Экспрес
сия
и
сек
ре
ция
ре
ком
би
нан
тно
го
бел
ка
LIF
че
ло
ве
ка
ге
не
ти
чес
ки
мо
ди
фи
ци
ро
ван
ны
ми
клет
ка
ми
мле
ко
пи
та
ю
щих
С
.
Е
.
Ры
марь
,
Т
.
А
.
Ру
бан
,
Д
.
М
.
Иро
дов
,
В
.
А
.
Кор
дюм
Инсти тут мо ле ку ляр ной би о ло гии и ге не ти ки НАН Укра и ны Ул. Академика За бо лот но го, 150, Киев, Укра и на, 03680
s.y.rymar@imbg.org.ua
Цель ра бо ты со сто я ла в по лу че нии экс прес сии гена LIF че ло ве ка в ге не ти чес ки мо ди фи ци ро ван ных клет ках мле ко пи та ю щих и из уче нии сек ре ции ре ком би нан тно го бел ка эти ми клет ка ми в куль ту -раль ную сре ду. Методы. Для вы яв ле ния ре ком би нан тно го LIF в кон ди ци о ни ро ван ной сре де, по лу чен -ной в ре зуль та те куль ти ви ро ва ния кле ток, транс феци ро ван ных ре ком би нан тны ми плаз ми да ми, со дер жа щи ми ген LIF, ис поль зо ва ли Вес терн-блот-ана лиз и им му ноп ре ци пи та цию. Результаты. Ско нстру и ро ван ные ре ком би нан тные плаз ми ды об ес пе чи ва ют експрес сию и сек ре цию ре ком би-нантно го LIF че ло ве ка клет ка ми трех ли ний (CHO-K1, L-M(TK–)(ins+) и 293Т), транс феци ро ван ны -ми эти ми плаз ми да ми. Сте пень гли ко зи ли ро ва ния про ду ци ру е мо го та ки ми клет ка ми ре ком би нант-ного LIF варь и ру ет, при этом на блю да ет ся сек ре ция по лнос тью гли ко зи ли ро ван но го LIF (с мо ле ку -лярной мас сой око ло 68 кДа). Выводы. Кон ди ци о ни ро ван ную сре ду, по лу чен ную вследствие куль ти -ви ро ва ния транс феци ро ван ных кле ток, мож но ис поль зо вать как ис точ ник LIF че ло ве ка для куль-ти ви ро ва ния кле ток, нуж да ю щих ся в этом рос то вом фак то ре, и для его вы де ле ния в чис том виде.
Клю че вые сло ва: ре ком би нан тный LIF, экс прес сия, сек ре ция, транс фек ция,кле точ ные ли нии.
Введение. LIF (фактор, угнетающийлейкемию) яв -ляется полифункциональным цитокином, принад -лежащимксемейству IL-6. Оноказывает влияние на различные тканиитипыклеток, включаягемо -поэтические клетки, нейральные имышечные, ге -патоциты, адипоциты, остеобластыиостеокласты. LIF действует на пролиферацию герменальных клеток, установление стволовых клеток, играет ключевуюрольвимплантациибластоцистыиран -них стадияхбеременности, участвуетв активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси, в раз -витиигипоталамуса, почек, энергетическогогоме -остазаидр. [1].
Влияние LIF на основные процессы в клетках организма обусловливает необходимость исполь
-зования этого белка как ростового фактора вэкс -периментах, связанных с культивированием ство -ловыхклетокразличногопроисхождения, атакжес ихнаправленнойдифференцировкойвклеткираз -ныхтипов.
LIF, какизвестно, являетсяабсолютнонеобхо -димым компонентом среды для поддержания в плюрипотентном состоянии мышиных эмбриона -льных стволовых клеток, широко применяемых при изучениимеханизмовподдержания плюрипо -тентности и биологии эмбриональной стволовой клеткивцелом [2, 3]. Онспособствуетмультипли -кациинейральныхстволовыхклетокчеловека, обе- спечивая их длительное самовосстановление (до 110 удвоений) [4] исохраняяихмультипотентные свойствавтечениегода [5], используетсявсредах
для культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК), улучшает их остеогенную диффе -ренцировку [6, 7], добавляетсявсредыдлядиффе -ренцировкиМСКвкардиомиоциты [8, 9] идр. Ре -комбинантный LIF человека, экспрессируемый в клетках Escherichia coli, обладает биологической активностью, индуцируядифференцировкуклеток лейкемическоймиелоидной линии мышиМ1 [10], егоиспользуюттакжевисследованиях in vitro и in vivo, хотя во втором случае не всегда получают ожидаемыеэффекты [11]. Однимизопределяющих факторовприэтомявляетсягликозилированиере -комбинантных белков. Оно увеличивает стабиль -ность белка ивремя его жизни вкровяном русле, еслиречьидетотерапевтическихбелках, влияетна устойчивость к протеазам, антигенность и специ -фическую активность [12]. Это вынуждаетискать специальныеспособыповышенияуровнягликози -лирования рекомбинантных белков в процессеих экспрессиивклеткахмлекопитающих[13, 14].
