UNIVERSIDADE FEDERAL DOPARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA EPÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DEPESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF,UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, PIBIT EFAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO -CIENTÍFICO Período:08 /2016
(X)PARCIAL ( )FINAL
IDENTIFICAÇÃO DOPROJETO
A 07 /2017
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Nome do orientador: Simone do Socorro Damasceno Santos
Titulação do orientador: Professora Doutora associado III na UFPA Faculdade: Biotecnologia
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciência Biológicas
Laboratório: Reprodução Animal – Fecundação in vitro
Título do Plano de Trabalho:Uso do sulfato de cobre como agente antioxidante na maturação in vitro de oócitos bubalinos (Bubalus bubalis)
Nome doBolsista: Eduardo Baia de Souza
Tipo deBolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq –AF ( ) PIBIC /CNPq- Cotadopesquisador(X )PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA–AF( ) PIBIC/INTERIOR ( )PIBIC/PRODOUTOR ( )PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR( )PIBIC/FAPESPA ( )PIBIC/PIBIT
2 INTRODUÇÃO:
Devido sua expressividade no setor pecuário para a região norte e para o país, a espécie bubalina (Bubalus bubalis) tem se tornado o alvo cada vez mais frequente de pesquisas, principalmente voltadas para o desenvolvimento e melhoramento genético da espécie. No que concerne à reprodução desses animais, biotecnologias reprodutivas, como a transferência e a produção in vitro de embriões (PIVE) (Drost, 2007), são as técnicas mais utilizadas com o intuito de melhor compreender os primeiros momentos do desenvolvimento e os mecanismos celulares envolvidos durante o estágio embrionário inicial destes animais. Entretanto, a taxa de produção de embriões da espécie é inferior se comparada com a espécie bovina, indicando uma baixa eficiência da técnica em búfalos (Sharma et al., 2016).
Um dos aspectos cruciais durante a produção in vitro de embriões (PIVE) é o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) durante as etapas de cultivo, como ânion superóxido, que podem causar alteração em diversas moléculas e por consequência alterar diversas estruturas celulares, tais como DNA e membranas (Culotta et al., 2009). Algumas proteínas são responsáveis em balancear de forma adequada a quantidade de EROs, uma vez que eles participam de uma gama de processos de sinalização celular e são importantes para o desenvolvimento embrionário. Portanto, um balanço adequado de tais moléculas é necessário para se alcançar altas taxas de produção de embriões e assim melhorar a eficiência da PIVE (CELINO et al., 2011).
As Superoxido dismutases (SODs), assim como as Catalases e as Glutationas peroxidases, são enzimas celulares que atuam como fatores antioxidantes naturais, reduzindo as espécies reativas de oxigênio a formas menos danosas as estruturas celulares, adequando o ambiente celular sem comprometer os mecanismos de sinalização celular (GUÉRIN et al., 2001). A ação da SOD em transformar EROs em moléculas não nocivas envolve a redução de um átomo de Cobre no sítio catalítico da enzima, demonstrando o papel crucial do metal nos processos oxidativos celulares (Culotta et al., 2009). Portanto é de extrema importância verificar a função do cobre na ação da SOD e por consequência no balanço oxidativo durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário da espécie bubalina, com o intuito de aumentar as taxas de produção embrionária da espécie.
JUSTIFICATIVA:
Durante o metabolismo aeróbico de todos os tipos celulares ocorre a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), também conhecidos como radicais livres, que são formados durante o processo de redução de moléculas de oxigênio (radical superóxido – O2-; peróxido de hidrogênio – H2O2; e radical hidroxila – OH-) (FUKAI & USHIO-FUKAI, 2011) e que estão associados a diversos processos de danos de estruturas celulares, ocasionando a oxidação de lipídeos, proteínas e até mesmo de DNA (RIBEIRO et al., 2015).
Antioxidante pode ser definido como qualquer molécula que cause a redução ou inibição da oxidação de seu substrato (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 1989). Podem ser tanto componentes não enzimáticos (vitaminas A, C (GHYASVAND et al., 2015; ZHANG et al., 2016), cisteamina (Anchordoquy et al., 2015) entre outros) como componentes enzimáticos, tais como as SODs, as Catalases e as Glutationas peroxidases, entre outras (GUÉRIN et al., 2001). Durante o metabolismo celular, ânions superóxido são dismutados pelas SODs, formando H2O2 que é convertido em H2O pela ação da catalase, peroxirredoxinas (Prxs) ou glutationa peroxidase (GPx) (FUKAI & USHIO-FUKAI, 2011).
O processo de dismutação do radical superóxido em radical peróxido (O2- para H2O2) pela ação da SOD necessita da redução e reoxidação ativa de um metal de transição, como o Cobre (Cu) ou Manganês (Mn) no sítio ativo da enzima. Três tipos de SODs foram descritas em mamíferos: duas isoformas (citosol e extracelular) que possuem Cu e Zn como cofatores – Cu/Zn SOD, e uma terceira presente nas mitocôndrias, dependente de Mn - Mn SOD (ZELKO et al., 2002). Os íons Zn2+ and Cu2+, são indispensáveis para a estabilização final da Cu/Zn SOD e para manter a atividade catalítica da enzima ativa. No entanto, Zn é considerado menos crítico e pode ser substituído por outros íons como cádmio, mercúrio e cobalto (BEEM et al., 1974), enquanto nenhum outro metal pode substituir o cobre em restaurar a função catalítica.
