UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
Geraldo Henrique Lemos Barbosa
Preserva¸c˜ ao Das Fun¸c˜ oes Executivas Em Ratos Expostos Ao Status Epilepticus Neonatal
S˜ ao Paulo
2017
UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE PROGRAMA DE P ´ OS-GRADUAC ¸ ˜ AO EM
DIST ´ URBIOS DO DESENVOLVIMENTO
Geraldo Henrique Lemos Barbosa
Preserva¸ c˜ ao Das Fun¸ c˜ oes Executivas Em Ratos Expostos Ao Status Epilepticus Neonatal
Tese vinculada ` a linha de pesquisa b´ asica em Neurociˆ encias do Desenvolvimento, apresentada ao Programa de P´ os-Gradua¸c˜ ao da Universidade Presbiteriana Mackenzie, como requisito para a obten¸c˜ ao do t´ıtulo de Doutor.
Orientadora: Professora Doutora Roberta Monterazzo Cysneiros
S˜ ao Paulo
2017
B238p Barbosa, Geraldo Henrique Lemos.
Preservação das funções executivas em ratos expostos ao status epilepticus neonatal / Geraldo Henrique Lemos Barbosa.
53 f.: il.; 30 cm
Tese (Doutorado em Distúrbios do Desenvolvimento) – Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo, 2017.
Orientadora: Roberto Monterazzo Cysneiros.
Bibliografia: f. 28-34.
1. Convulsões neonatais. 2. Pilocarpina. 3. Memória de trabalho. 4. Análise do discurso. 5. Memória referência. 6.
Aprendizagem associativa. 7. Flexibilidade comportamental. I.
Cysneiros, Roberto Monterazzo. I. Título.
CDD 618.928
Dedico este trabalho ` a minha amada esposa
Erica e aos meus filhos queridos Henrique e ´
Esther pelo amor, incentivo, compreens˜ ao e
paciˆ encia sempre dispensados a mim. Amo
muito vocˆ es.
AGRADECIMENTOS
Agrade¸co a Deus “bendito e ´ unico Soberano, o Rei dos Reis e Senhor dos senhores, o
´
unico que ´ e imortal e habita em luz inacess´ıvel... A Ele sejam honra e poder para sempre”.
(I Tim´ oteo 6. 15 e 16)
Aos meus pais, pelo amor incondicional. Amo muito vocˆ es.
Agrade¸co ` a minha ´ınclita orientadora Prof.
aDr
aRoberta Monterazzo Cysneiros, pelo aprendizado, amizade e sobretudo parceria.
A ilustre Prof. `
aDr
aC´ assia Roberta da Cunha Thomaz, que cumpriu com excelˆ encia o papel de co-orientadora, pela coopera¸c˜ ao.
Aos insignes examinadores, Prof.
aDr
a. Alessandra Gotuzo Seabra, Prof. Dr. Luiz Renato Rodrigues Carreiro, Prof. Dr. S´ ergio Gomes da Silva e Prof. Dr. F´ ulvio Alexandre Scorza, que muito agregaram ao meu trabalho.
Ao Rev. Dr. Davi Charles Gomes, pelo apoio e constante incentivo.
Ao Rev. Jorge Corrˆ ea dos Santos Filho pela amizade e parceria que foram de grande valia para a execu¸c˜ ao desse trabalho.
Ao meu amigo Jos´ e Antˆ onio dos Santos Neto (Branco) pela paciˆ encia e destreza para sempre concretizar minhas ideias.
A minha amiga Ana Miri˜ ` a, pelo constante apoio, incentivo e prontid˜ ao em me auxiliar na jornada desse trabalho.
Ao seleto grupo de estudo: Samuel, Pedro, Gabriel, Denise, Fernanda, Let´ıcia e Dayane. Obrigado pela ajuda com os experimentos, pelas conversas e sobretudo pela amizade que cresce a cada experimento que fazemos juntos.
As minhas amigas, Fernanda, Bruna J´ ` ulia, Tha´ıs pelos momentos de descontra¸c˜ ao em meio aos experimentos.
Ao veterin´ ario Alexandre, aos t´ ecnicos do Biot´ erio: Domingos e Junior e aos t´ ecnicos do Laborat´ orio: Lucas e Nathalia por todo o aux´ılio prestado durante os experimentos.
A Daniele, da secretaria do programa, por toda a disponibilidade e prestabilidade ` durante o curso.
A Universidade Presbiteriana Mackenzie, pelo grande incentivo ` ` a pesquisa.
“Pois o Senhor ´ e quem d´ a sabedoria; de sua boca procedem o conhecimento e o discernimento”
Prov´ erbios 2:6
RESUMO
O Status Epilepticus (SE) ´ e uma ocorrˆ encia transit´ oria de sinais e ou sintomas devido a atividade neuronal excessiva ou sincronia anormal no c´ erebro. O termo transit´ orio ´ e usado como demarcador de tempo, para in´ıcio e fim da crise. A crise neonatal constitui- se a mais frequente manifesta¸c˜ ao de disfun¸c˜ ao neurol´ ogica no rec´ em-nascido, com maior incidˆ encia no primeiro ano de vida, e apresenta risco de morte, les˜ ao neuronal, morte neuronal, altera¸c˜ oes de redes neuronais ou preju´ızos neurol´ ogicos e cognitivos de longo prazo dependendo do tipo e dura¸c˜ ao da crise. Entretanto, cerca de 40%-50% das crian¸cas afetadas se desenvolvem normalmente. Estudos em modelos animais demonstram que as convuls˜ oes neonatais em roedores produzem efeitos adversos neurol´ ogicos de longo prazo, tais como: d´ eficits na aprendizagem, mem´ oria visuo-espacial, preju´ızo na flexibilidade cog- nitiva, comportamento autista, caracterizado pela baixa preferˆ encia pela novidade social, d´ eficit de discrimina¸c˜ ao social e comportamento tipo ansioso. Com base no conjunto de altera¸c˜ oes desencadeadas pelas crises neonatais em roedores, o modelo pode ser ´ util para a investiga¸c˜ ao da rela¸c˜ ao entre as convuls˜ oes no in´ıcio do desenvolvimento e as fun¸c˜ oes executivas. Assim, este projeto pretende avaliar comportamentos relacionados ` as fun¸c˜ oes executivas de animais que foram expostos ao SE neonatal. Ratos Wistar machos ao nono dia de vida (P9) foram submetidos ao SE pela administra¸c˜ ao da pilocarpina (350 mg/kg, ip) e os controles receberam salina 0.9% (0,1 mL/10 g). Em P60 os animais foram avali- ados pelos seguintes paradigmas: a caixa de condicionamento operante e o labirinto em T. A amostra foi composta por 25 animais, 11 controles e 14 experimentais. Estes testes avaliam: aprendizagem associativa visuo-espacial, consolida¸c˜ ao da mem´ oria, mem´ oria de trabalho, comportamento perseverante, controle inibit´ orio e flexibilidade comportamental.
Os dados sugerem que o grupo experimental, na caixa de condicionamento operante, n˜ ao exibiu preju´ızo na aprendizagem associativa visuo-espacial, que houve a consolida¸c˜ ao da mem´ oria, n˜ ao apresentou comportamento perseverante, preju´ızo na mem´ oria de trabalho e nem comportamento perseverante. No labirinto em T o grupo experimental mantiveram preservadas a mem´ oria de trabalho, a mem´ oria de referencia e a motiva¸c˜ ao, e n˜ ao exibiram preju´ızo na flexibilidade comportamental. Os dados sugerem que um ´ unico epis´ odio SE neonatal n˜ ao impacta a aprendizagem associativa, a mem´ oria de longo prazo, as mem´ orias de trabalho e de referˆ encia e a flexibilidade comportamental.
