UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Farmacêuticas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

MARIANA CRISTINA DA SILVA

AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO DO TAMANDUÁ-BANDEIRA

(Myrmecophaga tridactyla) A AGROTÓXICOS NO CERRADO BRASILEIRO

Campinas

2020

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AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO DO TAMANDUÁ-BANDEIRA

(Myrmecophaga tridactyla) A AGROTÓXICOS NO CERRADO BRASILEIRO

ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ LUIZ DA COSTA

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARIANA CRISTINA DA SILVA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ LUIZ DA COSTA.

Campinas

2020

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na Área de Concentração Ciências Farmacêuticas - Insumos Farmacêuticos Naturais, Biotecnológicos e Sintéticos.

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Prof. Dr. José Luiz da Costa (Orientador)

Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho (Faculdade de Ciências Farmacêuticas – FCF/UNICAMP)

Profa. Dra. Marina Franco Maggi Tavares (Instituto de Química – IQ/Universidade de São Paulo)

A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pela aluna MARIANA CRISTINA DA

SILVA, aprovada pela Comissão Julgadora em 20 de fevereiro de 2020.

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Aos meus pais, Ana e Paulo, e à minha irmã Marília, pelo apoio incondicional.

Ao meu orientador, Prof. Dr. José Luiz, pela orientação e oportunidade concedida.

À equipe do Projeto Bandeiras e Rodovias: Prof. Dr. Arnaud Desbiez, Débora Yogui e Mário Alves, pela oportunidade de fazer parte deste trabalho.

Aos professores doutores João Ernesto de Carvalho, Marina Tavares, Rodrigo Catharino, Paulo Rosa e Fábio Bucaretchi, por terem aceitado participar desta banca.

À toda equipe do Laboratório de Toxicologia Analítica, pelo suporte diário.

À UNICAMP, pela experiência e aprendizado proporcionados.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 - Processo 39-P-24091/2018.

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acumular-se na biota, através da cadeia alimentar, podendo causar desequilíbrio ecológico. A alimentação dos tamanduás-bandeira é constituída principalmente de formigas e cupins, e a captura destes se dá através da língua. O tamanduá-bandeira come até 30 mil formigas e cupins por dia e, portanto, precisa de variados habitats para encontrar esta quantidade necessária de alimento. Assim, acredita-se que estes animais estão expostos a agrotóxicos utilizados nos cultivos agrícolas na região do Cerrado brasileiro. Este trabalho tem por objetivo avaliar a exposição do tamanduá-bandeira a agrotóxicos utilizados no Cerrado. Foi avaliada a exposição a agrotóxicos através de análises toxicológicas realizadas em amostras de sangue post mortem de animais atropelados em rodovias do estado do Mato Grosso do Sul. Também foram analisadas amostras de sangue de animais vivos, capturados e monitorados por coletes de GPS como parte do Projeto Bandeiras e Rodovias. As amostras foram armazenadas sob congelamento (-20 ºC) desde a coleta até o momento da análise. O método foi validado seguindo as recomendações do Scientific Working Group for Forensic

Toxicology para análises qualitativas e quantitativas (SWGTOX). Os agrotóxicos investigados

são aqueles dos principais cultivos do Cerrado (grãos, eucalipto, cana-de-açúcar e pastagens). As amostras foram submetidas ao método de extração QuEChERS (quick, easy, cheap,

effective, rugged and safe). Trata-se de uma extração simples, utilizando acetonitrila seguida

de uma etapa de limpeza do extrato. Dentre as vantagens deste método, destacam-se a sensibilidade na detecção de substâncias de diferentes classes químicas em um único método, a pouca quantidade de solvente utilizada e a rápida execução. Após a extração, as amostras foram analisadas em cromatógrafo líquido acoplado a espectrômetro de massas sequencial (LC-MS/MS) modelo LCMS8060 (Shimadzu, Kyoto, Japão). Oito agrotóxicos (2,4-D, aldicarbe, atrazina, carbofurano, clorpirifós, fentiona, mevinfós e fipronil) e o produto de transformação do aldicarbe (aldicarbe sulfona) foram analisados. O método foi otimizado em monitoramento de reações múltiplas (MRM). O método proposto foi validado e aplicado para as análises de sangue, a fim de se avaliar a exposição do tamanduá-bandeira aos agrotóxicos selecionados. A linearidade foi avaliada entre as concentrações de 5 ng/mL e 1000 ng/mL, exceto para o 2,4-D, que foi avaliada entre 25 ng/mL e 5000 ng/mL. Para cinco dias de análise, a curva analítica apresentou r² maior que 0,98 (1/x2), imprecisão e inexatidão menor que 20% para todos os compostos. A recuperação variou entre 10,2% e 31,9%, enquanto o efeito matriz foi melhor que 38,1%, excetuando-se o clorpirifós e a fentiona. Foram analisadas 64 amostras, sendo 27 amostras post mortem e 37 amostras de animais vivos monitorados por GPS. Os compostos selecionados não foram detectados nas amostras analisadas. Além disso, o método proposto foi avaliado quanto à correlação de concentração entre sangue total e plasma para ser utilizado em rotina no laboratório para confirmação de suspeitas de intoxicações por agrotóxicos de pacientes que são admitidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP. O método mostrou correlação linear entre as duas matrizes testadas (r² maior que 0,99 (1/x²). A recuperação variou entre 13,9% e 24,8%, enquanto o efeito matriz foi melhor que 41,2%, excetuando-se o clorpirifós e a fentiona. Foram analisadas três amostras de casos de tentativa de suicídio, das quais duas confirmaram intoxicação por aldicarbe (aldicarbe e aldicarbe sulfona foram detectados) e a terceira confirmou intoxicação por carbofurano.

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accumulating in biota, through the food chain, which can cause ecological imbalance. The feeding of giant anteaters consists mainly of ants and termites, and their capture is done through the tongue. The giant anteater eats up to 30,000 ants and termites a day and therefore needs a variety of habitats to find this necessary amount of food. Thus, it is believed that these animals are exposed to pesticides used in agricultural crops in the Brazilian Cerrado region. This work aims to evaluate the exposure of the giant anteater to pesticides used in the Cerrado. Exposure to pesticides was assessed through toxicological analyzes carried out on

post mortem blood samples from animals found in highways in the state of Mato Grosso do

Sul. Also blood samples from live animals, captured and monitored by GPS vests as part of the Flags and Highways Project were analyzed. The samples were stored under freezing (-20 ºC) from collection to the moment of analysis. The method was validated following the recommendations of the Scientific Working Group for Forensic Toxicology for qualitative and quantitative analyzes (SWGTOX). The investigated pesticides are those of the main Cerrado crops (grains, eucalyptus, sugar cane and pastures). The samples were submitted to the

QuEChERS extraction method (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe). It is a simple

extraction, using acetonitrile followed by an extract cleaning step. Among the advantages of this method, stand out the sensitivity in detecting substances of different chemical classes in a single method, the small amount of solvent used and the fast execution. After extraction, the samples were analyzed in a liquid chromatograph tandem-mass spectrometer (LC-MS/MS) model LCMS8060 (Shimadzu, Kyoto, Japan). The total of 8 pesticides (2,4-D, aldicarb, atrazine, carbofuran, chlorpyrifos, fentiona, mevinfós and fipronil) and the aldicarb transformation product (aldicarb sulfone) were analysed. The method was optimized in multiple reaction monitoring (MRM). The proposed method was validated and applied for blood tests, in order to assess the exposure of the giant anteater to the selected pesticides. Linearity was assessed between the concentrations of 5 ng/mL and 1000 ng/mL, except for 2,4-D, which was evaluated between 25 ng/mL and 5000 ng/mL. For five days of analysis, the analytical curve showed r² value greater than 0.98 (1/x2), imprecision and inaccuracy less than 20% for all compounds. The recovery varied between 10.2% and 31.9%, while the matrix effect was better than 38.1%, except for chlorpyrifos and fenthion. 64 samples were analyzed, being 27 post mortem samples and 37 samples of live animals monitored by GPS. The selected compounds were not detected in the analyzed samples. In addition, the proposed method was evaluated for concentration correlation between whole blood and plasma to be used routinely in the laboratory to confirm suspected pesticide poisoning in patients admitted in the Hospital de Clínicas of UNICAMP. The method showed a linear correlation between the two matrices tested (r² value greater than 0.99 (1/x²). Recovery varied between 13.9% and 24.8%, while the matrix effect was better than 41.2%, except for chlorpyrifos and fenthion. Three samples of suicide attempt cases were analyzed, which two of them confirmed intoxication by aldicarb (aldicarb and aldicarb sulfone were detected) and the third confirmed carbofuran intoxication.