Entretanto, um equilíbrio na concentração tanto intra quanto extracelular de EROs é indispensável para uma gama de processos bioquímicos incluindo sinalização intracelular, defesa contra microrganismos e função celular. Porém, o acumulo de EROS podem ocasionar estresses oxidativos, levando a apoptose ou até necrose celular (CELINO et al., 2011). Portanto, se faz necessário o balanceamento correto da quantidade de agentes antioxidantes disponíveis, a fim de não se prejudicar os processos de sinalização intracelulares indispensáveis para as funções metabólicas.
Poucos estudos relacionam o papel do Cobre, e por consequência da Cu/Zn SOD, durante a produção in vitro de embriões e suas etapas. Picco et al. (2012) avaliaram o papel do
4 cobre na proteção contra acúmulo de espécies reativas de oxigênio na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e suas consequências no desenvolvimento embrionário pré-implantacional e perceberam que a adição de sulfato de cobre no meio de MIV aumentou a taxa de embriões produzidos em relação ao meio sem a utilização de antioxidantes.
Entretanto não se encontram estudos relacionando a característica antioxidante do cobre na produção in vitro de embriões da espécie bubalina. Logo se percebe a importância deste trabalho, que pretende avaliar o papel do Cobre durante a maturação in vitro de oócitos bubalinos (Bubalus bubalis), animal de extremo valor agro econômico para a região, e suas consequências no desenvolvimento embrionário inicial da espécie.
OBJETIVOS:
Objetivo geral:
Avaliar o uso do Sulfato de cobre (CuSO4) como agente antioxidante em oócitos bubalinos durante a maturação in vitro e suas consequências no desenvolvimento embrionário.
Objetivos Específicos:
Identificar a melhor concentração de Sulfato de Cobre na maturação in vitro de oócitos bubalinos
Avaliar os efeitos do uso de sulfato de cobre durante a maturação in vitro no desenvolvimento embrionário inicial (até o estágio de blastocisto).
MATERIAIS E MÉTODOS:
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Serão avaliadas três concentrações de Sulfato de Cobre no meio de maturação in vitro de oócito da espécie Bubalus bubalis. Os oócitos serão distribuídos entre os grupos experimentais: Controle – (Meio de maturação in vitro sem adição de Sulfato de Cobre); Grupo C1 (Meio de MIV com adição de 2μg/ml de Sulfato de Cobre); Grupo C2 (Meio de MIV com adição de 4 μg/ml de Sulfato de Cobre) e Grupo C3 (Meio de MIV com adição de 6 μg/ml de Sulfato de Cobre) de acordo com a metodologia utilizada por Picco et al. (2012) na espécie bovina. Serão avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também será avaliado o número total de células por embrião para análise qualitativa dos mesmos.
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
OBTENÇÃO DOS OVÁRIOS
Os ovários estão sendo obtidos no abatedouro frigorífico local, sendo coletados logo após o abate, lavados em PBS e acondicionados em frasco com solução salina (0,9% cloreto de sódio) à temperatura de 30 a 35°C e transportados até o laboratório de Fecundação in Vitro do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará dentro de um período máximo de 2 horas.
RECUPERAÇÃO E SELEÇÃO DOS CCOS
Folículos antrais de 2 a 8 mm foram puncionados utilizando-se agulhas 40 x 12 e seringas de 10 mL, sendo o fluido folicular obtido depositado em tubos de 15 mL. Terminada a aspiração, os tubos foram centrifugados por 5 segundos de forma que houvesse a separação do sobrenadante e do pellet onde se encontram os CCOs (Complexos Cumulus-oophurus). A porção líquida foi desprezada e o sedimento foi transferido para uma placa de Petri estéril de poliestireno de 35 mm de diâmetro.O rastreamento dos COCs foi realizado com auxílio de lupa estereomicroscópica. Os COCs com citoplasma homogêneo, sem vacúolos ou grânulos escurecidos e que apresentavam células do cumulus oophorus compactas e refringentes foram lavados e selecionados em TCM-199 Hepes acrescido 10% de SFB (v/v), e antibióticos (TCM 199-Hepes).
MATURAÇÃO IN VITRO (MIV)
Os CCOs foram lavados e incubados, em meio de MIV de acordo com os grupos experimentais (TCM 199 suplementado com bicarbonato de sódio, 10% SFB (v/v), FSH, LH, piruvato, antibióticos, com e sem sulfato de cobre). A incubação foi feita em placas de petri com gotas de 100 μL de meio (10 a 13 CCOs por gota) sob óleo mineral estéril, em estufa de cultivo com 5% de CO2, 20% de O2 e 75% de N2 sob atmosfera úmida e temperatura de 38,5°C por um período de 18 horas.
