ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS DO FUNGO TERMORRESISTENTE ISOLADO DE POLPA
DE ABACAXI
Luciano Bertollo Rusciolelli1*, Carmelita Zacchi Scolforo1, Salatir Rodrigues Junior2, Wilmer Edgard Luera Peña1
RESUMO: Fungos filamentosos termorresistentes são capazes de sobreviver a processos térmicos aplicados aos produtos alimentícios. Estes microrganismos provocam deterioração de alimentos e podem produzir toxinas. O presente trabalho teve como objetivo isolar e identificar o fungo mais termorresistente em polpas de abacaxi e determinar seus parâmetros microbiológicos D e Z. Os fungos termorresistentes isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Mucor ssp. A presença desse fungo nas polpas pode representar más condições higiênicas, pelo fato de ser um fungo proveniente do solo. Para determinação dos valores D, construiu-se a curva de sobreviventes para cada ensaio, com os binômios temperatura/tempo 67 °C/90 minutos, 70 °C/25 minutos, 73 °C/10 minutos e 75 °C/6 minutos. Em seguida, construiu-se a Curva Fantasma para determinação do parâmetro Z. Os valores D67°C, D70°C, D73°C e D75°C foram 112; 50; 16,5 e 5,90 minutos, respectivamente, e o Z foi de 6,31 °C. De acordo com os valores obtidos, o fungo estudado apresentou considerável resistência térmica, porém quando comparados aos fungos tradicionais termorresistentes relatados na literatura, é mais sensível aos tratamentos térmicos.
Palavras-chave: Fungos filamentosos termorresistentes, Valor D e parâmetro Z, polpa de abacaxi.
ISOLATION, IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF MICROBIOLOGICAL PARAMETERS OF HEAT-RESISTANTE MOLD FROM PINEAPPLE PULP
ABSTRACT: Heat-resistant molds are able to survive the thermal processes applied to food products. These microorganisms cause food spoilage and can produce toxins. This study aimed to isolate and identify the most heat-resistant mold in pineapple pulps and determine their microbiological parameters D and Z. The heat-resistant mold isolated were identified as belonging to the genus Mucor ssp. The presence of this mold in the pulps may represent poor hygienic conditions, because it is one from the soil. For determination of D values, built up the curve of survivors for each assay, with the binomial temperature / time 67 °C / 90 minutes 70 °C / 25 minutes 73 °C / 10 minutes and 75 °C / 6 minutes. Then built up the Ghost Curve to determine the parameter Z. The values D67°C, D70°C, D73°C e D75°C were 112; 50; 16.5 and 5.90 minutes, respectively, and Z was 6.31 ° C. According to the obtained values, the studied mold showed considerable thermal resistance, but when compared to traditional heat-resistant mold reported in the literature, is more sensitive to heat treatments.
Key-words: Heat-resistant molds, Value D and parameter Z, pineapple pulp.
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1 Universidade Federal de Viçosa - UFV. *E-mail: lucianobertollo@yhaoo.com.br. Autor para correspondência. 2 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo.
INTRODUÇÃO
As frutas têm grande importância na saúde humana por serem fontes de diversas vitaminas e sais minerais essenciais. No entanto, as frutas são susceptíveis à deterioração por fungos, devido as suas características, como elevada atividade de água e baixo pH (FERREIRA et al., 2011). Fatores como o alto nível de perecibilidade das frutas in natura e dificuldades no transporte dificultam a aquisição de certas frutas fazendo com que aumente a procura pelos seus derivados.
Dentre os diversos derivados de frutas, têm-se as polpas congeladas como alternativa para a comercialização. A conservação de frutas na forma de polpas foi desenvolvida para aumentar a oferta das mesmas e para armazenar os excedentes de produção. Trata-se de um método de conservação que preserva as características da fruta, permite o seu consumo nos períodos de entressafra e facilita a comercialização a longas distâncias. Assim, os comerciantes e as indústrias têm despertado interesse para o emprego de polpa de frutas como matéria-prima para o processamento de outros produtos como néctares, sucos, geleias, sorvetes e doces (BRUNINI et al., 2002; BENEVIDES et al., 2008).