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Figura 2. Sinapse colinérgica na presença e na ausência de um inibidor da AChE ... 15

Figura 3. Ação do fipronil (fenilpirazol) no receptor GABA ... 15

Figura 4. (A) Características dos canais regulados pela voltagem de sódio. (B) Neurônio em um estado excitado ocasionado pelo influxo de sódio ... 16

Figura 5. (A) Mudança na estrutura celular da planta durante elongação. (B) Mecanismo proposto para a perda da parede celular em células vegetais ... 17

Figura 6. Reação de oxidação-redução do paraquat ... 17

Figura 7. Esquema do fotossistema II. ... 18

Figura 8. Metabolismo do agrotóxico carbamato aldicarbe em ratos. ... 19

Figura 9. Estruturas químicas de agrotóxicos utilizados nas principais lavouras do Cerrado brasileiro. ... 23

Figura 10. (A) Captura de tamanduá-bandeira para colocar colete GPS. (B) Monitoramento do tamanduá-bandeira “Scott” através de colete GPS. ... 25

Figura 11. Exemplo de carcaça fresca de tamanduá-bandeira encontrado atropelado na rodovia BR-262 ... 25

Figura 12. Cromatogramas dos íons extraídos obtidos pela análise de amostra de sangue adicionado de padrão dos praguicidas investigados na concentração de 5 ng/mL (LOQ) e também do padrão interno (diazepam-d5 200 ng/mL) e submetida ao método descrito. ... 30

Figura 13. Cromatograma dos íons extraídos obtido pela análise de amostra de sangue adicionado de padrão dos praguicidas investigados na concentração de 5 ng/mL (LOQ) e também do padrão interno (diazepam-d5 200 ng/mL) e submetida ao método descrito. ... 31

Figura 14. Notificação de intoxicações por agrotóxicos em tentativas de suicídio, segundo evolução dos casos – Brasil (2007-2015) ... 37

Figura 15. Cromatogramas dos íons extraídos obtidos pela análise de amostra de plasma adicionado de padrão dos praguicidas investigados na concentração de 5 ng/mL (LOQ) e também do padrão interno (diazepam-d5 200 ng/mL) e submetida ao método descrito. ... 42

Figura 16. Cromatograma obtido pela análise de amostra de sangue adicionado de padrão dos praguicidas investigados na concentração de 5 ng/mL (LOQ) e também do padrão interno (diazepam-d5 200 ng/mL) e submetida ao método descrito... 43

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submetidas ao método descrito. ... 44

Figura 18. Cromatograma para confirmação de intoxicação por agrotóxicos (caso 1) ... 46

Figura 19. Cromatograma para confirmação de intoxicação por agrotóxicos (caso 2) ... 47

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Tabela 1. Agrotóxicos utilizados nas principais lavouras do Cerrado brasileiro. ... 23 Tabela 2. Condições instrumentais do método de análise de praguicidas em amostras de sangue por LC-MS/MS. ... 29 Tabela 3. Log P e dados da curva analítica dos analitos referentes a cinco dias de análise. .... 31 Tabela 4. Imprecisão intra-dia, imprecisão inter-dia e inexatidão do método. ... 32 Tabela 5. Recuperação e efeito matriz do método... 32 Tabela 6. Relação de amostras reais analisadas. ... 33 Tabela 7. Correlação das curvas analíticas referentes aos compostos investigados referentes a um dia de análise comparativa entre as matrizes sangue e plasma ... 45 Tabela 8. Recuperação e efeito matriz do método utilizando plasma humano como matriz. .. 45 Tabela 9. Quantificação dos agrotóxicos encontrados em três amostras de casos de tentativa de suicídio. ... 48

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2,4-D - Ácido diclorofenoxiacético ACh - Acetilcolina

AChE – Enzima Acetilcolinesterase

AGROFIT - Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária CA – Controle alto

CAAE – Certificação de Apresentação para Apreciação Ética CATI - Coordenadoria de Assistência Técnica Integral CB – Controle baixo

CIATOX - Centro de Informação e Assistência Toxicológica Cl- - Íon cloro

CM – Controle médio CoA – Coenzima A

CV – Coeficiente de variação DDT – Diclorodifeniltricloroetano

ELISA - Enzyme-Linked ImunosSorbent Assay

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária GABA – ácido gama-aminobutírico

GPS – Sistema de Posicionamento Global

HC-UNICAMP – Hospital de Clínicas da UNICAMP HPLC – High Performance Liquid Chromatography IAChE – Inibidor da Enzima Acetilcolinesterase ICAS - Instituto de Conservação de Animais Silvestres IPE - Instituto de Pesquisas Ecológicas

IUCN - International Union for Conservation of Nature and Natural Resources kPa - kiloPascal

kV - kilovolt

LC-MS/MS - Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry L/min – Litros por minuto

LNC - Lista Nacional de Notificação Compulsória LOQ – Limite de quantificação

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MRM – Monitoramento de reações múltiplas mv – milivolts m/z – massa/carga N2 – gás nitrogênio Na+ - Íon sódio ND – Não detectado

OMS – Organização Mundial da Saúde

OPAS – Organização Pan-Americana de Saúde pH – Potencial hidrogeniônico

PI –Padrão interno QB – plastoquinona QB

QuEChERS - Quick, easy, cheap, effective, rugged and safe

SINAN - Sistema Nacional de Agravos de Notificação SNC – Sistema nervoso central

SUS - Sistema Único de Saúde

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Capítulo I – Desenvolvimento de método analítico por QuEChERS e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial para verificação da exposição do

tamanduá-bandeira a agrotóxicos ... 22

1.Introdução ... 22

1.1. O Tamanduá-bandeira e o Cerrado brasileiro... 22

1.2. Projeto Bandeiras e Rodovias ... 24

1.3. Justificativa ... 26 2.Objetivo ... 26 3.Materiais e Métodos ... 26 3.1. Reagentes ... 26 3.2. Amostras ... 27 3.3. Preparo da amostra ... 27 3.4. Instrumentação analítica ... 28 4.Resultados ... 29 5.Discussão ... 34 6.Conclusão ... 36

Capítulo II – Determinação de agrotóxicos em amostras de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP após tentativa de suicídio ... 37

1.Introdução ... 37 2.Objetivo ... 38 3.Materiais e Métodos ... 38 3.1. Reagentes ... 38 3.2. Amostras ... 39 3.3. Preparo da amostra ... 39 3.4. Instrumentação analítica ... 40 4.Resultados ... 41 5.Discussão ... 48 6.Conclusão ... 50 7.Conclusão Geral ... 50 8.Referências bibliográficas ... 52 9. Anexos ... 63

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1. Introdução

Segundo o Decreto Nº 4.074 de 04 de janeiro de 2002, os agrotóxicos são produtos destinados ao uso na produção, armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, cujo objetivo é a proteção de um ecossistema da ação danosa de seres vivos e substâncias consideradas nocivas (1).

