Orientações para Coleta,
Transporte, Processamento,
Análise e Meios de Cultura.
Análise e Meios de Cultura.
•• ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;
•• CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;
•• CASOS CLÍNICOS;CASOS CLÍNICOS; blog do professor: blog do professor:
http://chitoteixeira.wordpress.com http://chitoteixeira.wordpress.com
Colheita de Amostras
Quando se suspeita de doença infecciosa
Técnicas dirigidas à detecção sorológica de antígenos e anticorpos
Sondas de DNA - PCR
Cultivos apropriados
Anticorpos monoclonais Sondas de DNA - PCR
Colheita de Amostras
É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa mis importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo processo de enfermidade infecciosa.
Na instituição de uma terapia incorreta e ainda danosa, caso o tratamento seja dirigido para um comensal.
Uma amostra mal colhida: de enfermidade infecciosa.
Fracasso no isolamento de microrganismos importantes.
Exemplo: (caso clínico)
Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarro
de um paciente com pneumonia clínica;
Escarro colhido de forma inadequada sendo constituído principalmente de saliva;
Klebsiella pneumoniae
O pior:
O tratamento seria inadequado e só
resultaria efetivo, por casualidade, se a espécie causadora da pneumonia tivesse um padrão de susceptibilidade a antibióticos similar à de K. pneumoniae.Pseudomonas aeruginosa similar à de K. pneumoniae.
A terapia eleita poderia ter sido errônea.
• A amostra deve ser material do sítio real de
infecção, devendo ser colhida com o mínimo
de contaminação dos tecidos, órgãos e
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
de contaminação dos tecidos, órgãos e
secreções adjacentes;
• Deve-se estabelecer o momento ótimo para a
colheita de amostras, com o objetivo de contar com melhor possibilidade de isolar microrganismos causadores de enfermidades;
• Deve-se obter uma quantidade suficiente de
amostra para realização das técnicas de Enviar ao laboratório swab seco ou secreções
escassas é uma prática inútil e de custo Considerações fundamentais na
colheita de amostras.
Colheita de Amostras
Calcularam que o
rendimento do isolamento
Swabs retais para isolar
espécies de Shigella, o material amostra para realização das técnicas de cultivo solicitadas;
escassas é uma prática inútil e de custo considerável para o paciente;
• Devem ser utilizados dispositivos de colheita,
recipientes de amostras e meios de cultura apropriados para assegurar isolamento ótimo de microrganismos.; rendimento do isolamento de microrganismos a partir de culturas de sangue aumentava em cerca de 3% por mL de sangue colhido; (Mermel e Maki).
Com demasiada freqüência, são enviados ao laboratório 0,5 mL ou menos de material
identificado como “escarro” ou “lavado brônquico”;bactérias anaeróbicas
espécies de Shigella, o material colhido deve ser inoculado diretamente na superfície de
ágar Mac Conkey ou caldo enriquecido para
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
• Sempre que possível, deve-se obter amostras
antes da administração de antibióticos; Etiqueta legível com nome, antes da administração de antibióticos; Etiqueta legível com nome,
número de idenficacção, origem, médico e a data/hora
da colheita; Garganta Neisseria gonorrhoea Amostras geniturinárias Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Líquido cefalorraquidiano (LCR)
• O recipiente da amostra deve ser rotulado de
Colheita de Amostras
O objetivo primário no transporte de
amostras para diagnóstico consiste em
manter a amostra o mais próximo possível de seu estado original, com deterioração
Transporte de Amostras
de seu estado original, com deterioração mínima, e minimizar os riscos para os transportadores das amostras, utilizando-se dispositivos protetores do recipiente da
amostra inseridos no interior de um
Transporte de Amostras
Deve-se evitar:Condições ambientais adversas Frio
Calor extremo
Transporte de Amostras
Se for previsto:Um atraso prolongado (acima de 4 dias por exemplo) antes da amostra ser processada;
É preferível congelar a amostra a -70ºC, podendo ser utilizado um congelador a -20ºC, se o período de estocagem for breve.