A polpa de fruta é definida, segundo a legislação brasileira do Ministério da Agricultura, como o produto não concentrado, não diluído, não fermentado, obtido pelo esmagamento de frutos polposos. Devem ser preparadas com frutas sãs, limpas, isentas de matérias terrosas e detritos de animais ou vegetais. Não deverão conter fragmentos das partes não comestíveis da fruta, nem substâncias estranhas à sua composição normal, devendo ser observada também a presença de sujidades, parasitas e larvas (BRASIL, 2000).
O desconhecimento das boas práticas de fabricação no processamento da polpa de frutas pode elevar a carga microbiana deteriorante e, consequentemente, comprometer a qualidade do produto final (FOSTER e VASAVADA, 2003). Além da
implementação de boas práticas de fabricação para o controle da contaminação e proliferação microbiana, pequenas unidades de processamento podem aplicar a pasteurização, que consiste em um processo térmico em que a polpa é submetida a altas temperaturas por curtos intervalos de tempo (PELAIS et al., 2008).
Os tratamentos de conservação de alimentos pelo uso do calor têm como objetivo reduzir a quantidade de microrganismos deteriorantes até níveis permitidos, eliminar todos os patógenos e desnaturar a maior parte das enzimas presentes que provocam alterações indesejáveis (PELAIS et al., 2008). Trata-se do método mais consagrado de conservação e produção de alimentos industrializados, pois ao alcançar os objetivos citados, fornece um produto estável do ponto de vista microbiológico (RICHARDSON, 2001). Segundo Scaramuzza e Berni (2014), a combinação temperatura/tempo de 80 a 90 °C por 15 segundos é normalmente suficiente para alcançar tais objetivos.
O grande desafio é aplicar um tratamento térmico que causa o mínimo possível de alterações no valor nutritivo e nas características sensoriais do alimento, com a garantia de que os microrganismos termorresistentes de interesse terão sido destruídos e as reduções logarítmicas da carga microbiana sejam alcançadas. Para isso, o processo térmico deve ser desenhado de modo a preservar a qualidade do produto. A ausência do microrganismo mais termorresistente após o tratamento térmico é um indicativo de que o alimento está seguro e que a vida de prateleira será prolongada, uma vez que os microrganismos deterioradores também foram reduzidos consideravelmente.
Os alimentos como as frutas e seus derivados, que inclui os sucos, polpas, concentrados e frutas enlatadas são susceptíveis à deterioração por fungos filamentosos (KOTZEKIDOU, 1997; CABRAL et al., 2010;). Os fungos filamentosos possuem pouca resistência ao calor, pois o processamento térmico destrói facilmente suas estruturas de crescimento e de reprodução. Entretanto, alguns gêneros são
capazes de produzir ascósporos resistentes ao calor. Os ascósporos destes fungos podem permanecer em estado de dormência no solo, nas frutas e nos derivados após o processamento, e, durante o armazenamento podem ocasionar a deterioração destes produtos (SLONGO e ARAGÃO, 2006; WELKE et al., 2009).
Entre as frutas susceptíveis à ação de fungos filamentosos produtores de ascósporos resistentes ao calor, como fungos filamentosos termorresistentes deterioradores, destaca-se o abacaxi. O presente trabalho teve como objetivo isolar e identificar o fungo mais termorresistente em polpas de abacaxi e determinar seus parâmetros microbiológicos D e Z.
MATERIAIS E MÉTODOS
Preparo das amostras
Amostras de 100 ml de polpa de abacaxi congeladas foram obtidas e descongeladas em geladeira a 5 °C/24 h para realização das análises.