Os agrotóxicos podem ser classificados de diferentes maneiras, seja pela praga a ser controlada (inseticidas, herbicidas, fungicidas, nematicidas, cupinicidas, formicidas, etc), pela sua estrutura química (organofosforados, organoclorados, carbamatos, pirazóis, piretróides, piretrinas, triazinas, bipiridílios, entre outros), ou ainda, pelos dados de toxicidade aguda, cuja classificação no Brasil é realizada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em extremamente tóxico, altamente tóxico, moderadamente tóxico, pouco tóxico, improvável de causar dano agudo, ou não classificado (2).

Os agrotóxicos possuem diferentes mecanismos de ação, sendo responsáveis por diferentes manifestações clínicas no indivíduo. Alguns exemplos de mecanismos de ação dos agrotóxicos são:

1) inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE): esta enzima é responsável pela hidrólise da acetilcolina nas sinapses colinérgicas, conforme reação da Figura 1. O sistema colinérgico é encontrado no sistema nervoso central, sistema periférico autônomo e no sistema periférico somático (3,4).

Figura 1. Reação de síntese e hidrólise da acetilcolina (ACh) (4; figura adaptada).

Na presença de uma substância inibidora da enzima AChE, a acetilcolina não é hidrolisada, acumulando-se na fenda sináptica, conforme ilustrado na Figura 2, causando intensificação da transmissão colinérgica (4). Dentre as substâncias inibidoras da AChE, destacam-se os agrotóxicos das classes dos organofosforados e os carbamatos (3). A inibição da AChE pode ser irreversível, como nos casos de intoxicações por organofosforados, ou reversível, como nos carbamatos, porém ambos podem causar intoxicações igualmente graves (5). Os sintomas agudos iniciais são fraqueza, tontura e visão turva, e, posteriormente, vômitos, dificuldade respiratória e

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convulsões, entre outros sintomas (5).

Figura 2. Sinapse colinérgica na presença e na ausência de um inibidor da AChE (4).

2) bloqueio de canais de cloro mediados pelo GABA: neste grupo encontram-se as classes de agrotóxicos dos fenilpirazóis e ciclodienos (3). O GABA é uma substância responsável pelo controle do fluxo de íons cloro através de reação com uma proteína pós-sináptica com função inibitória (6,7). Os bloqueadores do canal de cloro, portanto, se ligam ao canal e bloqueiam a ativação deste receptor, provocando a não-inibição sináptica, causando assim a hiperexcitação do sistema nervoso central, conforme ilustrado na Figura 3. (6,7). Os sintomas agudos iniciais são irritabilidade e mal-estar, e posteriormente, tontura, náuseas e convulsões, entre outros (5).

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3) moduladores dos canais de sódio: neste grupo encontram-se as classes dos piretróides, das piretrinas, o DDT (diclorodifeniltricloroetano) e o metoxicloro (3). Estas substâncias atuam sobre os canais de sódio. O influxo de sódio através dos canais provoca a excitação do neurônio, causando assim a transmissão do potencial de ação, conforme ilustrado na Figura 4.

Figura 4. (A) Características dos canais regulados pela voltagem de sódio. (B) Neurônio em um

estado excitado ocasionado pelo influxo de sódio (8; figura adaptada).

Estes compostos bloqueiam os canais de sódio tanto na abertura quanto no fechamento, e consequentemente, prolongam a fase despolarizante, permitindo assim a entrada de íons sódio por mais tempo para o interior da célula (9-12). Os sintomas agudos de intoxicação são formigamento nas pálpebras e nos lábios, e irritação. Posteriormente, os sintomas encontrados são manchas na pele, coceira, excitação e convulsões (5).

4) mimetizadores de auxinas: são compostos reguladores de crescimento, que abrangem as classes de agrotóxicos dos ácidos fenoxicaboxílicos, ácidos benzoicos, entre outros (3,13). Destaca-se o composto 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético), que foi o primeiro composto orgânico sintetizado pela indústria a ser utilizado como herbicida seletivo (13,14). Acredita-se que este composto acidifica a parede celular da planta, induzindo à elongação celular, promovida por auxinas e giberilinas (14). Este alongamento desordenado ativa o metabolismo da planta e a leva ao esgotamento em concentrações baixas, enquanto que em concentrações altas a divisão celular e o crescimento são inibidos, estimulando a liberação de etileno (14). Desta forma, 2,4-D é um herbicida sistêmico, que se transloca pelo floema, suprimindo tanto o crescimento de raízes quanto das partes aéreas das plantas (13). A elongação celular induzida por auxina encontra-se

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ilustrada na Figura 5.

Figura 5. (A) Mudança na estrutura celular da planta durante elongação. (B) Mecanismo

proposto para a perda da parede celular em células vegetais (15; figura adaptada).

Em humanos, estes compostos podem causar sintomas agudos como perda de apetite, irritação da pele exposta e irritação do trato gastrintestinal, podendo levar a fasciculação muscular, convulsões e coma (5).

5) inibidores da fotossíntese no fotossistema I: dentro deste grupo encontra-se a classe dos bipiridílios, grupo de substâncias geradoras de espécies reativas de oxigênio. O principal representante desta classe é o herbicida paraquat. Sua ação como herbicida é de contato, inibindo a fotossíntese no fotossistema e produzindo radicais livres, que levam à morte das membranas e folhas celulares (3,16). No indivíduo, a intoxicação por paraquat pode levar ao estresse oxidativo (16), provocando fibrose pulmonar e morte (5). A reação de oxidação-redução do paraquat está ilustrada na Figura 6.

Figura 6. Reação de oxidação-redução do paraquat (17; figura adaptada).

6) inibidores da fotossíntese no fotossistema II: este grupo compreende as classes de agrotóxicos das triazinas, uracilas e fenilureias. O mecanismo de ação se dá pela ligação do agrotóxico a uma molécula receptora de elétrons denominada plastoquinona QB, causando o bloqueio do fluxo de elétrons. O acúmulo de elétrons gera radicais livres, que matam a planta

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devido à peroxidação de lipídeos na membrana (13). O esquema do fotossistema II, apresentando seus constituintes na ausência de um agrotóxico, está ilustrado na Figura 7, onde o fluxo de elétrons está livre, permitindo a realização da fotossíntese.

Figura 7. Esquema do fotossistema II. (18)

A toxicidade dos compostos presente neste grupo varia consideravelmente entre as moléculas (19). A atrazina, que pertence à classe das triazinas e é um dos compostos mais comercializados no Brasil, pode causar sintomas de envenenamento como dor abdominal, diarreia, irritação dérmica, entre outros, porém não há dados publicados sobre a toxicidade sistêmica aguda em humanos (20,21).

O uso generalizado dos agrotóxicos tem causado problemas de saúde e fatalidades em todo o mundo, muitas vezes devido à exposição ocupacional e as intoxicações acidentais ou intencionais (22). A intoxicação por agrotóxicos faz parte da Lista Nacional de Notificação Compulsória (LNC) do Sistema Único de Saúde (SUS), que deve ocorrer semanalmente (23). Foram registradas 84.206 notificações de intoxicação por agrotóxicos entre 2007 e 2015 pelo Sistema Nacional de Agravos de Notificação (SINAN), sendo os estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná e Pernambuco foram os estados que mais notificaram casos (20). Os raticidas tiveram a maior porcentagem dentre os agrotóxicos utilizados (42,1%), seguidos pelos agrotóxicos de uso agrícola (36,5%), agrotóxicos domésticos (11,4%), produtos veterinários (8%) e de uso em saúde pública (2%) (20). Dessas notificações, 53,6% foram decorrentes de

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tentativas de suicídio, seguidas pela exposição acidental (27,3%) e 19,1% por outras causas (20). Os fenômenos de bioacumulação e biomagnificação são de grande relevância para a avaliação de risco dos agrotóxicos e suas aplicações (24). Tem sido relatada, por exemplo, a bioacumulação de agrotóxicos em peixes devido à contaminação aquática (25). Esta bioacumulação também pode ser observada em produtos de origem animal como carnes e leite de animais que se alimentam de ração com traços de agrotóxicos (24). Portanto, no meio ambiente, os agrotóxicos podem contaminar a água e o solo e também acumular-se na biota, através da cadeia alimentar, podendo causar um desequilíbrio ecológico (26).