Прикультивированииклеток in vitro всредудо -бавляют очищенные рекомбинантные ростовые факторы, цитокины идругиебиологическиактив -ные молекулы илииспользуюткондиционирован -ные среды [15, 16]. Инактивацияростовыхфакто -ров требует постоянной замены среды, поэтому разрабатывают и другие подходы к обеспечению эффективного микроокружения культивируемых клеток, в частности, используют иммобилизован -ныеростовыефакторы [17] итрансгенныеклеточ -ные линии, которые могут служить фидерными клетками [18–20]. Получениетрансгенныхклеточ -ных линий разного происхождения дает возмож -ностьрешатьрядзадач, связанных, средипрочего, сизучениемвлияниятрансгенанабиологиюклет -ки-реципиента. Кромеэтого, экспрессиярекомби -нантныхбелковвклеткахмлекопитающихявляет -сяосновным источникомполучения гликозилиро -ванныхбелков.
Так, ужек 2007 годуоколо 70 % всехизвестных терапевтических рекомбинантных белков в мире получены в клетках китайского хомячка (CHO) [21]. Основываясьназначимости LIF дляисследо -ваний in vivo и in vitro, цельюданнойработыстало получениеэкспрессиирекомбинантного LIF чело -векавклеткахтрансгенныхклеточныхлиниймле
-копитающих и изучение его секреции в культу -ральнуюсреду.
Материалыиметоды. Вработеиспользованы плазмиды pUC28, pBluScrII (KS+
), pEGFP-C1; штаммы E. coli XL1, DH10B; клеточные линии CHO-K1 (китайский хомячок, яичник), L-M(TK–
) (ins+
) (мышь, подкожная соединительная ткань), трансфецированная рекомбинантной плазмидой, несущейгенинсулиначеловека, и 293T, являющая -сявариантомлинии HEK293 (эмбриональнаяпочка человека), экспрессирующим большой Т-антиген SV40 иустойчивымк G418.
ВыделениеплазмидныхДНК, обработкуихэн -донуклеазами рестрикции, лигирование, получе -ниекомпетентных клеток E. coli, анализрекомби -нантныхплазмидпроводилипостандартныммето -дикам [22].
ДляполучениякДНК LIF использовалиследу -ющие праймеры: 5'-TCTGAGGTTTCCTCCAAGG-3' и 5'-TGCTCAGCTTCATCACAGC-3'; 5'-ATGAA-
GGTCTTGGCGGCAGG-3' и
5'-ACCTCCTGCTAG-AAGGCCTG-3'.
кДНК гена LIF получали с помощью реакции обратнойтранскрипциисогласноинструкциипро -изводителя, используя набор для синтеза кДНК («Fermentas», Литва). ПЦР проводили в стандарт -ныхбуферныхусловияхдля Taq- и Pfu-полимераз, подбираяоптимальнуюпрограммусоответственно поставленнымзадачам.
Эукариотические клетки трансформировали рекомбинантными плазмидами с помощью поли -этиленимина (ПЭИ) [23]. Клетки выдерживали с комплексами ДНК–ПЭИв течение 1 ч. Селекцию клеток CHO-K1, трансфецированных pC1-L, осу -ществляли на G418 (200 мкг/мл). В случае транс -фекции pC1-IL клетки отбирали, используягигро -мицин (200 мкг/мл). Клетки L-M(TK–)(ins+) и 293Т трансфецировалитолько pC1-IL, посколькуониус- тойчивык G418. Концентрациюантибиотиков, до -статочнуюдля селекциирезистентныхклеток, оп -ределялипредварительно.