Palavras-chave: convuls˜ oes neonatais, pilocarpina, mem´ oria de trabalho, mem´ oria
referˆ encia, aprendizagem associativa, flexibilidade comportamental
ABSTRACT
Status Epilepticus (SE) is a transient occurrence of signs and / or symptoms due to ex- cessive neuronal activity or abnormal synchrony in the brain. The transient term is used as a time path for the beginning and end of the crisis. The neonatal crisis is the most fre- quent manifestation of neurological dysfunction in the newborn, with a higher incidence in the first year of life, and presents risk of death, neuronal injury, neuronal death, neural network alterations or neurological and cognitive impairment of long depending on the type and duration of the crisis. However, about 40-50% of affected children develop nor- mally. Studies in animal models demonstrate that neonatal seizures in rodents produce long-term neurological adverse effects such as: deficits in learning, visuospatial memory, impairment in cognitive flexibility, autistic behavior, characterized by low preference for social novelty, discrimination deficit social and anxious type behavior. Based on the set of changes triggered by neonatal seizures in rodents, the model may be useful for inves- tigating the relationship between seizures in early development and executive functions.
Thus, this project intends to evaluate behaviors related to the executive functions of an- imals that were exposed to neonatal SE. Male Wistar rats at the ninth day of life (P9) were submitted to SE by the administration of pilocarpine (350 mg / kg, ip) and controls received 0.9% saline (0.1 mL / 10 g). In P60 the animals were evaluated by the following paradigms: the operant conditioning box and the T. maze. The sample was composed of 25 animals, 11 controls and 14 experimental. These tests evaluate: visuospatial associative learning, memory consolidation, working memory, persevering behavior, inhibitory control and behavioral flexibility. The data suggest that the experimental group in the operant conditioning box showed no impairment in visuospatial associative learning, that there was memory consolidation, did not present perseverant behavior, impairment in working memory and persevering behavior. In the T-maze, the experimental group maintained their working memory, reference memory and motivation, and it showed no impairment in behavioral flexibility. The data suggest that a single neonatal SE episode does not impact associative learning, long-term memory, working and reference memories, and behavioral flexibility.
Palavras-chave: neonatal seizures, pilocarpine, working memory, reference memory,
associative learning, behavioral flexibility.
Lis t a d e Figu r a s
1 Circuitaria envolvida no desempenho das fun¸c˜ oes executivas . . . . 6
2 Linha do Tempo dos Testes Comportamentais . . . . 10
3 Caixa de Isolamento Ac´ ustico . . . . 11
4 Caixa de Condicionamento Operante . . . . 11
5 Labirinto em T . . . . 14
o i r á m u S
1 INTRODUC ¸ ˜ AO 1
2 Objetivo Geral 8
2.1 Objetivos Espec´ıficos . . . . 8
3 Materiais e M´ etodos 9 3.1 Animais . . . . 9
3.2 Testes Comportamentais . . . . 9
3.2.1 Caixa de condicionamento Operante (CCO) . . . . 10
3.2.2 Auto Modelagem . . . . 12
3.2.3 Refor¸co Cont´ınuo de Respostas – CRF . . . . 12
3.2.4 Extin¸c˜ ao . . . . 13
3.2.5 Treino Discriminativo . . . . 13
3.3 Labirinto em T . . . . 14
4 AN ´ ALISE ESTAT´ ISTICA 16 5 RESULTADOS 17 5.1 Condicionamento Operante . . . . 17
5.2 Labirinto em T . . . . 19
6 DISCUSS ˜ AO 23
7 CONCLUS ˜ AO 26
REFERˆ ENCIAS BIBLIOGR ´ AFICAS 33
APˆ ENDICE I 34
APˆ ENDICE II 38
1 INTRODUC ¸ ˜ AO
O Status Epilepticus (SE) ´ e uma ocorrˆ encia transit´ oria de sinais e ou sintomas devido a atividade neuronal excessiva ou sincronia anormal no c´ erebro. O termo transit´ orio ´ e usado como demarcador de tempo, para in´ıcio e fim da crise (TRINKA et al., 2015).
A crise neonatal constitui-se a mais frequente manifesta¸c˜ ao de disfun¸c˜ ao neurol´ ogica no rec´ em-nascido, com maior incidˆ encia no primeiro ano de vida, e apresenta risco de morte, les˜ ao neuronal, morte neuronal, altera¸c˜ oes de redes neuronais ou preju´ızos neu- rol´ ogicos e cognitivos de longo prazo dependendo do tipo e dura¸c˜ ao da crise (WIRRELL et al., 2011; VASUDEVAN; LEVENE, 2013). Entretanto, cerca de 40%-50% das crian¸cas afetadas se desenvolvem normalmente.
As crises refrat´ arias est˜ ao associadas com altas taxas de mortalidade e baixo desem- penho neurol´ ogico, o que causa sequelas a longo prazo como: atraso global do desenvolvi- mento, deficiˆ encia intelectual, paralisia cerebral e epilepsia (FRIEDMAN; HU, 2014). A susceptibilidade para a ocorrˆ encia das crises neonatais ´ e devida ao c´ erebro do infante ser altamente excit´ avel (HERNAN et al., 2013; YILDIZ et al., 2012; CORNEJO et al., 2007), o que pode ser em parte explicada pelo fato do ´ acido gama-aminobut´ırico (GABA), que no c´ erebro maduro ´ e o principal neurotransmissor inibit´ orio, no c´ erebro imaturo, paradoxal- mente exerce a fun¸c˜ ao excitat´ oria. A a¸c˜ ao excitat´ oria mediada pelo GABA decorre da existˆ encia de uma maior concentra¸c˜ ao intracelular de ´ıons cloreto em neurˆ onios imaturos em compara¸c˜ ao aos maduros ((BEN-ARI; HOLMES, 2006; HOLMES, 2009)) e da sua extrus˜ ao quando os neurˆ onios s˜ ao estimulados.
Fatores combinados aumenta a excitabilidade: vertiginoso crescimento e desenvolvi- mento do c´ erebro imaturo que o torna mais suscept´ıvel a insultos ex´ ogenos (MIZRAHI, 1999); a preeminˆ encia do sistema excitat´ orio em rela¸c˜ ao ao inibit´ orio facilita a propaga¸c˜ ao da atividade el´ etrica sincronizada; bem como a substˆ ancia nigra que no c´ erebro em de- senvolvimento propicia a propaga¸c˜ ao da atividade epileptogˆ enica (HERNAN et al., 2013;
YILDIZ et al., 2012; CORNEJO et al., 2007).
Aliada a elevada excitabilidade do c´ erebro imaturo, a presen¸ca de fatores desen-
cadeantes tais como trauma do nascimento, insultos hip´ oxico-isquˆ emico, infec¸c˜ oes in-
trauterinas e adquiridas ap´ os o nascimento, hemorragias intracranianas e dist´ urbios metab´ o-
licos transit´ orios como: hipoglicemia, hipocalcemia, hipomagnesenia, hipo ou hiperna- tremia, considerados tamb´ em fatores desencadeadores de crises (BEN-ARI; HOLMES, 2006) (STAFSTROM, 2006; THIBEAULT-EYBALIN; LORTIE; CARMANT, 2009) (HUANG et al., 2011; LONG; DELETERIOUS, 2014). A encefalopatia hip´ oxico-isquˆ emica, a hemorragia intracraniana, infec¸c˜ ao intracraniana e a m´ a forma¸c˜ ao juntas perfazem 80 a 85% das crises no per´ıodo neonatal (VASUDEVAN; LEVENE, 2013). Quanto mais precoce o in´ıcio e tempo de dura¸c˜ ao das crises, tende a ser menor o desempenho cog- nitivo (KAADEN; HELMSTAEDTER, 2009; KENT et al., 2006). Por muito tempo foi aceito que a etiologia das crises era o fator mais importante na predi¸c˜ ao do progn´ ostico do desenvolvimento neurol´ ogico subsequente ` as crises neonatais. Contudo, estudos cl´ınicos apontam que fatores independentes, que inclui a semiologia das crises, contribuem para o progn´ ostico adverso de longo prazo (GARFINKLE; SHEVELL, 2011; YILDIZ et al., 2012; LAI et al., 2013).