A biotransformação dos agrotóxicos ocorre através de enzimas existentes nas plantas, animais e microrganismos (27). Essas transformações podem resultar na geração de moléculas mais simples, porém a molécula original ainda pode ser encontrada se as condições do ambiente forem desfavoráveis à degradação (27). Segundo o Decreto Nº 4.074 de 04 de janeiro de 2002, os resíduos do uso de agrotóxicos são substâncias ou misturas remanescentes em alimentos ou no ambiente, tais como produtos de degradação, metabólitos, produtos de reação e impurezas (1). Na Figura 8 é possível observar, como exemplo, a biotransformação do aldicarbe em ratos.

Figura 8. Metabolismo do agrotóxico carbamato aldicarbe em ratos (28, figura adaptada).

Os métodos utilizados para a análise de agrotóxicos, em diferentes matrizes, são compostos por pelo menos duas etapas: preparo da amostra, cujo objetivo é o isolamento dos analitos de interesse, e a determinação dos analitos, de forma qualitativa ou quantitativa, frequentemente utilizando técnicas cromatográficas e eletroforéticas (29).

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As técnicas de extração líquido-líquido e em fase sólida são as mais citadas na literatura para análise de agrotóxicos em matrizes diversas (30-33). Técnicas de microextração, derivadas da extração líquido-líquido e em fase sólida vem ganhando destaque nos últimos anos para este tipo de análise (34-37).

Outra técnica de preparo de amostras que merece destaque é a conhecida comumente por QuEChERS, acrônimo de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro) (29). É composta pelas seguintes etapas: extração com solvente, partição em água através do uso de um sal e limpeza através de uso de um sorvente, sendo que esta última não é uma etapa obrigatória. (29, 38). Trata-se de uma técnica desenvolvida inicialmente para análise de resíduos de agrotóxicos em matrizes com baixo teor de gordura, como alimentos, porém, vem sendo utilizada e adaptada para a análise de diferentes tipos de analitos em diferentes tipos de matrizes (29,38-47).

Após o preparo de amostras, a determinação de agrotóxicos pode ser feita por diferentes técnicas. As técnicas imunológicas são métodos de detecção imunoquímicos, baseados na adaptação de técnicas de ELISA (Enzyme-Linked ImunosSorbent Assay) (48). Trata-se de uma forma rápida para a análise de amostras, contudo, possuem como fator limitante o aparecimento de reações cruzadas, impossibilitando a determinação do agrotóxico presente com precisão (48). Já as técnicas cromatográficas são baseadas em processos físico-químicos de separação de componentes de uma amostra, que se distribuem entre uma fase estacionária e uma fase móvel de acordo com suas propriedades químicas (29). As condições da cromatografia abrangem aspectos, como o tipo da coluna utilizada, temperatura da coluna, tipo de injeção de amostra, polaridade da fase estacionária, volume da amostra, entre outros. As técnicas cromatográficas são mais comumente utilizadas nas análises de agrotóxicos por apresentarem maior sensibilidade e especificidade quanto à metodologia, quando comparadas às demais (29). Dentre elas, destacam-se a cromatografia gasosa, que consiste no uso de fadestacam-se móvel gasosa, favorecendo a determinação de moléculas voláteis (29), e a cromatografia líquida, que consiste no uso de fase móvel líquida, possibilitando a determinação de moléculas termolábeis e não voláteis (29). A escolha da cromatografia a ser utilizada depende da estrutura química do analito e da sensibilidade e especificidade do método (29). A cromatografia acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) apresenta como vantagem maior detectabilidade e sensibilidade, permitindo a análise de multirresíduos de agrotóxicos simultaneamente (29). Através da obtenção de grande quantidade de informação estrutural, é possível a confirmação dos compostos analisados com exatidão e em concentrações baixas (29).

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capilar também podem ser utilizadas para análise de agrotóxicos (49-52).

A combinação de escolhas da técnica de preparo de amostra e do método de detecção é de suma importância para que se obtenha uma metodologia adequada para uma análise de agrotóxicos, e que, juntamente com o histórico da amostra e os sinais clínicos apresentados, permita o diagnóstico rápido e preciso das intoxicações encontradas na rotina laboratorial.

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Capítulo I – Desenvolvimento de método analítico por QuEChERS e

cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial para

verificação da exposição do tamanduá-bandeira a agrotóxicos

1. Introdução

1.1. O Tamanduá-bandeira e o Cerrado brasileiro

O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla), em inglês conhecido como “Giant

Anteater”) é um animal reconhecido facilmente no ambiente: possui pelagem característica, com

uma faixa dorsal preta com bordas brancas, além de um longo focinho para captura de alimento (53). Possui cerca de 2,20 metros de comprimento, podendo pesar até 45 kg. Sua atividade ocorre durante os períodos do dia com temperatura mais amena. Recebeu este nome devido à sua cauda lembrar uma bandeira, que utiliza para se cobrir no ambiente durante os períodos mais quentes do dia (53).

É um animal considerado “vulnerável” segundo a International Union for

Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN) (54). Um animal “vulnerável” é aquele

que atende pelo menos um dentre cinco critérios quantitativos que caracterizam uma redução populacional, e, portanto, possui alto risco de extinção na natureza. Estes critérios são: a) população em declínio (passado, presente e/ou projetado), b) tamanho do intervalo geográfico e fragmentação, declínio ou flutuações, c) tamanho populacional pequeno e fragmentação, declínio ou flutuações, d) população muito pequena ou distribuição muito restrita e e) análise quantitativa do risco de extinção (55).

As áreas de cerrado são o ambiente em que o tamanduá-bandeira é mais comumente encontrado (53). O Cerrado brasileiro é originalmente formado por formações florestais, savânicas e campestres (56). Trata-se de um bioma que vem sofrendo grandes alterações nos últimos anos devido à ocupação humana, causando grande perda do habitat do tamanduá-bandeira. Esta ocupação pode ser descrita pela expansão de novas áreas, que incluem o desmatamento, a construção de novas rodovias, o cultivo de grãos, de eucalipto, de cana-de-açúcar, e a produção de carne (57-59). Consequentemente, o uso de agrotóxicos aumentou na região devido a esta expansão agrícola. Os agrotóxicos que são utilizados nestas lavouras encontram-se na Tabela 1, que abrange substâncias herbicidas, formicidas e cupinicidas utilizados nesses cultivos. A Tabela 1 foi construída a partir da base de dados do Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários – AGROFIT (60).

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Tabela 1. Agrotóxicos utilizados nas principais lavouras do Cerrado brasileiro.

Substância Classe Milho Soja Eucalipto Pastagens Cana-de-açúcar 2,4-D* H X X X X Aldicarbe** A, I, N X Atrazina* H X X Carbofurano A, C, I, N X X Clorpirifós* A, F, I X X X Fipronil F,C X X X X X

Legenda: H: herbicida; F: formicida; A: acaricida; I: inseticida; N: nematicida; C: cupinicida. *Substâncias listadas entre as 10 mais comercializadas no Brasil, em 2014 (20). **Substâncias já encontradas em amostras de material biológico de antas coletadas na região do Mato Grosso do Sul (61).

Além das substâncias acima, outros três compostos são de relevância do Cerrado brasileiro para investigação: o mevinfós, inseticida que também foi encontrado em material biológico de antas da região (61), a fentiona, formicida e cupinicida utilizado nas plantações de algodão, que também é característica no Mato Grosso do Sul (20), e o aldicarbe sulfona, produto de transformação do aldicarbe (62).

As estruturas químicas dos agrotóxicos acima citados encontram-se na Figura 9. O composto fipronil apresenta isomeria óptica, enquanto o mevinfós apresenta isomeria geométrica.