Verificação da presença e isolamento dos fungos termorresistentes
O método empregado para verificação da presença de fungos filamentosos termorresistentes na polpa de abacaxi foi baseado em Splittistoesser (1976) e Salomão (2002), com modificações. Amostras líquidas de 200 ml foram preparadas a partir de 100 ml de água destilada esterilizada e 100 ml de polpa de abacaxi. A mistura foi submetida a tratamentos térmicos em banho termostático. Os binômios tempo/temperatura utilizados em cada ensaio são apresentados na Tabela 1. Tabela 1. Binômios temperatura/tempo aplicados à polpa de abacaxi diluída para verificação da presença de fungo termorresistente.
Temperatura (°C) Tempo (minutos) Temperatura (°C) Tempo (minutos)
90 10 75 10
85 20 75 5
80 30 70 15
80 10 70 10
75 15 70 5
Ao final do tratamento térmico, as amostras foram retiradas do banho termostático e imediatamente transferidas para banho de gelo. Então foi realizado o plaqueamento em profundidade (duplicata) com 1 ml de cada amostra em meio Ágar Batata Dextrose (PDA) acidificado para pH 3,5 com ácido tartárico 10%, acrescido com 3% de Ágar para garantir adequada solidificação. Após inoculação e solidificação, as placas foram vedadas com filme para evitar o ressecamento ou qualquer tipo de contaminação, em seguida, foram incubadas a 30 °C por 7 dias (SPLITTISTOESSER, 1976; BAGLIONI et al., 1999; SALOMÃO et al., 2008). Após o período determinado, as colônias desenvolvidas foram submetidas à identificação.
Identificação do fungo isolado
Para identificação dos fungos isolados, fez-se a inoculação em placas contendo meios de cultura Ágar Czapeck Extrato de Levedura (CYA) e Ágar de Extrato de Malte (MEA), por meio da introdução de um fragmento no centro da placa. As placas foram vedadas com filme e incubadas a 30 °C. Após sete dias de incubação, seguiu-se a chave de identificação proposta por Pitt e Hocking (1999).
Preparação da suspensão de esporos
Para obtenção da suspensão de esporos foi necessário submeter o fungo isolado ao processo de esporulação, como realizado por Salomão et al. (2008), Salomão (2002), Baglioni et al. (1999) e Kotzekidou (1997).
Inicialmente, o conteúdo de cada placa contendo as colônias isoladas foi submetido a uma etapa de pré-esporulação. Nesta etapa um fragmento da colônia foi transferido para placas contendo Ágar Batata Dextrose (PDA) acidificado. As placas para a pré-esporulação ficaram em incubação a 30 °C durante 7 dias (SALOMÃO, 2002).
Passado esse tempo, água destilada estéril foi transferida para cada placa e o crescimento superficial do meio foi coletado com o auxílio de baguetas de vidro estéril de acordo com Baglioni et al. (1999). Assim, obteve-se uma suspensão do fungo isolado, contendo diversos fragmentos e materiais do mesmo, incluindo esporos.
Alíquotas da suspensão do fungo isolado foram transferidas para placas contendo o mesmo meio de cultura da pré-esporulação e foram incubadas a 30 °C por 30 dias. Dessa forma, permitiu-se a esporulação e desenvolvimento das estruturas de resistência e reprodução dos fungos. Transcorrido este período, o material desenvolvido em cada placa também foi coletado por meio da adição de água destilada estéril, de forma que o crescimento superficial do meio fosse “raspado” com o auxílio de baguetas de vidro estéreis de acordo com Baglioni et al. (1999).
A suspensão preparada foi filtrada em gaze estéril e submetida a três centrifugações, cada uma delas a 1254,4 g por 15 minutos em
ambiente refrigerado. Ao separar o excesso de sobrenadante, obteve-se a suspensão de esporos (suspensão mãe). Foram realizadas observações microscópicas da suspensão, de forma a conferir a presença dos esporos dos fungos isolados (SALOMÃO et al., 2008).
A quantificação da suspensão final foi necessária para o conhecimento da contagem inicial e foi realizada retirando-se 1 ml desta suspensão que foi diluída sucessivamente e plaqueada no mesmo meio de cultura empregado na esporulação. A incubação ocorreu a 30 °C e a contagem a partir do terceiro dia de incubação. A estocagem da suspensão, até o momento de sua utilização ficou sob refrigeração a 5 °C (SALOMÃO et al., 2008).