A prevalˆ encia das crises neonatais apresenta uma ampla variabilidade que varia de 1, 1-8, 6 por 1000 nascidos vivos dependendo da popula¸c˜ ao estudada e dos crit´ erios utiliza- dos para o diagn´ ostico (MOSLEY, 2010; CHAPMAN; RAOL; BROOKS-KAYAL, 2012;
HERNAN et al., 2013).
Crises convulsivas no in´ıcio do desenvolvimento s˜ ao associadas com preju´ızos com- portamentais em longo prazo, podendo ser inclu´ıdo autismo e transtorno de d´ eficit de aten¸c˜ ao e hiperatividade, o que sugere que estruturas relacionadas ao lobo frontal podem ser afetadas permanentemente (BROOKS-KAYAL, 2010; ZAMARIAN et al., 2011).
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) ´ e caracterizado por um preju´ızo qualitativo na intera¸c˜ ao social rec´ıproca, preju´ızo na comunica¸c˜ ao verbal e n˜ ao-verbal, padr˜ ao de comportamento estereotipado e interesses restritos [Associa¸c˜ ao Psiqui´ atrica Americana
1(APA), 2014].
Os estudos epidemiol´ ogicos apontam que 46% dos indiv´ıduos com autismo tˆ em alguma forma de epilepsia. N˜ ao h´ a um tipo de crise ou s´ındrome particularmente associada ao Transtorno do Espectro Autista (TEA). Crise parcial complexa, ausˆ encia e tˆ onico- clˆ onico generalizada j´ a foram relatadas. Esta extensa variabilidade pode ser atribu´ıda ` a
1
American Psychiatric Association
heterogeneidade da popula¸c˜ ao estudada, quanto ` a coexistˆ encia de deficiˆ encia intelectual, idade, hist´ oria familiar, atraso grave na linguagem, s´ındromes gen´ eticas e a gravidade dos sintomas aut´ısticos (WOOLFENDEN et al., 2012; AMIET et al., 2013). As crian¸cas que co-expressam epilepsia e autismo apresentam um pior desempenho comportamental e cognitivo do que aqueles com somente autismo ou epilepsia (DEPOSITARIO-CABACAR;
ZELLEKE, 2010). A incidˆ encia da epilepsia em crian¸cas com TEA ´ e bimodal. Tem sido observada um pico antes dos 5 anos de idade e um segundo pico crian¸cas com mais de 10 anos (VOLKMAR; NELSON, 1990). As crian¸cas que apresentam crises convulsivas no primeiro ano de vida tˆ em um risco mais elevado para desenvolver autismo que a popula¸c˜ ao geral. Apesar deste risco maior, e de provavelmente fatores comuns (esclerose tuberosa, s´ındrome do X Fr´ agil e etc.) contribu´ırem para o surgimento de ambas as condi¸c˜ oes ainda n˜ ao est´ a claro, na condi¸c˜ ao humana, se as crises convulsivas per se, podem diretamente afetar o desenvolvimento de caracter´ısticas aut´ısticas. Nosso grupo de pesquisa foi o primeiro a demonstrar que as crises convulsivas neonatais em ratos produzem preju´ızos na sociabilidade (CASTELHANO et al., 2010; CASTELHANO et al., 2013; CASTELHANO et al., 2015) e que tamb´ em foi demonstrado por grupos independentes (LUGO; SWANN;
ANDERSON, 2014; BERNARD; BENKE, 2015; HOLMES et al., 2015). A elucida¸c˜ ao dos mecanismos biol´ ogicos envolvidos pode ajudar na busca de interven¸c˜ oes precoces que possam minimizar tais preju´ızos.
Diferentemente da pesquisa cl´ınica, a pesquisa com modelos animais permite a ob- serva¸c˜ ao, an´ alise e o controle das vari´ aveis, e assim, permite investigar as consequˆ encias das crises, independente da etiologia (HOLMES, 2005; NARDOU; FERRARI; BEN-ARI, 2013).
Assim, estudos em modelos animais demonstram que as convuls˜ oes neonatais em roedores produzem efeitos adversos neurol´ ogicos de longo prazo, tais como: d´ eficits na aprendizagem e na mem´ oria viso-espacial (HOLMES et al., 1998; HUANG et al., 1999;
LUGO; SWANN; ANDERSON, 2014), brotamento das fibras musgosas na regi˜ ao CA3
e supragranular (HOLMES et al., 1998; SOGAWA et al., 2001), redu¸c˜ ao da sinaliza¸c˜ ao
inibit´ oria da regi˜ ao CA1 da forma¸c˜ ao hipocampal (VILLENEUVE et al., 2000), aumento
da excitabilidade na regi˜ ao CA1 (VILLENEUVE et al., 2000; SANTOS et al., 2000a),
redu¸c˜ ao da potencia¸c˜ ao a longo prazo (LTP) (LYNCH et al., 2000; CORNEJO et al.,
2007), redu¸c˜ ao da arboriza¸c˜ ao dendr´ıtica basilar na forma¸c˜ ao hipocampal (NISHIMURA;
GU; SWANN, 2011), aumento na express˜ ao dos receptores Glutamat´ ergicos (GluR1 e NMDAR1) na forma¸c˜ ao hipocampal (SOGAWA et al., 2001) e aumento persistente da excitabilidade do neoc´ ortex (ISAEVA et al., 2010), preju´ızo na flexibilidade cognitiva (KLEEN et al., 2011), altera¸c˜ ao robusta na camada II/III, bem como na camada V do c´ ortex pr´ e-frontal (HERNAN et al., 2013), comportamento autista caracterizado pela baixa preferˆ encia pela novidade social, d´ eficit de discrimina¸c˜ ao social (CASTELHANO et al., 2010; CASTELHANO et al., 2013; CASTELHANO et al., 2015; LUGO; SWANN;
ANDERSON, 2014; BERNARD; BENKE, 2015; HOLMES et al., 2015) e comportamento tipo ansioso (SAYIN; SUTULA; STAFSTROM, 2004; SHI, 2007; CASTELHANO et al., 2013; CASTELHANO et al., 2015; LUGO; SWANN; ANDERSON, 2014).
Um modelo animal apropriado deve incorporar validade de face, validade de con- struto e validade preditiva. Neste sentido, modelos animais com validade de construto tˆ em sido utilizados para testar hip´ oteses acerca das causas gen´ eticas e ambientais dos TEA. Diversos modelos utilizando camundongos com muta¸c˜ oes encontradas na condi¸c˜ ao humana j´ a foram desenvolvidos e os mesmos exibem fen´ otipo comportamental compat´ıvel para os crit´ erios diagn´ osticos para autismo, configurando a validade de face dos modelos (SILVERMAN et al., 2010).
Para valida¸c˜ ao de face, v´ arios testes comportamentais tˆ em sido propostos como rele- vantes para avalia¸c˜ ao dos sintomas centrais do autismo, bem como dos sintomas associados (CRAWLEY, 2007; CYSNEIROS, 2011).
No que concerne ` a sociabilidade, uma an´ alise quantitativa e qualitativa da intera¸c˜ ao social ao longo da vida ´ e de extrema importˆ ancia. Destaca-se neste caso o comportamento de brincar em animais jovens, sociabilidade, preferˆ encia para a novidade social e mem´ oria de reconhecimento social em animais adultos.
No que tange a comunica¸c˜ ao, os roedores emitem sinais auditivos, incluindo vocal- iza¸c˜ ao ultrassˆ onica, que podem ser registradas em diferentes circunstˆ ancias. A avalia¸c˜ ao das vocaliza¸c˜ oes ultrassˆ onicas associada ` a observa¸c˜ ao dos comportamentos sociais pode fornecer pistas da capacidade de comunica¸c˜ ao e do estado emocional em diferentes situa¸c˜ oes (PORTFORS, 2007). Indiv´ıduos com autismo frequentemente mantˆ em h´ abitos r´ıgidos e uma forte resistˆ encia para a mudan¸ca de rotina.