Figura 9. Estruturas químicas de agrotóxicos utilizados nas principais lavouras do Cerrado

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A alimentação dos tamanduás-bandeira é constituída principalmente de formigas e cupins, e a captura destes se dá através da língua (53, 63). O tamanduá-bandeira come até 30 mil formigas e cupins por dia e, portanto, precisa de variados habitats para encontrar esta quantidade necessária de alimento (53). Assim, acredita-se que estes animais estão sendo expostos a agrotóxicos, principalmente herbicidas, inseticidas, formicidas e cupinicidas que são utilizados nos cultivos agrícolas na região do Cerrado brasileiro.

1.2. Projeto Bandeiras e Rodovias

Particularmente no Mato Grosso do Sul, os tamanduás-bandeira estão entre as espécies com maior incidência de atropelamentos nas rodovias. A rodovia BR-262, que liga os municípios de Campo Grande e Corumbá dentro do estado do Mato Grosso do Sul, é considerada não somente a rodovia mais mortal para a vida silvestre, como também é considerada uma das mais mortais do mundo (64). Em 2017, mais de 1000 atropelamentos de mamíferos de tamanho médio a grande foram quantificados (64,65).

Com o objetivo de entender melhor o impacto da expansão da malha viária na região do Cerrado brasileiro, foi criado o Projeto Bandeiras e Rodovias. Este projeto foi implementado pelo Instituto de Conservação de Animais Silvestres (ICAS), sediado em Campo Grande, e tem duração de quatro anos (janeiro de 2017 a dezembro de 2020).

De acordo com a Equipe do Projeto Bandeiras e Rodovias, este trabalho é constituído por três etapas:

1- Impacto das rodovias: realização da quantificação dos atropelamentos a fim de compreender o impacto que as rodovias causam nas populações de tamanduás, através de monitoramentos quinzenais em trechos específicos, sendo eles: rodovia BR-262, no trecho entre Campo Grande até a Ponte do Rio Paraguai; e rodovia MS-040 no trecho entre Campo Grande até Santa Rita do Pardo. Também são colocados coletes de GPS nos tamanduás-bandeira encontrados em circulação próximos a rodovias, como mostrado na Figura 10, a fim de entender quando, onde e como estes animais cruzam as rodovias.

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Figura 10. (A) Captura de tamanduá-bandeira para colocar colete GPS (arquivo Projeto

Bandeiras e Rodovias). Da esquerda para a direita: Danilo Kluyber (veterinário coordenador), Arnaud Desbiez (coordenador do Projeto Bandeiras e Rodovias), e Débora Yogui (médica veterinária). (B) Monitoramento do tamanduá-bandeira “Scott” através de colete GPS (arquivo

pessoal).

2 - Consequências das rodovias: entendimento da saúde e da densidade populacional da espécie, além da realização de necropsia de carcaças frescas encontradas no entorno das rodovias, exemplificadas na Figura 11. Nesta etapa é feita a coleta de materiais biológicos para avaliar o impacto do ambiente antropizado sobre os animais.

Figura 11. Exemplo de carcaça fresca de tamanduá-bandeira encontrado atropelado na rodovia

BR-262 (arquivo pessoal).

3- Manejo das rodovias: etapa final do Projeto, onde serão definidas estratégias para mitigar os atropelamentos de tamanduás-bandeira. Estas estratégias serão implementadas em novas rodovias ou em outras rodovias que estejam sofrendo o mesmo tipo de impacto.

O Projeto Bandeiras e Rodovias é financiado principalmente pela Fundação Segré. Os demais financiadores são: Zoo Conservation Outreach Group, Royal Zoological Society of

Scotland e o Instituto de Pesquisas Ecológicas (IPE) (59). O número da autorização SISBIO para

a realização do Projeto é 53798-10 (Anexo 1).

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1.3. Justificativa

Sabe-se que a expansão agropecuária traz impactos para a fauna silvestre. A expansão da malha viária, necessária para o escoamento dos produtos, tem como consequências o efeito de barreira, a perda e fragmentação do hábitat (66). No entanto, faltam estudos que objetivem entender detalhadamente outros impactos decorrentes dessa expansão, como a exposição de animais por agrotóxicos usados pela agropecuária, que podem ter efeitos negativos na saúde e reprodução destes. Considerando este aspecto, nota-se a relevância de realizar análises que possam quantificar este impacto nas populações de tamanduás-bandeira.

Desta forma, este trabalho representa uma das etapas analíticas do Projeto Bandeiras e Rodovias, e pretende mensurar a exposição do tamanduá-bandeira a agrotóxicos utilizados no Cerrado.

2. Objetivo

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a exposição do tamanduá-bandeira a agrotóxicos de diferentes classes, em especial formicidas e cupinicidas, através de análises toxicológicas realizadas em amostras de sangue coletadas post mortem de animais atropelados e amostras de sangue coletadas de animais monitorados por colete GPS que vivem na região de Cerrado brasileiro.

Para atingir este objetivo geral, foram definidos os seguintes objetivos específicos: 1) Desenvolver e validar o método analítico para determinação de praguicidas em amostras de sangue;

2) Analisar amostras coletadas pelo Projeto Bandeiras e Rodovias, utilizando o método validado.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais e reagentes

Os reagentes utilizados para preparo de amostras e análises cromatográficas já se encontravam disponíveis no Laboratório de Toxicologia Analítica, são eles: metanol e acetonitrila (grau HPLC, Merck), ácido fórmico (pureza 98-100%, Merck) formiato de amônio (pureza 99%, Merck), argônio (99,999%, Air Liquide), nitrogênio e ar sintético (gerador Peak Scientific), água ultrapurificada (sistema Milli-Q, Millipore, Bedford, EUA). Materiais de

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referência das substâncias investigadas, além da referência para uso como padrão interno, também se encontravam disponíveis no laboratório e foram adquiridos ou recebidos por doações de laboratórios parceiros. Foram utilizados os seguintes materiais de referencia: clorpirifós (99,9%, Flukar Analytical), fentiona (98,3%, Flukar Analytical), aldicarbe (99,5%, Aventis CropScience), aldicarbe sulfona (99%, Sigma Aldrich), atrazina (99%, Sigma Aldrich), diazepam-d5 (99%, Cerilliant, utilizado como padrão interno). Os compostos carbofurano (95,7%) e 2,4-D (99,5%) foram doados pela Coordenadoria de Assistência Técnica Integral (CATI). Os compostos fipronil (98,4%) e mevinfós (98,1%) foram doados pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).

3.2. Amostras

Foram analisadas 64 amostras de sangue coletadas na região do Mato Grosso do Sul pela equipe do Projeto Bandeiras e Rodovias, coordenada pelo Prof. Dr. Arnaud Desbiez, sendo 27 amostras post mortem de animais atropelados e 37 amostras de animais vivos monitorados por colete GPS. A equipe também foi responsável pelo envio das amostras à UNICAMP. As amostras coletadas foram armazenadas sob congelamento (-20 oC) desde a coleta até o momento da análise. O período de armazenamento das amostras foi de até 24 meses. Para desenvolvimento e validação do método, foram utilizadas amostras de sangue desfibrinado de cavalo, adquirido da empresa ANILAB.

3.3. Preparo de amostra

A técnica de preparo de amostra utilizada foi o QuEChERS. Foram utilizados 250 µL de sangue, que foram transferidos para um tubo de polipropileno. Durante o desenvolvimento e validação, adicionou-se na amostra “branco” 25 µL de solução contendo mistura dos padrões de praguicidas selecionados em diferentes concentrações. Em seguida, adicionou-se 25 µL de padrão interno (diazepam-d5, 200 ng/mL em metanol) e 500 µL de acetonitrila gelada, a fim de promover a precipitação de proteínas. Após 5 minutos em repouso, adicionou-se 100 mg de sal de QuEChERS (Q-sepTM, Restek®) composto por 80% de sulfato de magnésio e 20% de cloreto de sódio. Os tubos foram fechados, agitados por 10 min e centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos. A fase orgânica (125 µL) foi transferida para outro tubo de polipropileno contendo 375 µL da fase móvel aquosa. Após homogeneização, 100 μL desta diluição foram transferidos para uma placa de 96 poços. Dois microlitros da diluição foram injetados no sistema LC-MS/MS.