без сыворотки, после чего помещали в такую же среду. Через 1,5–2 суткультуральнуюсредусоби -рали, белки осаждали 10 %-м раствором ТХУ в присутствии 0,015 % дезоксихолатанатрия. После разделения белковв 10 %-м денатурирующемпо -лиакриламидномгеле (ПААГ) [24] проводилиВес -терн-блот анализ согласно online-протоколу фир -мы «Millipore» (США) (millipore.com/immunodetec- tion/id3/westernblotting), используякозьиполикло -нальныеантителапротиврекомбинантного LIF че -ловекаиконъюгатантителк IgG козы, полученных вкролике, спероксидазойхрена («Sigma», США).
Иммунопреципитацию проводили согласно протоколуфирмы «Abcam» (США) (abcam.com/ps/ pdf/protocols/immunoprecipitation). Полученную в результатекультивирования 2,5 ×105клетокконди
-ционированнуюсреду ДМЕМ вобъеме 1 млсме -шивалис 3 мкгпервичныхантителиинкубировали в течение 4 ч при перемешивании и температуре 4 °С, послечегодобавляли 70 мклбелок G-сефаро
-зыисноваинкубировалисперемешиванием (4 °С,
4 ч). Образцыцентрифугировали, удалялинадоса -дочнуюжидкостьибелок G-сефарозутриждыпро -мывалибуферомследующегосостава: 50 мM трис -HCl, pH 8,0,150 мM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS. После отмывания к осадку белок G-сефарозыдо -бавляли 25 мклдвукратногобуферадлянанесения образцовикипятили (5 мин). Послеэлектрофореза в 10 %-мПААГпроводилиВестерн-блотанализ.
Результатыиобсуждение.Посколькуцельра -ботысостоялавполучениисекретируемоговкуль -туральную среду рекомбинантного белка, было
проведеноклонирование гена LIF человека, коди -рующего LIF ссигнальнымпептидом. Этупоследо -вательностьполучилиметодом ОТ-ПЦРс исполь -зованиемвыделеннойизплацентычеловекамРНК исоответствующихпраймеров. Амплифицирован -ную в ПЦР кДНК LIF клонировали в pBluScrII (KS+), ее нуклеотидную последовательность под -твердилисеквенированием.
Длятрансфекцииклетокмлекопитающихнаос- новевекторадляэкспрессиирекомбинантныхбел -ков в клетках эукариотов pEGFP-C1 («Clontech», США) былисконструированыдвеплазмиды – pC1- L и pC1-IL (рис. 1). В pC1-L ген LIF введенподкон -трольцитомегаловирусногопромотора, ав pC1-IL, кромегена LIF, встроен фрагмент ДНК, содержа -щий IRES (внутреннийсайтдлярибосомы), вируса энцефаломиокардитаи ген устойчивости к гигро -мицину.
Экспрессиягена LIF всоставеэтихконструк -цийвэукариотическихклеткахдолжнаприводить к секреции гликозилированного белка. Известно, что LIF имеетшестьсайтовгликозилирования [25] ивзависимостиотегостепенимолекулярнаямасса (м. м.) белка колеблетсяот 32 до 73 кДа. Вестерн -блотанализсред, вкоторыхкультивироваликлет -китрехклеточныхлиний, трансфецированныере -комбинантнымиплазмидамисовстроеннымгеном LIF человека, показал, что они секретируют LIF, который, по-видимому, вразнойстепенигликози -лирован. Как правило, идентифицировали белкис м. м. около 30, 55 и 68–72 кДа (рис. 2–4). Высоко -молекулярнаяформа, вероятно, соответствуетпол
-Энхансер/P CMV
SV40 ori Kan (R) /
Neo (R)
pC1-L
4600п.н.
Зрелый пептид Энхансер/P CMV
F1 ori ColE1 ori
Сигнальний пептид
BamHI HindIII
MluI PstI
LIF
Сигнальний пептид
Kan (R) / Neo (R)
SV40 ori
pC1-IL
6795п.н.
Зрелый пептид
hph
IRES ColE1 ori
F1 ori
BamHI NheI
LIF
Энхансер/P CMV
SV40 ori Kan (R) /
Neo (R)
pC1-L
4600п.н.
Зрелый пептид Энхансер/P CMV
F1 ori ColE1 ori
Сигнальний пептид
BamHI HindIII
MluI PstI
LIF
Сигнальний пептид
Kan (R) / Neo (R)
SV40 ori
pC1-IL
6795п.н.