Determinação dos parâmetros de resistência térmica
Para determinação dos parâmetros de resistência térmica dos isolados termorresistentes (valor D e Z) foi construído gráfico de morte térmica. Para isso, ensaios térmicos foram realizados sob 4 diferentes temperaturas com 5 intervalos de tempo, levando-se em consideração o tempo lag (tempo necessário para o líquido atingir a temperatura de processo). A Tabela 2 contém as temperaturas e os intervalos de tempo utilizados nos ensaios, com base em testes empíricos realizados previamente.
Tabela 2. Temperatura e intervalos de tempo utilizados nos ensaios para determinação dos parâmetros de resistência térmica dos fungos isolados termorresistentes.
Ensaio Temperatura (°C) Intervalo de tempo (min)
1 67 90
2 70 25
3 73 10
4 75 6
Inicialmente, foi preparada a chamada suspensão filha, que consistiu na adição de 1 ml da suspensão de esporos (suspensão mãe) em 9 ml de água peptonada. Para cada ensaio, foram preparados 6 tubos para realização de 6 tratamentos. O primeiro correspondia ao tempo lag, e o restante para cada intervalo de
suspensão filha em cada tubo, que continha 9 ml de água peptonada. Dessa forma, todos os 6 tubos foram submetidos ao tratamento térmico. Passado o respectivo intervalo de tempo, retirou-se o tubo correspondente para realização das diluições e plaqueamento. Isso foi feito para todos os ensaios e o
tubo retirado após cada intervalo de tempo foi submetido ao banho de gelo, para cessar o tratamento térmico, e depois seguir ao plaqueamento.
Após realização das diluições em série e o plaqueamento de 0,1 ml em PDA acidificado, as placas foram incubadas a 30 °C e, as leituras do número de colônias formadas foram realizadas a partir do terceiro dia de incubação. Com o número de sobreviventes encontrado em cada tempo de aquecimento, foram construídas as curvas de sobrevivência para cada temperatura (FERREIRA et al., 2011).
A população de sobreviventes (esporos/ml) versus o tempo de aquecimento (minutos) foi plotada em gráfico semi-log. Ao promover a linearização da curva foi possível obter o valor D de cada ensaio. Com o valor D de cada ensaio, 4 no total, foi possível criar um gráfico do Log (D)
(minutos) versus temperatura (°C), para então obter a curva fantasma, e a partir dela foi possível a obtenção do parâmetro Z. Com os parâmetros D e Z determinados, desenhou-se, por meio de extrapolação, o processo térmico que seria proposto para a polpa de abacaxi. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Isolamento e identificação dos fungos termorresistentes
Após aplicação dos tratamentos térmicos nas polpas preparadas (Tabela 1) e passados os 7 dias de incubação a 30 °C, foi verificado o desenvolvimento de fungos filamentosos sobreviventes apenas no tratamento com o binômio 70 °C / 5 minutos (Tabela 3). A partir das observações seguindo as chaves de identificação, foi possível identificar que os fungos isolados pertenciam ao gênero Mucor.
Tabela 3. Sobreviventes aos binômios de temperatura/tempo aplicados à polpa diluída para detecção da presença e isolamento de fungo termorresistente.
Binômio do
tratamento Sobreviventes
Binômio do
tratamento Sobreviventes
90 °C / 10 min Não 75 °C / 10 min Não
85 °C / 20 min Não 75 °C / 5 min Não
80 °C / 30 min Não 70 °C / 15 min Não
80 °C / 10 min Não 70 °C / 10 min Não
75 °C / 15 min Não 70 °C / 5 min Sim
Fungos do gênero Mucor são encontrados no solo, esterco, frutas, vegetais e grãos. Deterioram alimentos, especialmente carnes e produtos cárneos congelados, bem como frutas e vegetais. Portanto, a presença desse fungo em polpas de frutas, é um indicativo de uma inadequada sanitização da matéria-prima ou um processo térmico ineficiente (RUSCIOLELLI et al., 2014). Dessa forma, para o caso do emprego das polpas como matéria-prima na formulação de produtos em estabelecimentos comerciais, é preocupante o fato de existir a possibilidade de determinada carga elevada desse fungo deteriorante.