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3.4. Instrumentação analítica

Após a extração, as amostras foram analisadas em sistema de cromatografia líquida acoplado a espectrômetro de massas sequencial triploquadruplo (LC-MS/MS) modelo LCMS8060 (Shimadzu, Kyoto, Japão), disponível no Laboratório de Toxicologia Analítica. A separação foi realizada em coluna bifenil (Raptor, 100 x 2,1 mm, 2,7 µm, Restek®), termostatizada a 40ºC. As fases móveis são compostas por:

 Fase aquosa (A): solução aquosa contendo 2 mmol/L de formiato de amônio e 0,1% de ácido fórmico (v/v);

 Fase orgânica (B): metanol contendo 2 mmol/L de formiato de amônio e 0,1% de ácido fórmico (v/v).

A eluição do gradiente, com variação da concentração da fase móvel B ao longo da corrida, seguiu conforme citado abaixo:

 0 – 0,5 min: 5% fase móvel B  0,5 – 9,0 min: 100% fase móvel B  9,0 – 12,0 min: 100% fase móvel B  12,0 – 12,1 min: 5% fase móvel B

 12,1 – 15 min: Término do tempo de corrida

A vazão utilizada foi de 400 µL/min em uma corrida com duração de 15 minutos. O espectrômetro de massa com ionização electrospray operou nos modos positivo e negativo. Os parâmetros do equipamento utilizados no método foram: temperatura do bloco de aquecimento 400 °C; voltagem do ion spray 4,0 kV para ionização em modo positivo e -3,0 kV ionização em modo negativo; vazão do gás de nebulização (N2) 3 L/min; temperatura da linha de solvatação 250 °C; vazão do gás de secagem (N2) 10 L/min; vazão do gás de aquecimento (N2) 10 L/min; e pressão do gás de dissociação induzida por colisão (gás argônio) 270 kPa. O modo de aquisição foi o monitoramento de reações múltiplas (MRM). Para cada composto, duas transições MRM foram selecionadas, uma para quantificação e outra para confirmação da identificação (Tabela 2), utilizando-se a razão entre os MRM como critério de identificação (intervalo máximo de tolerância igual a 20%). Antes da análise das amostras reais, o método desenvolvido foi parcialmente validado seguindo as recomendações do Scientific Working Group for Forensic

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4. Resultados

As condições analíticas do método contendo os compostos selecionados para investigação nas amostras de tamanduá-bandeira foram otimizadas no LC-MS/MS. Os íons precursores e produtos, energias de colisão, modo de ionização e respectivos tempos de retenção dos compostos selecionados e do padrão interno são apresentados na Tabela 2.

O limite de detecção para os analitos investigados foi definido como 5 ng/mL, exceto para o 2,4-D, que foi cinco vezes maior (25 ng/mL). O limite de quantificação apresentou valor de concentração igual ao limite de detecção.

Tabela 2. Condições instrumentais do método de análise de praguicidas em amostras de sangue

por LC-MS/MS. Composto Íon Precursor m/z Íons produto* m/z Energia de Colisão (eV) Modo de ionização Tempo de retenção (min)

Aldicarbe sulfona 240 148 -15 Positivo 3,77

86 -22 Mevinfós 225 193 -8 Positivo 5,74 127 -16 Aldicarbe 208 116 -9 Positivo 5,80 89 -18 Atrazina 216 174 -17 Positivo 6,65 132 -23 Carbofurano 222 165 -13 Positivo 6,66 123 -22 2,4-D 219 161 13 Negativo 6,77 221 163 11 Fipronil 437 332 15 Negativo 7,45 320 23

Diazepam-d5 (PI) 290 198 -34 Positivo 8,40

154 -28

Fentiona 279 247 -14 Positivo 8,60

169 -18

Clorpirifós 350 198 -20 Positivo 9,11

162 -38

*Os íons sublinhados são os íons quantificadores.

Foi obtida a curva analítica dos compostos investigados. A curva variou entre as concentrações de 5 ng/mL e 1000 ng/mL, exceto para o 2,4-D, que variou entre 25 ng/mL e 5000 ng/mL (concentrações 5 vezes maiores). Na Figura 12 encontram-se os cromatogramas individuais dos analitos, na concentração do limite de quantificação (LOQ), e também do padrão interno, na concentração de 200 ng/mL. Na Figura 13, encontra-se o cromatograma de todos os analitos juntos nas mesmas concentrações.

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Figura 12. Cromatogramas dos íons extraídos obtidos pela

análise de amostra de sangue adicionado de padrão dos praguicidas investigados na concentração de 5 ng/mL (LOQ) e também do padrão interno (diazepam-d5 200 ng/mL) e submetida ao método descrito. Legenda: 1-aldicarbe sulfona; 2-mevinfós; 3-aldicarbe; 4-carbofurano; 5-atrazina; 6-2,4-D; 7-fipronil; 8-diazepam-d5 (padrão interno); 9-fentiona; 10-clorpirifós.

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Figura 13. Cromatograma dos íons extraídos obtido pela análise de amostra de sangue

adicionado de padrão dos praguicidas investigados na concentração de 5 ng/mL (LOQ) e também do padrão interno (diazepam-d5 200 ng/mL) e submetida ao método descrito. Legenda: 1-aldicarbe sulfona; 2-mevinfós; 3-1-aldicarbe; 4-carbofurano; 5-atrazina; 6-2,4-D; 7-fipronil; 8-diazepam-d5 (padrão interno); 9-fentiona; 10-clorpirifós.

Para cinco dias de análise, a curva apresentou boa linearidade, pois foi obtido valor de coeficiente de correlação linear igual ou maior que 0,98 (1/x2). Não foi observado efeito residual (carryover) quando branco de amostra foi injetado após o limite superior de quantificação. Os controles de baixa concentração, média concentração e alta concentração foram definidos como 15 ng/mL, 200 ng/mL e 750 ng/mL, respectivamente, exceto para o 2,4-D, que teve concentração cinco vezes maior para os controles: 75 ng/mL, 1000 ng/mL e 3750 ng/mL. A imprecisão intra-dia e a imprecisão inter-dia foram calculadas por ANOVA, apresentando resultados melhores que 20%. A inexatidão do método foi calculada conforme recomendado pelo SWGTOX e os resultados obtidos também foram melhores que 20%. Os valores estão apresentados nas Tabelas 3 e 4.

Tabela 3. Log P e dados da curva analítica dos analitos referentes a cinco dias de análise. Analito Log P* Coeficiente angular

(a) Coeficiente linear (b) r² (1/x2) Aldicarbe sulfona -0,57 0,0732±0,0101 0,145±0,0354 0,989 Mevinfós 0,13 0,0421±0,00435 0,0736±0,0222 0,992 Aldicarbe 1,13 0,00914±0,00235 0,0170±0,00549 0,988 Atrazina 2,61 0,0659±0,00566 -0,0144±0,0339 0,994 Carbofurano 2,32 0,108±0,0172 0,168±0,101 0,989 2,4-D 2,81 0,000459±0,0000496 0,00306±0,00147 0,984 Fipronil 4,00 0,00807±0,000988 0,0787±0,0608 0,980 Fentiona 4,09 0,0338±0,00388 0,0574±0,0511 0,994 Clorpirifós 4,96 0,0190±0,00379 0,0599±0,0491 0,992 *Dados obtidos na base de dados do PubChem (68-76).