Em roedores, a resistˆ encia para mudan¸ca de h´ abito em resposta a mudan¸ca de rotina
pode ser analisada, por exemplo, com a utiliza¸c˜ ao do labirinto em T, e falha para mudan¸ca de h´ abito pode ser an´ aloga ` a inflexibilidade encontrada na mudan¸ca de rotina observada em indiv´ıduos com autismo.
Trabalhos anteriores do nosso grupo j´ a investigaram parte do conjunto de compor- tamentos preconizados para valida¸c˜ ao do modelo para estudo do TEA, por exemplo, o comportamento de brincar (CASTELHANO et al., 2010), sociabilidade e comportamento do tipo ansioso em ambos gˆ eneros (CASTELHANO et al., 2013; CASTELHANO et al., 2015).
Com bases no conjunto de altera¸c˜ oes desencadeadas pelas crises neonatais em roe- dores, o modelo pode ser ´ util para a investiga¸c˜ ao da rela¸c˜ ao entre as convuls˜ oes no in´ıcio do desenvolvimento e as fun¸c˜ oes executivas.
As fun¸c˜ oes executivas s˜ ao descritas como um complexo conjunto de habilidades, como planejamento, solu¸c˜ ao de problemas, flexibilidade cognitiva, que nos permite regular efi- cientemente os objetivos comportamentais tanto externos quanto internos, particular- mente em contextos n˜ ao familiares (TROUDET et al., 2016), Hamdan e Pereira (2009) referem-se a fun¸c˜ oes executivas como habilidades cognitivas envolvidas no planejamento, inicia¸c˜ ao, seguimento e monitoramento de comportamentos complexos dirigidos a um determinado fim.
Mour˜ ao-J´ unior e Melo (2011) preferem usar o termo fun¸c˜ ao executiva no singular, para, segundo eles, evitar confus˜ oes e ambiguidades conceituais. Imaginam fun¸c˜ ao exec- utiva como um sistema gerenciador que tem como atributo organizar uma sequˆ encia de a¸c˜ oes a fim de atingir um objetivo definido. Por isso, conceituam como um conjunto de habilidades, que de forma integrada, possibilita ao indiv´ıduo, direcionar comportamen- tos a objetivos, realizando a¸c˜ oes volunt´ arias. Tais a¸c˜ oes s˜ ao auto organizadas, mediante avalia¸c˜ ao de sua adequa¸c˜ ao e eficiˆ encia em rela¸c˜ ao ao objetivo pretendido, de modo a eleger estrat´ egias mais eficientes, resolvendo assim, problemas imediatos, e ou de m´ edio e longo prazo.
Diamond (2013) usa o termo no plural e se refere a ele tamb´ em como controle executivo
ou controle cognitivo, pois mostra que as fun¸c˜ oes executivas tornam poss´ıvel que a ideia
possa ser realizada; que existe um tempo entre agir e pensar, a rea¸c˜ ao quando se est´ a ` a
frente de uma novidade, que imprevistos acontecem e sempre ´ e um desafio saber como
enfrent´ a-los, o qu˜ ao importante e necess´ ario ´ e se manter o foco tendo consciˆ encia de fatores que podem desviar a aten¸c˜ ao.
Ela afirma que h´ a uma concordˆ ancia geral sobre os trˆ es pilares b´ asicos das fun¸c˜ oes executivas, a saber:
1. Controle Inibit´ orio – controla a aten¸c˜ ao, comportamento, pensamentos e/ou emo¸c˜ oes em substitui¸c˜ ao a uma forte predisposi¸c˜ ao e atra¸c˜ ao externa. Um outro aspecto do controle inibit´ orio ´ e o autocontrole que envolve a manuten¸c˜ ao da aten¸c˜ ao e n˜ ao agir impulsivamente e nem prematuramente.
2. Mem´ oria de trabalho – manter a informa¸c˜ ao armazenada e trabalhar mentalmente com ela, ou seja, relacionar uma coisa ` a outra, usando a informa¸c˜ ao para resolver um problema.
3. Flexibilidade Cognitiva – mudan¸ca perspectiva ou de abordagem frente a um prob- lema, de forma flex´ıvel a fim de se adaptar ` as novas exigˆ encias, regras ou prioridades em alternˆ ancia entre as tarefas.
Duncan (1986) ´ e dos primeiros a levantar a hip´ otese de comprometimento da fun¸c˜ ao executiva como d´ eficit subjacente ao autismo devido a semelhan¸ca entre o comportamento de indiv´ıduos com disfun¸c˜ ao no c´ ortex pr´ e-frontal e daqueles com autismo.
Malloy-Diniz et al. (2008) afirmam que trˆ es circuitos (al¸ca cognitiva, al¸ca l´ımbica e
al¸ca motora) est˜ ao envolvidos no desempenho das fun¸c˜ oes executivas.
Figu r 1 a : Circuitaria envolvida no desempenho das fun¸c˜ oes executivas
Fonte: (GALVAN; DEVERGNAS; WICHMANN, 2015)
Na al¸ca motora o circuito tem sua origem no c´ ortex motor prim´ ario, pr´ e-motor e ´ areas sens´ orio-motora, projeta-se para o putˆ amen, segue para o globo p´ alido segmento interno ventrolateral projeta-se para n´ ucleos ventral lateral e anterior do t´ alamo retornando para as regi˜ oes corticais motoras. Esse circuito est´ a envolvido o planejamento e a execu¸c˜ ao da a¸c˜ ao motora.
Na al¸ca l´ımbica, o circuito tem sua origem no c´ ortex pr´ e-frontal medial e cingulado anterior e projeta-se para o estriado ventral ou n´ ucleo accumbens que tamb´ em recebe aferˆ encias da am´ıgdala, hipocampo e da ´ area tegmental ventral. Essa circuitaria segue para o globo p´ alido segmento interno e para os n´ ucleos ventral anterior e dorsomedial do t´ alamo e retorna para o c´ ortex pr´ e-frontal medial e cingulado anterior. Esse circuito est´ a envolvido na motiva¸c˜ ao, recompensa, monitoramento de comportamentos, controle executivo da aten¸c˜ ao, sele¸c˜ ao e controle de respostas.
Na al¸ca cognitiva, o circuito se origina no c´ ortex pr´ e-frontal dorsolateral, orbitofrontal
lateral e das ´ areas de associa¸c˜ ao temporal e parietal segue para a parte dorsolateral do
n´ ucleo caudado, com conex˜ oes em por¸c˜ oes dorsolaterais do globo p´ alido e da substancia
negra reticulada rostral. A circuitaria tem sua continuidade na regi˜ ao parvocelular dos n´ ucleos talˆ amicos dorsolateral e ventral anterior. Do t´ alamo s˜ ao emitidas proje¸c˜ oes para o c´ ortex pr´ e-frontal dorsolateral. ´ Area de convergˆ encia cortical, associada a processos cog- nitivos como: estabelecimento de objetivos, planejamento, solu¸c˜ ao de situa¸c˜ oes adversas, fluˆ encia, categoriza¸c˜ ao, memoria operacional, monitora¸c˜ ao de aprendizagem e aten¸c˜ ao, flexibilidade cognitiva, capacidade de abstra¸c˜ ao, auto regula¸c˜ ao, julgamento, tomada de decis˜ ao, foco, sustenta¸c˜ ao da aten¸c˜ ao e tomada de decis˜ ao.
Assim, este projeto pretende avaliar comportamentos relacionados ` as fun¸c˜ oes execu- tivas de animais que foram expostos ao SE neonatal. Ressalta-se que por se tratar de um estudo com modelo animal o termo flexibilidade cognitiva foi substitu´ıdo por flexibilidade comportamental.