Зрелый пептид
hph
IRES ColE1 ori
F1 ori
BamHI NheI
LIF
ностью гликозилированному белку. Еевизуализа -ции мешаетбычий сывороточный альбумин, при -сутствующийвсыворотке. Поэтойпричинесекре -цию LIF изучали, культивируяхорошоотмытыеот
сыворотки клетки в культуральной среде ДМЕМ, несодержащейсыворотки. Втакихусловияхчерез 2–3 сутокклеткитеряютжизнеспособность, чтояв -носказываетсянаэффективности экспрессиикле -точных белков, в том числе и рекомбинантного. Лучшевсегосохраняетсяжизнеспособностьклеток линии L-M(TK–
)(ins+
), продуцирующих инсулин. Кромеэтого, посколькустепеньгомологиичелове -ческого LIF смышинымсоставляет 79 %, вконтро -ляхвозможнопоявлениеположительныхсигналов, обусловленных эндогенным LIF. Анализ экспери -ментальныхданных, полученныхразными автора -ми, показывает, чтомолекулярнаямассачеловечес -кого LIF, выделенногоизразныхклеток, отличает -ся. Так, в клеткахкитайского хомячка экспресси -руется рекомбинантный LIF с м. м. около 45 кДа [26]. Изкондиционированнойсредыклеточнойли -ниикарциномымочевогопузыря 5637 выделен LIF см. м. 73 кДа [27], другиеавторыизэтогожеисточ -никавыделили LIF см. м. 43 кДа [28], вработе [29] из кондиционированной средыТ-лимфоцитов по -лучен LIF см. м. 38 кДа.
Для более эффективного концентрирования LIF, секретируемогов среду, примененметод им -мунопреципитации с использованиембелок G-се -фарозы с последующим Вестерн-блот-анализом преципитата. Результаты, полученные на генети -чески модифицированных линиях CHO-K1, L-M (TK–)(ins+) и 293Т, приведенына рис. 5. Исходяиз данныхВестерн-блот анализа очевидно, чтонеко -торыеформы LIF (м. м. около 30 и 55 кДа), совпа -даяпоподвижностислегкойитяжелойцепямиим -муноглобулинов, внесенных впробувовремя им -мунопреципитации, маскируютсяими. Виммуно -преципитации культуральных сред, полученных после выращивания клеток, трансфецированных векторнойплазмидой (безгена LIF), интенсивность сигналов, обусловленныхлегкойитяжелойцепями иммуноглобулинов, отчетливо слабее. Дополни -тельновизуализируютсяинтенсивнаяполоса, соот -ветствующаябелкусм. м. 65–68 кДа, которая, по -видимому, представляетсобойполностьюгликози -лированнуюформу LIF, именееинтенсивнаяполо -са, отвечающаябелкусм. м. около 48 кДа. Экспрес -сиявклетках CHO-K1 (рис. 3, 4), трансфицирован -ных pC1-L, когдавозможнаселекцияна G418, про
-1 2 3 4 5
72
55
43
34
25
кДа
Рис. 2. Вес терн-блот ана лиз кон ди ци о ни ро ван ных сред (клет ки 1-го пас са жа): 1 – CHO-K1 (кон троль, транс фек ция век то ром, сре -да без сы во рот ки, одни сут ки); 2 – CHO-K1 (транс фек ция pC1-L, сре да без сы во рот ки, одни сут ки); 3 – CHO-K1 (кон троль, транс -фек ция век то ром, сре да без сы во рот ки, двое су ток); 4 – CHO-K1 (транс фек ция pC1-L, сре да без сы во рот ки, двое су ток); 5 – мар кер мо ле ку ляр ной мас сы, кДа
1 2 3 4
кДа
26 34 43 55 72
Рис. 3. Вес терн-блот ана лиз кон -ди ци о ни ро ван ных сред (клет ки 2-го и 3-го пас са жей, куль ти ви ро -ван ные в сре де ДМЕМ без сы во -рот ки в те че ние 2 сут): 1 – CHO-K1 (кон троль, транс фек ция век то -ром); 2 – CHO-K1 (транс фек ция pC1-L); 3 – CHO- K1 (транс фек ция pC1- IL); 4 – мар кер мо ле ку ляр ной мас сы, кДа
1 2 3 4 5
кДа
26 34 43 55 72
Рис. 4. Вес терн-блот ана лиз кон ди ци о ни ро ван ных сред (клет ки 2–4-го пас са жей, куль ти ви ро ван ные в сре де ДМЕМ без сы во рот ки в те че -ние 2 сут): 1 – L-M (TK–) (ins+) (кон троль, транс фек -ция век то ром); 2 – L-M (TK–)
(ins+) (транс фек ция pC1-IL);
исходитболееэффективно, чемвклетках, трансфе -цированных pC1-IL, где селекция осуществляется нагигромицине. Приэтомклеткилинии L-M(TK–) (ins+
), трансфецированные pC1-IL, демонстрируют достаточновысокуюэффективостьэкспрессии LIF (в ряде опытов, как и клетки CHO-K1 (рис. 4), трансфецированные pC1-L). Вероятно, это объяс -няетсятем, чтоприотсутствиисывороткивсредев клетках, продуцирующихинсулин, процессы, обе -спечивающиеих метаболизм, не угнетаются в та -коймере, каквклетках CHO-K1 и 293Т.