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Tabela 4. Imprecisão intra-dia, imprecisão inter-dia e inexatidão do método. Analito Imprecisão intra-dia (%CV) (n=3) Imprecisão inter-dia (%CV) (n=15) Inexatidão (%) (n=15) CB CM CA CB CM CA CB CM CA Aldicarbe sulfona 3,7 2,6 3,4 4,8 8,0 7,9 -0,2 -6,9 -2,9 Mevinfós 3,8 2,9 3,4 5,8 8,6 8,9 -1,3 -7,5 -1,2 Aldicarbe 4,8 2,7 3,6 4,1 8,4 8,7 -0,2 -5,1 1,1 Atrazina 3,9 4,2 3,3 4,8 6,6 8,5 -5,4 5,9 6,8 Carbofurano 2,5 3,2 3,5 6,1 8,0 6,7 -1,2 -6,4 -2,7 2,4-D 8,2 4,8 3,6 14 5,5 7,8 -2,5 -10 -7,1 Fipronil 4,6 4,7 3,3 7,7 8,9 9,2 -3,0 -8,3 -8,7 Fentiona 5,1 3,7 3,5 7,1 12 12 -2,2 -9,7 -3,6 Clorpirifós 16 4,1 2,9 19 12 8,8 -14 -18 -10

Legenda: CB: Controle Baixo; CM: Controle Médio; CA: Controle Alto; CV: Coeficiente de variação.

A recuperação para os analitos foi melhor que 10,2% e o efeito matriz observado foi menor que 38,3%, exceto para os analitos fentiona e clorpirifós. Ambos foram calculados conforme recomendado pelo SWGTOX. Os resultados estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 5. Recuperação e efeito matriz do método.

Analito Recuperação (%) (n=6) Efeito Matriz (%) (n=6)

CB CA CB CA Aldicarbe sulfona 22,6 23,5 10,5 11,3 Mevinfós 21,9 21,3 17,4 23,3 Aldicarbe 22,0 21,8 19,3 21,9 Atrazina 21,6 24,7 17,4 14,3 Carbofurano 21,5 31,9 16,6 8,40 2,4-D 12,0 10,2 13,2 22,3 Fipronil 24,2 24,1 38,1 32,8 Fentiona 19,5 17,8 84,0 73,0 Clorpirifós 19,9 16,3 1,16x103 1,16x103 Diazepam-d5 (PI) 21,4 18,7 29,8 37,6

Legenda: CB: Controle Baixo; CA: Controle Alto.

Foram analisadas 64 amostras reais, sendo 27 amostras post mortem de animais atropelados e 37 amostras de animais vivos monitorados por colete GPS. Nenhuma substância do método foi detectada nestas amostras considerando-se o limite de detecção igual a 5 ng/mL. Na Tabela 6 encontra-se a relação das amostras analisadas.

(33)

Tabela 6. Relação de amostras reais analisadas.

Identificação Nome Data da Coleta Local

NEC24 - 28/06/2017 MS040 - Campo Grande até Santa Rita do Pardo

NEC30 - 17/07/2017 BR262 - Campo Grande até a ponte do Rio Paraguai

NEC32 - 20/07/2017 Animal do CRAS

NEC36 - 09/08/2017 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

NEC40 - 25/09/2017 BR262 - Campo Grande até Água Clara + até Três Lagoas

NEC64 - 26/03/2018 BR262 - Campo Grande até Água Clara + até Três Lagoas

NEC70 - 20/04/2018 MS338/BR267/BR163 - Santa Rita do Pardo até Campo

Grande

NEC73 - 01/05/2018

MS338/BR267/BR163 - Santa Rita do Pardo até Campo Grande

NEC74 - 08/05/2018 BR262 - Campo Grande até Água Clara

NEC87 - 07/08/2018

MS338/BR267/BR163 - Santa Rita do Pardo até Campo Grande

TB06-CE Christoffer 06/02/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB23-CE Maria 20/05/2018 BR267 TB24-CE Luigi 20/05/2018 BR267 TB25-CE Nancy 21/05/2018 BR267 TB26-CE Bem 22/05/2018 BR267 TB27-CE - 23/05/2018 BR267 TB28-CE Jane 23/05/2018 BR267 TB29-CE Annie 24/05/2018 BR267 TB30-CE Larry 25/05/2018 BR267 TB31-CE Reid 26/05/2018 BR267

TB02-CE Bumps 02/06/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB12-CE Makao 03/06/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB16-CE Puji 05/06/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

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Tabela 6. Relação de amostras reais analisadas (continuação).

TB05-CE Eliane 06/06/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB33-CE Scott 15/06/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB34-CE Delphini 17/06/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB35-CE Ed 18/06/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB36-CE Beauval 20/06/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB37-CE Schwartz 21/06/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB07-CE Anthony 04/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB08-CE Rodolfo 04/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB19-CE Hamish 05/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB04-CE Kyle 06/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB20-CE Antônia 07/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB18-CE Alexander 07/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB14-CE Chester 08/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB09-CE Jackson 08/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB15-CE Nash 09/07/2018 MS040- Campo Grande ate Santa Rita do Rio Pardo

TB41-CE Sheron 30/07/2018 BR267

TB42-CE Lee 23/08/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB43-CE Pequi 24/08/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB44-CE Barbara 25/08/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB45-CE Jennifer 26/08/2018 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB44-CE Barbara 02/04/2019 BR262 - Campo Grande até Ribas do Rio Pardo

TB41-CE Sheron 17/01/2019 BR267

TB46-CE Evelyn 28/08/2018 BR262

5. Discussão

O método proposto apresenta vantagens frente a outros métodos tradicionais de extração, pois utiliza pouco volume de amostra e de solvente, o que reduz o custo da análise, além de ser um método de rápida execução. O uso de acetonitrila como solvente permite a detecção de substâncias de diferentes classes químicas com eficiência, além de reduzir a extração de compostos lipofílicos da amostra (38).

A cromatografia líquida vem sendo amplamente utilizada nas análises multirresíduo de agrotóxicos por abranger uma grande variedade de compostos, independentemente de suas características químicas (77). Além disso, o uso do espectrômetro de massas como detector garante um método de alta sensibilidade e seletividade (77).

A coluna cromatográfica utilizada, com fase estacionária bifenil, apresentou boa seletividade cromatográfica para a maior parte dos analitos investigados. A fase móvel utilizada, composta por água ultrapura e metanol, contendo formiato de amônio e ácido fórmico como aditivos, foi padronizada para se adequar à rotina do laboratório, evitando a necessidade de trocas

(35)

de fase móvel a cada diferente método. A presença de sais voláteis de amônio (como o formiato de amônio) na fase móvel é fundamental para detecção de aldicarbe e aldicarbe sulfona, uma vez que estas substâncias são detectadas como adutos de amônio formados durante a ionização por

electrospray. Os aditivos são responsáveis por melhorar a ionização dos analitos na fase móvel, o

que aumenta a sensibilidade do método (78).

Foi possível avaliar o método segundo a recomendação do SWGTOX para os seguintes parâmetros: limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, imprecisão intra-dia, imprecisão inter-intra-dia, inexatidão, recuperação e efeito matriz. O método mostrou-se linear (r²>0,98), preciso (valores menores que 20%) e exato (valores menores que 20%). Porém, apresentou baixos valores de recuperação, que variaram entre 10,2% e 31,9%. Mesmo apresentando baixas porcentagens de recuperação, o método mostrou-se sensível e reprodutível, permitindo a quantificação de amostras a partir do limite de detecção estabelecido. Quanto ao efeito matriz, este foi satisfatório para os analitos (valores melhores que 38,1%), excetuando-se o clorpirifós e a fentiona. Uma das possibilidades para o resultado encontrado para estes dois analitos é maior lipofilicidade destes compostos quando comparado aos demais (segundo o valor de Log P da Tabela 3).