Para estudos com roedores ´ e necess´ ario considerar, tamb´ em, a mem´ oria de referˆ encia
que representa o conhecimento para os aspectos de uma tarefa que permanecem con-
stantes entre os ensaios. Este tipo de mem´ oria est´ a ligado a consolida¸c˜ ao da mem´ oria e
estabiliza¸c˜ ao progressiva ao longo do tempo (NADEL; HARDT, 2011).
2 Objetivo Geral
Investigar a rela¸c˜ ao entre as convuls˜ oes no in´ıcio do desenvolvimento e fun¸c˜ oes exec- utivas.
2.1 Objetivos Espec´ıficos
Avaliar mem´ oria de trabalho, mem´ oria de referˆ encia, controle dos impulsos e respostas
perseverantes em animais submetidos ao status epilepticus neonatal.
3 Materiais e M´ etodos
3.1 Animais
O projeto foi aprovado pela comiss˜ ao de ´ Etica no Uso de Animais da Universidade Presbiteriana Mackenzie, CEUA/UPM n
o130/10/2015, de acordo com os preceitos da lei n
o11.794/2008, do decreto n
o6.899/2009 e das Normas do Conselho Nacional de Controle de Experimenta¸c˜ ao Animal (CONCEA).
A pesquisa contou com ratos da ra¸ca Wistar, provenientes do Biot´ erio da Universidade Presbiteriana Mackenzie, divididos em dois grupos: um grupo experimental de 14 animais que receberam pilocarpina dilu´ıda em salina na concentra¸c˜ ao de 3,5% (350 mg/kg, i.p) e o grupo controle de 11 animais receberam solu¸c˜ ao salina 0,9% (0,1mL/10g), perfazendo um total de 25 animais, todos com idade de 9 dias p´ os-natal ser˜ ao mantidos em condi¸c˜ oes controladas (12 horas, ciclo claro/escuro, 22–24
oC) e com livre acesso a ´ agua e a comida.
A pilocarpina ´ e um alcal´ oide extra´ıdo das folhas da planta jaborandi (Pilocarpus jab- orandi), a qual possui propriedades colin´ ergicas capazes de induzir status epilepticus(SE), culminando com les˜ oes encef´ alicas espec´ıficas e movimentos estereotipados convulsivantes.
A pilocarpina ´ e capaz de induzir status epilepticus tanto administrada diretamente no enc´ efalo como por via intraperitonial.
Na dose de 350 mg/kg, os animais apresentam crises motoras l´ımbicas com intensa saliva¸c˜ ao, “rearing” (o animal permanece em p´ e apresentando clonias dos membros an- teriores apoiado sobre as patas posteriores) e crises tˆ onico-clˆ onicas generalizadas. Tais crises recorrem a cada 2 - 8 minutos e evoluem para o SE, o qual perdura em m´ edia 10 horas, sendo que as primeiras 24 horas ap´ os a inje¸c˜ ao da pilocarpina caracterizam o per´ıodo agudo do modelo (CAVALHEIRO et al., 1994).
3.2 Testes Comportamentais
Os testes comportamentais foram iniciados a partir de 60 dias ap´ os o nascimento
(P60) os animais come¸caram a fazer os testes. Os testes que foram utilizados: a caixa
de condicionamento operante (CCO, INSIGHT Brasil) e o labirinto em T. A Figura 2
representa a linha do tempo dos testes realizados. Os animais forma submetidos a pilo-
carpaina aos nove dias ap´ os do nascimento (P9), foram desmamados em P21 e colocados em suas caixas at´ e que completaram os 60 dias para inicio dos testes. Primeiro teste foi de Condicionamento Operante na caixa de Skinner em seguida o Labirinto em T, que come¸cou no 181
odia.
Figu r 2 a : Linha do Tempo dos Testes Comportamentais
3.2.1 Caixa de condicionamento Operante (CCO)
O condicionamento operante foi usado para investigar a aprendizagem e mem´ oria associativa, mem´ oria de trabalho, flexibilidade cognitiva e resposta perseverante.
A CCO ´ e equipada com uma barra que se encontra na parede esquerda, com uma
distˆ ancia de sete cent´ımetros e meio em rela¸c˜ ao ao bebedouro podendo ser acionada tanto
automaticamente quanto mecanicamente, que permite a realiza¸c˜ ao de diversas altera¸c˜ oes
como: libera¸c˜ ao de ´ agua, apresenta¸c˜ ao de luzes e sons. A CCO fica dentro de uma caixa
de madeira com isolamento ac´ ustico, com sistema de refrigera¸c˜ ao para manuten¸c˜ ao da
temperatura.
Figu r a 3 : Caixa de Isolamento Ac´ ustico
Figu r 4: a Caixa de Condicionamento Operante
Em todas as fases dos protocolos experimentais, os animais foram privados por 20
horas de ´ agua, e receberam como est´ımulo ´ agua com 20% de sacarose. Cada sess˜ ao teve
30 minutos de dura¸c˜ ao e ocorreram 6 vezes por semana. Os testes seguiram os seguintes protocolos:
3.2.2 Auto Modelagem
A automodelagem foi utilizada para avaliar o n´ umero de sess˜ oes para aprendizagem associativa visuo-espacial. A sess˜ ao teve seu in´ıcio quando o animal foi colocado na Caixa de Condicionamento Operante, antes disso uma gota de ´ agua com 20% de sacarose j´ a estava dispon´ıvel para ele no bebedouro. Assim, no momento em que ele come¸cou a explorar a caixa ele tinha possibilidade de encontrar a recompensa e com isso, aprender que ao pressionar a barra ele ganhava o incentivo da recompensa.
Foi estabelecido o n´ umero m´ aximo de 15 sess˜ oes para que o animal aprendesse a tarefa de pressionar a barra e obter a recompensa. Cada sess˜ ao durou 30 minutos e o crit´ erio que estabelecido o cumprimento da tarefa foi o animal pressionar a barra por no m´ınimo 10 vezes consecutivas. Os animais que n˜ ao atenderam os crit´ erios at´ e a d´ ecima quinta sess˜ ao foram exclu´ıdos do teste.
3.2.3 Refor¸ co Cont´ınuo de Respostas – CRF
CRF termo que tem sua origem de uma express˜ ao em inglˆ es cont´ınuos reinforcement,
´ e um esquema de refor¸camento para o fortalecimento do comportamento de pressionar a barra, em que todas as respostas de pressionar a barra s˜ ao refor¸cadas (MOREIRA;
MEDEIROS, 2009). Com a emiss˜ ao de respostas corretas o comportamento aprendido far´ a parte do repert´ orio do indiv´ıduo.
A previs˜ ao desta atividade foi de uma sess˜ ao de 30 minutos, a qual toda vez que o sujeito emitia a resposta de pressionar a barra era liberada ´ agua no bebedouro.
O bot˜ ao do bebedouro esteve na posi¸c˜ ao “autom´ atico”, o que possibilitou a libera¸c˜ ao autom´ atica da ´ agua cada vez que o animal pressionava a barra.
O crit´ erio para o encerramento dessa sess˜ ao ´ e o t´ ermino do tempo previsto para sess˜ ao
e foram realizadas 4 sess˜ oes de CRF.
3.2.4 Extin¸ c˜ ao
Utilizado para avaliar a resposta perseverante. Nessa sess˜ ao o procedimento foi de extinguir o comportamento refor¸cador de apertar a barra e obter ´ agua. Esse protocolo foi realizado em uma sess˜ ao, como se segue:
1. No come¸co da sess˜ ao o rato ficou em CRF por cinco refor¸cos.
2. Ap´ os a quinta resposta refor¸cada, o comportamento de pressionar a barra foi colo- cado em extin¸c˜ ao, isto ´ e, quando o animal pressionava a barra n˜ ao era apresentado
´ agua.
