinação do seu potencial
leishmanicida (frente formas promastigotas). Esses autores sugeriram que é considerado amostra promissora (CI50 >10 e <50 µg/mL), moderadamente promissora
(CI50 >50 e <100 µg/mL) e ausência atividade (CI50 >100 µg/mL), sendo parâmetro
utilizado no presente estudo para determinar que o veneno B. jararaca apresenta promissora atividade frente formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis.
Tabela 1. Avaliação da Concentração Inibitória 50% (CI50) do veneno Bothrops
jararaca e Anfotericina B (Controle Positivo) frente formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após 24 h de incubação.
Concentrações (µg/mL)
Bothrops jararaca Anfotericina B (%Inibição ± D.P.) (%Inibição ± D.P.) 100 77,85 ± 1,16 N/A 50 73,37 ± 1,15 N/A 25 49,25 ± 0,40 N/A 12,5 40,00 ± 0,76 N/A 6,25 38,15 ± 0,65 N/A 3,12 33,84 ± 0,66 N/A CI50 14,57 ± 0,64 0,011 ± 0,54
Porcentagem de inibição crescimento formas promastigotas. D.P.: Desvio Padrão.
N/A: Não aplicado.
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
Para avaliação da atividade citotóxica, o veneno B. jararaca apresentou valor de CC50 164,1 ± 0,52 µg/mL frente macrófagos da linhagem celular J774A.1 após 24
h de incubação, sendo observado moderada toxicidade desse veneno. Entretanto, foi observado resultados significativos desse veneno em comparação com o controle negativo (DMSO 0,1%), onde notou-se porcentagem de viabilidade celular (células viáveis) dos macrófagos igual e/ou superior que 75% em menores concentrações avaliadas (12,5; 6,25 e 3,12 µg/mL). O DMSO em altas concentrações (igual e/ou superior a 25%) torna-se tóxico para as células, promovendo alterações na membrana na célula, resultando na morte da célula (Massumoto; Mizukami, 2000), conforme demonstrado na Tabela 2. Em relação aos ensaios de citotoxicidade, alguns autores (Osório et. al., 2007) estabeleceram critérios de valor de CC50 para determinação do
seu potencial citotóxico. Esses autores sugeriram que é considerado amostra como altamente tóxico (CC50 <10 µg/mL), tóxico (CC50 >10 e <100 µg/mL), moderadamente
tóxico (CC50 >100 e <1.000 µg/mL) e potencialmente não tóxico (CC50 >1.000 µg/mL),
parâmetro utilizado no presente estudo para determinar que o veneno B. jararaca apresenta moderada toxicidade frente macrófagos da linhagem celular J774A.1. Relacionando a citotoxicidade em macrófagos e atividade leishmanicida (formas amastigotas), é possível avaliar o Índice de Seletividade (IS), calculado entre a razão de CC50/CI50. Conforme demonstrado na Tabela 2, o veneno B. jararaca apresentou
IS 11,26. De acordo com os critérios de Lenta et. al. (2007), valores de IS maiores de 10 podem sugerir uma melhor segurança do produto para uso em mamíferos, devido
à ausência de toxicidade, enquanto que valores de IS abaixo de 10 é considerado tóxico. Parâmetro utilizado no presente estudo para determinar que o veneno B. jararaca apresenta baixa toxicidade aos macrófagos em menores concentrações, indicando maior eficácia frente amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis.
Tabela 2. Avaliação da Concentração Citotóxica 50% (CC50) do veneno Bothrops
jararaca frente macrófagos da linhagem celular J774A.1, bem como determinado o Índice de Seletividade (IS) após 24 h de incubação.
Concentrações (µg/mL) Bothrops jararaca (%Viabilidade ± D. P.) 100 58,16 ± 0,28 50 66,56 ± 0,31 25 69,24 ± 0,23 12,5 75,53 ± 0,71 6,25 85,14 ± 0,77 3,12 94,67 ± 0,50 CC50 164,1 ± 0,52 IS 11,26
Porcentagem de viabilidade celular, ou seja, células viáveis (saudáveis). D.P.: Desvio Padrão.
Controle Negativo (Meio RPMI 1640 contendo DMSO 0,1 %). Controle Positivo (DMSO à 25%).
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
Até o presente momento, não foi encontro critérios de CI50 para determinação
do potencial leishmanicida do veneno B. jararaca frente formas amastigotas, tornado assim trabalho importante e inovador. O veneno B. jararaca apresentou valor de CI50
1,81 ± 0,73 µg/mL após 48 h de incubação frente formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, sendo observado resultados significativos desse veneno em comparação com o controle negativo (DMSO 0,1%), onde notou-se porcentagem de inibição crescimento de formas amastigotas próximo e/ou maior que 50% nas maiores concentrações avaliadas (6,25; 3,12 e 1,56 µg/mL), conforme demonstrado na Tabela 3.
Tabela 3. Avaliação da Concentração Inibitória 50% (CI50) do veneno Bothrops
jararaca frente formas amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após 48 h de incubação. Concentrações (µg/mL) Bothrops jararaca (%Inibição ± D.P.) 6,25 87,99 ± 0,11 3,12 70,43 ± 0,33 1,56 46,47 ± 0,41 0,78 19,81 ± 0,11 0,39 00,00 ± 0,00 CI50 1,81 ± 0,73
Porcentagem inibição de formas amastigotas. D.P.: Desvio Padrão.
Controle Negativo (Meio RPMI 1640 contendo DMSO 0,1 %). Controle Positivo (DMSO à 25%).
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
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