Выводы. Сконструированные нами рекомби -нантные плазмиды pC1-L и pC1-IL обеспечивают экспрессиюи секрецию рекомбинантного LIF че -ловекавсредуиз клетоктрехтрансфецированных ими клеточных линий млекопитающих (двух мы -шиныхиоднойчеловеческой). Продуцируемыйта -кимиклеткамирекомбинантный LIF гликозилиро -ванвразнойстепени, втомчисле, очевидно, всре -де присутствует полностью гликозилированная форма. Среда, кондиционированная генетически модифицированными клетками, может быть ис -пользованакакисточник LIF длявыращиванияраз -личных клеток, нуждающихся в этом ростовом факторе, атакжедлявыделенияеговчистомвиде.
АвторывыражаютблагодарностьЕ. К. Топоро -вой за любезно предоставленную клеточную ли -нию L-M(TK–
)(ins+
).
S. Yu. Rymar, Т. А. Ruban, D. M. Irodov, V. А. Kordium
Expression and secretion of human recombinant LIF by genetically modified mammalian cells
Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine 150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680 Summary
Aim. The aim of this work was to express the human LIF gene in mammalian cells and to study the secretion of recombinant LIF into culture medium. Methods. Recombinant LIF was detected by Wes-tern blot analysis and immunoprecipitation in culture medium of CHO-K1, L-M (TK–
) (ins+
), 293Т cells, transfected with recombi-nant plasmids containing human LIF gene. Results. The recombi-nant plasmids. containing human gene LIF, were constructed. The cells of three (CHO-K1, L-M (TK–) (ins+), 293Т) mammalian lines were transfected with these plasmids. It was shown that the trans-fected mammalian cells secreted recombinant human LIF which was characterized by variable degree of glycosylation including completely glycosylated form (approximately 68 kD). Сonclusions. The conditioned medium of developed cell lines can be used as a sourсe of human recombinant LIF for different purposes, including purification of human recombinant LIF and as an additional sup-plement for cell culturing.
Keywords: recombinant LIF, expression, secretion, transfec-tion, cell lines.
С. Ю. Ри мар, Т. А. Ру бан, Д. М. Іро дов, В. А. Кор дюм
Експресія і сек реція ре комбіна нтно го білка LIF лю ди ни ге не тич но мо дифіко ва ни ми кліти на ми ссавців
Ре зю ме
Мета. Мета ро бо ти по ля га ла в одержанніекспресії гена LIF людини в ге не тич но мо дифіко ва них кліти нах ссавців і вив ченні сек реції ре комбіна нтно го білка цими кліти на ми в куль ту раль -не се ре до ви ще. Методи. Для виз на чен ня ре комбіна нтно го LIF в кон диціоно ва но му се ре до вищі, одер жа но му в ре зуль таті культи ву ван ня клітин, транс феко ва них ре комбіна нтни ми плазмідами, що містять ген LIF, ви ко рис то ву ва ли Вес терн-блот аналіз та іму ноп ре ципітацію. Результати. Ско нстру йо -вані ре комбіна нтні плазміди за без пе чу ють експресію і сек ре-цію ре комбіна нтно го LIF лю ди ни кліти на ми трьох ліній (CHO-K1, L-M(TK–)(ins+) і 293Т), транс феко ва них цими плазмідами. Ступінь гліко зи лю ван ня ре комбіна нтно го LIF, про ду ко ва но го та ки ми кліти на ми, варіює, при цьо му спос терігається сек ре-ція повністю гліко зиль о ва но го LIF (з мо ле ку ляр ною ма сою близь ко 68 кДа). Висновки. Кон диціоно ва не се ре до ви ще, одер -жа не внаслідок куль ти ву ван ня транс феко ва них клітин, мож -на ви ко рис то ву ва ти як дже ре ло LIF лю ди ни для куль тиву-ван ня клітин, яким потрібен цей рос то вий фак тор, а та кож для його виділен ня в очи ще но му стані.