3. O animal foi observado at´ e atingir cinco minutos consecutivos sem pressionar a barra.
3.2.5 Treino Discriminativo
O objetivo do treino discriminativo foi ensinar o rato a pressionar a barra quando a luz que se localiza acima da barra encontrar-se acesa, fazendo com que a luz adquira fun¸c˜ ao de est´ımulo discriminativo para a resposta ` a press˜ ao a barra. Esse protocolo avaliou mem´ oria de trabalho, comportamento perseverante, controle inibit´ orio e flexibili- dade comportamental. Procedimento:
1. O experimento foi iniciado com a luz sobre a barra acesa.
2. Nos per´ıodos em que o est´ımulo discriminativo esteve presente (luz acesa), o compor- tamento de press˜ ao ` a barra foi refor¸cado. A barra foi utilizada no modo autom´ atico.
E quando a luz esteve apagada, o comportamento de pressionar a barra foi colocado em extin¸c˜ ao.
3. As apresenta¸c˜ oes da luz acesa e da luz apagada foram feitas da seguinte forma: trˆ es refor¸cos na presen¸ca da luz acesa e 10 segundos de apresenta¸c˜ ao da luz apagada.
4. Foi considerado controle discriminativo quando o animal passou por cinco per´ıodos
consecutivos na presen¸ca da luz apagada, pressionando no m´ aximo uma vez em cada
per´ıodo.
5. Durante 30 minutos, foi registrado, minuto a minuto, o n´ umero de press˜ oes ` a barra enquanto a luz estava tanto acesa quanto apagada.
6. Esse procedimento contou com 10 sess˜ oes.
3.3 Labirinto em T
O labirinto em T baseia-se na tendˆ encia natural dos roedores em alternar a escolha do bra¸co, que reflete a motiva¸c˜ ao do animal em explorar seu ambiente e localizar a presen¸ca de recursos (DEACON; RAWLINS, 2006).
O labirinto tem formato de um T (cada bra¸co mede 50X16) ´ e um aparato fechado feito de madeira e revestido internamente com papel autoadesivo cinza escuro. O protocolo utilizado foi adaptado do descrito por Shoji et al. (2012). Os animais tiveram restri¸c˜ ao alimentar que consistia de 15g da ra¸c˜ ao que eles, costumeiramente, receberam no Biot´ erio da Universidade Presbiteriana Mackenzie.
Figu r 5 a : Labirinto em T
Fonte:http://www.cebiolog.com.br/comportamento–labirinto–rastreamento.html
Os ratos foram submetidos inicialmente a um jejum noturno e depois 3 dias de raciona-
mento de comida. A recompensa (Nescau cereal) foi disponibilizada dentro das caixas
moradia para os animais se habituarem com as mesmas em um ambiente familiar. O
teste foi realizado ap´ os habitua¸c˜ ao do animal com o aparato. Para habitua¸c˜ ao, a
recompensa foi distribu´ıda no aparato para permitir que o animal deambulasse livremente para recolher as recompensas. Assim, no primeiro dia e segundo dias, em pares, os ani- mais deambularam livremente por 10 min ou at´ e recolherem as recompensas. A partir do terceiro dia, os animais deambularam sozinhos. Foram considerados habituados quando deambularam sem hesita¸c˜ ao, sem urinar ou defecar no aparato. O aparato foi limpo com
´
alcool 5% a cada troca de animal/ensaio. O teste foi dividido em 3 fases: alternˆ ancia for¸cada, discrimina¸c˜ ao esquerda-direita e flexibilidade comportamental.
O teste de alternˆ ancia for¸cada foi utilizado para avaliar a mem´ oria de trabalho e consiste de uma escolha for¸cada seguida por uma de livre escolha, quando o animal pode escolher entre os dois bra¸cos. A resposta ser´ a considerada correta se o animal entrar no bra¸co oposto ao da alternˆ ancia for¸cada para coletar a recompensa (Nescau cereal). Caso o animal entrasse no mesmo bra¸co da escolha for¸cada ele foi confinado por 10 segundos.
Foram realizados 10 ensaios por dia por 4 dias consecutivos.
A discrimina¸c˜ ao esquerda-direita, usada para avaliar a mem´ oria de referˆ encia, consiste de livre escolha, na qual os animais poderiam escolher entre os dois bra¸cos, mas somente um dos bra¸cos (bra¸co alvo) continha a recompensa. A resposta foi considerada correta quando o animal entrou no bra¸co alvo e considerada incorreta quando o animal alternou entre os bra¸cos. Foram realizados 10 ensaios por dia durante 4 dias.
A flexibilidade comportamental foi utilizada para avaliar comportamento persever-
ante, considerando que a mem´ oria de referˆ encia est´ a sujeita a consolida¸c˜ ao. O teste foi
semelhante ao anterior, por´ em o bra¸co alvo foi o oposto do anterior. Ser˜ ao realizados 10
ensaios/dia durante 5 dias. O crit´ erio estabelecido foi de 80% de respostas corretas.
4 AN ´ ALISE ESTAT´ ISTICA
Os resultados foram expressos com m´ edia ± erro padr˜ ao. Os parˆ ametros mensurados na caixa de condicionamento operante e no labirinto em T foram analisados empregando- se a ANOVA de 2 vias (2-way ANOVA) com medidas repetidas, seguido pelo p´ os-teste de Bonferroni. O teste exato de Fisher foi utilizado para avaliar aprendizagem associativa visuo-espacial. As diferen¸cas foram consideradas significantes para um valor de p¡0,05.
As an´ alises foram efetuadas utilizando-se o Prism vers˜ ao comercial 5.03 para Windows.
5 RESULTADOS
5.1 Condicionamento Operante
O n´ umero de sess˜ oes para aprender a tarefa n˜ ao diferiu entre os grupos (t=0,4564,
gl=12, p=0,6562), Gr´ afico 6A. Contudo, observamos que alguns animais em ambos os
grupos n˜ ao atingiram os crit´ erios de aprendizagem, mas a propor¸c˜ ao entre os animais
que aprenderam e n˜ ao aprenderam n˜ ao foi diferente entre os grupos (teste de Fisher,
p=0,6285), Gr´ afico 6B, sugerindo que o grupo experimental n˜ ao exibiu preju´ızo na apren-
dizagem associativa visuo-espacial. A frequˆ encia de refor¸co cont´ınuo (CRF) aumentou
progressivamente no decorrer das sess˜ oes (F (3,36) = 9,515, p < 0,0001) e n˜ ao diferiu
entre os grupos (F (1,36) = 0,01855, p = 0,8939), Gr´ afico 6C, sugerindo que houve a
consolida¸c˜ ao da mem´ oria. O tempo para extin¸c˜ ao do comportamento n˜ ao foi estatistica-
mente diferente entre os grupos, (t= 0,5968, gl= 12, p= 0,5434), sugerindo que o grupo
experimental n˜ ao apresentou comportamento perseverante.
1 o c i f á r
G : Condicionament o operante.
Os dados s˜ ao expressos como m´ edia + erro padr˜ ao dos grupos CTR (n=6) e
experimental (n=8). O n´ umero de sess˜ oes para aquisi¸c˜ ao do comportamento operante (A) e propor¸c˜ ao de animais que alcan¸caram os crit´ erios de aprendizagem (B) ao final das 15 sess˜ oes para diferiu entre os grupos. O n´ umero de press˜ oes a barra no refor¸co cont´ınuo (C) e o tempo para extin¸c˜ ao do comportamento operante (D) n˜ ao diferiu entre os grupos.
No treinamento discriminativo, o percentual de respostas corretas ao longo das sess˜ oes
n˜ ao diferiu entre os grupos (F[1, 108] = 2,12, p = 0,17) e aumentou gradualmente no decor-
rer das sess˜ oes (F[9, 108] = 9,148, p < 0,0001), Gr´ afico 7A. O n´ umero de press˜ oes corretas
e incorretas ` a barra foi mensurada ao longo das sess˜ oes. As respostas corretas n˜ ao foram
estatisticamente diferentes entre os grupos (F[9, 108]= 0,99, p= 0,33) e aumentaram
gradualmente ao longo das sess˜ oes (F[9, 108]= 8,71, p < 0,0001) gr´ afico 2B. Concomi-
tantemente, as respostas incorretas reduziram gradualmente (F[9, 108]= 5,75, p<0,0001),
mas n˜ ao foram diferentes entre os grupos (F[9, 108] = 2,32, p = 0,15), gr´ afico 2B. Os
dados sugerem que os animais experimentais n˜ ao apresentaram preju´ızo na mem´ oria de
trabalho e nem comportamento perseverante.