6 FECUNDAÇÃO IN VITRO (FIV)
Para a fecundação in vitro foi utilizado sêmen congelado de um único touro (Bos taurus). O método de separação dos espermatozóides (SPTZ) dos crioprotetores e plasma seminal foi o gradiente de densidade descontínuo de Percoll. A mini-palheta (500mL) de sêmen foi descongelada em água a 35°C durante 30 segundos. Em seguida, o sêmen foi depositado sobre a coluna de 800mL de Percoll (gradientes de 45 e 90%) e centrifugado (3.000 rpm) durante 7 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet lavado por centrifugação a 3000 rpm, durante 3 minutos para remoção dos resíduos de Percoll, em 800 mL de meio TALP. Após as lavagens, a concentração espermática foi determinada, com auxílio de uma câmara de Neubauer, e ajustada para 2x106 SPTZ/mL. Os espermatozoides foram colocados nas gotas (80 mL) de meio de fecundação (TALP, suplementado com heparina, penicilamina, hipotaurina, epinefrina e BSA), junto com os CCOs (20 a 25 por gota). Oócitos e espermatozoides permaneceram co-incubados nas mesmas condições citadas para a MIV por um período de aproximadamente 18 horas.
CULTIVO IN VITRO DOS EMBRIÕES.
O desenvolvimento embrionário foi realizado em um sistema de co-cultivo dos embriões com as células da granulosa que aderiram a placa durante a MIV. O meio de cultivo utilizado foi o Sintetic Oviductal Fluid suplementado com 10% de SFB, 1mM de glicose, 10μg/mL de insulina, 6mg/mL de BSA, 80μg/mL piruvato e gentamicina. Após a FIV os prováveis zigotos foram submetidos a sucessivas pipetagens para retirada das células do cumulus restantes e dos espermatozóides aderidos à zona pelúcida e então foram transferidos para gotas de cultivo com os grupos experimentais, onde permaneceram por sete dias.
ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
A avaliação quantitativa do desenvolvimento embrionário foi realizada no segundo dia de cultivo, mediante a contagem das taxas de clivagem e no sétimo dia de cultivo, através da taxa de formação de blastocisto e cinética do desenvolvimento. Os embriões também foram
classificados morfologicamente em embriões Grau 1, 2 ou 3, de acordo com o Manual da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões - IETS (STRINGFELLOW & SEIDEL 1998), todas as análises foram feitas sob observação em estereomicroscópio.
A análise qualitativa será realizada através da contagem do número tota lde células. Para isso os embriões serão fixados em formol salino, no sétimo dia de desenvolvimento, para posterior marcação com fluorocromo Hoechst 33342 (10 μg/mL) e observação em microscópio de Epifluorescência.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Ao final de todas as repetições os valores percentuais das taxas de desenvolvimento embrionário foram submetidos à ANOVA, com o pós-teste de Tukey, adotando-se o nível de significância de 5%, com auxílio do programa SigmaPlot.
RESULTADOS:
Devido a extrema dificuldade em conseguir o material biológico (ovários provenientes de animais abatidos em abatedouro local) uma vez que a grande maioria dos animais que são abatidos diariamente na região são da espécie bovina, as análises ainda não puderam ser realizadas na espécie de interesse (bubalina).
ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES:
Além das coletas no abatedouro local, os ovários também serão coletados em um abatedouro no município de Castanhal, a fim de se obter um maior número de oócitos viáveis para a produção dos embriões para que as análises possam ser realizadas.
CONCLUSÃO:
Os testes ainda não puderam ser realizados devido à dificuldade na obtenção dos oócitos da espécie bubalina. Por tanto, as análises na espécie ainda serão realizadas a fim de verificar o potencial antioxidante do cobre durante a maturação dos oócitos in vitro na espécie.
8 REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS
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BEEM K. M.; RICH W. E.; RAJAGOPALAN K. V. Total reconstitution of copper
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RIBEIRO T. P.; FERNANDES C.; MELO K. V.; FERREIRA S. S.; LESSA J. A.; FRANCO R. W. A.; SCHENK G.; PEREIRA M. D.; HORN JR. A. Iron, copper, and manganese complexes with in vitro superoxide dismutase and/or catalase activities that keep Saccharomyces cerevisiae cells alive under severe oxidative
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STRINGFELLOW D. A. & SEIDEL S. M. Manual da Sociedade Internacional
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gene structures, evolution, and expression. Free Radical Biol Med. v. 33, p.
1 DIFICULDADES – A principal dificuldade para a realização deste trabalho está sendo a baixa quantidade de animais (material biológico) abatidos e por consequência a dificuldade em coletar os CCOs para a produção dos embriões e realização das análises.
PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for ocaso.
DATA: / /
ASSINATURA DOORIENTADOR
ASSINATURA DOALUNO
INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e dainstituição.
FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃOCIENTÍFICA O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO:
1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foramjustificadas?
2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho?
3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?
4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo deveículo?
5. Comente outros aspectos que considera relevantes norelatório
6. Parecer Final: Aprovado( )
Aprovado comrestrições( ) (especificar se são mandatóriasourecomendações)Reprovado( )
7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a5)
Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, odesenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação dorelatório.
Data: / / .