Клю чові сло ва: ре комбіна нтний LIF, експресія, сек реція, транс фекція, клітинні лінії.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
кДа
26 34 43 55 72 IgG,тяжелая
цепь
IgG,легкая цепь
®
®
Рис. 5. Опре де ле ние LIF в кон ди ци о ни ро ван ных сре дах (им му -ноп ре ци пи та ция) (клет ки 2–4-го пас са жей, куль ти ви ро ван ные в сре де ДМЕМ без сы во рот ки в те че ние 2 сут, кро ме L-M(TK–) (ins+)): 1 – кон троль им му ноп ре ци пи та ции (им му ноп ре ци пи та -ция без сре ды); 2 – 293Т (кон троль, транс фек ция век то ром); 3 – 293Т (транс фек ция pC1-IL); 4 – CHO-K1 (кон троль, транс фек -ция век то ром); 5 – CHO-K1 (транс фек ция pC1-IL); 6 – CHO-K1 (транс фек ция pC1-L); 7 – L-M(TK–)(ins+) (кон троль, транс фек -ция век то ром); 8 – L-M(TK–)(ins+) (транс фек ция pC1-IL, сре да
без сы во рот ки, 15 ч); 9 – L-M(TK–)(ins+) (транс фек ция pC1-IL,
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. AuernhammerC. J., Melmed S. Leukemia inhibitory factor – neuroimmune modulator of endocrine function // Endocrin. Revs.–2000.–21, N 3.–P. 313–345.
2. Matsuda T., Nakamura T., Nakao K. T., Katsuki M., Heike T., Yokota T. STAT3 activation is sufficient to maintain an un-differentiated state of mouse embryonic stem cells // EMBO J.–1999.–18, N 15.–Р. 4261–4269.
3. Zandstra P. W., Le H. V., Daley G. Q., Griffith L. G., Lauffen-burger D. A. Leukemia inhibitory factor (LIF) concentration modulates embryonic stem cell self-renewal and differentia-tion independently of proliferadifferentia-tion // Biotechnol. Bioeng.– 2000.–69, N 6.–Р. 607–617.
4. Wright L. S., Li J., Caldwell M. A., Wallace K., Johnson J. A., Svendsen C. N. Gene expression in human neural stem cells: effects of leukemia inhibitory factor // J. Neurochem.–2003.– 86, N 1.–Р. 179–195.
5. Carpentera M. K., Cuib X., Hua Z., Jacksona J., Shermana S., Seigerc A., Wahlberga L. U. In vitro expansion of a multi-potent population of human neural progenitor cells // Exp. Neurol.–1999.–158, N 2.–Р. 265–278.
6. Pat. USA 7109032. Serum-free medium for mesenchymal stem cells / R. Cancedda, B. Dozin // Publ. 09/19/2006.
7. Pat. USA 6432711. Embryonic stem cells capable of differen-tiating into desired cell lines / J. H. Dinsmore, J. Ratliff // Publ. 8/13/2002.
8. Pat. USA 7534607. Method of producing cardiomyocytes from mesenchymal stem cells / W. Chen, S. Lin // Publ. 19.05.2009.
9. Dimaracis I., Levicar N., Nihoyannopoulos P. In vitro stem cell differentiation into cardiomyocytes: Part 1.Culture medi- um and growth factors // J. Cardiothor. Renal Res.–2006.–1, N 2.–Р. 107–114.
10. Gearing P. D., Gough N. M., King J. A., Hilton D. J., Nicola N. A., Simpson R. J.,Nice E. C., Kelso A., Metcalf D. Molecu-lar cloning and expression of cDNA encoding a murine mye-loid leukaemia inhibitory factor (LIF) // EMBO J.–1987.–6, N 13.–Р. 3995–4002.
11. Brinsden P. R., Alam V., De Moustier B., Engrand P. Recom-binant human leukemia inhibitory factor does not improve implantation and pregnancy outcomes after assisted repro-ductive techniques in women with recurrent for unexplained implantation failure // Fertil. Steril.–2009.–91, N 4.–Р. 1445– 1447.