2 o c i f á r
G : Condicionament o operant e n o treinament o discriminativo.
Os dados s˜ ao expressos como m´ edia + erro padr˜ ao dos grupos CTR (n=6) e experi mental (n=8). O percentual de respostas corretas (A) aumentou progressivamente para ambos os grupos ao longo das sess˜ oes. O n´ umero de respostas corretas aumentou e de incorretas diminui (B) igualmente para ambos os grupos.
5.2 Labirinto em T
Na alternˆ ancia for¸cada, o percentual de respostas corretas aumentou no decorrer das sess˜ oes (F(3,69)=4,32, p=0,0075), n˜ ao diferiu entre os grupos (F(1,69) = 0,4582, p = 0,505) e n˜ ao houve intera¸c˜ ao entre os fatores (F(3,69) = 0,2936, p = 0,8299), Gr´ afico 7A.
O n´ umero de iscas coletas aumentou gradualmente no decorrer das sess˜ oes ((F(3,69) =
13,89, p < 0,0001), n˜ ao diferiu entre os grupos (F(1,69) = 1,052, p = 0,32) e n˜ ao houve
intera¸c˜ ao entre os fatores (F(3,69) = 1,06, p = 0,3748), 7B. Os dados sugerem que a
mem´ oria de trabalho e a motiva¸c˜ ao est˜ ao preservadas nos animais experimentais.
3 o c i f á r
G : Labirinto em T – Alternˆ ancia for¸cada.
Os dados s˜ ao expressos como m´ edia + erro padr˜ ao dos grupos CTR (n=11) e
experimental (n=14). Percentual de respostas corretas (A) e o n´ umero de recompensas coletadas (B) n˜ ao diferiram entre os grupos, mas aumentaram gradualmente ao longo das sess˜ oes para ambos os grupos.
Na discrimina¸c˜ ao esquerda – direita, o percentual de respostas corretas n˜ ao diferiu en-
tre os grupos (F(1,69)=1,58, p= 0,221) e aumentou gradualmente para ambos os grupos no
decorrer das sess˜ oes (F(9,69)=10,33, p<0,0001), Gr´ afico 9A. O n´ umero de iscas coletadas
aumentou gradualmente entre as sess˜ oes (F(9,69)=11,09, p¡0,0001) e n˜ ao diferiu entre
os grupos ((F(1,69) = 1,71, p=0,2036), Gr´ afico 9B. N˜ ao foram observadas diferen¸cas na
propor¸c˜ ao de animais entre os grupos que alcan¸caram os crit´ erios de desempenho m´ınimo
ao final das 4 sess˜ oes (teste de Fisher, P=1000, NS), Gr´ afico 9C. Os dados sugerem que
a mem´ oria de referˆ encia e a motiva¸c˜ ao est˜ ao preservadas nos animais submetidos ao SE
neonatal.
4 o c i f á r
G : Discrimina¸c˜ ao esquerda-direita no labirinto em T.
Os dados s˜ ao expressos como m´ edia + erro padr˜ ao dos grupos CTR (n = 11) e
experimental (n = 14). Percentual de respostas corretas (A) e o n´ umero de recompensas coletadas (B) n˜ ao diferiram entre os grupos, mas aumentaram gradualmente ao longo das sess˜ oes. A propor¸c˜ ao de animais que atingiram os crit´ erios de aprendizagem n˜ ao diferiu entre os grupos (C).
Esta etapa do teste ´ e semelhante a anterior, contudo o bra¸co alvo passou a ser o
extremo oposto. Considerando que a mem´ oria de referˆ encia est´ a sujeita ` a consolida¸c˜ ao,
ou seja, estabiliza¸c˜ ao progressiva ao longo do tempo, avaliamos nesta etapa a flexibilidade
comportamental frente ` a nova rotina. O percentual de respostas corretas n˜ ao diferiu entre
os grupos (F(1,69)=3,877, p= 0,0611) e aumentou gradualmente para ambos os grupos no
decorrer das sess˜ oes (F(9,69)=37,21, p<0,0001), 10A. O n´ umero de alimentos coletados
aumentou gradualmente entre as sess˜ oes (F(9,69)=25,90, p<0,0001), mas n˜ ao diferiu entre
os grupos ((F(1,69) = 1,53, p = 0,2365), tampouco se observou intera¸c˜ ao entre os fatores
(F(9,69) = 1,047, p = 0,3773), Gr´ afico 10B. N˜ ao foram observadas diferen¸cas na propor¸c˜ ao de animais entre os grupos que alcan¸caram crit´ erio de desempenho m´ınimo ao final das sess˜ oes (teste de Fisher, P=1000, NS), 10C. Os dados sugerem que os animais do grupo experimental n˜ ao exibiram preju´ızo na flexibilidade cognitiva.
: 5 o c i f á r
G Flexibilidade cognitiva no labirinto em T.
Os dados s˜ ao expressos como m´ edia + erro padr˜ ao dos grupos CTR (n = 11) e
experimental (n = 14). Percentual de respostas corretas (A) e o n´ umero de recompensas
coletas (B) n˜ ao diferiram entre os grupos, mas aumentaram gradualmente ao longo das
sess˜ oes. A propor¸c˜ ao de animais que atingiram os crit´ erios de aprendizagem n˜ ao diferiu
entre os grupos (C).
6 DISCUSS ˜ AO
O objetivo deste estudo foi investigar a fun¸c˜ ao cognitiva em ratos adultos machos submetidos a um ´ unico epis´ odio de SE neonatal. Os dados demonstraram claramente que um ´ unico epis´ odio de SE neonatal n˜ ao interferiu na aprendizagem associativa, na mem´ oria de longo prazo, nas mem´ orias de trabalho e de referˆ encia e na flexibilidade comportamental. Esses resultados corroboram com os de Kleen et al. (2011), que n˜ ao observaram d´ eficit na aprendizagem associada avaliada pela tarefa de condicionamento operante em animais sujeitos ` as convuls˜ oes induzidas por flurotil, mas encontraram um leve comprometimento da flexibilidade comportamental. No trabalho de Kleen et al.
(2011), a flexibilidade comportamental foi avaliada usando duas medidas: o n´ umero de vezes que os ratos passaram de uma alavanca para outra (esquerda e direita) e o tempo gasto na alavanca de preferˆ encia. Para o primeiro crit´ erio n˜ ao houve diferen¸ca entre os grupos, mas para o segundo, o grupo experimental exibiu uma assimetria de preferˆ encia de alavanca, sugerindo comportamento perseverante. A diferen¸ca entre os resultados relatados por Kleen et al. (2011) com os do presente trabalho pode ser atribu´ıda a maior complexidade da tarefa, propiciada pelas caracter´ısticas do equipamento utilizado. O aparato utilizado por Kleen et al. (2011) possu´ıa duas barras de press˜ ao, e o nosso aparato possui apenas uma barra.