Transporte de Amostras
As amostras de escarro colhidas principalmente para o isolamento:
Podem ser remetidas sem qualquer tratamento desde que colhidas em recipientes de propileno ou polietileno esterilizados.micobactérias fungos
Transporte de Amostras
A maioria das amostras líquidas, em particular amostra de urina, deve ser transportada ao laboratório o quanto antes possível:
Contexto hospitalar
Recomenda-se um limite máximo de 2 horas entre a colheita e a chegada da amostra ao laboratório.
Transporte de Amostras
O limite de tempo representa um problema
quando as amostras são colhidas em
consultórios particulares.
Podem ser utilizados
Amostras de urina
Podem ser utilizados
recipientes contendo uma pequena quantidade de
ácido bórico, se o
transporte rápido não for possível.
Transporte de Amostras
Para a maioria das amostras pode ser utilizado
um meio de manutenção ou transporte,
seguindo-se as instruções do fabricante.
Meio de
transporte Stuart
Solução tampão, isenta de
nutrientes e fatores de
crescimento, conserva a
viabilidade sem permitir a multiplicação das bactérias durante o transporte.
Transporte de Amostras
• Tioglicolato de sódio – tem função de agente
redutor para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias;
• Ágar (pequena quantidade) – proporciona
uma consistência semi-sólida que impede a
oxigenação e o derrame durante o
Transporte de Amostras
Solução de borato de sódioTampão com sacarose, fosfato e glutamato
Transporte de Amostras
As amostras devem ser embaladas de modo a suportar golpes ou mudanças de pressão que
podem ocorrer durante a manipulação e
causar vazamento do conteúdo;
Um recipiente que vaza não apenas predispõe a amostra a uma potencial contaminação, mas também expõe os microrganismos ao pessoal que transporta ou recebe a amostra;
Transporte de Amostras
Técnica apropriada para embalar e rotular agentes etiológicos:
Recipiente primário com tampa à prova d’água
Recipiente secundário de preferência de metal
Embalagem para envio fabricada em cartão ondulado, cartão grosso
Recepção de Amostras
jalecos
luvas
Processamento de Amostras
• Ingresso de dados essenciais em um livro de
registros ou em um terminal de computador;
• Exame visual e determinação do
cumprimento de todos os critérios para cumprimento de todos os critérios para
aceitação da amostra;
• Para certas amostras, o exame microscópico
de montagens úmidas ou de esfregaços corados, para estabelecer um diagnóstico presuntivo;
Processamento de Amostras
USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:
É recomendável que os microbiologistas
efetuem exames microscópicos diretos das amostras enviadas para cultivo;
amostras enviadas para cultivo;
Rápido diagnóstico
presuntivo Guia para selecionar os meios de cultura apropriados
Processamento de Amostras
Coloração de Gram• Cristal violeta – serve como coloração
primária, unindo-se à parede celular
bacteriana após tratamento com uma
solução de iodo fraca (mordente para a solução de iodo fraca (mordente para a ligação do corante);
• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) –
as bactérias que retêm o corante aparecem azuladas se observadas ao microscópio e são denominadas gram-positivas;
Processamento de Amostras
Coloração de Gram• Contracorante Safranina – certas bactérias
perdem a coloração primária com cristal
violeta quando são tratadas com o
descorante e captam a contracoloração com descorante e captam a contracoloração com safranina e aparecem em vermelho quando observadas ao microscópio, denominando-se gram-negativas;
A coloração de Gram pode ser utilizada para efetuar identificações presuntivas.
Processamento de Amostras
Colorações de àlcool-ácido-resistênciaRecobertas por um
espesso material ceroso que resiste à coloração,
entretanto, uma vez entretanto, uma vez coradas, resistem à
descoloração mesmo por solventes orgânicos fortes,
como o álcool-ácido.
Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).