12. Hossler P., Khattak S. F., Jian Z. Optimal and consistent pro-tein glycosylation in mammalian cell culture// Glycobiolo-gy.–2009.–19, N 9.–P. 936–949.
13. Pat. USA 6673575. Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation / F. Reinhard, E. Horst, W. Claus // Publ. 10.06.1999.
14. Bork K., Horstkorte R., Weidemann W. Increasing the sialyla- tion of therapeutic glycoproteins: The potential of the sialic acid biosynthetic pathway // J. Pharmaceutic. Sci.–2009.–98, N 10.–P. 3499–3508.
15. Pat. USA 7118746. Conditioned cell culture medium compo- sitions and methods of use / G. K. Naughton, D. L. Horwitz, M. A. Applegate, J. Zeltinger, J. N. Mansbridge, A. Kern, L. K. Landeen, A. Ratcliffe, R. E. Pinney // Publ.10.10.2006.
16. Pat. USA 7723105. Conditioned cell culture medium, me-thod to obtained the same and use of it for maintenance, proli-feration and differentiation of mammalian cells / V. Bordoni, T. Alonzi, M. Tripodi // Publ. 5/25/2010.
17. Makino H., Hasuda H., Ito Y. Immobilization of leukemia in-hibitory factor (LIF) to culture murine embryonic stem cells // J. Biosci. Bioeng.–2004.–98, N 5.–P. 374–379.
18. Kameda T., Sugiyama T. Application of genetically modified feeder cells for culture of keratinocytes // Meth. Mol. Biol.– 2005.–289, N 1.–P. 29–38.
19. Sidhu K. S., Lie K. H., Tuch B. E. Transgenic human fetal fib-roblasts as feeder layer for human embryonic stem cell linea-ge selection // Stem Cells Dev.–2006.–15, N 5.–P. 741–747. 20. Unger C., Gao S.,Cohen M., Jaconi M., Bergstrom R., Holm
F., Galan A., Sanchez E., Irion P., Dubuisson J. B., Giry-La-terriere M., Salmon P., Simon C., Hovatta O., Feki A. Immor-talized human skin fibroblast feeder cells support growth and maintenance of both human embryonic and induced pluripo-tent stem cells // Hum. Reprod.–2009.–24, N 10.–P. 2567– 2581.
21. Jayapal K. P., Wlaschin K. F., Yap M. G. S., Hu W.-S. Re-combinant protein therapeutics from CHO cells – 20 years and counting // Chem. Eng. Prog.–2007.–103, N 7.–P. 40–47. 22. Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E. F. Molecular cloning: A laboratory manual.–New York: Cold Spring Harbor Lab. publ., 1982.–545 p.
23. Geisse S., Henke M. Large-scale transient transfection of mammalian cells: a newly emerging attractive option for re-combinant protein production // J. Struct. Funct. Genomics.– 2005.–6, N 2–3.–P. 165–170.
24. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the as-sembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.–1970.– 227, N 5259.–Р. 680–685.
25. Schmelzer C. H., Harris R. J., Butler D., Yedinak C. M., Wag-ner K. L., BurtonL. E. Glycosylation pattern and disulfide as-signment of recombinant human differentiation-stimulating fac- tor // Arch. Biochem. Biophys.–1993.–302, N 2.–P. 484–489. 26. Schmelzer C. H., Burton L. E., Tamony C. M. Purification and
partial characterization of recombinant human differentiati-on-stimulating factor // Protein Exp. Purific.–1990.–1, N 1.– P. 54–62.
27. Pat. USA 004098. Leukemia inhibitory factor / N. M. Gough, T. A. Willson, D. Metcalf, D. J. Hilton, E. C. Nice, N. A. Nicola, R. J. Simpson, J. A. King, D. P. Gearing // Publ. 02.01.2003. 28. Gascan H., Anegon I., Praloran V., Naulet J., Godard A.,
Soulillou J. P., Jacques Y. Constitutive production of human interleukin for DA cells/leukemia inhibitory factor by human tumor cell lines derived from various tissues // J. Immunol.– 1990.–144, N 7.–P. 2592–2598.
29. Godard A., Gascan H., Naulet J., Peyrat M. A., Jacques Y., Soulillou J. P., Moreau J. F. Biochemical characterization and purification of HILDA, a human lymphokine active on eosi- nophils and bone marrow cells // Blood.–1988.–71, N 6.– P. 1618–1623.