O impacto das convuls˜ oes no in´ıcio desenvolvimento sobre as fun¸c˜ oes cognitivas em longo prazo ainda ´ e motivo de controv´ ersia. Por exemplo, (SOGAWA et al., 2001; SAN- TOS et al., 2000a; LANDROT et al., 2001; KARNAM et al., 2009; NISHIMURA; GU;
SWANN, 2011; LUGO; SWANN; ANDERSON, 2014) relataram preju´ızo na aprendiza-
gem visuo-espacial no labirinto aqu´ atico de Morris e no labirinto radial, ambas tarefas
dependentes do hipocampo. No entanto, tamb´ em foi relatado ausˆ encia de d´ eficits na
aprendizagem visuo-espacial avaliada no labirinto aqu´ atico de Morris (CORNEJO et al.,
2007; BARRY et al., 2016), no reconhecimento de objeto e no condicionamento ao medo
(CORNEJO et al., 2007). Levantamos o questionamento que o protocolo utilizado para
a indu¸c˜ ao das convuls˜ oes tem um papel crucial na circuitaria cerebral, seja por efeito di-
reto ou por adapta¸c˜ ao ao insulto inicial, com consequˆ encias tardias sobre a cogni¸c˜ ao. Por
exemplo, na pesquisa de Sogawa et al. (2001) os animais foram expostos a 45 crises induzi-
das pelo flurotil de P0–P9. Al´ em do preju´ızo cognitivo na aprendizagem visuo-espacial,
observou-se brotamento das fibras musgosas na regi˜ ao CA3 e supragranular do giro den- teado e aumento da express˜ ao dos receptores glutamat´ ergicos (GluR1 e NMDA). Santos et al. (2000b) induziram trˆ es epis´ odios consecutivos de SE neonatal com pilocarpina em P7, P8 e P9. Neste estudo, os autores relataram que os animais controles aprenderam o condicionamento operante na caixa de Skinner em at´ e 3 dias, e os animais experimentais n˜ ao aprenderam.
Utilizando o mesmo protocolo de Santos et al. (2000b), Silva et al. (2005) observaram altera¸c˜ ao do desenvolvimento da microcircuitaria cortical, revelado pela redu¸c˜ ao do pro- cesso de apoptose na regi˜ ao neocortical que foi acompanhado pelo aumento da imunore- atividade para parvalbumina nos interneurˆ onios gaba´ ergicos. Os autores levantaram a hip´ otese que os interneurˆ onios gaba´ ergicos programados para serem eliminados pelo pro- cesso de poda neuronal foram preservados e poderiam estabelecer conex˜ oes anˆ omalas in- tracorticiais e com regi˜ oes subcorticais, provocando um desequil´ıbrio da neurotransmiss˜ ao excitat´ oria e inibit´ oria.
Landrot et al. (2001) submeteram os animais de P0 a P12 ` a 55 crises induzidas pelo flurotil. A semelhan¸ca do observado por Sogawa et al. (2001), a an´ alise histol´ ogica revelou brotamento das fibras musgosas na regi˜ ao CA3 da forma¸c˜ ao hipocampal e na camada granular do giro denteado, bem como preju´ızo do desempenho no labirinto aqu´ atico de Morris. Assim, se um ´ unico epis´ odio de SE produz disfun¸c˜ ao cognitiva, o preju´ızo deve ser leve e os protocolos utilizados neste estudo n˜ ao foram suficientemente sens´ıveis para captar o d´ eficit ou que o d´ eficit foi superado ao longo do tempo. Em rela¸c˜ ao ` a primeira possibilidade, Kleen et al. (2011) encontraram d´ eficit de flexibilidade comportamental somente quando foi analisada a assimetria de preferˆ encia de alavanca no condicionamento operante, sugerindo que s˜ ao necess´ arios protocolos mais sens´ıveis para a avalia¸c˜ ao de d´ eficits leves.
Em rela¸c˜ ao ` a segunda possibilidade, Nishimura, Gu e Swann (2011) relataram em
animais submetidos ao status Epilepticus induzido por ´ acido Ca´ınico em PN35, compro-
metimento no labirinto aqu´ atico de Morris quando os animais foram avaliados em PN46-49
ou PN60-PN63, mas sem d´ eficits quando testados em idades mais avan¸cadas. Em nosso
estudo, os testes comportamentais come¸caram em PN60 e terminaram em PN210, e se
alguma disfun¸c˜ ao cognitiva esteve presente, ela foi superada antes dos animais serem
testados.
No que se refere ` as convuls˜ oes neonatais, o protocolo mais utilizado emprega o flurotil e cobre todo o per´ıodo neonatal ou al´ em dele, o que poderia contribuir para a disfun¸c˜ ao cognitiva. Nesse sentido, levantou-se a suposi¸c˜ ao de que um ´ unico epis´ odio de SE induzido por pilocarpina n˜ ao afeta a fun¸c˜ ao cognitiva, ou que o efeito ´ e leve ou dif´ıcil de detectar, exceto sob uma tarefa cognitiva de alta demanda. Para testar essa hip´ otese, estudos posteriores ser˜ ao conduzidos em uma tarefa de maior complexidade cognitiva, tarefa de tempo de rea¸c˜ ao de uma s´ erie de 5 escolhas (5CSRT).
Apesar de n˜ ao ter sido observado preju´ızo cognitivo mensur´ avel, estudos anteriores do grupo, que utilizaram o mesmo tipo de animal, com a mesma idade, que submeteram seus animais com a mesma dose de pilocarpina mostraram que um ´ unico epis´ odio de SE produz preju´ızo na sociabilidade e comportamento do tipo ansioso (CASTELHANO et al., 2010; CASTELHANO et al., 2013; CASTELHANO et al., 2015; LEITE; CASTELHANO;
CYSNEIROS, 2016), sugerindo que a circuitaria envolvida com a sociabilidade ´ e mais
vulner´ avel ` as crises neonatais que aquela envolvida com a fun¸c˜ ao cognitiva.
7 CONCLUS ˜ AO
Este estudo demonstrou que um ´ unico epis´ odio SE neonatal induzido pela pilocarpina
n˜ ao impactou a aprendizagem associativa, a mem´ oria de longo prazo, as mem´ orias de
trabalho e de referˆ encia e a flexibilidade comportamental.
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APˆ ENDICE I
Letter to the Editor
Single neonatalstatus epilepticusdoes not impair cognitive function in rats
To the Editor:
It is common sense that cognitive impairment is one of the most important and distressing aspects of epilepsy[1]. Thus, recent clinical findings suggest that the developing brain may be vulnerable to the effects of intractable seizure disorders with subsequent adverse
neurodevelopmental consequences, which has been mostly attributed to its underlying etiology[1]. However, experimental studies show that a single episode ofstatus epilepticus(SE) in rodents produces an autistic phenotype, characterized by social play impairment, low prefer- ence by novelty and deficit in social discrimination[2–5]as well as multiple seizures[6–8]. As the extension of deleterious effects of a single neonatal SE on brain development is not fully understood, we investi- gated cognitive function in adult male rats subjected to a single episode of neonatal SE using two well-standardized paradigms, Operant conditioning and T maze, a prefrontal/hippocampus-dependent tasks.
Operant Conditioning task has been widely used to assess associate Epilepsy & Behavior 72 (2017) 200–202
CTR EXP
0 2 4 6 8 10
A
Sessions (number)
CTR EXP
0 2 4 6 8
10 Y
N
B
Frequency
CRF1 CRF2 CRF3 CRF4
0 50 100 150 200
250 CTR
EXP
C
Number of press lever
CRT EXP
0 5 10 15 20 25
D
Time (s)
0 2 4 6 8 10
0 20 40 60 80
100 CTR
EXP
E
Sessions
Correct response (%)
0 2 4 6 8 10
0 50 100 150 200
250 CTR- CORRECTS
CTR- INCORRECTS EXP-CORRECTS EXP- INCORECTS
F
Sessions
Lever presses (units)
Operant conditioning
Fig. 1.Operant conditioning. The data are expressed as mean ± stand error of control (CTR, n = 6) and experimental (EXP, n = 8) groups. The number of sessions for associative learning (A) the proportion of animals that reach and did not reach the criteria (B), the number lever presses on continuous reinforcement—CRF (C), and the time for extinction (D), correct response in percentage (E) and number of lever presses discriminative stimuli (F). No differences were found between groups for all parameters analyzed.
http://dx.doi.org/10.1016/j.yebeh.2017.04.031
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Epilepsy & Behavior
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