Processamento de Amostras
OUTROS CORANTES:Laranja de acridina
Azul de toluidina e Azul de Metileno Coloração com Prata
Coloração com Wright-Giemsa Ácido periódico de Schiff
Processamento dos Cultivos
Após recebimento de amostras para cultivo no
laboratório de microbiologia, devem ser
tomadas as seguintes decisões:
• Selecionar os meios de cultura primários • Selecionar os meios de cultura primários
apropriados para o tipo de amostra
particular;
• Determinar a temperatura e a
atmosfera de incubação para
isolar todos os microrganismos potencialmente significativos;
Processamento dos Cultivos
• Determinar qual dos microrganismos
isolados em meios primários requer uma maior caracterização;
• Determinar se são necessárias provas de
suscetibilidade a antibióticos, uma vez suscetibilidade a antibióticos, uma vez conhecida a identidade do organismo;
Comum a todos é o reconhecimento das
dificuldades envolvidas na manutenção da
qualidade dos serviços, em vista das políticas de redução de custos, cada vez mais rigorosas;
Seleção de Meios de
Cultura Primários
Meios não-seletivos – são isentos de inibidores e permitem o crescimento de microrganismos encontrados freqüentemente em laboratórios clínicos;
clínicos;
Ágar com 5% de sangue de carneiro
Ágar com sangue de cavalo ou de ovelha
Haemophilus influenzae
Ágar com sangue humano
Seleção de Meios de
Cultura Primários
Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediante a adição de um ou mais antibióticos ou de certas substâncias químicas;
Ágar sangue Colistina e o ácido nalidíxico Inibe gram-negativos e favorece o crescimento de gram-positivos Ágar-KV Canamicina e vancomicina Bacilos gram-negativos anaeróbios (bacteroides)
Ágar McConkey Ágar EMB Inibem gram-positivos
Seleção de Meios de
Cultura Primários
O caldo de enriquecimento é empregado para
isolar microrganismos patogênicos de
amostras, como fezes, nas quais existe uma
elevada concentração de microrganismos
elevada concentração de microrganismos
comensais;
Salmonella e Shigella Escherichia coli e outros
comensais entéricos
Fase logaritmica
Uma vez que a amostra tenha ultrapassado os vários critérios para rejeição e tenha sido aceita para cultivo, porções apropriadas da mesma devem ser transferidas aos vários
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
mesma devem ser transferidas aos vários meios de cultura descritos no item anterior. Essa atividade também é usualmente realizada em uma parte separada de outras áreas do
laboratório, conhecida como área de
“semeadura”;jalecos
luvas
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
O equipamento necessário para a inoculação primária de amostras é relativamente simples:
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Espalhamento nos quatro quadrantes
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido (0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar
semi-sólido é adequado para as provas de
motilidade; motilidade;
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Os microrganismos diferem quanto à
temperatura ótima de incubação. Porém, a maioria dos microrganismos cresce a 35ºC; assim, se o laboratório dispõe apenas de uma assim, se o laboratório dispõe apenas de uma
estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC; O crescimento da maior parte dos
microrganismos é potencializado por uma atmosfera de 5% a 10% de CO2;
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Mais importante que o modo de incubação é a prevenção de amplas flutuações na
temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos e placas fiquem protegidos de correntes de e placas fiquem protegidos de correntes de
ar-condicionado ou de fluxos de calor;
O controle da umidade no interior da estufa também é importante. A maioria dos
microrganismos tem crescimento máximo quando a umidade é de 70% ou superior;
Interpretação dos Cultivos
A identificação dos cultivos primários após 24
a 48 horas de incubação requer uma
considerável habilidade;
Essa avaliação se faz:
O microbiologista deve avaliar o crescimento das colônias e decidir se são necessários procedimentos adicionais;
Interpretação dos Cultivos
• Anotando as características e o número
relativo de cada tipo de colônia isolada em meios de ágar;
• Determinando a pureza, reação à coloração • Determinando a pureza, reação à coloração
de Gram e morfologia das bactérias em cada tipo de colônia;;
• Verificando mudanças no meio que circunda
as colônias, o que reflete atividades metabólicas específicas de bactérias