Suspensão de esporos
A suspensão de esporos obtida apresentou contagem inicial de 108 esporos/ml. Além disso, foi realizada uma observação microscópica da suspensão para certificar a presença dos esporos do fungo isolado, como realizado por Salomão et al. (2008).
Determinação dos parâmetros de resistência térmica
A partir da contagem das colônias sobreviventes aos ensaios térmicos (Tabela 2), foram construídas curvas de morte térmica dos esporos dos fungos isolados termorresistentes. Na Figura 1 estão
apresentados os sobreviventes de acordo com os intervalos de tempo dos ensaios.
Figura 1. Curva de morte térmica dos esporos do fungo isolado termorresistente no Ensaio 1: 67 °C / 90 minutos (♦); Ensaio 2: 70 °C / 25 minutos (■); Ensaio 3 – 73 °C / 10 minutos (▲); Ensaio 4: 75 °C / 6 minutos (●).
Para o cálculo do Valor D foi necessário realizar a linearização da curva de sobreviventes. Salomão (2002), Salomão et al (2004) e Slongo e Aragão (2006) realizaram a linearização pelo método de Alderton e Snell (1970) pelo fato da percepção de “ombros” nas curvas de sobreviventes.
No presente trabalho o método de linearização utilizado foi o convencional, pois não ocorreu a presença de “ombros” nas curvas. A ausência de “ombros” nas curvas de sobreviventes obtidas pode ser explicada pelo fato dos fungos isolados termorresistentes encontrados nas polpas de abacaxi possuírem esporos menos resistentes do que os esporos de fungos termorresistentes
comumente encontrados ou utilizados em outros trabalhos como em Kotzekidou (1997), Baglioni et al. (1999), Salomão (2002), Salomão et al. (2004), Slongo e Aragão (2006) e Ferreira et al. (2011). Para realizar a linearização, o log da população de esporos (esporos/ml) em cada intervalo de tempo foi calculado. Assim foi utilizada regressão linear e, a partir da inclinação reta obtida, foi determinado o valor D, o qual corresponde ao negativo do inverso da inclinação. As inclinações das retas, os coeficientes de determinação e os valores D determinados em cada ensaio estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Valor D para cada ensaio.
Ensaio Temperatura (°C) Inclinação R2 Valor D (min)
1 67 -0,0088 0,916 112,59
2 70 -0,0199 0,889 50,04
3 73 -0,0605 0,783 16,52
4 75 -0,1692 0,948 5,90
Para calcular o valor D em qualquer temperatura dentro faixa de estudo, calculou-se o parâmetro Z, que corresponde à diferença de temperatura requerida para
seu valor. Na Figura 2 está apresentado o gráfico de log D versus temperatura, que representa a Curva Fantasma, para a determinação do valor Z. 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 0 100 200 300 400 P o p u laç ão (es p o ro s/ml) Tempo (min) 67°C / 90 min 70°C / 25 min
Figura 2. Curva Fantasma para determinação de Z.
A partir do inverso negativo da inclinação (-0,1583) da equação da reta, determinou-se que o Z para os fungos mais termorresistentes isolados do gênero Mucor foi de 6,31 °C (R² = 0,982).
Para desenhar um processo térmico em temperaturas além da faixa de estudo, se faz necessário realizar uma extrapolação. Se for devidamente validada, pode ser proposto um processo térmico em temperaturas mais elevadas e com menor tempo de tratamento, sendo, portanto, otimizado. A vantagem de ter o parâmetro Z conhecido é a facilidade proporcionada na determinação dos valores a serem extrapolados. A extrapolação pode ser realizada a partir da Equação 1, obtida a partir do parâmetro Z e da curva fantasma construída (STUMBO, 1965), sendo possível determinar o valor D para outra temperatura de processo.