O único estudo encontrado relacionado à análise de agrotóxicos em animais silvestres foi o relatório técnico do IPE, que relata o impacto dos agrotóxicos na anta brasileira. Foi obtida uma amostra com resultado positivo para mevinfós em sangue, na concentração de 73,20±0 ng/mL, além de outros organofosforados em amostras na mesma matriz (61). As amostras de anta analisadas foram armazenadas por um período que variou entre 22 e 522 dias. Desta forma, esperava-se encontrar a presença de analitos de uso comum nas lavouras do cerrado em concentrações abaixo de 100 ng/mL nas amostras de sangue de tamanduá-bandeira. Entretanto, não foi detectado nenhum composto selecionado nas amostras reais analisadas. Uma das possibilidades é a diferença de porte entre o tamanduá-bandeira e a anta, que possuem diferentes volumes de distribuição, o que pode interferir na distribuição dos analitos nas diferentes matrizes biológicas. Outras possibilidades que justificam os resultados encontrados são o fato de se tratar de uma exposição crônica aos compostos, onde os animais poderiam apresentar níveis abaixo do limite de quantificação proposto, e o grande período de armazenamento da amostra (até 24 meses), o que pode afetar a estabilidade do analito na matriz.

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6. Conclusão

Foi possível desenvolver um método analítico para determinação multirresíduo de agrotóxicos em amostras de sangue. A extração por QuEChERS combinada com a cromatografia acoplada à espectrometria de massas sequencial permitiu a detecção de diferentes agrotóxicos com diferentes propriedades químicas em uma única metodologia. Dentre os compostos selecionados, encontram-se formicidas e cupinicidas utilizados no Cerrado brasileiro.

O método foi parcialmente validado de acordo com as recomendações do SWGTOX. Foram analisadas as amostras reais de tamanduás-bandeira, abrangendo tanto as amostras post

mortem quanto as amostras de animais vivos, porém nenhum dos compostos selecionados no

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Capítulo II – Determinação de agrotóxicos em amostras de pacientes

atendidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP após tentativa de suicídio

1. Introdução

Conforme citado anteriormente, o uso generalizado dos agrotóxicos tem causado problemas de saúde e fatalidades em todo o mundo, muitas vezes devido à exposição ocupacional e as intoxicações acidentais ou intencionais (22). Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) e a Organização Mundial da Saúde (OMS), a intoxicação por agrotóxicos é um dos principais meios utilizados na tentativa de suicídio nos países de rendimento baixo e médio, principalmente aqueles com alta proporção de residentes rurais que trabalham em agricultura de pequena escala (20,79). Entre 1990 e 2007, aproximadamente 30% dos casos de suicídio no mundo se devem à intoxicação por agrotóxicos (20,79).

No Brasil, das 84.206 notificações de intoxicação por agrotóxicos entre 2007 e 2015, os raticidas tiveram a maior porcentagem dentre os agrotóxicos utilizados (42,1%), seguidos pelos agrotóxicos de uso agrícola (36,5%), agrotóxicos domésticos (11,4%), produtos veterinários (8%) e de uso em saúde pública (2%) (20). Destacam-se as tentativas de suicídio, que correspondem a 53,6% dos casos notificados. Destes casos, 77% evoluíram para cura sem sequela, enquanto 5% evoluíram para óbito devido à intoxicação, conforme apresentado na Figura 14 (20).

Figura 14. Notificação de intoxicações por agrotóxicos em tentativas de suicídio, segundo

evolução dos casos – Brasil (2007-2015). (Consulta ao SINAN realizada em fevereiro de 2016. Os dados referentes a 2015 são parciais) (20).

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A frequência dos casos de tentativa de suicídio no período citado (2007-2015) foi maior em mulheres (52,5%). Quanto à ocupação, destacam-se as categorias de dona de casa (21,5%), estudante (18,8%), e trabalhador da agricultura e afins (13,9%) (20).

Com relação à faixa etária, um estudo no município de Campinas mostrou que o perfil etário nos casos de suicídio mudou ao longo do tempo. Entre 1980 e 1985, os idosos (acima de 55 anos) e os jovens (15-34 anos) possuíam maior risco de morte por suicídio, enquanto que de 1997 a 2001, esses grupos tiveram diminuição de risco, havendo um aumento na taxa no grupo dos adultos de meia idade (35-54 anos) (80,81).

O fácil acesso à substância que é utilizada no suicídio é determinante para a vítima cometer ou não o ato (81). Portanto, o uso de agrotóxicos como meio de suicídio em países de menor rendimento e com alta taxa de residentes rurais pode ser justificada pelo maior contato com estes produtos. O curto espaço de tempo decorrido entre a intoxicação e o atendimento médico são fatores que favorecem a evolução favorável dos casos (81).

O tratamento dos pacientes intoxicados de forma aguda por agrotóxicos é, num primeiro momento, sintomático. No acompanhamento do paciente, a correta identificação da substância ativa responsável pela intoxicação é de fundamental importância para, por exemplo, decidir-se sobre a quantidade ou período de uso de antídotos. Desta forma, nota-se a relevância de obter-se um método analítico que permita a detecção e quantificação de possíveis agrotóxicos presentes em amostras recebidas na rotina de emergência de casos de tentativa de suicídio por estes agentes.

2. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi avaliar se o método desenvolvido no capítulo 1 (extração QuEChERS e detecção em LC-MS/MS em amostras de sangue total de origem animal) poderia ser utilizado para análise de amostras de plasma humano apenas por validação parcial.

Para atingir este objetivo geral, foram definidas as seguintes etapas:

1) Avaliar a correlação entre as matrizes sangue de animal e plasma humano; 2) Analisar amostras recebidas na rotina de emergência do CIATOX.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais e reagentes

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encontravam disponíveis no Laboratório de Toxicologia Analítica, são eles: metanol e acetonitrila (grau HPLC, Merck), ácido fórmico (pureza 98-100%, Merck) formiato de amônio (pureza 99%, Merck), argônio (99,999%, Air Liquide), nitrogênio e ar sintético (gerador Peak Scientific), água ultrapurificada (sistema Milli-Q, Millipore, Bedford, EUA). Materiais de referência das substâncias investigadas, além da referência para uso como padrão interno, também se encontravam disponíveis no laboratório e foram adquiridos ou recebidos por doações de laboratórios parceiros. Foram utilizados os seguintes materiais de referencia: clorpirifós (99,9%, Flukar Analytical), fentiona (98,3%, Flukar Analytical), aldicarbe (99,5%, Aventis CropScience), aldicarbe sulfona (99%, Sigma Aldrich), atrazina (99%, Sigma Aldrich), diazepam-d5 (99%, Cerilliant, utilizado como padrão interno). Os compostos carbofurano (95,7%) e 2,4-D (99,5%) foram doados pela Coordenadoria de Assistência Técnica Integral (CATI). Os compostos fipronil (98,4%) e mevinfós (98,1%) foram doados pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).

3.2. Amostras

Foram analisadas três amostras de sangue coletadas de indivíduos maiores de 18 anos que tentaram suicídio e foram atendidos na unidade de emergência do Hospital de Clínicas – HC-UNICAMP. Estas amostras fazem parte do estudo “Suicídio na Emergência: estudo de relações

entre uso de substâncias psicoativas e tentativas de suicídio em unidade de emergência referenciada da cidade de Campinas - SP”, coordenado pela Profa. Dra. Karina Diniz Oliveira,

Departamento de Psicologia Médica e Psiquiatria, Faculdade de Ciências Médicas, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa UNICAMP (CAAE nº 58187816.6.0000.5404) (Anexo 3). As amostras coletadas foram refrigeradas (2 a 8 oC) desde a coleta até o momento da análise. Para avaliação da correlação de linearidade do método, foram utilizadas amostras de plasma branco, provenientes de bolsas de plasma fornecidas pelo Hemocentro da UNICAMP.

3.3. Preparo de amostra

A técnica de preparo de amostra utilizada foi o QuEChERS. Foram utilizados 250 µL de sangue ou plasma, que foram transferidos para um tubo de polipropileno. Durante o desenvolvimento e validação, adicionou-se na amostra “branco” 25 µL de solução contendo mistura dos padrões de praguicidas selecionados em diferentes concentrações. Em seguida, adicionou-se 25 µL de padrão interno (diazepam-d5, 200 ng/mL em metanol) e 500 µL de