(Equação 1)
Onde: D1 é o valor D conhecido, D2 é o valor D que se deseja determinar, Z é o valor Z obtido, T1 é a temperatura relacionada à D1 e T2 é a temperatura relacionada ao D2.
Salomão et al. (2004) isolaram Neosartorya fischeri de concentrado de maçã e concluíram por meio dos valores D e Z obtidos, que o tratamento térmico comercial geralmente aplicado (95 °C / 30 s) ao produto não realiza as reduções necessárias na
população deste fungo para tornar o produto suficientemente seguro. Baglioni et al. (1999) identificaram Neosartorya fischeri como isolado mais termorresistente (sobrevivente ao tratamento de 100 °C por 25 minutos) proveniente da água de lavagem do processamento de polpa de tomates. Byssochlamys fulva e Byssochlamys nivea foram os fungos termorresistente isolados de néctar de maracujá e néctar de abacaxi, respectivamente, por Ferreira et al. (2011). Os autores mostraram que o tratamento térmico comumente aplicado pelas indústrias não se mostrou suficiente para inativação dos fungos isolados. Portanto, para o desenho de um processo térmico de um produto, é necessária a identificação do microrganismo mais termorresistente para servir de alvo, para dessa forma, além de eliminá-lo, contribuir na redução da carga deteriorante. Scaramuzza e Berni (2014) realizaram um estudo de curva de morte térmica para determinação dos parâmetros microbiológicos dos fungos Hamigera avellanea e Thermoascus crustaceus em diferentes meios. Para o primeiro, os dados obtidos para o valor D variaram entre 11,11 a 66,67 minutos a 87 °C; 4,67 a 13,51 minutos a 90 °C e 0,43 a 1,52 minutos a 95 °C. Para o segundo, os resultados foram similares, sendo 18,52 a 90,91 minutos a 90 °C; 2,79 a 19,23 minutos a 93 °C e 1,11 a 2,53 minutos a 95 °C. A variação dos valores foi devido aos diferentes meios que os esporos dos fungos foram submetidos ao tratamento térmico.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 Log D Temperatura (°C)
Dessa forma, os autores destacam a importância do impacto promovido devido aos diferentes meios utilizados e o fato de se tratar de um estudo com fungos não tradicionais, mas que também podem ser prejudiciais para os casos em que o processo térmico não for bem conduzido.
De acordo com os valores de D e Z obtidos, os esporos do gênero dos fungos isolados (Mucor) apresentaram considerável resistência térmica, porém quando comparado a outros fungos termorresistentes dos gêneros Byssochlamys, Neosartorya, Talaromyces, apresentou menor resistência. Com relação aos fungos Hamigera avellanea e Thermoascus crustaceus, os parâmetros apresentaram maior semelhança.
CONCLUSÕES
A presença dos fungos filamentosos do gênero Mucor ssp. pode indicar falta de condições higiênicas adequadas na unidade de processamento, pelo fato de ser um fungo proveniente do solo. Contudo, trata-se de um microrganismo que não produz toxinas, assim não causa perigo à saúde do consumidor. Por outro lado, pode promover uma acelerada degradação do produto ocasionando diminuição da qualidade do mesmo, principalmente para o caso em que se empregam as polpas como matéria-prima nas formulações de produtos sem tratamentos térmicos. Os ascósporos do fungo isolado são termorresistentes e os valores D67°C, D70°C, D73°C e D75°C foram 112, 50, 16,5 e 5,90 minutos, respectivamente, e o parâmetro Z foi de 6,31 °C. Um processo de pasteurização comumente utilizado em polpas e sucos causa as reduções desejáveis na população inicial desse fungo.
Vale ressaltar que a metodologia de determinação dos parâmetros microbiológicos D e Z do fungo mais termorresistente utilizada neste trabalho é aplicável a qualquer tipo de polpa e/ou suco de fruta.
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